Luận án tiến sĩ phân lập tuyển chọn nhận diện vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ cây mía saccharum spp l trồng trên đất xám tỉnh tây ninh

Luận án tiến sĩ nghiên cứu phân lập, tuyển chọn và nhận diện vi khuẩn nội sinh, vi khuẩn vùng rễ cây mía trồng trên đất xám tỉnh Tây Ninh.

• Tác giả: Hoàng Minh Tâm
• Người hướng dẫn: GS. Cao Ngọc Điệp
• Trường học: Đại học Cần Thơ
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Phân lập, tuyển chọn, nhận diện vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ cây mía (Saccharum spp L.) trồng trên đất xám tỉnh Tây Ninh
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Cần Thơ

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• 1. CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
• 1.1. Mục tiêu và phạm vi nghiên cứu
• 1.1.1. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.1.2. Phạm vi nghiên cứu
• 1.2. Nội dung nghiên cứu
• 1.3. Ý nghĩa nghiên cứu
• 1.4. Thời gian thực hiện và địa điểm nghiên cứu
• 1.5. Các điểm mới của nghiên cứu
• 2. CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
• 2.1. Hiện trạng sản xuất mía đường của tỉnh Tây Ninh
• 2.1.1. Đặc điểm khí hậu, đất đai của tỉnh Tây Ninh
• 2.1.2. Đặc điểm vùng mía đường Tây Ninh
• 2.1.3. Các vấn đề về môi trường và sức khoẻ phát sinh từ việc trồng mía
• 2.1.3.1. Đối với thuốc trừ sâu và thuốc diệt cỏ
• 2.1.3.2. Đối với phân bón hoá học
• 2.2. Đa dạng các vi khuẩn có khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật liên kết với cây mía
• 2.2.1. Các khái niệm vi khuẩn vùng rễ, vi khuẩn nội sinh, vi khuẩn liên kết thực vật và vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật
• 2.2.2. Các vi khuẩn có khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật liên kết với cây mía
• 2.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng các vi khuẩn liên kết cây mía trồng trên đất xám
• 2.3.1. Tình hình nghiên cứu về các đặc tính của vi khuẩn liên kết cây mía trồng trên đất xám
• 2.3.2. Tình hình nghiên cứu về hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các vi khuẩn liên kết trên cây mía
• 2.4. Các phương pháp thường được sử dụng trong nghiên cứu phân lập, đặc tính hoá và nhận diện vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ cây mía
• 2.4.1. Xử lý mẫu để phân lập vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh thực vật
• 2.4.2. Xác định khả năng cố định đạm của vi khuẩn
• 2.4.3. Xác định khả năng hoà tan lân của vi khuẩn
• 2.4.4. Xác định khả năng sinh tổng hợp IAA của vi khuẩn
• 2.4.5. Xác định khả năng sản xuất siderophore của vi khuẩn
• 2.4.6. Định danh vi khuẩn liên kết cây mía dựa trên trình tự gene 16S rRNA
• 2.5. Nuôi cấy mô thực vật và một số kết quả trong vi nhân giống mía
• 2.5.1. Một số nguyên lý và vai trò của nuôi cấy mô thực vật
• 2.5.2. Quy trình và một số kết quả trong vi nhân giống mía
• 3. CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Vật liệu và dụng cụ thí nghiệm
• 3.1.1. Mẫu đất và cây mía trong thí nghiệm phân lập và khảo sát đặc tính vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật
• 3.1.2. Các giống mía dùng trong thử nghiệm hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật in vivo của vi khuẩn
• 3.1.3. Đất trồng mía dùng trong thử nghiệm hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật ở quy mô trong chậu và ngoài đồng
• 3.1.4. Phân bón hoá học dùng trong thử nghiệm hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật ở quy mô trong chậu và ngoài đồng
• 3.1.5. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
• 3.2. Phương pháp nghiên cứu
• 3.2.1. Thu thập và xử lý mẫu đất và cây mía
• 3.2.2. Phân tích một số chỉ tiêu dinh dưỡng của đất
• 3.2.3. Xác định mật số vi khuẩn cố định đạm, hoà tan lân trong đất vùng rễ cây mía và sự tương quan với các chỉ tiêu dinh dưỡng đất
• 3.2.4. Phân lập và bảo quản các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và hòa tan lân từ đất vùng rễ cây mía
• 3.2.5. Phân lập và bảo quản các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và hòa tan lân nội sinh trong cây mía
• 3.2.6. Mô tả hình thái khuẩn lạc và đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn thu được
• 3.2.7. Định lượng khả năng cố định đạm, hòa tan lân và sản xuất IAA in vitro của các dòng vi khuẩn thu được
• 3.2.8. Định tính khả năng sản xuất siderophore của một số dòng vi khuẩn
• 3.2.9. Định danh một số dòng vi khuẩn có đặc tính tốt bằng phương pháp sinh học phân tử
• 3.2.10. Đánh giá khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh trên cây mía con trồng trong điều kiện nhà lưới
• 3.2.11. Đánh giá khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh trên cây mía trồng trong chậu và ngoài đồng
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Đặc tính dinh dưỡng của đất trồng mía tại tỉnh Tây Ninh và sự tương quan với mật số vi khuẩn cố định đạm, hoà tan lân trong đất
• 4.2. Nguồn gốc và đặc tính phân lập của các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây mía trồng tại tỉnh Tây Ninh
• 4.3. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây mía trồng tại tỉnh Tây Ninh
• 4.4. Kết quả định lượng khả năng cố định đạm, hoà tan lân và sản xuất IAA in vitro của các vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây mía trồng ở tỉnh Tây Ninh
• 4.5. Kết quả định tính khả năng sinh siderophore của các vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây mía trồng ở tỉnh Tây Ninh
• 4.6. Kết quả định danh các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và nội sinh cây mía đã tuyển chọn
• 4.6.1. Kết quả định danh các dòng vi khuẩn đất vùng rễ
• 4.6.2. Kết quả định danh các dòng vi khuẩn nội sinh
• 4.6.3. Nhận xét chung về kết quả định danh các dòng vi khuẩn liên kết cây mía và sự chọn lọc dòng cho các thí nghiệm in vivo
• 4.7. Kết quả đánh giá hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh trên cây mía nuôi cấy mô trồng trong điều kiện nhà lưới
• 4.7.1. Kết quả nuôi cấy mô cây mía
• 4.7.2. Khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh trên cây mía nuôi cấy mô trồng trong điều kiện nhà lưới
• 4.8. Khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh tuyển chọn trên cây mía trồng trong chậu
• 4.9. Khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh tuyển chọn trên cây mía trồng ngoài đồng
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu

Luận án tập trung vào việc phân lập và nhận diện các vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ cây mía (Saccharum spp) trồng trên đất xám Tây Ninh. Mục tiêu chính là tìm ra các chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA và sản xuất siderophore, nhằm thúc đẩy tăng trưởng và năng suất cây mía. Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc giảm thiểu sử dụng phân bón hóa học, bảo vệ môi trường và sức khỏe con người.

1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của luận án là phân lập và nhận diện các vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ cây mía có khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA và sản xuất siderophore. Các chủng vi khuẩn này được kỳ vọng sẽ thúc đẩy tăng trưởng và năng suất cây mía, đồng thời giảm thiểu sự phụ thuộc vào phân bón hóa học.

1.2. Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện trên cây mía (Saccharum spp) trồng trên đất xám Tây Ninh, một vùng đất có đặc điểm khí hậu và thổ nhưỡng đặc trưng. Các mẫu vi khuẩn được thu thập từ vùng rễ và nội sinh của cây mía, sau đó được phân lập và đánh giá các đặc tính sinh học.

II. Phương pháp nghiên cứu

Luận án sử dụng các phương pháp phân lập vi khuẩn trên môi trường Burk, LGI và NBRIP. Các chủng vi khuẩn được đánh giá khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA và sản xuất siderophore thông qua phương pháp so màu. Định danh vi khuẩn dựa trên trình tự gene 16S rRNA bằng phương pháp sinh học phân tử và công cụ tin sinh học.

2.1. Phân lập vi khuẩn

Các mẫu vi khuẩn được thu thập từ vùng rễ cây mía và nội sinh, sau đó được phân lập trên các môi trường chuyên biệt như Burk, LGI và NBRIP. Quá trình này giúp xác định các chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và hòa tan lân.

2.2. Đánh giá đặc tính vi khuẩn

Các chủng vi khuẩn được đánh giá khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA và sản xuất siderophore thông qua phương pháp so màu. Kết quả định lượng được sử dụng để lựa chọn các chủng vi khuẩn tiềm năng.

III. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy đã phân lập được 422 dòng vi khuẩn, trong đó có 246 dòng vi khuẩn vùng rễ và 176 dòng vi khuẩn nội sinh. Các chủng vi khuẩn này thuộc các chi Enterobacter, Burkholderia, Bacillus, Stenotrophomonas, Kosakonia, Serratia, Advenella, Paraburkholderia, Chitinophaga, Herbaspirillum, và Acinetobacter. Hai chủng vi khuẩn tiềm năng là CT4bd (Serratia oryzae) và TPD3b (Bacillus subtilis) được đánh giá cao về khả năng thúc đẩy tăng trưởng cây mía.

