MỞ ĐẦU Theo ước tính, trên trái đất có khoảng 5,5 triệu loài côn trùng [1]. Tuy nhiên, cho đến nay, chỉ khoảng 20% các loài côn trùng đã được các nhà khoa học trên thế giới mô tả [1]. Điều này chỉ ra rằng, việc phân loại và mô tả theo các phương pháp truyền thống gặp phải rất nhiều khó khăn, thiếu chuyên gia, thời gian phân loại mẫu lâu dài. Điều này càng thúc đẩy việc hiện nay phải phát triển mạng lưới phân loại học toàn cầu để đồng bộ dữ liệu hình thái, sinh thái, phân bố… với dữ liệu sinh học phân tử của loài.
Ứng dụng thành tựu của sinh học phân tử, phân loại học cũng đề xướng một phương pháp phân loại mới: Xác định các loài dựa trên đặc điểm trình tự ADN nucleotide của một đoạn gen đặc trưng. Trong đó, ở động vật phổ biến nhất là gen Cytochrome oxidase I (COI) được coi như dấu hiệu đặc trưng cho loài (có thể coi như “dấu vân tay” của loài) [31]. Đây là vùng gen liên quan đến quá trình trao đổi chất của tất cả các loài sinh vật, nhưng nó lại có trình tự ADN biến đổi đặc trưng ở mỗi loài khác nhau. Bằng phương pháp này, việc xác định các loài trở nên nhanh, chính xác và ít tốn kém hơn phương pháp hình thái.
Việt Nam là điểm nóng về đa dạng sinh học vì vậy vẫn còn rất nhiều loài côn trùng chưa được phát hiện và nghiên cứu. Trên khắp vùng lãnh thổ của Việt Nam từ trên cạn đến nước nội địa ra tới vùng biển, đảo các kiểu hệ sinh thái tự nhiên rất đa dạng. Do có tính chất đặc thù về hệ sinh thái nên khu hệ động, thực vật Việt Nam chứa đựng nhiều loài đặc hữu. Mặc dù vậy cho đến nay ở Việt Nam các số liệu, các thông tin về các loài đặc hữu, nhất là các loài côn trùng đặc hữu chỉ xuất hiện trong các công bố riêng lẻ, tản mạn, chưa có nghiên cứu nào đánh giá tổng thể về các loài đặc hữu.
Mặt khác, các thông tin trước đây về phân loại về các loài côn trùng đặc hữu chủ yếu dựa vào các chỉ tiêu hình thái và sinh thái, có rất ít hoặc hoàn toàn không có các thông tin về các chỉ thị phân tử và đặc biệt là mã vạch ADN. Trong xu thế phát triển mạng lưới phân loại học toàn cầu hiện nay các thông tin về phân loại học, từ hình thái đến sinh học phân tử, phân bố,…là rất cần thiết. Đặc biệt các yếu tố loài đặc hữu sẽ khẳng định tính đa dạng sinh học của quốc gia, bên cạnh đó loài đặc hữu có thể góp phần trong việc khẳng định chủ quyền quốc gia. Trên cơ sở kết 6 quả của nghiên cứu dữ liệu về các loài côn trùng đặc hữu sẽ là mô hình mở rộng phạm vi đối với nhiều nhóm sinh vật khác để góp phần xây dựng được bộ cơ sở dữ liệu về toàn bộ nguồn tài nguyên đa dạng sinh học của Việt Nam.
