MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, người tiêu dùng ngày càng có xu hướng sử dụng dược liệu tự nhiên thay cho các thuốc hóa dược. Đinh lăng (thuộc loài Polyscias fruticosa (L.) Harms) là một trong số các loại được sử dụng phổ biến. Các nghiên cứu trước đây [20, 22, 32] cho thấy các hoạt chất chiết xuất từ rễ và lá Polyscias fruticosa (L.) Harms chứa hàm lượng saponin cao nhất, đặc biệt là hợp chất saponin có trong chiết xuất methanol của lá Polyscias fruticosa (L.) Harms có thể ức chế hoạt động chống lại α-amylase và α-glucosid, có tác dụng trong việc điều trị bệnh tiểu đường. Các saponin đa phần xuất hiện với phần aglycon là oleanolic acid có đặc tính dược học quan trọng không những có tác dụng bảo vệ gan khỏi tổn thương do hóa chất mà còn bảo vệ gan khỏi xơ gan do các bệnh mãn tính gây ra [20].
Nghiên cứu trước đây [30] cũng chỉ ra rằng, quercitrin nhóm flavonoid trong Polyscias fruticosa (L.) Harms có tác dụng chống viêm và chống oxi hóa. Vì vậy, việc nghiên cứu xác định các hoạt chất oleanolic acid và quercitrin là cần thiết để làm cơ sở ứng dụng dược liệu đinh lăng trở thành sản phẩm hỗ trợ điều trị các bệnh về gan, thận cho bệnh nhân nói chung và cho các đối tượng dùng thuốc hóa trị nói riêng. Để phân tích hai hợp chất này, các phương pháp phân tích thường được sử dụng là sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với detector quang (DAD, PDA) [4, 33], quang phổ hồng ngoại (FTIR) [39]. Trong đó phương pháp HPLC được sử dụng phổ biến và cho hiệu quả cao đối với việc phân tích các hoạt chất trong các loại thực vật nói chung và dược liệu đinh lăng nói riêng.
Do đó, đề tài "Phân tích một số thành phần hóa học chính trong dược liệu Đinh lăng bằng phương pháp HPLC" đã được thực hiện với mục tiêu thẩm định và áp dụng phương pháp HPLC/DAD nhằm phân tích hai thành phần chính là oleanolic acid và quercitrin trong dược liệu đinh lăng. Tổng quan về đinh lăng 1. Cây đinh lăng Đinh lăng có tên khoa học là Polyscias được đặt tên đầu tiên từ hơn hai thế kỷ trước bởi Forster J. (1775), nhiều năm sau đó tiếp tục được các nhà phân loại thực vật nghiên cứu trên thế giới như Baker (1877), Viguier (1905), Smith & Stone (1965), Hutchinson (1967), Bernardi (1971), Frodin & Govaerts (2003), Plunkett & Lowry (2010) [38] mở rộng và thu hẹp các loài thuộc chi Polyscias và kết quả được sự đồng thuận cao của các nhà thực vật học hoàn thiện đi đến thống nhất.
Hệ thống phân loại thực vật có hoa của Takhtajan A. [41], loài Polyscias fruticosa (L.) Harms có vị trí phân loại sau: - Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) - Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) - Bộ Hoa tán (Apiales) - Họ Nhân sâm (Araliaceae) - Chi đinh lăng (Polyscias) Ở Việt Nam có 8 loài thuộc chi Polyscias theo Phạm Hoàng Hộ [41]. Đa số các loài thuộc chi Polyscias được làm cây cảnh, chỉ có một số loài được nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học để sử dụng làm thuốc, trong đó loài Polyscias fruticosa (L). Harms được sử dụng phổ biến nhất.1 thể hiện thông tin về 8 loài thuộc chi Polyscias.
Các loài thuộc chi Polyscias ở Việt Nam STT Tên khoa học các loài Polyscias ở Việt Nam Tên Việt Nam Đinh lăng lá xẻ/Đinh lăng 1 Polyscias fruticosa (L.) Harms lá nhỏ 2 Polyscias scutellaria (Burm.) Fosberg Đinh lăng lá đĩa Polyscias filicifolia (C. 3 Đinh lăng đuôi phụng H. Bailey 4 Polyscias balfouriana (André) L. Bailey Đinh lăng lá tròn 5 Polyscias guilfoylei (W.
