Phát triển kỹ thuật cold pcr và real time pcr lna để xác định và sàng lọc nhanh các đột biến kháng thuốc nucleotside của hepatitis virus b

Nghiên cứu phát triển kỹ thuật Cold-PCR & Real-time PCR LNA giúp xác định, sàng lọc nhanh đột biến kháng thuốc Nucleotide của virus viêm gan B (HBV).

• Tác giả: Chu Văn Sơn
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thị Vân Anh
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Phát triển kỹ thuật Cold-PCR và Real- time PCR LNA để xác định và sàng lọc nhanh các đột biến kháng thuốc Nucleot(s)ide của Hepatitis Virus B
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• 1. CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU
• 1.1. Đại cương về viêm gan B và HBV
• 1.2. Virus viêm gan B
• 1.3. Gánh nặng bệnh tật gây ra bởi HBV
• 1.4. Chẩn đoán viêm gan B
• 1.5. Thuốc điều trị viêm gan B
• 1.6. Đột biến kháng thuốc Nucleot(s)ide của HBV
• 1.7. Cơ chế kháng thuốc Nucleot(s)ide của HBV
• 1.8. Các loại đột biến kháng thuốc Nucleot(s)ide của HBV
• 1.9. Tình hình kháng thuốc của HBV tại Việt Nam
• 1.10. Đột biến kháng thuốc của HBV trên bệnh nhân đang điều trị
• 1.11. Đột biến kháng thuốc của HBV trên bệnh nhân chưa điều trị
• 1.12. Các kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện đột biến kháng thuốc của HBV
• 1.12.1. Polymerase chain reaction (PCR) kết hợp với giải trình tự Sanger
• 1.12.2. Giải trình tự thế hệ mới
• 1.12.3. COLD-PCR kết hợp với giải trình tự Sanger
• 1.12.4. Real time PCR sử dụng đầu dò Taqman LNA
• 2. CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Mẫu bệnh phẩm
• 2.3. Hóa chất và thiết bị
• 2.4. Phương pháp
• 2.4.1. Thiết kế mồi nhân đoạn gen RTase của HBV
• 2.4.2. Thiết kế đầu dò LNA phát hiện các đột biến kháng thuốc NA
• 2.4.3. Tạo các mẫu chuẩn chứa trình tự gen kiểu dại và đột biến
• 2.4.4. Xây dựng phương pháp COLD-PCR phát hiện đột biến kháng thuốc HBV
• 2.4.5. Xác định độ nhạy của phương pháp COLD-PCR
• 2.4.6. Xây dựng phương pháp real time PCR sử dụng đầu dò Taqman LNA
• 2.4.7. Xác định độ nhạy và giới hạn phát hiện của phương pháp real time PCR sử dụng đầu dò Taqman LNA
• 2.4.8. Đánh giá hiệu quả của phương pháp COLD-PCR và real time PCR Taqman LNA trên mẫu bệnh phẩm
• 2.4.9. Phân tích số liệu thống kê
• 3. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Đặc điểm bệnh nhân tham gia nghiên cứu
• 3.2. Xác định nhiệt độ biến tính giới hạn của phương pháp COLD-PCR
• 3.3. Đánh giá độ nhạy của phương pháp COLD-PCR xác định đột biến kháng thuốc NA
• 3.4. Kết quả sàng lọc đột biến kháng thuốc NA bằng phương pháp COLD-PCR
• 3.5. Thiết kế bộ đầu dò Taqman LNA cho phản ứng real time PCR phát hiện nhanh các đột biến kháng thuốc NA
• 3.6. Đánh giá độ nhạy và giới hạn phát hiện của phương pháp real time PCR Taqman phát hiện các đột biến kháng thuốc NA
• 3.7. Đánh giá khả năng phát hiện đột biến kháng thuốc NA của phương pháp real time PCR Taqman LNA trên mẫu bệnh phẩm
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN KẾT QUẢ CỦA LUẬN VĂN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Kỹ Thuật Cold PCR Real Time PCR LNA 55

Viêm gan B (HBV) là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, gây ra nhiều biến chứng nghiêm trọng như xơ gan và ung thư gan. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hàng trăm triệu người trên toàn cầu đang phải đối mặt với tình trạng viêm gan B mãn tính. Điều trị HBV bao gồm sử dụng các loại thuốc kháng virus, tuy nhiên, sự xuất hiện của các đột biến kháng thuốc đang trở thành một thách thức lớn. Xác định sớm xu hướng kháng thuốc là yếu tố then chốt để lựa chọn phác đồ điều trị hiệu quả. Bài viết này sẽ đi sâu vào việc phát triển và ứng dụng các kỹ thuật Cold-PCR và Real-time PCR LNA trong sàng lọc và phát hiện các đột biến này. Các kỹ thuật này hứa hẹn mang lại những cải tiến đáng kể so với các phương pháp truyền thống.

1.1. Viêm Gan B HBV và Gánh Nặng Bệnh Tật Toàn Cầu

HBV (Virus viêm gan B) là nguyên nhân hàng đầu gây ra các bệnh về gan, ảnh hưởng đến hàng triệu người trên toàn thế giới. Theo thống kê của WHO, có khoảng 296 triệu người nhiễm viêm gan B mãn tính, và mỗi năm có khoảng 1,5 triệu ca nhiễm mới. Bệnh tiến triển âm thầm, gây ra các biến chứng nghiêm trọng như xơ gan, ung thư gan và dẫn đến tử vong. Việt Nam nằm trong khu vực có tỷ lệ nhiễm HBV cao, gây ra gánh nặng lớn cho hệ thống y tế và xã hội. Các chương trình tiêm chủng mở rộng đã được triển khai nhưng vẫn cần các giải pháp hiệu quả hơn để kiểm soát và điều trị bệnh.