Do vậy, cần phải có các công trình nghiên cứu về chỉ thị sinh học phân tử của các loài côn trùng đặc hữu của Việt Nam. Bộ Cánh màng (Hymenoptera) là một trong những bộ côn trùng lớn nhất tham gia vào hầu hết các hệ sinh thái trên cạn, và có tầm quan trọng sinh thái lớn. Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có nghiên cứu về chỉ thị gen COI cho các loài côn trùng đặc hữu thuộc bộ Cánh màng. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Phân tích trình tự đoạn gen COI ở một số loài côn trùng đặc hữu Việt Nam định hướng xây dựng cơ sở dữ liệu mã vạch ADN”.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành phân tích mẫu vật của một số loài côn trùng đặc hữu của Việt nam được phân loại hình thái thuộc bộ Cánh màng (Hymenoptera) với các nội dung sau: - Thu thập 21 mẫu côn trùng đặc hữu thuộc bộ Hymenoptera ở Việt Nam được thu ngoài thực địa hoặc đã được lưu trữ tại các Viện, Bảo tàng của Việt Nam. - Tách chiết và lưu trữ ADN tổng số của 21 mẫu côn trùng đặc hữu thuộc bộ Hymenoptera ở Việt Nam - Thiết kế khoảng 3-4 cặp mồi nhân đoạn gen COI cho các mẫu côn trùng thuộc bộ Hymenoptera. - Phân tích trình tự gen, xây dựng và đánh giá cây phát sinh chủng loại của 21 mẫu côn trùng thuộc bộ Hymenopreta. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.
Phân loại học 1. Giới thiệu về phân loại học Phân loại học là quá trình các nhà khoa học nhóm các sinh vật sống dựa trên mức độ giống nhau của chúng nhằm phản ánh sự liên quan tiến hóa của các sinh vật và các nhóm sinh vật. Phân loại học động vật gắn liền với lịch sử phát triển của toàn bộ tri thức về động vật của con người, xuất phát từ nhu cầu phân loại và nhận biết động vật để sử dụng trong đời sống. Trong lịch sử, sự giống nhau được xác định bằng cách kiểm tra các đặc điểm vật lý, hóa học.
Theo truyền thống những đặc điểm này có thể quan sát bằng hình thái nhưng với sự ra đời và phát triển của giải trình tự gen, trình tự ADN và các dấu hiệu phân tử cũng được sử dụng để phân loại, định danh các loài. Hình 1: Phân loại các loài Kiến [10] 8 Nhiệm vụ cơ bản của phân loại học là phát hiện, mô tả, đặt tên và sắp xếp sinh vật thành hệ thống phân loại, giúp chúng ta nắm được một cách hệ thống các đặc điểm của sinh vật trong khối lượng rất lớn các sinh vật [3]. Cũng nhờ hệ thống phân loại, chúng ta có thể dự đoán được vị trí của sinh vật trong hệ thống phân loại, giúp nghiên cứu và tìm hiểu được con đường tiến hóa của từng nhóm sinh vật. Một ý nghĩa thực tiễn quan trọng khác là nhờ có hệ thống phân loại với hệ thống danh pháp khoa học đặt cho sinh vật đã giúp tránh được nhầm lẫn vì nhiều sinh vật mang tên dân gian, được gọi tên khác nhau ở các vùng khác nhau.
Phân loại học truyền thống và phân loại học hiện đại Phân loại học hình thái là phương pháp phân loại học truyền thống dựa trên sự tương đồng rõ ràng nhất giữa các loài và đã được đưa ra từ rất lâu trước khi ý tưởng về sự tiến hóa xuất hiện. Phân loại học này chủ yếu dựa trên sự khác biệt đặc điểm hình thái các cơ quan, bộ phận, mô của loài. Phương pháp phân loại học hình thái có lịch sử lâu đời và nhờ vào phương pháp này mà hệ thống phân loại động vật được hoàn thiện khá đầy đủ. Ưu điểm của nó là có thể phân biệt các loài dựa trên sự quan sát các đặc điểm bên ngoài, dễ ứng dụng và thân thiện với nhiều đối tượng.
Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là sẽ gặp khó khăn khi phân loại các mẫu đang trong giai đoạn phát triển hoặc có các đặc điểm hình thái giống nhau do cùng sinh trưởng và phát triển trong cùng một điều kiện môi trường địa lý hay có nhiều điểm tương đồng do ở mức độ phân loại thấp như loài và dưới loài. Không chỉ vậy, phương pháp này thường được sử dụng bởi các chuyên gia hình thái và cần một khoảng thời gian tương đối dài và tốn nhiều công sức. Dù còn tồn tại nhiều nhược điểm nhưng không thể phủ nhận tầm quan trọng của phân loại học hình thái trong lĩnh vực phân loại học hiện nay [10]. 9 Muỗi vằn (Aedes) Muỗi Anophel Muỗi Culex Đặc điểm: Đặc điểm: Đặc điểm: Chân trắng, vòi đen và Chân dài bằng chiều Chiều dài cơ thể từ 4 những xúc tu có đầu dài vòi, thân gầy.
đến 10mm, có màu trắng, lưng giữa có Cánh có những vệt đen nâu sậm tối. những vệt trắng như trắng và chúng thường Hai cánh trước của hình đàn lia với 2 sọc đậu ở góc 45 độ so với muỗi nằm ngang trên ở giữa, nổi lên trên mặt nước. vùng bụng khi ở trạng những vệt đen. Trứng muỗi Anophel thái nghỉ.
Cánh của chúng cũng dài khoảng 1mm và Trứng của muỗi Culex có màu đen. có phao ở hai bên. màu nâu, dài và có Trứng muỗi vằn có Sau 2 đến 3 ngày, hình trụ, nằm thẳng màu đen và hình dạng trứng nở thành ấu đứng so với mặt nước như bóng bầu dục, ấu trùng nằm song song và kết thành bè gồm có trùng loài muỗi này với mặt nước. nằm ở góc 45 độ so với mặt nước.
Hình 2: Phân loại các loài Muỗi phổ biến dựa vào đặc điểm hình thái [2] Để khắc phục những nhược điểm của phương pháp phân loại học truyền thống, hiện nay các nhà khoa học đã xây dựng nhiều phương pháp phân loại học mới, trong đó đặc biệt là phân loại học phân tử. Với sự phát triển của sinh học phân tử vào những năm 1990 cùng với thành công của việc giải trình tự hệ gen, phân loại học phân tử được hình thành. Phương pháp phân loại này dựa trên việc phân tích các dữ liệu về gen (ADN) trong hoặc ngoài nhân hoặc cả hệ gen hay các sản phẩm của chúng như protein, enzyme từ đó 10 giúp định danh và xây dựng mối quan hệ tiến hóa và di truyền giữa các loài [13]. Tùy vào mục đích nghiên cứu, có thể lựa chọn một trong các công cụ ADN hay protein.
Các kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng gồm: giải trình tự ADN, đa hình các đoạn ADN nhân bản ngẫu nhiên (Random Amplified Polymorphic DNA) đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism) hay kỹ thuật nghiên cứu đa hình (isozyme),… Các kỹ thuật này đã được ứng dụng thành công trong việc phân loại, định danh và xác định mối quan hệ tiến hóa của nhiều loài sinh vật và ngày càng cho thấy những lợi ích thiết thực [11]. So với phân loại học truyền thống thì phương pháp này giúp quá trình xác định các loài trở nên nhanh, chính xác và ít tốn kém hơn. Mục tiêu chính của phân loại học phân tử là: (i) Xác định mối quan hệ phân cấp giữa các loài hiện có theo mối quan hệ tiến hóa của chúng. Các sinh vật có cùng một tổ tiên chung tập hợp lại thành nhóm gần gũi hơn so với những sinh vật có tổ tiên chung xa.
(ii) Ước tính thời gian phân kỳ giữa các loài, tức là thời gian tồn tại của tổ tiên chung gần nhất. Chỉ thị phân tử trong phân loại học 1. Tổng quan về mã vạch ADN Mã vạch ADN là phương pháp xác định nhanh các loài sinh vật dựa trên sự đa dạng về trình tự nucleotit của các vùng gen ngắn, được chuẩn hóa [5-7].