MỞ ĐẦU Thực phẩm an toàn có vai trò quyết định đối với sức khỏe con ngƣời, tới chất lƣợng cuộc sống hiện tại cũng nhƣ phát triển giống nòi. Việc không đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm (ATVSTP) có thể dẫn đến ngộ độc thực phẩm, nhiễm trùng thực phẩm và bệnh do thực phẩm. Mỗi năm Việt Nam có khoảng 2 triệu ngƣời bị ngộ độc thực phẩm hoặc ngộ độc có liên quan đến thực phẩm, chi phí cho việc giải quyết các vụ ngộ độc ƣớc tính trên 2000 tỷ đồng/năm [2]. Nguyên nhân gây ra ngộ độc thực phẩm thƣờng gặp là do hóa chất, do độc tố, do vi sinh vật …Tuy nhiên nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm là do nhiễm vi khuẩn và chủ yếu tập trung vào các vi khuẩn nhƣ: Salmonella, Shigella, Escherichia coli, Staphylococus aureus, Vibrio cholerae, Clostridium perfringens…[40].
Số lƣợng các ca ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn vẫn ngày càng tăng, không chỉ ở những nƣớc đang phát triển mà cả các nƣớc có nền kinh tế vững mạnh. Để làm giảm nguy cơ ngộ độc thức ăn cần có nhiều biện pháp đồng bộ từ việc trang bị kiến thức cho những ngƣời liên quan trực tiếp đến thực phẩm, chủ động làm sạch môi trƣờng, thực hiện quy trình vệ sinh đề phòng sự ô nhiễm và đặc biệt là cần thƣờng xuyên kiểm tra phát hiện mức độ ô nhiễm vi khuẩn gây bệnh đối với thực phẩm. Có rất nhiều phƣơng pháp khác nhau để kiểm tra, phát hiện sự có mặt của vi khuẩn trên thực phẩm nhƣ phƣơng pháp nuôi cấy truyền thống, phƣơng pháp sử dụng sinh học phân tử hay phƣơng pháp miễn dịch. Phƣơng pháp sử dụng sinh học phân tử cho kết quả nhanh, chính xác nhƣng lại tốn kém, đòi hỏi trang thiết bị và nguyên vật liệu đồng bộ với chi phí cao trong khi phƣơng pháp truyền thống đòi hỏi thời gian và công sức lớn của kỹ thuật viên và vẫn là phƣơng pháp đƣợc dùng phổ biến tại các phòng thí nghiệm ở Việt Nam [72].
Tuy vậy, phƣơng pháp vẫn gặp phải một số khó khăn khi triển khai tại các phòng thí nghiệm nhỏ. Hƣớng nghiên cứu sử dụng lectin trong phát hiện, phân loại vi khuẩn đang đƣợc quan tâm trong thời gian gần đây. Ƣu 9 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com điểm của phƣơng pháp này là cho kết quả nhanh, không đắt tiền, độ lặp lại cao, các nguyên liệu trong thí nghiệm bền và dễ bảo quản [45], đặc biệt là có thể triển khai tại các phòng thí nghiệm phân tích nhỏ. Lectin là một protein không có chức năng xúc tác, không có tính chất miễn dịch nhƣng có khả năng liên kết thuận nghịch, phi hóa trị các carbohydrate mà không làm thay đổi cấu trúc của carbohydrate đƣợc liên kết [55].
Bề mặt của tế bào vi khuẩn có nhiều gốc đƣờng có khả năng tƣơng tác với lectin, mang tính đặc hiệu cao. Do vậy, dựa vào mối tƣơng tác lectin – vi khuẩn có thể nhận biết đƣợc nhóm vi khuẩn nào có liên kết đặc hiệu với lectin, từ đó sử dụng lectin để nhận biết đƣợc nhóm này. Đã có nhiều công bố về việc sử dụng lectin để phát hiện một số vi khuẩn, điển hình nhƣ lectin từ đậu tƣơng (SBA) và ốc sên (HPA) để nhận biết Bacillus anthracis – vi khuẩn gây bệnh than – một vi khuẩn rất khó phân biệt với các chủng Bacillus khác, lectin mầm lúa mỳ (WGA) giúp phát hiện vi khuẩn Neisseria…[41]. Lectin đã trở thành một chất thử tiêu chuẩn dùng trong phân loại vi sinh vật học [110].