1.2. Thách Thức Trong Điều Trị HBV Sự Xuất Hiện Kháng Thuốc

Các thuốc điều trị HBV hiện nay có hai nhóm chính: nhóm thuốc tiêm (Interferon) và nhóm thuốc uống (Nucleotide Analogs – NA). Nhóm thuốc NA, mặc dù có hiệu quả ức chế virus cao, nhưng lại gặp phải vấn đề kháng thuốc. Các đột biến kháng thuốc xảy ra trong vùng gen mã hóa enzyme RTase (Reverse Transcriptase) của virus. Điều này làm giảm ái lực của thuốc với enzyme, khiến thuốc mất hiệu quả. Do đó, việc xác định sớm và chính xác các đột biến này là vô cùng quan trọng để lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp. Sự kháng thuốc không chỉ làm giảm hiệu quả điều trị mà còn có thể dẫn đến kháng chéo giữa các loại thuốc, gây khó khăn hơn trong việc kiểm soát bệnh.

II. Vấn Đề Sàng Lọc Đột Biến Kháng Thuốc HBV Tiêu Chuẩn Vàng 59

Việc sàng lọc đột biến kháng thuốc HBV đóng vai trò then chốt trong quản lý điều trị bệnh. Phương pháp PCR kết hợp giải trình tự Sanger được xem là tiêu chuẩn vàng, cho phép xác định các đột biến mới và tiềm năng. Tuy nhiên, phương pháp này có độ nhạy thấp, khoảng 10-20% đột biến trong quần thể virus. Do đó, khả năng ứng dụng trong chẩn đoán sớm còn hạn chế. Các phương pháp như MALDI-ToF và giải trình tự thế hệ mới (NGS) có độ nhạy cao hơn, nhưng lại đòi hỏi thiết bị đắt tiền và phức tạp, gây khó khăn cho việc triển khai rộng rãi. Cần có những giải pháp hiệu quả, có độ nhạy cao và chi phí hợp lý để sàng lọc đột biến HBV.

2.1. Giải Trình Tự Sanger Hạn Chế Về Độ Nhạy và Chi Phí

Kỹ thuật giải trình tự Sanger là phương pháp truyền thống và được coi là tiêu chuẩn vàng trong xác định đột biến. Tuy nhiên, phương pháp này có độ nhạy thấp, chỉ phát hiện được các đột biến chiếm tỷ lệ cao trong quần thể virus (trên 10-20%). Ngoài ra, chi phí thực hiện giải trình tự Sanger cũng khá cao, đặc biệt khi cần phân tích nhiều mẫu. Điều này gây khó khăn trong việc sàng lọc đột biến kháng thuốc HBV trên diện rộng, đặc biệt ở các nước đang phát triển.

2.2. Giải Trình Tự Thế Hệ Mới NGS Ưu Điểm và Thách Thức Triển Khai

Giải trình tự gen HBV thế hệ mới (NGS) có độ nhạy cao hơn nhiều so với giải trình tự Sanger, cho phép phát hiện các đột biến chiếm tỷ lệ nhỏ trong quần thể virus. Tuy nhiên, NGS đòi hỏi thiết bị hiện đại, quy trình phức tạp và chi phí đầu tư lớn. Điều này gây khó khăn cho việc triển khai rộng rãi NGS trong các phòng xét nghiệm lâm sàng, đặc biệt ở các nước có nguồn lực hạn chế. Bên cạnh đó, phân tích dữ liệu NGS cũng đòi hỏi kiến thức chuyên môn sâu về tin sinh học.

2.3. Real Time PCR TaqMan Probe Chưa Đủ Phổ Đột Biến Kháng Thuốc

Kỹ thuật Real-Time PCR sử dụng TaqMan probe có ưu điểm là đơn giản, nhanh chóng và có độ nhạy tương đối cao (1-5%). Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu chỉ tập trung vào một vài đột biến kháng thuốc, chưa bao phủ được toàn bộ phổ đột biến đang lưu hành hiện nay. Do đó, cần có một phương pháp sàng lọc đột biến kháng thuốc HBV toàn diện hơn, có thể phát hiện được nhiều loại đột biến khác nhau với độ nhạy cao.

III. Cách Phát Triển Kỹ Thuật Cold PCR Sàng Lọc Đột Biến 57

Cold-PCR là một kỹ thuật PCR cải tiến giúp tăng cường tín hiệu của các alen đột biến hiếm có trong mẫu bệnh phẩm. Nguyên tắc của Cold-PCR dựa trên việc điều chỉnh nhiệt độ biến tính (denaturation temperature) trong quá trình PCR. Bằng cách hạ thấp nhiệt độ biến tính, các alen đột biến (có cấu trúc không ổn định hơn) sẽ được khuếch đại ưu tiên hơn so với các alen kiểu dại. Luận văn đã phát triển thành công kỹ thuật Cold-PCR có độ nhạy cao để xác định phổ đột biến và các đột biến mới/tiềm năng liên quan đến tính kháng thuốc NA của HBV.

3.1. Nguyên Tắc Hoạt Động Của Kỹ Thuật Cold PCR

Kỹ thuật Cold-PCR hoạt động dựa trên nguyên tắc điều chỉnh nhiệt độ biến tính. Khi nhiệt độ biến tính được hạ thấp, các ADN đột biến (do có sự thay đổi về cấu trúc) sẽ dễ dàng tách chuỗi hơn so với ADN kiểu dại. Điều này dẫn đến việc các mồi (primers) sẽ bám vào ADN đột biến dễ dàng hơn, từ đó tăng cường sự khuếch đại của các đột biến. Việc điều chỉnh nhiệt độ biến tính là yếu tố then chốt để tối ưu hóa hiệu quả của kỹ thuật Cold-PCR.

3.2. Tối Ưu Hóa Quy Trình Cold PCR Để Tăng Độ Nhạy

Để đạt được độ nhạy cao nhất, quy trình Cold-PCR cần được tối ưu hóa cẩn thận. Các yếu tố cần được xem xét bao gồm: thiết kế mồi (primers), nhiệt độ biến tính, thời gian ủ (annealing time), và nồng độ MgCl2. Việc sử dụng các phần mềm chuyên dụng để thiết kế mồi và thực hiện các thử nghiệm tối ưu hóa sẽ giúp cải thiện đáng kể hiệu quả của kỹ thuật Cold-PCR trong việc phát hiện các đột biến kháng thuốc HBV.