Bailey Đinh lăng lá trổ 6 Polyscias grandifolia Volkens Đinh lăng lá to 7 Polyscias sambucifolia (Sieber ex DC.) Harms Đinh lăng lá cơm cháy 8 Polyscias serrata Balf. Đinh lăng lá răng 1. Thành phần hóa học chính của Polyscias fruticosa (L.) Harms Các saponin đa phần xuất hiện với phần aglycon là OA có đặc tính dược học quan trọng là bảo vệ gan khỏi tổn thương do hóa chất mà còn bảo vệ gan khỏi xơ gan do các bệnh mãn tính gây ra [20]. Các nghiên cứu trước đây cho thấy quercitrin nhóm flavonoid trong Polyscias fruticosa (L.) Harms cũng có vai trò dược học [16].
Đây là những hợp chất chuyển hóa thứ cấp rất điển hình có tác dụng chống oxi hóa trong thực vật. - Thành phần saponin triterpenoid: Các saponin đa phần xuất hiện với phần aglycon là OA với phần đường thường được gắn vào vị trí C3 và C28 của aglycon.1 trình bày về công thức tổng quát của Saponin triterpenoid [11]: 3 Hình 1. Công thức tổng quát của Saponin triterpenoid 1.3 GlcA; R2 = Glc Saponin C Glc A = β-D-glucuronopyranosyl Glc = β-D-glucopyranosyl [11]. Oleanolic acid [25]: • Công thức tổng quát và cấu trúc hóa học của OA OA có công thức tổng quát là C30H48O3.2 thể hiện cấu trúc hóa học của OA theo José M Castellano, Sara Ramos-Romero và Javier S Perona [25]: Hình 1.
Cấu trúc hóa học của Oleanolic acid 4 • Tính chất hóa học và vật lý Khối lượng phân tử của OA được xác định là 456,7 g/mol. OA là hợp chất kỵ nước, thực tế là không tan trong nước (1,748 µg/L). Thông thường OA được chiết xuất từ thực vật bằng các dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, 1-butanol, etyl axetat, dietyl ete hoặc axeton [25]. Nhiệt độ sôi của OA là 309oC.
Nhiệt độ nóng chảy trong khoảng từ 553-554oC ở 760 mmHg [25]. - Thành phần Flavonoid: Đa số hợp chất flavonoid trong chi Polyscias đều có khung flavonol. Các flavonol này thường tạo glycosid với rhamnose gắn vào aglycon tại C3. Saito et al.
(1990) đã phát hiện ra 2 hợp chất flavonoid có trong lá P. fruticosa là kaempferol 3- O-α-L-rhamnopyranoside và quercitrin 3-O-α-L-rhamnopyranoside.3 thể hiện cấu trúc đơn giản của flavonoid [30]: Hình 1. Cấu trúc đơn giản của flavonoid Quercitrin (Quercetin 3-O-α-L-rhamnosid): Quercitrin có công thức tổng quát là C21H20O11.4 thể hiện cấu trúc hóa học của quercitrin [4, 43]: 5 Hình 1. Công thức cấu tạo của quercetin-3-O-α-rhamnopyranoside • Tính chất hóa học và vật lý Khối lượng phân tử của quercitrin 448,4 g/mol.
Quercitrin tan được trong một số dung môi hữu cơ như: dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, ethanol [23]. Nhiệt độ sôi là 813,97oC và 760 mmHg, nhiệt độ nóng chảy là 250-252oC [23]. Tác dụng dược học của Polyscias fruticosa (L.) Harms Tác dụng dược học của OA: Polyscias fruticosa (L.) Harms là một loài thực vật thuộc họ Araliaceae và được sử dụng như một cây thuốc có nhiều công dụng trong việc chữa bệnh như tăng cường hệ thống miễn dịch của cơ thể, cải thiện khả năng sinh sản của nam giới, chống mệt mỏi, giải độc.Trong y học dân gian Việt Nam, lá đinh lăng còn được sử dụng để hỗ trợ điều trị các bệnh như Parkinson, Alzheimer.Ngoài ra, một số nghiên cứu gần đây 6 chỉ ra rằng P.fruticosa có tác dụng khác như chống trầm cảm, giảm căng thẳng, cải thiện trí nhớ, hạ đường huyết, bảo vệ gan, hạ lipid trong máu, kháng nấm và kháng khuẩn [32]. Các nghiên cứu trước đây đã báo cáo rằng chất chiết xuất từ rễ và lá P.fruticosa chứa hàm lượng saponin cao nhất, đặc biệt là hợp chất saponin có trong chiết xuất methanol của lá P.fruticosa có tác dụng ức chế hoạt động chống lại α-amylase và α- glucosid, có tác dụng trong việc điều trị bệnh tiểu đường.
