Tổng quan nghiên cứu

Viêm gan B (HBV) là một trong những bệnh truyền nhiễm phổ biến và nguy hiểm trên toàn cầu, với khoảng 296 triệu người mắc viêm gan B mạn tính và 1,5 triệu ca nhiễm mới mỗi năm theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) năm 2019. Việt Nam nằm trong nhóm các quốc gia có tỷ lệ nhiễm HBV cao, ước tính từ 8-25% dân số, trong đó khoảng 8,4% chuyển thành viêm gan B mạn tính. Việc điều trị viêm gan B chủ yếu dựa vào nhóm thuốc analog nucleot(s)ide (NA) như Lamivudine, Telbivudine, Adefovir, Tenofovir và Entecavir. Tuy nhiên, hiệu quả điều trị giảm dần do sự xuất hiện các đột biến kháng thuốc trong vùng gen mã hóa enzym phiên mã ngược (RTase) của HBV.

Mục tiêu nghiên cứu là phát triển kỹ thuật COLD-PCR và real time PCR sử dụng đầu dò LNA nhằm nâng cao độ nhạy và khả năng sàng lọc nhanh các đột biến kháng thuốc NA của HBV. Nghiên cứu được thực hiện trên 228 mẫu huyết thanh bệnh nhân viêm gan B mạn tính tại Việt Nam, bao gồm 130 bệnh nhân nhi chưa điều trị và 98 bệnh nhân người lớn đã và đang điều trị NA. Ý nghĩa của nghiên cứu là cung cấp công cụ chẩn đoán sớm, hỗ trợ lựa chọn liệu pháp điều trị hiệu quả, góp phần giảm thiểu thất bại điều trị và kháng chéo thuốc.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

  • Cơ chế kháng thuốc nucleot(s)ide của HBV: Đột biến trong gen polymerase, đặc biệt vùng RTase, làm giảm ái lực của thuốc NA với enzym, dẫn đến kháng thuốc. Các đột biến sơ cấp và thứ cấp ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị.
  • Phương pháp COLD-PCR (Co-amplification at Lower Denaturation temperature PCR): Biến thể của PCR truyền thống, tận dụng sự khác biệt nhiệt độ biến tính giữa sợi DNA đột biến và kiểu dại để làm giàu các alen đột biến, nâng cao độ nhạy phát hiện.
  • Real time PCR sử dụng đầu dò TaqMan LNA (Locked-Nucleic Acid): Tăng cường độ đặc hiệu và độ nhạy nhờ đầu dò LNA có nhiệt độ nóng chảy cao hơn, giúp phân biệt chính xác các đột biến điểm đơn nucleotide.

Các khái niệm chính bao gồm: đột biến kháng thuốc NA, enzym phiên mã ngược HBV polymerase, nhiệt độ biến tính tới hạn (Tc), tỷ lệ phần trăm đột biến/kiểu dại (mt/wt), và giới hạn phát hiện (LoD).

Phương pháp nghiên cứu

  • Nguồn dữ liệu: 228 mẫu huyết thanh bệnh nhân viêm gan B mạn tính tại các bệnh viện lớn ở Hà Nội, gồm 130 bệnh nhân nhi chưa điều trị và 98 bệnh nhân người lớn đã và đang điều trị NA.
  • Thiết kế mồi và đầu dò: Thiết kế 3 cặp mồi PCR nhân bản vùng gen RTase chứa các đột biến kháng thuốc phổ biến, cùng bộ đầu dò TaqMan LNA đặc hiệu cho từng đột biến.
  • Phân tích: Thực hiện phản ứng PCR truyền thống, COLD-PCR và real time PCR TaqMan LNA. Xác định nhiệt độ biến tính tới hạn (Tc) bằng real time PCR SYBR Green. Đánh giá độ nhạy, giới hạn phát hiện và so sánh hiệu quả giữa các phương pháp.
  • Timeline nghiên cứu: Thu thập mẫu và phân tích trong năm 2022, với các bước tối ưu kỹ thuật, thử nghiệm trên mẫu chuẩn và mẫu bệnh phẩm lâm sàng.
  • Phân tích số liệu: Sử dụng phần mềm SPSS 20, đánh giá ý nghĩa thống kê với P < 0,05 và hệ số tương đồng Cohen’s kappa để so sánh kết quả giữa các phương pháp.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Đặc điểm bệnh nhân: Bệnh nhân nhi có tuổi trung bình 64 tháng, 92,3% dương tính HBeAg, chủ yếu genotype B (78,5%). Bệnh nhân người lớn tuổi trung bình 41 tuổi, 67,3% dương tính HBeAg, genotype B chiếm 73,5%. Tải lượng virus dao động từ 5,0 × 10^4 đến 4,6 × 10^8 IU/mL.