3.3. Ưu Điểm Vượt Trội Của Cold PCR So Với PCR Truyền Thống

So với PCR truyền thống, Cold-PCR có ưu điểm vượt trội về độ nhạy. Kỹ thuật này có thể phát hiện các đột biến chiếm tỷ lệ rất nhỏ trong quần thể virus (dưới 1%), trong khi PCR truyền thống thường chỉ phát hiện được các đột biến chiếm tỷ lệ cao (trên 10%). Điều này giúp phát hiện sớm các đột biến kháng thuốc HBV, cho phép bác sĩ lâm sàng đưa ra các quyết định điều trị kịp thời và hiệu quả.

IV. Phát Triển Real Time PCR LNA Giải Pháp Sàng Lọc Nhanh 54

Kỹ thuật Real-time PCR sử dụng LNA (Locked Nucleic Acid) là một phương pháp sàng lọc nhanh và hiệu quả các đột biến kháng thuốc HBV. LNA là các nucleotide biến đổi giúp tăng độ ổn định và ái lực liên kết của mồi và đầu dò, từ đó cải thiện độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng. Luận văn đã phát triển thành công kỹ thuật Real-time PCR LNA có độ nhạy cao để sàng lọc nhanh, phát hiện sớm các đột biến kháng thuốc NA của HBV, ứng dụng xác định sớm xu hướng kháng thuốc, hỗ trợ bác sĩ lâm sàng lựa chọn liệu pháp điều trị hiệu quả cho bệnh nhân viêm gan B mạn tính.

4.1. Vai Trò Của LNA Trong Kỹ Thuật Real Time PCR

LNA (Locked Nucleic Acid) là một loại nucleotide biến đổi, trong đó đường ribose bị khóa ở cấu hình C3'-endo. Điều này làm tăng độ ổn định và ái lực liên kết của LNA với DNA hoặc RNA đích. Trong kỹ thuật Real-time PCR, việc sử dụng LNA trong mồi và đầu dò giúp tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng, đặc biệt trong việc phát hiện các đột biến điểm.

4.2. Thiết Kế Đầu Dò LNA Đặc Hiệu Cho Các Đột Biến Kháng Thuốc

Việc thiết kế đầu dò LNA đặc hiệu cho các đột biến kháng thuốc HBV là yếu tố quan trọng để đảm bảo độ chính xác của kỹ thuật Real-time PCR LNA. Đầu dò LNA cần được thiết kế sao cho có ái lực liên kết cao với trình tự đột biến, nhưng lại có ái lực liên kết thấp với trình tự kiểu dại. Điều này giúp phân biệt rõ ràng giữa các alen đột biến và alen kiểu dại trong mẫu bệnh phẩm.

4.3. Ưu Điểm Của Real Time PCR LNA So Với Các Phương Pháp Khác

So với các phương pháp khác như giải trình tự Sanger hoặc PCR truyền thống, Real-time PCR LNA có nhiều ưu điểm vượt trội, bao gồm: thời gian thực hiện nhanh chóng, độ nhạy cao, độ đặc hiệu cao và chi phí hợp lý. Điều này giúp Real-time PCR LNA trở thành một công cụ sàng lọc hiệu quả và phù hợp cho các phòng xét nghiệm lâm sàng trong việc phát hiện sớm các đột biến kháng thuốc HBV.

V. Ứng Dụng Kết Quả Cold PCR Real Time PCR LNA 59

Nghiên cứu đã ứng dụng thành công kỹ thuật Cold-PCR và Real-time PCR LNA để sàng lọc đột biến kháng thuốc NA trên các mẫu bệnh phẩm. Kết quả cho thấy cả hai kỹ thuật đều có độ nhạy cao và khả năng phát hiện các đột biến ở nồng độ thấp. So sánh với giải trình tự Sanger, Cold-PCR và Real-time PCR LNA có thể phát hiện các đột biến mà giải trình tự Sanger không phát hiện được. Điều này chứng tỏ tính ưu việt của các kỹ thuật mới trong việc phát hiện sớm xu hướng kháng thuốc HBV.

5.1. Đánh Giá Độ Nhạy Của Cold PCR Trong Phát Hiện Đột Biến Kháng Thuốc

Các thí nghiệm đã được thực hiện để đánh giá độ nhạy của kỹ thuật Cold-PCR trong việc phát hiện các đột biến kháng thuốc HBV. Kết quả cho thấy Cold-PCR có thể phát hiện các đột biến chiếm tỷ lệ rất nhỏ trong quần thể virus (dưới 1%), vượt trội so với độ nhạy của PCR truyền thống. Điều này cho thấy tiềm năng lớn của Cold-PCR trong việc phát hiện sớm các đột biến kháng thuốc, trước khi chúng trở nên phổ biến và ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị.

5.2. So Sánh Kết Quả Real Time PCR LNA Với Giải Trình Tự Sanger

Kết quả sàng lọc đột biến bằng Real-time PCR LNA được so sánh với kết quả giải trình tự Sanger trên cùng các mẫu bệnh phẩm. Kết quả cho thấy Real-time PCR LNA có độ tương đồng cao với giải trình tự Sanger, đồng thời có thể phát hiện các đột biến mà giải trình tự Sanger không phát hiện được do độ nhạy thấp hơn. Điều này khẳng định tính chính xác và độ nhạy cao của Real-time PCR LNA trong việc sàng lọc đột biến kháng thuốc HBV.

5.3. Ứng Dụng Thực Tế Của Kỹ Thuật Trong Quản Lý Điều Trị HBV

Kỹ thuật Cold-PCR và Real-time PCR LNA có thể được ứng dụng rộng rãi trong các phòng xét nghiệm lâm sàng để sàng lọc đột biến kháng thuốc HBV. Việc phát hiện sớm các đột biến này giúp bác sĩ lâm sàng đưa ra các quyết định điều trị kịp thời và hiệu quả, chẳng hạn như thay đổi phác đồ điều trị hoặc sử dụng các loại thuốc kháng virus khác. Điều này góp phần cải thiện đáng kể hiệu quả điều trị và giảm thiểu nguy cơ kháng thuốc lan rộng.