Ngoài ra thành phần chính của chiết xuất rễ cây P.fruticosa được gọi là saponin là glycoside tự nhiên với sự biến đổi cấu trúc đáng kể, được công nhận như một tác nhân chống ung thư tự nhiên [22]. Các saponin đa phần xuất hiện với phần aglycon là oleanolic acid và một trong những đặc tính dược học quan trọng của oleanolic acid không những có tác dụng bảo vệ gan khỏi tổn thương do hóa chất mà còn bảo vệ gan khỏi xơ gan do các bệnh mãn tính gây ra. Con đường tổng hợp OA từ BAS = b-amyrin synthase, CAS = cycloartenol synthase, IPP = isopentenyl pyrophosphate được thể hiện ở hình 1. Con đường tổng hợp oleanolic acid Tác dụng dược học của Quercitrin: Các nghiên cứu trước đây cho thấy quercitrin trong Polyscias fruticosa (L.) Harms cũng có vai trò dược học [30].
Đây là những hợp chất chuyển hóa thứ cấp rất điển hình có tác dụng chống oxi hóa trong thực vật.6 thể hiện sơ đồ chuyển hóa của quercitrin. 7 Enzyme quercitrinase là xúc tác cho quá trình phản ứng hóa học sau: quercitrin + H2O ⇄ L-rhamnose + quercetin [16] + H2 O ⇄ Hình 1. Sơ đồ chuyển hóa của quercitrin Do đó, hai cơ chất của enzyme này là quercitrin và H2O, trong khi hai sản phẩm của nó là L-rhamnose và quercetin. Enzyme này thuộc họ hydrolases, cụ thể là những glycosidases thủy phân các hợp chất O- và S-glycosyl.
Tên hệ thống của lớp enzyme này là quercitrin 3-L-rhamnohydrolase. Enzyme này có thể được tìm thấy trong Aspergillus flavus. Nó là một enzym trong con đường dị hóa rutin [16]. Phương pháp xác định OA và quercitrin trong dược liệu đinh lăng Hiện nay, nhiều phương pháp xác định OA và quercitrin trong mẫu dược liệu đinh lăng lá nhỏ.
Các kỹ thuật phân tích chủ yếu được sử dụng là HPLC/DAD; HPLC/PDA; HPLC/SPD [2, 9, 33]. Phương pháp xử lý mẫu Phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm (UAE) kết hợp phương pháp chiết hồi lưu: • Phương pháp UAE: Nguyên tắc, cơ chế hoạt động của phương pháp UAE: dưới tác dụng của siêu âm dung môi tại các hốc nhỏ/dược liệu bị sủi bọt, đẩy chất cần chiết ra khỏi dược liệu, chất tan vào trong dung môi (chiết xuất) [44]. • Phương pháp chiết hồi lưu: Phương pháp chiết hồi lưu là một quá trình chiết xuất rắn-lỏng ở nhiệt độ không đổi với quá trình bay hơi và ngưng tụ dung môi lặp lại trong một khoảng thời gian cụ 8 thể mà không làm thất thoát dung môi. Hệ thống này được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp dược liệu vì nó hiệu quả, dễ vận hành và tiết kiệm chi phí [41].
• Phương pháp chiết lỏng-lỏng: Chiết lỏng-lỏng (LLE), còn được gọi là chiết dung môi, là một kỹ thuật phổ biến được sử dụng để chiết và tinh chế chất phân tích. Đây là một trong những phương pháp chiết xuất lâu đời nhất nhưng vẫn được sử dụng thường xuyên nhất. Phương pháp chiết này dựa trên hai dung môi không thể trộn lẫn là dung môi chứa chất phân tích và dung môi hữu cơ. Dung môi chứa chất phân tích được đặt trong phễu và thêm dung môi không trộn lẫn vào, tạo thành hai lớp được lắc với nhau.
Sau đó, chất phân tích di chuyển từ dung môi ban đầu sang dung môi thứ hai dựa trên độ hòa tan tương đối của chúng trong dung môi. Tuy nhiên, phương pháp này sử dụng một lượng lớn dung môi hữu cơ (như dichloromethane, chloroform), một quá trình tốn nhiều công sức, dung môi hóa chất và thời gian chiết lâu hơn [34].