Thêm vào đó vì lectin có hoạt độ cao nên tác dụng ở những nồng độ rất loãng, có tính đặc hiệu và có thể sử dụng ở dạng dẫn xuất gắn enzym, vàng, các đồng vị phóng xạ hoặc các chất chuẩn. Nguồn lectin đƣợc sử dụng nghiên cứu trong phân loại vi khuẩn thƣờng có nguồn gốc từ thực vật do có nhiều ƣu điểm nhƣ nồng độ lectin cao, đặc hiệu với nhiều loại đƣờng, dễ tách chiết…[56]. Việt Nam là một nƣớc nhiệt đới với nguồn thực vật phong phú. Đây chính là nguồn cung cấp lectin dồi dào mà chƣa đƣợc khám phá.
Trong nƣớc, các lectin thực vật mới đƣợc tập trung nghiên cứu về các đặc tính, quá trình tinh sạch và ứng dụng trong y học. Hƣớng nghiên cứu ứng dụng lectin trong phát hiện vi sinh vật chỉ đƣợc bắt đầu một vài năm trở lại đây. Kết quả bƣớc đầu cho thấy việc xác định các vi khuẩn gây bệnh bằng lectin có độ đặc hiệu cao, ổn định, cho kết quả nhanh, dễ thực hiện và ít tốn kém [20, 21, 22]. Tuy vậy các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc thăm dò khả năng 10 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com ngƣng kết của lectin đối với một số loài vi khuẩn.
Tại Việt Nam chƣa có công trình nghiên cứu nào thống kê đầy đủ về mối tƣơng tác đặc hiệu của lectin với các loài vi khuẩn gây bệnh, đặc biệt là vi khuẩn gây bệnh qua thực phẩm. Do tiềm năng ứng dụng lớn của lectin, luận án đƣợc tiến hành với những mục tiêu: 1. Phát hiện, nghiên cứu, tuyển chọn đƣợc các nhóm lectin tƣơng tác đặc hiệu với các nhóm vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm phân lập tại Việt Nam. Tinh chế, xác định đƣợc một số tính chất các lectin có biểu hiện tƣơng tác đặc hiệu với vi khuẩn, bƣớc đầu xây dựng quy trình phát hiện vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm bằng phản ứng ngƣng kết với lectin.
Những đóng góp mới của luận án: 1. Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu một cách toàn diện về các nhóm lectin thực vật gây ngƣng kết đặc hiệu với một số vi khuẩn gây bệnh qua đƣờng thực phẩm. Bƣớc đầu xây dựng đƣợc quy trình phát hiện và phân biệt 4 vi khuẩn Eschesrichia coli gây bệnh (EPEC), Shigella flexneri, Staphylococcus aureus và Salmonella bằng lectin. Đã đƣa ra đƣợc quy trình tinh chế tách chiết một số lectin có ngƣng kết đặc hiệu với vi khuẩn Eschesrichia coli gây bệnh (EPEC) và vi khuẩn Salmonella.
11 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TÌNH HÌNH NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 1. Trên Thế giới Theo ƣớc tính của WHO (2008), hàng năm trên Thế giới có khoảng 130 triệu ngƣời mắc bệnh tiêu chảy, trong đó xấp xỉ 70% là do truyền qua đƣờng ăn uống nhƣ ăn phải thực phẩm bị nhiễm bẩn, hóa chất hay vi sinh vât gây bệnh [108]. Cũng theo WHO, hơn 49 nƣớc đang phát triển trung bình có tỷ lệ chết do tiêu chảy ở trẻ em dƣới 5 tuổi là 6,6%, chiếm 36% ca tử vong do mọi nguyên nhân của trẻ em dƣới 5 tuổi. Ở Mỹ, theo thống kê của Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa dịch bệnh (CDC) thì mỗi năm có khoảng 5% dân số bị ngộ độc trong năm, với khoảng 5000 ngƣời chết [40].