VI. Kết Luận Tương Lai Cold PCR Real Time PCR LNA 54

Việc phát triển và ứng dụng kỹ thuật Cold-PCR và Real-time PCR LNA đã mang lại những tiến bộ đáng kể trong lĩnh vực sàng lọc và phát hiện đột biến kháng thuốc HBV. Các kỹ thuật này có độ nhạy cao, thời gian thực hiện nhanh chóng và chi phí hợp lý, phù hợp cho việc triển khai rộng rãi trong các phòng xét nghiệm lâm sàng. Trong tương lai, các nghiên cứu cần tập trung vào việc mở rộng phạm vi phát hiện các đột biến và tối ưu hóa quy trình để nâng cao hơn nữa hiệu quả của các kỹ thuật này.

6.1. Tóm Tắt Những Ưu Điểm Vượt Trội Của Nghiên Cứu

Nghiên cứu đã thành công trong việc phát triển hai kỹ thuật mới, Cold-PCR và Real-time PCR LNA, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong việc phát hiện đột biến kháng thuốc HBV. Các kỹ thuật này có nhiều ưu điểm so với các phương pháp truyền thống, bao gồm: độ nhạy cao hơn, thời gian thực hiện nhanh hơn, chi phí hợp lý hơn. Điều này góp phần nâng cao hiệu quả sàng lọc đột biến kháng thuốc và hỗ trợ bác sĩ lâm sàng đưa ra các quyết định điều trị tốt nhất cho bệnh nhân.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Để Hoàn Thiện Kỹ Thuật

Trong tương lai, các nghiên cứu cần tập trung vào việc mở rộng phạm vi phát hiện các đột biến bằng Cold-PCR và Real-time PCR LNA, bao gồm cả các đột biến mới và hiếm gặp. Ngoài ra, cần tiếp tục tối ưu hóa quy trình thực hiện để giảm thiểu thời gian và chi phí, đồng thời nâng cao độ chính xác của kết quả. Các nghiên cứu về ứng dụng lâm sàng cũng cần được đẩy mạnh để đánh giá hiệu quả thực tế của các kỹ thuật này trong việc quản lý điều trị bệnh viêm gan B.

6.3. Triển Vọng Ứng Dụng Rộng Rãi Trong Y Học Tương Lai

Kỹ thuật Cold-PCR và Real-time PCR LNA có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong y học tương lai, không chỉ trong lĩnh vực sàng lọc đột biến kháng thuốc HBV, mà còn trong việc phát hiện các đột biến liên quan đến các bệnh lý khác, như ung thư và các bệnh di truyền. Việc phát triển các kỹ thuật sàng lọc đột biến nhạy bén và hiệu quả sẽ góp phần nâng cao chất lượng chẩn đoán và điều trị bệnh, mang lại lợi ích to lớn cho sức khỏe cộng đồng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Viêm gan B (HBV) là một trong những bệnh truyền nhiễm phổ biến và nguy hiểm trên toàn cầu, với khoảng 296 triệu người mắc viêm gan B mạn tính và 1,5 triệu ca nhiễm mới mỗi năm theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) năm 2019. Việt Nam nằm trong nhóm các quốc gia có tỷ lệ nhiễm HBV cao, ước tính từ 8-25% dân số, trong đó khoảng 8,4% chuyển thành viêm gan B mạn tính. Việc điều trị viêm gan B chủ yếu dựa vào nhóm thuốc analog nucleot(s)ide (NA) như Lamivudine, Telbivudine, Adefovir, Tenofovir và Entecavir. Tuy nhiên, hiệu quả điều trị giảm dần do sự xuất hiện các đột biến kháng thuốc trong vùng gen mã hóa enzym phiên mã ngược (RTase) của HBV.

Mục tiêu nghiên cứu là phát triển kỹ thuật COLD-PCR và real time PCR sử dụng đầu dò LNA nhằm nâng cao độ nhạy và khả năng sàng lọc nhanh các đột biến kháng thuốc NA của HBV. Nghiên cứu được thực hiện trên 228 mẫu huyết thanh bệnh nhân viêm gan B mạn tính tại Việt Nam, bao gồm 130 bệnh nhân nhi chưa điều trị và 98 bệnh nhân người lớn đã và đang điều trị NA. Ý nghĩa của nghiên cứu là cung cấp công cụ chẩn đoán sớm, hỗ trợ lựa chọn liệu pháp điều trị hiệu quả, góp phần giảm thiểu thất bại điều trị và kháng chéo thuốc.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Cơ chế kháng thuốc nucleot(s)ide của HBV: Đột biến trong gen polymerase, đặc biệt vùng RTase, làm giảm ái lực của thuốc NA với enzym, dẫn đến kháng thuốc. Các đột biến sơ cấp và thứ cấp ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị.
• Phương pháp COLD-PCR (Co-amplification at Lower Denaturation temperature PCR): Biến thể của PCR truyền thống, tận dụng sự khác biệt nhiệt độ biến tính giữa sợi DNA đột biến và kiểu dại để làm giàu các alen đột biến, nâng cao độ nhạy phát hiện.
• Real time PCR sử dụng đầu dò TaqMan LNA (Locked-Nucleic Acid): Tăng cường độ đặc hiệu và độ nhạy nhờ đầu dò LNA có nhiệt độ nóng chảy cao hơn, giúp phân biệt chính xác các đột biến điểm đơn nucleotide.

Các khái niệm chính bao gồm: đột biến kháng thuốc NA, enzym phiên mã ngược HBV polymerase, nhiệt độ biến tính tới hạn (Tc), tỷ lệ phần trăm đột biến/kiểu dại (mt/wt), và giới hạn phát hiện (LoD).