3.1. Phân lập và định danh vi khuẩn

Kết quả phân lập và nhận diện cho thấy 422 dòng vi khuẩn được phân lập từ vùng rễ cây mía và nội sinh. Các chủng vi khuẩn này được định danh dựa trên trình tự gene 16S rRNA, với mức tương đồng từ 95-100% so với các chủng trong cơ sở dữ liệu Genbank.

3.2. Đánh giá hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng

Hai chủng vi khuẩn CT4bd và TPD3b được đánh giá cao về khả năng thúc đẩy tăng trưởng cây mía. Kết quả thử nghiệm cho thấy sự kết hợp của hai chủng này giúp tăng năng suất mía và đường, đồng thời giảm thiểu lượng phân bón hóa học cần sử dụng.

IV. Kết luận và đề xuất

Luận án đã thành công trong việc phân lập và nhận diện các vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ cây mía có tiềm năng thúc đẩy tăng trưởng và năng suất cây mía. Hai chủng vi khuẩn CT4bd và TPD3b được đề xuất tiếp tục khảo nghiệm trên các giống mía khác nhau và trong các điều kiện canh tác khác nhau tại Tây Ninh.

4.1. Kết luận

Nghiên cứu đã phân lập và nhận diện thành công các vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ cây mía có khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA và sản xuất siderophore. Các chủng vi khuẩn này có tiềm năng lớn trong việc thúc đẩy tăng trưởng và năng suất cây mía.

4.2. Đề xuất

Hai chủng vi khuẩn CT4bd và TPD3b được đề xuất tiếp tục khảo nghiệm trên các giống mía khác nhau và trong các điều kiện canh tác khác nhau tại Tây Ninh. Nghiên cứu cũng đề xuất ứng dụng các chủng vi khuẩn này trong nông nghiệp bền vững để giảm thiểu sử dụng phân bón hóa học.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Cây mía (Saccharum spp L.) là cây công nghiệp có giá trị kinh tế quan trọng, phục vụ sản xuất đường và các sản phẩm sinh học như ethanol, xơ sợi và nhiên liệu sinh học. Tại vùng Đông Nam Bộ, tỉnh Tây Ninh là địa phương có diện tích canh tác mía lớn nhất với 14.668 ha (năm 2018), chiếm 60% diện tích mía toàn vùng. Tuy nhiên, trên 81% diện tích đất tự nhiên của tỉnh là đất xám bạc màu, đặc trưng bởi thành phần cơ giới nhẹ, chua, nghèo mùn và dinh dưỡng khoáng (N, P, K). Để duy trì năng suất, tập quán canh tác thâm canh phụ thuộc lớn vào phân bón hóa học với liều lượng khuyến cáo lên tới 200 – 250 kg N, 90 – 100 kg $\text{P}_2\text{O}_5$ và 180 – 200 kg $\text{K}_2\text{O}$/ha. Việc bón thừa phân đạm và lân gây rửa trôi nitrate, phú dưỡng hóa nguồn nước, phát thải khí nhà kính ($\text{N}_2\text{O}$) và làm tăng chi phí sản xuất. Trong khi đó, các nghiên cứu về hệ vi sinh vật bản địa liên kết với cây mía trên đất xám nhằm khai thác tiềm năng cố định đạm sinh học, hòa tan lân khó tan và kích thích sinh trưởng thực vật ở Việt Nam vẫn còn hạn chế. Luận án của nghiên cứu sinh Hoàng Minh Tâm được thực hiện nhằm giải quyết khoảng trống nghiên cứu này.

Mục tiêu nghiên cứu được xác định rõ:

1. Mục tiêu chung: Tìm kiếm và khai thác tiềm năng của các giống vi khuẩn bản địa có khả năng thúc đẩy tăng trưởng cây mía trong lĩnh vực sản xuất phân bón vi sinh, hướng tới nền nông nghiệp phát triển bền vững.
2. Mục tiêu cụ thể:
   • 2.1. Phân lập, nhận diện, tuyển chọn các dòng vi khuẩn nội sinh và vùng rễ cây mía có khả năng cố định đạm, hòa tan lân và sản xuất hormone tăng trưởng thực vật IAA.
   • 2.2. Thử nghiệm hiệu quả của các dòng vi khuẩn tuyển chọn trên cây mía trồng trong chậu và ngoài đồng.