Tại Pháp, hàng năm có khoảng 75 vạn ca ngộ độc thực phẩm (1210 ca/10 vạn dân) trong đó 7 vạn ca cấp cứu trong tình trạng nguy kịch, 113 nghìn ca phải nhập viện [80]. Tại Thái Lan, Ân Độ, Philipin có khoảng 100 ngƣời vào viện hằng ngày do nguyên nhân sử dụng thực phẩm không an toàn. Theo thống kê ở Philipin thì tiêu chảy là một trong 10 nguyên nhân gây bệnh chính với tổng số 19. Đặc biệt năm 2011, một biến chủng E.
coli cực độc đã gây tình trạng nhiễm khuẩn thực phẩm bùng phát tại Đức và một số nƣớc châu Âu khác với 16 ngƣời chết và hơn 1.000 ngƣời mắc bệnh, trong đó gần 400 ngƣời có nguy cơ tử vong. Theo Trung tâm Kiểm soát và Ngăn ngừa dịch bệnh châu Âu (ECDC), đã có 9 trƣờng hợp đƣợc thông báo ở Thụy Điển, 4 ngƣời trong số đó có đi du lịch tới phía bắc nƣớc Đức. Vụ dịch này đã gây thiệt hại lớn cho ngành nông nghiệp châu Âu khi ECDC thông báo vi khuẩn bị lây nhiễm qua các thực phẩm nhƣ dƣa chuột, cà chua, giá đỗ… 12 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail. Tại Việt Nam Theo thống kê, mỗi năm Việt Nam có khoảng 250-500 vụ ngộ độc thực phẩm với 3000 - 5000 nạn nhân nhập viện và 30 - 100 ca tử vong [4].
Nhà nƣớc cũng phải dành một kinh phí rất lớn cho việc điều trị, xét nghiệm và điều tra tìm nguyên nhân ngộ độc. Theo cục ATVSTP, năm 2012 số vụ ngộ độc thực phẩm xảy ra trong toàn quốc có giảm nhẹ so với cuối năm 2010 nhƣng số ngƣời chết và nhập viện có chiều hƣớng tăng cao so với năm 2011 (Bảng 1. Số ngƣời mắc tăng so với năm trƣớc là 54,8%, số ngƣời nhập viện tăng 43,5%, số ngƣời tử vong tăng 53,6%. Số ca mắc ngộ độc thực phẩm tập trung cao nhất ở miền Đông Nam Bộ chiếm 51,91%.
Số tử vong do ngộ độc thực phẩm tập trung nhiều ở các vùng núi phía Bắc chiếm 51,81% [4,107].1 Tình hình ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam (nguồn: http://vfa.vn/) Năm 2010 2011 2012 Số vụ ngộ độc 175 148 168 Số ca mắc 5664 4700 5541 Số ca tử vong 51 27 34 Số ca nhập viện 3978 3663 4335 Nguyên nhân hàng đầu trong các vụ ngộ độc thực phẩm là do vi sinh vật. Trong số đó, vi khuẩn chiếm tỉ lệ cao và là nguyên nhân chính gây ra các vụ tiêu chảy hàng loạt (chiếm 33-49%) [2]. Các vi khuẩn gây bệnh thƣờng gặp là Salmonella, Shigella, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Vibrio cholerae… Bệnh thƣờng xảy ra do thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong quá trình chế biến, bảo quản nhƣ thức ăn nấu chƣa kĩ, để lâu ở nhiệt độ thƣờng, thực hiện khâu vệ sinh kém…[23]. Salmonella là nguyên nhân của 70% vụ ngộ độc do vi khuẩn, có trong nhiều loại thực phẩm (đồ nguội, thịt nguội, nghêu sò, gà chƣa nấu chín, sản phẩm từ sữa sống…) nhất là các món ăn chế biến từ trứng tƣơi hoặc còn hơi tƣơi sống [40].
Độc tố từ vi sinh vật cũng là một trong các nguyên nhân chiếm 20-30% các vụ ngộ độc thực phẩm tập thể. 13 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Trong số này, vi khuẩn Staphylococcus aureus hiện diện nhiều trong các món ăn làm bằng tay (bánh ngọt), vi khuẩn Clostridium perfringens hay phát sinh trong các món đƣợc nấu, nƣớng và hâm nóng. Ngoài ra, ngộ độc thực phẩm còn có nguyên nhân là do thực phẩm bị ô nhiễm hóa chất (chiếm11-27%) nhƣ cyanua, asen, các kim loại nặng, benladol, hóa chất bảo quản thực phẩm, hóa chất bảo vệ thực vật. 27% số vụ ngộ độc là do ăn phải thực phẩm còn tồn đọng hóa chất hay bị đầu độc qua nƣớc, thức ăn, không khí… 1.