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: 228 mẫu huyết thanh bệnh nhân viêm gan B mạn tính tại các bệnh viện lớn ở Hà Nội, gồm 130 bệnh nhân nhi chưa điều trị và 98 bệnh nhân người lớn đã và đang điều trị NA.
• Thiết kế mồi và đầu dò: Thiết kế 3 cặp mồi PCR nhân bản vùng gen RTase chứa các đột biến kháng thuốc phổ biến, cùng bộ đầu dò TaqMan LNA đặc hiệu cho từng đột biến.
• Phân tích: Thực hiện phản ứng PCR truyền thống, COLD-PCR và real time PCR TaqMan LNA. Xác định nhiệt độ biến tính tới hạn (Tc) bằng real time PCR SYBR Green. Đánh giá độ nhạy, giới hạn phát hiện và so sánh hiệu quả giữa các phương pháp.
• Timeline nghiên cứu: Thu thập mẫu và phân tích trong năm 2022, với các bước tối ưu kỹ thuật, thử nghiệm trên mẫu chuẩn và mẫu bệnh phẩm lâm sàng.
• Phân tích số liệu: Sử dụng phần mềm SPSS 20, đánh giá ý nghĩa thống kê với P < 0,05 và hệ số tương đồng Cohen’s kappa để so sánh kết quả giữa các phương pháp.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Đặc điểm bệnh nhân: Bệnh nhân nhi có tuổi trung bình 64 tháng, 92,3% dương tính HBeAg, chủ yếu genotype B (78,5%). Bệnh nhân người lớn tuổi trung bình 41 tuổi, 67,3% dương tính HBeAg, genotype B chiếm 73,5%. Tải lượng virus dao động từ 5,0 × 10^4 đến 4,6 × 10^8 IU/mL.

2. Nhiệt độ biến tính tới hạn (Tc): Xác định Tc của đoạn gen P2 và P3 lần lượt là 81,9°C và 81,5°C, thấp hơn nhiệt độ biến tính tiêu chuẩn 95°C, phù hợp cho phản ứng COLD-PCR.

3. Độ nhạy của COLD-PCR: Phương pháp COLD-PCR phát hiện được đột biến kháng thuốc ở tỷ lệ 5% mt/wt, cao hơn so với PCR truyền thống chỉ phát hiện được ở 10%. COLD-PCR làm giàu đột biến, tăng độ nhạy và độ chính xác khi giải trình tự Sanger.

4. Tần suất đột biến kháng thuốc NA:

   • Ở bệnh nhân nhi chưa điều trị, 64,6% mang đột biến kháng thuốc NA, phổ biến nhất là rtV207M (40%), rtN238T (8,5%), rtN238A (6,2%). Một số bệnh nhân có đồng thời nhiều đột biến, bao gồm các đột biến cổ điển rtL180M + rtM204V/I.
   • Ở bệnh nhân người lớn đã điều trị, 69,4% mang đột biến kháng thuốc NA, với rtV207M (29,6%), rtN238T (10,2%), rtN238A (8,2%) là phổ biến nhất. Một số bệnh nhân có đồng thời 2 đột biến liên quan kháng thuốc.

5. Hiệu quả real time PCR TaqMan LNA: Phương pháp có độ nhạy phát hiện đột biến thấp nhất 0,1% mt/wt, giới hạn phát hiện DNA là 5 x 10^2 IU/mL, vượt trội so với COLD-PCR. Thời gian xét nghiệm nhanh, phù hợp sàng lọc số lượng lớn mẫu.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy kỹ thuật COLD-PCR và real time PCR TaqMan LNA đều nâng cao đáng kể độ nhạy phát hiện đột biến kháng thuốc NA của HBV so với phương pháp PCR truyền thống. COLD-PCR làm giàu đột biến dựa trên nhiệt độ biến tính tới hạn, giúp phát hiện các đột biến có tỷ lệ thấp trong quần thể virus, phù hợp cho nghiên cứu và xác định phổ đột biến mới. Real time PCR TaqMan LNA với đầu dò LNA tăng cường độ đặc hiệu và độ nhạy, cho phép sàng lọc nhanh các đột biến điểm đơn nucleotide với giới hạn phát hiện rất thấp, thích hợp ứng dụng trong chẩn đoán lâm sàng.

Tần suất đột biến kháng thuốc NA cao ở cả bệnh nhân chưa điều trị và đã điều trị phản ánh sự tồn tại rộng rãi của các biến thể kháng thuốc trong quần thể HBV tại Việt Nam, đồng thời cho thấy nguy cơ thất bại điều trị và kháng chéo thuốc. Các đột biến rtV207M, rtN238T/A là những vị trí không cổ điển nhưng phổ biến, cần được chú ý trong theo dõi và lựa chọn phác đồ điều trị.

So sánh với các nghiên cứu trước đây, độ nhạy của COLD-PCR trong nghiên cứu này (5% mt/wt) tương đương hoặc cao hơn các nghiên cứu trước, đồng thời mở rộng phát hiện đột biến trên nhiều domain của enzym RTase. Real time PCR TaqMan LNA thể hiện ưu thế vượt trội về độ nhạy và thời gian thực hiện, phù hợp cho ứng dụng thực tiễn tại các cơ sở y tế.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh độ nhạy giữa các phương pháp, bảng tần suất đột biến kháng thuốc theo nhóm bệnh nhân, và biểu đồ phân bố các đột biến phổ biến.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Áp dụng kỹ thuật real time PCR TaqMan LNA trong chẩn đoán lâm sàng: Thực hiện sàng lọc nhanh các đột biến kháng thuốc NA ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính, đặc biệt trước và trong quá trình điều trị, nhằm phát hiện sớm xu hướng kháng thuốc, tối ưu hóa phác đồ điều trị. Thời gian thực hiện: trong vòng 6-12 tháng; chủ thể: các phòng xét nghiệm bệnh viện tuyến trung ương và tỉnh.

2. Sử dụng COLD-PCR kết hợp giải trình tự Sanger cho nghiên cứu và giám sát dịch tễ học: Phát hiện phổ đột biến mới, đột biến tiềm năng và đánh giá sự tiến hóa của virus HBV trong quần thể. Thời gian: liên tục hàng năm; chủ thể: các trung tâm nghiên cứu và viện y học.