Phạm vi nghiên cứu của luận án bao gồm:

• Không gian thu mẫu: Đất vùng rễ và mô thực vật (thân, rễ) cây mía thu thập tại 41 điểm thuộc 7 huyện của tỉnh Tây Ninh (Tân Châu, Tân Biên, Châu Thành, Dương Minh Châu, Trảng Bàng, Gò Dầu, Bến Cầu; không lấy mẫu tại Hòa Thành và thành phố Tây Ninh do diện tích trồng nhỏ lẻ).
• Đối tượng thực vật: Giống mía VN85-1859 nhân giống vô tính in vitro (dùng cho thí nghiệm nhà lưới trong bình Leonard) và giống mía thương mại K95-156 (dùng cho thí nghiệm trong chậu 6 tháng và ngoài đồng 12 tháng).
• Thời gian thực hiện: Thu mẫu và phân lập, định danh vi khuẩn từ tháng 10/2015 đến tháng 4/2017; thử nghiệm nhà lưới từ tháng 4/2017 đến tháng 5/2018; thử nghiệm trong chậu và ngoài đồng từ tháng 5/2019 đến tháng 1/2020.
• Địa điểm thực nghiệm: Phòng thí nghiệm của Trường Đại học Sài Gòn và Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học (Trường Đại học Cần Thơ); khu thí nghiệm nhà lưới Trường Đại học Sài Gòn; khu thực nghiệm 3.000 $\text{m}^2$ tại Trung tâm Nghiên cứu ứng dụng Mía đường Thành Thành Công (ấp Bình Hòa, xã Thái Bình, huyện Châu Thành, tỉnh Tây Ninh).

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án điểm lại các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến hiện trạng sản xuất mía, tác động của hóa chất nông nghiệp và hệ vi sinh vật thúc đẩy tăng trưởng thực vật:

Hướng nghiên cứu	Tác giả, công trình và năm công bố	Phát hiện chính được trích dẫn
Đặc điểm đất xám và canh tác mía Tây Ninh	Viện Quy hoạch và Thiết kế Nông nghiệp (2004); Viện Nghiên cứu Mía đường (2020); Cục Thống kê Tây Ninh (2019)	Đất xám chiếm 81,9% diện tích tự nhiên Tây Ninh; gồm 3 nhóm chính: đất xám trên phù sa cổ (Haplic Acrisols), đất xám có tầng loang lổ gley (Stagni-Plinthic Acrisols) và đất xám gley (Gleyic Acrisols). Nhu cầu phân bón NPK cao do đất nghèo kiệt dinh dưỡng.
Tác động môi trường của phân bón và thuốc BVTV	Hartemink (2008); Southwick et al. (1992, 1995, 2002); Lanchote et al. (2000); Li et al. (2019); Ward et al. (2018)	Dư lượng thuốc diệt cỏ (atrazine, 2,4-D) gây ô nhiễm nước ngầm và độc hại tế bào. Bón thừa N (>180 kg/ha) làm tăng rửa trôi nitrate và phát thải $\text{N}_2\text{O}$. Dư thừa phân lân gây phú dưỡng hóa và tích lũy tạp chất Cadmium (Cd) trong đất.
Khái niệm và cơ chế vi khuẩn có lợi (PGPB/PGPR/PGPBE)	Kloepper & Schroth (1978, 1981); Bashan & de-Bashan (2005); Gaiero et al. (2013); Souza et al. (2015)	Phân loại vi khuẩn liên kết thực vật (PAB) thành vi khuẩn vùng rễ (PGPR) và vi khuẩn nội sinh (PGPBE). Cơ chế thúc đẩy: cố định đạm sinh học, hòa tan phosphate, tổng hợp IAA, tiết siderophore bắt giữ sắt và sản xuất enzyme/kháng sinh đối kháng nấm bệnh.
Vi khuẩn liên kết mía trên thế giới	Mehnaz (2011); Mendes et al. (2007); Michelangelo et al. (2016); Sadiq et al. (2013); Quecine et al. (2012); Santos et al. (2018); Armanhi et al. (2018)	Phân lập các chi Enterobacter, Klebsiella, Pantoea, Burkholderia, Bacillus, Gluconacetobacter từ mía tại Brazil, Pakistan, Ấn Độ. Các chủng vi khuẩn giúp gia tăng chiều cao, diện tích lá, sinh khối khô và năng suất mía trong nhà kính và ngoài đồng.
Nghiên cứu vi khuẩn liên kết mía tại Việt Nam	Hoang & Cao (2014, 2015); Cao Ngọc Điệp (2011)	Khảo sát vi khuẩn vùng rễ và nội sinh mía tại Đồng Nai, ghi nhận các chi Bacillus, Sphingomonas, Raoultella, Achromobacter, Klebsiella có khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án tập trung giải quyết: Chưa có công trình nào đánh giá toàn diện và hệ thống về hệ vi khuẩn vùng rễ và nội sinh của cây mía trên đất xám tỉnh Tây Ninh; thiếu các nghiên cứu tuyển chọn dòng vi khuẩn bản địa mang đồng thời 4 đặc tính có lợi (cố định đạm, hòa tan lân, sinh IAA, sản xuất siderophore) và kiểm chứng hiệu quả qua chuỗi thực nghiệm đầy đủ từ in vitro, hệ thống nuôi cấy mô sạch khuẩn (gnotobiotic) trong nhà lưới, đến bán thực địa (trồng chậu) và thực địa (ngoài đồng) nhằm đánh giá khả năng cắt giảm phân bón N, P hóa học.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết về mối quan hệ tương tác giữa thực vật và vi sinh vật vùng rễ/nội sinh (Plant-Microbe Interactions), trong đó nhóm vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật (Plant Growth Promoting Bacteria - PGPB) hỗ trợ cây chủ thông qua các cơ chế dinh dưỡng khoáng và điều hòa sinh trưởng:

• Khả năng cố định đạm sinh học nhờ phức hệ enzyme nitrogenase chuyển đổi $\text{N}_2$ khí quyển thành ammonia.
• Khả năng hòa tan các hợp chất phosphate vô cơ khó tan (như tricalcium phosphate $\text{Ca}_3(\text{PO}_4)_2$) nhờ tiết acid hữu cơ làm giảm pH môi trường.
• Khả năng tổng hợp hormone auxin (Indole-3-acetic acid - IAA) kích thích phát triển hệ rễ và kéo dài tế bào.
• Khả năng sản xuất siderophore tạo phức chelate bắt giữ ion $\text{Fe}^{3+}$, hỗ trợ dinh dưỡng sắt cho cây và ức chế vi sinh vật gây bệnh cạnh tranh.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được triển khai đồng bộ:

1. Thu mẫu và phân tích đất: Thu mẫu đất và cây mía tại 41 vị trí thuộc 7 huyện ở Tây Ninh. Phân tích các chỉ tiêu hóa lý đất: pH nước, đạm tổng số (N%), lân dễ tiêu ($\text{P}_2\text{O}_5$), hàm lượng chất hữu cơ (OM%).
2. Phân lập và đếm mật số:
   • Sử dụng phương pháp đếm sống nhỏ giọt (drop plate method).
   • Môi trường phân lập cố định đạm: Burk's N-free và LGI không đạm.
   • Môi trường phân lập hòa tan lân: NBRIP chứa $\text{Ca}_3(\text{PO}_4)_2$ không tan.
   • Khử trùng bề mặt mô thực vật bằng cồn $70^\circ$ và $\text{NaOCl}$ trước khi nghiền phân lập vi khuẩn nội sinh.
3. Định lượng và định tính hoạt tính sinh học in vitro:
   • Định lượng ammonia ($\text{NH}_4^+$): Đo quang phổ so màu sau phản ứng với thuốc thử chuyên biệt.
   • Định lượng lân hòa tan ($\text{P}_2\text{O}_5$): Phương pháp so màu phức phospho-molybdate xanh.
   • Định lượng IAA: Nuôi cấy trong môi trường bổ sung L-tryptophan, so màu với thuốc thử Salkowski ở bước sóng 530 nm.
   • Định tính siderophore: Khảo nghiệm trên môi trường thạch đĩa Chrome Azurol S (CAS) và môi trường lỏng CAS (đổi màu từ xanh lam sang da cam/vàng khi có siderophore).
4. Định danh phân tử:
   • Tách chiết DNA tổng số của các dòng vi khuẩn tuyển chọn.
   • Khuếch đại đoạn gene 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR: Cặp mồi 8F và 1492R (sản phẩm ~1.500 bp) cho vi khuẩn vùng rễ; cặp mồi p515FPL và p13B (sản phẩm ~900 bp) cho vi khuẩn nội sinh.
   • Giải trình tự DNA, đối soát bằng công cụ BLASTn trên cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI), xây dựng cây phả hệ bằng phương pháp Neighbor-Joining.
5. Vi nhân giống mía in vitro:
   • Khử trùng mẫu đỉnh sinh trưởng giống mía VN85-1859, cấy tạo chồi trên môi trường MS bổ sung BA (Benzyladenine), nhân nhanh chồi bằng tổ hợp BA và Kinetin, cảm ứng tạo rễ bằng NAA ($\alpha$-Naphthaleneacetic acid) và than hoạt tính nhằm tạo nguồn cây con sạch khuẩn (gnotobiotic).
6. Thí nghiệm in vivo:
   • Nhà lưới (3 tháng): Trồng cây mía in vitro trong bình Leonard chứa cát khử trùng, lây nhiễm 12 dòng vi khuẩn tuyển chọn đơn lẻ, đánh giá chiều cao, số lá, số rễ, khối lượng tươi và khô.
   • Trong chậu (6 tháng) và ngoài đồng (12 tháng): Bố trí theo khối ngẫu nhiên/kiểu lô phụ (split-plot) với 2 nhân tố (chủng vi khuẩn: CT4bd, TPD3b, kết hợp CT4bd+TPD3b, và đối chứng; mức phân bón: 50%, 75%, 100% N, P hóa học). Đánh giá chiều cao, đường kính thân, số cây/bụi, năng suất mía, chữ đường (CCS), năng suất đường và dinh dưỡng đất sau thu hoạch.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Giới thiệu