  2. Nhiệt độ biến tính tới hạn (Tc): Xác định Tc của đoạn gen P2 và P3 lần lượt là 81,9°C và 81,5°C, thấp hơn nhiệt độ biến tính tiêu chuẩn 95°C, phù hợp cho phản ứng COLD-PCR.

  3. Độ nhạy của COLD-PCR: Phương pháp COLD-PCR phát hiện được đột biến kháng thuốc ở tỷ lệ 5% mt/wt, cao hơn so với PCR truyền thống chỉ phát hiện được ở 10%. COLD-PCR làm giàu đột biến, tăng độ nhạy và độ chính xác khi giải trình tự Sanger.

  4. Tần suất đột biến kháng thuốc NA:

    • Ở bệnh nhân nhi chưa điều trị, 64,6% mang đột biến kháng thuốc NA, phổ biến nhất là rtV207M (40%), rtN238T (8,5%), rtN238A (6,2%). Một số bệnh nhân có đồng thời nhiều đột biến, bao gồm các đột biến cổ điển rtL180M + rtM204V/I.
    • Ở bệnh nhân người lớn đã điều trị, 69,4% mang đột biến kháng thuốc NA, với rtV207M (29,6%), rtN238T (10,2%), rtN238A (8,2%) là phổ biến nhất. Một số bệnh nhân có đồng thời 2 đột biến liên quan kháng thuốc.

  5. Hiệu quả real time PCR TaqMan LNA: Phương pháp có độ nhạy phát hiện đột biến thấp nhất 0,1% mt/wt, giới hạn phát hiện DNA là 5 x 10^2 IU/mL, vượt trội so với COLD-PCR. Thời gian xét nghiệm nhanh, phù hợp sàng lọc số lượng lớn mẫu.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy kỹ thuật COLD-PCR và real time PCR TaqMan LNA đều nâng cao đáng kể độ nhạy phát hiện đột biến kháng thuốc NA của HBV so với phương pháp PCR truyền thống. COLD-PCR làm giàu đột biến dựa trên nhiệt độ biến tính tới hạn, giúp phát hiện các đột biến có tỷ lệ thấp trong quần thể virus, phù hợp cho nghiên cứu và xác định phổ đột biến mới. Real time PCR TaqMan LNA với đầu dò LNA tăng cường độ đặc hiệu và độ nhạy, cho phép sàng lọc nhanh các đột biến điểm đơn nucleotide với giới hạn phát hiện rất thấp, thích hợp ứng dụng trong chẩn đoán lâm sàng.

Tần suất đột biến kháng thuốc NA cao ở cả bệnh nhân chưa điều trị và đã điều trị phản ánh sự tồn tại rộng rãi của các biến thể kháng thuốc trong quần thể HBV tại Việt Nam, đồng thời cho thấy nguy cơ thất bại điều trị và kháng chéo thuốc. Các đột biến rtV207M, rtN238T/A là những vị trí không cổ điển nhưng phổ biến, cần được chú ý trong theo dõi và lựa chọn phác đồ điều trị.

So sánh với các nghiên cứu trước đây, độ nhạy của COLD-PCR trong nghiên cứu này (5% mt/wt) tương đương hoặc cao hơn các nghiên cứu trước, đồng thời mở rộng phát hiện đột biến trên nhiều domain của enzym RTase. Real time PCR TaqMan LNA thể hiện ưu thế vượt trội về độ nhạy và thời gian thực hiện, phù hợp cho ứng dụng thực tiễn tại các cơ sở y tế.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh độ nhạy giữa các phương pháp, bảng tần suất đột biến kháng thuốc theo nhóm bệnh nhân, và biểu đồ phân bố các đột biến phổ biến.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Áp dụng kỹ thuật real time PCR TaqMan LNA trong chẩn đoán lâm sàng: Thực hiện sàng lọc nhanh các đột biến kháng thuốc NA ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính, đặc biệt trước và trong quá trình điều trị, nhằm phát hiện sớm xu hướng kháng thuốc, tối ưu hóa phác đồ điều trị. Thời gian thực hiện: trong vòng 6-12 tháng; chủ thể: các phòng xét nghiệm bệnh viện tuyến trung ương và tỉnh.

  2. Sử dụng COLD-PCR kết hợp giải trình tự Sanger cho nghiên cứu và giám sát dịch tễ học: Phát hiện phổ đột biến mới, đột biến tiềm năng và đánh giá sự tiến hóa của virus HBV trong quần thể. Thời gian: liên tục hàng năm; chủ thể: các trung tâm nghiên cứu và viện y học.

  3. Đào tạo và nâng cao năng lực kỹ thuật cho cán bộ y tế: Tổ chức các khóa đào tạo về kỹ thuật COLD-PCR và real time PCR LNA, đảm bảo chất lượng xét nghiệm và phân tích kết quả chính xác. Thời gian: 6 tháng đầu năm; chủ thể: Bộ Y tế, các trường đại học và bệnh viện.