3. Đào tạo và nâng cao năng lực kỹ thuật cho cán bộ y tế: Tổ chức các khóa đào tạo về kỹ thuật COLD-PCR và real time PCR LNA, đảm bảo chất lượng xét nghiệm và phân tích kết quả chính xác. Thời gian: 6 tháng đầu năm; chủ thể: Bộ Y tế, các trường đại học và bệnh viện.

4. Xây dựng hướng dẫn chuẩn về xét nghiệm đột biến kháng thuốc HBV: Ban hành quy trình chuẩn áp dụng kỹ thuật mới trong chẩn đoán và theo dõi điều trị viêm gan B, giúp đồng bộ và nâng cao hiệu quả quản lý bệnh. Thời gian: 12 tháng; chủ thể: Bộ Y tế phối hợp với các chuyên gia đầu ngành.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Bác sĩ chuyên khoa gan mật và truyền nhiễm: Nắm bắt kỹ thuật mới trong phát hiện đột biến kháng thuốc, hỗ trợ lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp, nâng cao hiệu quả điều trị và giảm nguy cơ kháng thuốc.

2. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành công nghệ sinh học, y học phân tử: Tham khảo phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật PCR cải tiến, ứng dụng trong phát hiện đột biến virus, phục vụ phát triển nghiên cứu khoa học.

3. Cán bộ phòng xét nghiệm y học: Áp dụng kỹ thuật COLD-PCR và real time PCR LNA trong xét nghiệm lâm sàng, nâng cao độ nhạy và độ chính xác, rút ngắn thời gian trả kết quả.

4. Quản lý y tế và hoạch định chính sách: Hiểu rõ tầm quan trọng của phát hiện sớm đột biến kháng thuốc, từ đó xây dựng chính sách điều trị và giám sát dịch tễ hiệu quả, giảm gánh nặng bệnh tật.

Câu hỏi thường gặp

1. COLD-PCR khác gì so với PCR truyền thống?
   COLD-PCR sử dụng nhiệt độ biến tính thấp hơn nhiệt độ tiêu chuẩn, làm giàu các alen đột biến nhờ sự khác biệt nhiệt độ nóng chảy giữa DNA đột biến và kiểu dại, giúp phát hiện đột biến với tỷ lệ thấp hơn (5% so với 10-20% của PCR truyền thống).

2. Tại sao sử dụng đầu dò LNA trong real time PCR?
   Đầu dò LNA có nhiệt độ nóng chảy cao hơn nucleotide thông thường, tăng độ đặc hiệu và giảm nhiễu tín hiệu, giúp phân biệt chính xác các đột biến điểm đơn nucleotide với độ nhạy cao (phát hiện đến 0,1% mt/wt).

3. Phương pháp nào phù hợp cho chẩn đoán lâm sàng?
   Real time PCR TaqMan LNA phù hợp hơn do thời gian thực hiện nhanh, độ nhạy cao và khả năng xử lý nhiều mẫu cùng lúc, trong khi COLD-PCR thích hợp cho nghiên cứu và xác định phổ đột biến.

4. Tần suất đột biến kháng thuốc NA ở bệnh nhân chưa điều trị có cao không?
   Nghiên cứu cho thấy khoảng 64,6% bệnh nhân nhi chưa điều trị đã mang đột biến kháng thuốc NA, cho thấy sự tồn tại rộng rãi của các biến thể kháng thuốc ngay cả trước khi điều trị.

5. Làm thế nào để ứng dụng kết quả nghiên cứu vào điều trị?
   Phát hiện sớm đột biến kháng thuốc giúp bác sĩ lựa chọn thuốc phù hợp, tránh thất bại điều trị và kháng chéo, đồng thời theo dõi hiệu quả điều trị và điều chỉnh phác đồ kịp thời.

Kết luận

• Phát triển thành công kỹ thuật COLD-PCR và real time PCR TaqMan LNA với độ nhạy phát hiện đột biến kháng thuốc NA lần lượt là 5% và 0,1% mt/wt.
• Tần suất đột biến kháng thuốc NA cao ở cả bệnh nhân chưa điều trị và đã điều trị tại Việt Nam, với các đột biến phổ biến như rtV207M, rtN238T/A.
• Kỹ thuật real time PCR TaqMan LNA phù hợp cho sàng lọc nhanh, hỗ trợ chẩn đoán lâm sàng và lựa chọn liệu pháp điều trị hiệu quả.
• COLD-PCR là công cụ hữu ích trong nghiên cứu phổ đột biến và phát hiện đột biến mới, góp phần nâng cao hiểu biết về cơ chế kháng thuốc của HBV.
• Khuyến nghị triển khai kỹ thuật real time PCR TaqMan LNA tại các phòng xét nghiệm lâm sàng và xây dựng hướng dẫn chuẩn xét nghiệm đột biến kháng thuốc HBV trong vòng 12 tháng tới.

Hành động tiếp theo là đào tạo nhân lực, đầu tư trang thiết bị và tích hợp kỹ thuật mới vào quy trình chẩn đoán viêm gan B tại các cơ sở y tế nhằm nâng cao hiệu quả điều trị và kiểm soát dịch bệnh.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Viêm gan B là một căn bệnh truyền nhiễm gây ra bởi virus viêm gan B (HBV). Đây là nguyên nhân hàng đầu dẫn đến sơ gan và ung thư gan. Theo thống kế của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hiện có khoảng 2 tỷ người nhiễm HBV trên toàn thế giới và khoảng 296 triệu người mắc viêm gan B mạn tính. Ước tính năm 2019, mỗi năm có khoảng 1,5 triệu ca mắc mới và các biến chứng của viêm gan virus B là nguyên nhân gây ra 820.000 ca tử vong trên toàn thế giới trong đó chủ yếu là sơ gan và ung thư gan [70].