Chương này xác định bối cảnh của ngành mía đường thế giới và Việt Nam, vị trí vùng nguyên liệu mía Tây Ninh và thực trạng đất xám bạc màu. Tác giả trình bày tính cấp thiết của việc giảm thiểu phân bón vô cơ, nêu rõ 2 mục tiêu cụ thể, 6 nội dung nghiên cứu, đối tượng, phạm vi thời gian (2015 – 2020), địa bàn nghiên cứu (7 huyện tỉnh Tây Ninh) và tóm lược 3 điểm mới về phương pháp (sử dụng cây mô gnotobiotic), nguồn vật liệu vi sinh vật bản địa đa dạng và hiệu quả thực tế của tổ hợp dòng vi khuẩn tuyển chọn.

Chương 2: Lược khảo tài liệu

Chương 2 tổng hợp cơ sở lý luận và các công trình liên quan gồm 6 mục lớn:

• Phân tích điều kiện khí hậu, thủy văn và đặc điểm thổ nhưỡng 3 nhóm đất xám Tây Ninh (Haplic Acrisols, Stagni-Plinthic Acrisols, Gleyic Acrisols).
• Đánh giá hiện trạng sản xuất mía Tây Ninh giai đoạn 2015 – 2018 (diện tích dao động 14.000 – 21.000 ha, năng suất trung bình 77,18 tấn/ha, sản lượng đạt trên 1,01 triệu tấn năm 2018; Châu Thành và Tân Châu là hai huyện trọng điểm).
• Tổng kết tác hại môi trường của thuốc diệt cỏ (atrazine, 2,4-D), thuốc trừ sâu gốc clo hữu cơ, và sự mất cân đối phân bón N, P (rửa trôi nitrate, tích lũy Cd, bùng phát tảo).
• Hệ thống hóa các khái niệm vi khuẩn liên kết thực vật (PAB), PGPR, PGPBE và cơ chế tác động.
• Điểm cứu các nghiên cứu vi khuẩn liên kết mía trên đất xám/Acrisols/Ultisols tại Brazil, Ấn Độ, Việt Nam.
• Tổng kết quy trình vi nhân giống mía phục vụ khảo nghiệm sinh học.

Chương 3: Phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết nguồn gốc vật liệu thí nghiệm, thiết bị, môi trường nuôi cấy (Burk, NBRIP, TYGA, LGI) và quy trình thực nghiệm:

• Thu thập mẫu tại 41 tọa độ; phương pháp phân tích hóa lý đất mặt.
• Phương pháp đếm sống nhỏ giọt xác định mật số CFU/g đất hoặc mô tươi.
• Phương pháp định lượng $\text{NH}_4^+$, $\text{P}_2\text{O}_5$, IAA và định tính CAS lỏng/đặc cho siderophore.
• Thành phần hóa chất và chu trình nhiệt PCR khuếch đại 16S rRNA.
• Quy trình nuôi cấy mô đỉnh sinh trưởng giống mía VN85-1859 qua các giai đoạn cảm ứng, nhân chồi, tạo rễ.
• Sơ đồ bố trí thí nghiệm lô phụ (split-plot) trong chậu và ngoài đồng (diện tích 3.000 $\text{m}^2$) đánh giá tương tác giữa vi khuẩn và các mức phân bón.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương 4 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được:

                  [ 41 mẫu đất vùng rễ & mô cây mía Tây Ninh ]
            [ Phân lập được 422 dòng vi khuẩn có đồng thời ]
            [      khả năng cố định đạm và hòa tan lân     ]
          [ 101 dòng sinh IAA ]                [ 81 dòng sinh Siderophore ]
             [ Tuyển chọn và định danh 36 dòng bằng 16S rRNA ]
             [ Khảo nghiệm in vivo trên 12 dòng trong bình Leonard ]
             [ Chọn 2 dòng ưu việt nhất: CT4bd và TPD3b ]
             [ Khảo nghiệm trong chậu (6 tháng) và ngoài đồng (12 tháng) ]
             (Kết hợp CT4bd + TPD3b + 75% N, P: Năng suất tương đương 100% N, P;
                            năng suất đường tăng 14%)