  4. Xây dựng hướng dẫn chuẩn về xét nghiệm đột biến kháng thuốc HBV: Ban hành quy trình chuẩn áp dụng kỹ thuật mới trong chẩn đoán và theo dõi điều trị viêm gan B, giúp đồng bộ và nâng cao hiệu quả quản lý bệnh. Thời gian: 12 tháng; chủ thể: Bộ Y tế phối hợp với các chuyên gia đầu ngành.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Bác sĩ chuyên khoa gan mật và truyền nhiễm: Nắm bắt kỹ thuật mới trong phát hiện đột biến kháng thuốc, hỗ trợ lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp, nâng cao hiệu quả điều trị và giảm nguy cơ kháng thuốc.

  2. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành công nghệ sinh học, y học phân tử: Tham khảo phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật PCR cải tiến, ứng dụng trong phát hiện đột biến virus, phục vụ phát triển nghiên cứu khoa học.

  3. Cán bộ phòng xét nghiệm y học: Áp dụng kỹ thuật COLD-PCR và real time PCR LNA trong xét nghiệm lâm sàng, nâng cao độ nhạy và độ chính xác, rút ngắn thời gian trả kết quả.

  4. Quản lý y tế và hoạch định chính sách: Hiểu rõ tầm quan trọng của phát hiện sớm đột biến kháng thuốc, từ đó xây dựng chính sách điều trị và giám sát dịch tễ hiệu quả, giảm gánh nặng bệnh tật.

Câu hỏi thường gặp

  1. COLD-PCR khác gì so với PCR truyền thống?
    COLD-PCR sử dụng nhiệt độ biến tính thấp hơn nhiệt độ tiêu chuẩn, làm giàu các alen đột biến nhờ sự khác biệt nhiệt độ nóng chảy giữa DNA đột biến và kiểu dại, giúp phát hiện đột biến với tỷ lệ thấp hơn (5% so với 10-20% của PCR truyền thống).

  2. Tại sao sử dụng đầu dò LNA trong real time PCR?
    Đầu dò LNA có nhiệt độ nóng chảy cao hơn nucleotide thông thường, tăng độ đặc hiệu và giảm nhiễu tín hiệu, giúp phân biệt chính xác các đột biến điểm đơn nucleotide với độ nhạy cao (phát hiện đến 0,1% mt/wt).

  3. Phương pháp nào phù hợp cho chẩn đoán lâm sàng?
    Real time PCR TaqMan LNA phù hợp hơn do thời gian thực hiện nhanh, độ nhạy cao và khả năng xử lý nhiều mẫu cùng lúc, trong khi COLD-PCR thích hợp cho nghiên cứu và xác định phổ đột biến.

  4. Tần suất đột biến kháng thuốc NA ở bệnh nhân chưa điều trị có cao không?
    Nghiên cứu cho thấy khoảng 64,6% bệnh nhân nhi chưa điều trị đã mang đột biến kháng thuốc NA, cho thấy sự tồn tại rộng rãi của các biến thể kháng thuốc ngay cả trước khi điều trị.

  5. Làm thế nào để ứng dụng kết quả nghiên cứu vào điều trị?
    Phát hiện sớm đột biến kháng thuốc giúp bác sĩ lựa chọn thuốc phù hợp, tránh thất bại điều trị và kháng chéo, đồng thời theo dõi hiệu quả điều trị và điều chỉnh phác đồ kịp thời.

Kết luận

  • Phát triển thành công kỹ thuật COLD-PCR và real time PCR TaqMan LNA với độ nhạy phát hiện đột biến kháng thuốc NA lần lượt là 5% và 0,1% mt/wt.
  • Tần suất đột biến kháng thuốc NA cao ở cả bệnh nhân chưa điều trị và đã điều trị tại Việt Nam, với các đột biến phổ biến như rtV207M, rtN238T/A.
  • Kỹ thuật real time PCR TaqMan LNA phù hợp cho sàng lọc nhanh, hỗ trợ chẩn đoán lâm sàng và lựa chọn liệu pháp điều trị hiệu quả.
  • COLD-PCR là công cụ hữu ích trong nghiên cứu phổ đột biến và phát hiện đột biến mới, góp phần nâng cao hiểu biết về cơ chế kháng thuốc của HBV.
  • Khuyến nghị triển khai kỹ thuật real time PCR TaqMan LNA tại các phòng xét nghiệm lâm sàng và xây dựng hướng dẫn chuẩn xét nghiệm đột biến kháng thuốc HBV trong vòng 12 tháng tới.

Hành động tiếp theo là đào tạo nhân lực, đầu tư trang thiết bị và tích hợp kỹ thuật mới vào quy trình chẩn đoán viêm gan B tại các cơ sở y tế nhằm nâng cao hiệu quả điều trị và kiểm soát dịch bệnh.