Việt Nam là nước có tỷ lệ nhiễm HBV cao, ước tính khoảng 8-25% dân số [26]. Điều trị viêm gan B mạn tính, hiện có 2 nhóm thuốc được cấp phép sử dụng để ức chế sự nhân lên của virus và hạn chế tổn thương gan trong lúc cơ thể hình thành miễn dịch với virus là nhóm thuốc dạng tiêm như Pegylated inteferon alfa-2a hoặc Interferon alfa-2b, và nhóm thuốc dạng uống có cấu trúc tương tự nucleot(s)ide (NA), gồm 5 loại: Lamivudine (LMV), Telbivudine (LdT), Adefovir (ADF), Tenofovir (TDF), và Entecavir (ETV) [36]. So sánh giữa 2 nhóm thuốc nói trên, nhóm thuốc dạng tiêm vừa có khả năng ức chế virus vừa bổ trợ miễn dịch, tuy nhiên có tỉ lệ đáp ứng thấp hơn, giá thành cao hơn và có nhiều tác dụng phụ hơn so với nhóm thuốc NA [30]. Nhóm thuốc NA mặc dù có tỉ lệ đáp ứng cao hơn, nhưng lại có hiệu quả giảm dần theo quá trình điều trị do xuất hiện tính kháng thuốc của HBV.

Sự kháng thuốc của HBV phát sinh do một số đột biến trong vùng gen mã hóa enzym phiên mã ngược (RTase, là đích tấn công của thuốc NA) làm giảm ái lực của thuốc NA với enzym RTase. Do đó, việc sử dụng thuốc NA đóng vai trò như tác nhân chọn lọc với các chủng virus có khả năng kháng thuốc, khả năng kháng thuốc của quần thể virus tăng nhanh và tương ứng với thời gian sử dụng thuốc. Những bệnh nhân này nếu không lựa chọn loại thuốc kháng virus phù hợp thì khả năng thất bại điều trị, đồng thời còn có thể kéo theo tình trạng kháng chéo. Bởi vậy, xác định sớm xu hướng kháng thuốc trước và trong quá trình điều trị viêm gan B là một trong những yếu tố quyết định tới hiệu quả của toàn bộ quá trình điều trị.

1 Nhiều kỹ thuật sinh học đã được phát triển để ứng dụng xác định đột biến kháng thuốc ở HBV, phương pháp PCR vùng gen mã hóa enzym RTase HBV kết hợp giải trình tự Sanger được coi là “tiêu chuẩn vàng” trong xác định đột biến kháng thuốc của HBV. Đồng thời, kỹ thuật này cho phép xác định các đột biến mới, các đột biến “tiềm năng” trong quần thể. Tuy nhiên, nhược điểm chính của phương pháp là độ nhạy thấp, khoảng 10 – 20% đột biến/quần thể [36]. Do đó, khả năng ứng dụng trong chẩn đoán sớm không cao.

Phương pháp MALDI-ToF và giải trình tự thế hệ mới (Next Generation Sequencing- NGS có độ nhạy cao, tuy nhiên yêu cầu máy móc và trang thiết bị đắt tiền nên khó áp dụng cho chẩn đoán [36]. Một số nhóm nghiên cứu đã phát triển những phương pháp cải tiến để khắc phục những hạn chế của các phương pháp trên như phương pháp real time PCR Taqman probe có ưu điểm đơn giản và có độ nhạy cao (1-5% đột biến/quần thể) [17,45]. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu này chỉ tập trung vào một vài đột biến kháng thuốc, phổ đột biến còn hạn chế nên chưa bao phủ được những đột biến đang lưu hành hiện nay ở Việt Nam. Do đó, tôi thực hiện đề tài: “Phát triển kỹ thuật COLD-PCR và real time PCR LNA để xác định và sàng lọc nhanh các đột biến kháng thuốc Nucleot(s)ide của Hepatitis virus B” Với những mục tiêu chính như sau: - Phát triển kỹ thuật COLD-PCR có độ nhạy cao để xác định phổ đột biến và các đột biến mới/tiềm năng liên quan đến tính kháng thuốc NA của HBV.

- Phát triển kỹ thuật real time PCR LNA có độ nhạy cao để sàng lọc nhanh, phát hiện sớm các đột biến kháng thuốc NA của HBV, ứng dụng xác định sớm xu hướng kháng thuốc, hỗ trợ bác sĩ lâm sàng lựa chọn liệu pháp điều trị hiệu quả cho bệnh nhân viêm gan B mạn tính. Đại cương về viêm gan B và HBV 1. Viêm gan B Viêm gan B là một bệnh nhiễm trùng phổ biến trên toàn thế giới do HBV gây ra. Nó có thể gây nhiễm trùng mạn tính và có nguy cơ cao dẫn đến tử vong do xơ gan và ung thư gan [70].

Nhiễm trùng mạn tính được đặc trưng bởi sự tồn tại của kháng nguyên HBsAg trong ít nhất 6 tháng (có hoặc không có đồng thời HBeAg). Sự tồn tại dai dẳng của HBsAg là dấu hiệu chính của nguy cơ phát triển bệnh viêm gan mạn tính và ung thư biểu mô tế bào gan về sau. Theo hướng dẫn Bộ Y tế 2014, viêm gan B mạn tính được xác định khi có HBsAg (+) > 6 tháng hoặc HBsAg (+) và Anti HBc IgG (+), AST, ALT tăng từng đợt hoặc liên tục trên 6 tháng, có bằng chứng tổn thương mô bệnh học tiến triển, xơ gan (được xác định bằng sinh thiết gan hoặc đo độ đàn hồi gan hoặc Fibrotest hoặc chỉ số Aspartate aminotransferase-to-Platelet Ratio Index (APRI)) mà không do căn nguyên khác. Virus viêm gan B 1.

Hệ gen virus HBV là virus điển hình thuộc phân họ Hepadnaviridae (nhóm virus tấn công tế bào gan (hepa-) và genome DNA (-dna)). Lớp vỏ ngoài virus được cấu thành bởi lớp phospholipid từ tế bào gan, và các glycoproteins của virus (HBsAg). Sau đó là lớp lõi virus, gồm các proteins lõi (HBcAg). Trong cùng là capsid của HBV, gồm genome virus ở dạng sợi đôi không hoàn chỉnh và protein Polymerase (P protein).

Cấu trúc của lõi (core) của HBV là một DNA mạch đôi không khép kín, với trọng lượng phân tử 2×106 dalton, có kích thước khoảng 3,2 kb, gồm ba khung mã hóa và có bốn khung đọc mở khác nhau (ORF), mã hóa cho polymerase của virus, kháng nguyên HBc và HBe, protein điều hòa HBx và gen mã hóa cho các kháng nguyên bề mặt của virus (LHBs, MHBs và SHBs). Cấu trúc hạt virion (A) và genome của virus HBV (B) [77] Khung đọc mở Surface protein (S) mã hóa cho các protein bề mặt, là các kháng nguyên của HBV và có thể chia theo cấu trúc và chức năng thành các gen pre-S1, pre-S2 và gen S. Gen S: Mã hóa cho protein chính. Gen S và preS2 mã hóa loại protein trung bình (M).

Gen S, preS1 và preS2 mã hóa protein lớn (L) của vỏ ngoài chứa 390 acide amine, tham gia vào việc gắn virus vào tế bào gan, lắp ráp virion và giải phóng virus ra khỏi tế bào. Khung đọc mở Core protein (C): gồm gen C và preC. Gen C mã hóa cho protein lớn của lõi gồm 138 acid amin, có khả năng gắn kết với acid nucleic, tham gia vào quá trình lắp ráp virus. Khung đọc mở X protein (X): là gen có kích thước nhỏ nhất, mã hóa cho hai protein tham gia vào các giai đoạn phiên mã và sao chép trong quá trình nhân đôi của HBV, ngoài ra chúng còn đóng vai trò chủ yếu trong sự phát triển thành ung thư gan.

Khung đọc mở Polymerase protein (P): Gen P chiếm ¾ bộ gen của virus, gối lên phần cuối gen C, phần đầu gen X và toàn bộ gen S. Gen P mã hóa một polypeptide chứa 832 acid amin rất giàu histidine, trọng lượng phân tử khoảng 90 kD, có hoạt tính DNA polymerase và enzym phiên mã ngược (DNA polymerase phụ thuộc RNA). 4 Trong các khung đọc mở của virus HBV, khung đọc mở liên quan trực tiếp tới tính kháng thuốc của virus là khung đọc mở P mã hóa cho enzym HBV polymerase [77]. Khung đọc mở này bao gồm 4 vùng, tương ứng với 4 vùng chức năng của enzym, bao gồm: terminal protein, spacer, POL/RT, và Rnase H.

Vùng POL/RT thực hiện chức năng polymerase và phiên mã ngược, gồm 7 domains: A, B, C, D, E, G (I), và F (II). Cấu trúc vùng gene mã hóa enzym HBV Pol và các đột biến phổ biến tương ứng với loại thuốc kháng [65] 1. Vòng đời và cơ chế lây nhiễm của virus Chu trình xâm nhập và nhân lên của virus tả tóm tắt các bước như sau: 1) Virus nhận biết và bám vào các phân tử HSPG (heparan sulfate proteoglycans) trên thành tế bào gan. Liên kết này có thể bị đảo ngược 2) Virus bám vào tế bào chủ qua một loại thụ thể đặc hiệu với preS1 5 3) Có hai con đường virus xâm nhập vào tế bào: qua nhập bào, sau đó giải phóng nhân khỏi lớp vỏ nhân qua các bóng nội bào; hòa trộn vỏ virus từ màng tế bào 4) Virus giải phóng nhân virus chứa hệ gen đã gắn với polymerase của nó vào tế bào chủ 5) Nhân virus dịch chuyển trên hệ thống vi ống, tìm đến nhân của tế bào chủ và bám vào các lỗ màng nhân (NPC) 6) Nhân virus gỡ bỏ vỏ nhân trên NPC và giải phóng hệ gen rcDNA của chúng vào trong nhân tế bào chủ 7) Sửa chữa thành hệ gen virus hoàn chỉnh: polymerase của virus tiếp tục tổng hợp vùng còn thiếu của sợi dương trên hệ gen virus, polymerase rời khởi phức hợp, cắt bỏ vùng trình RNA-primer dùng cho quá trình tổng hợp sợi đôi.

Virus sử dụng enzym nội bào của tế bào chủ để thực hiện hai quá trình còn lại 8) Hình thành cấu trúc cccDNA. Phân tử cccDNA được tổ chức thành một cấu trúc giống với các sợi chromatin của tế bào chủ. 9) Phiên mã 10) Toàn bộ các mRNA của virus đều chứa một vùng trình tự polyA. Các mRNA này đều được vận chuyển ra tế bào chất bởi các cơ quan của tế bào chủ 11) Dịch mã các protein cấu trúc, polymerase và các protein bỏ của virus 12) Đóng gói vỏ nhân virus 13) Phiên mã ngược trên vùng pregenomic RNA và hoàn thiện hệ gen trưởng thành của virus trong vỏ nhân.

Toàn bộ quá trình hình thành nhân của virus diễn ra trong chất tế bào 14) Nhân virus có thể bám ngược trở lại nhân tế bào để tiếp tục quá trình tạo ra các cccDNA (bước 7 – 13) để tạo thêm các nhân virus mới hoặc được đóng vỏ để giải phóng ra khỏi tế bào chủ. Quá trình đóng vỏ tạo thành hạt virus hoàn chỉnh diễn ra và tận dụng màng lưới nội nhất của tế bào chủ 6 15) Thực nghiệm cho thấy, đa phần các cccDNA trong tế bào bị nhiễm là được tạo mới. Số lượng cccDNA có thể đến 50 cccDNA trên một tế bào, tùy thuộc vào loài. Sơ đồ mô tả chi tiết chu trình lây nhiễm và nhân lên của virus HBV trong tế bào chủ [66] 1.