• Đặc tính đất và mật số vi sinh vật: Đất trồng mía tại 41 điểm có tính chua, N tổng số và P dễ tiêu ở mức nghèo đến trung bình. Mật số vi khuẩn cố định đạm và hòa tan lân dao động từ $10^4$ đến $10^6\text{ CFU/g}$ đất, có tương quan tuyến tính thuận với hàm lượng chất hữu cơ (OM) và P dễ tiêu trong đất.
• Phân lập và đặc tính sinh hóa: Thu được 422 dòng vi khuẩn có đồng thời hai đặc tính cố định đạm và hòa tan lân. Trong đó, 101 dòng có khả năng tổng hợp IAA và 81 dòng tạo được siderophore (tạo quầng đổi màu trên thạch CAS). Định lượng in vitro chọn ra 30 dòng vi khuẩn vùng rễ và 36 dòng nội sinh có hoạt tính cao nhất.
• Định danh phân tử 16S rRNA: Xác định danh tính của 36 dòng tuyển chọn (17 dòng vùng rễ, 19 dòng nội sinh) với độ tương đồng 95 – 100% trên GenBank. Các dòng thuộc 11 chi: Enterobacter, Burkholderia, Bacillus, Stenotrophomonas, Kosakonia, Serratia, Advenella, Paraburkholderia, Chitinophaga, Herbaspirillum, và Acinetobacter. Phát hiện dòng nội sinh thân mía CT4bd tương đồng cao với Serratia oryzae (loài công bố năm 2017 nội sinh trên lúa).
• Kết quả vi nhân giống mía: Xác định nồng độ chất điều hòa sinh trưởng tối ưu cho giống VN85-1859: cảm ứng chồi với BA, nhân nhanh chồi với tổ hợp BA và Kinetin, cảm ứng ra rễ hoàn chỉnh đạt tỷ lệ cao với NAA trên nền môi trường bổ sung than hoạt tính.
• Thử nghiệm in vivo nhà lưới: Trong 12 dòng vi khuẩn đưa vào thử nghiệm bình Leonard trên mía con in vitro, hai dòng cho hiệu quả vượt trội nhất trên chiều cao, số rễ và tích lũy sinh khối tươi/khô là dòng nội sinh CT4bd (Serratia oryzae) và dòng vùng rễ TPD3b (Bacillus subtilis).
• Thử nghiệm trong chậu và ngoài đồng:
  • Khi phối hợp 2 dòng CT4bd và TPD3b cùng với mức bón 75% phân N và P hóa học, các chỉ tiêu sinh trưởng (chiều cao, đường kính thân, số cây hữu hiệu) và năng suất mía đạt tương đương với nghiệm thức bón 100% phân N và P hóa học không chủng vi khuẩn.
  • Ở thí nghiệm ngoài đồng 12 tháng, nghiệm thức phối hợp 2 dòng vi khuẩn + 75% N, P làm tăng năng suất đường 14% (tương đương tăng 1,02 tấn đường/ha) so với đối chứng canh tác tiêu chuẩn 100% hóa học.
  • Phân tích đất sau thu hoạch ghi nhận hàm lượng N và P dễ tiêu trong đất ở các nghiệm thức có chủng vi khuẩn duy trì ổn định.

Chương 5: Kết luận và đề xuất

Tổng kết toàn bộ kết quả phân lập, định danh và hiệu quả thực địa; đưa ra các kiến nghị nghiên cứu tiếp nối trên các giống mía và chân đất khác nhau.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học

1. Cung cấp dữ liệu khoa học toàn diện về mật số, sự phân bố và tính đa dạng di truyền của quần xã vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây mía trồng trên vùng đất xám bạc màu tỉnh Tây Ninh.
2. Thiết lập cây phả hệ dựa trên trình tự gene 16S rRNA của 36 dòng vi khuẩn bản địa đại diện cho 11 chi vi khuẩn, bổ sung vào cơ sở dữ liệu sinh học phân tử của khu hệ vi sinh vật liên kết thực vật tại Việt Nam.
3. Ghi nhận sự hiện diện của loài vi khuẩn nội sinh Serratia oryzae (dòng CT4bd) trong thân cây mía, chứng minh khả năng đa dạng vật chủ của loài vi khuẩn này trên cây trồng ngoài lúa.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn

1. Xây dựng bộ sưu tập 422 dòng vi khuẩn bản địa có khả năng cố định đạm và hòa tan lân, trong đó tuyển chọn được 2 dòng ưu việt: nội sinh CT4bd (Serratia oryzae) và vùng rễ TPD3b (Bacillus subtilis).
2. Ứng dụng thành công tổ hợp 2 dòng vi khuẩn CT4bd và TPD3b trong canh tác mía trên đất xám, cho phép giảm 25% lượng phân đạm (N) và lân (P) hóa học mà vẫn đảm bảo năng suất sinh học tương đương mức bón 100% hóa học, đồng thời làm tăng năng suất đường thêm 14% (tương đương 1,02 tấn/ha) ở quy mô đồng ruộng.
3. Hoàn thiện quy trình vi nhân giống in vitro giống mía VN85-1859 tạo nguồn cây con sạch khuẩn phục vụ nghiên cứu tương tác thực vật - vi sinh vật có kiểm soát (gnotobiotic).

Kiến nghị và đề xuất của tác giả

• Tiếp tục khảo nghiệm diện rộng khả năng thúc đẩy tăng trưởng của 2 dòng vi khuẩn CT4bd và TPD3b trên nhiều giống mía thương mại khác nhau.
• Thử nghiệm trên cả vụ mía tơ và các vụ mía gốc (ratoon crops) tại các vùng sinh thái đất xám khác nhau của tỉnh Tây Ninh.
• Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học dạng chất mang hoặc dịch lỏng từ các chủng vi khuẩn này để ứng dụng đại trà trong sản xuất nông nghiệp.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Dựa trên phạm vi nghiên cứu mà văn bản đề cập, các hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp gồm:

• Hạn chế về phạm vi địa bàn: Nghiên cứu thu mẫu tại 7 huyện nhưng chưa bao gồm huyện Hòa Thành và thành phố Tây Ninh; các thử nghiệm thực địa mới chỉ thực hiện tại một điểm thuộc huyện Châu Thành trên giống mía K95-156.
• Hạn chế về vòng đời canh tác: Thử nghiệm đồng ruộng mới đánh giá trên chu kỳ mía tơ (12 tháng), chưa theo dõi sự tồn lưu và hiệu quả của vi khuẩn qua các chu kỳ lưu gốc (mía gốc năm 1, năm 2).
• Hướng nghiên cứu tiếp: Mở rộng khảo nghiệm trên các giống mía chủ lực khác; đánh giá cơ chế tương tác ở mức độ biểu hiện gene; nghiên cứu quy trình sản xuất sinh khối công nghiệp và công thức chất mang bảo quản chế phẩm vi sinh để chuyển giao ứng dụng.

---

Giá trị tham khảo

Luận án có giá trị tham khảo chuyên môn đối với các nhóm đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học, sinh viên ngành Vi sinh vật học, Công nghệ sinh học, Nông học: Tham khảo quy trình phân lập, định lượng in vitro hoạt tính cố định đạm, hòa tan lân, IAA, khảo nghiệm CAS siderophore, kỹ thuật nhân giống mía in vitro gnotobiotic và phương pháp PCR định danh 16S rRNA (cặp mồi 8F/1492R và p515FPL/p13B).
• Giảng viên và các nhà nghiên cứu đất - vi sinh vật: Tham khảo phương pháp bố trí thí nghiệm chuỗi từ in vitro, bình Leonard nhà lưới, đến thí nghiệm trong chậu và ngoài đồng dạng lô phụ (split-plot) đánh giá tương tác vi khuẩn - phân bón hóa học.
• Doanh nghiệp mía đường và đơn vị sản xuất phân bón vi sinh: Tham khảo nguồn dữ liệu về hai chủng tiềm năng Serratia oryzae CT4bd và Bacillus subtilis TPD3b để phát triển chế phẩm vi sinh chuyên dùng cho đất xám giúp giảm chi phí phân bón vô cơ.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã phân lập được bao nhiêu dòng vi khuẩn và có bao nhiêu dòng mang các đặc tính thúc đẩy sinh trưởng thực vật?
Luận án đã phân lập được tổng cộng 422 dòng vi khuẩn có đồng thời khả năng cố định đạm và hòa tan lân (gồm 246 dòng vi khuẩn đất vùng rễ và 176 dòng vi khuẩn nội sinh). Trong số đó, có 101 dòng có khả năng tổng hợp hormone IAA và 81 dòng có khả năng sản xuất siderophore.

2. Các dòng vi khuẩn tuyển chọn thuộc những chi vi khuẩn nào sau khi định danh bằng trình tự 16S rRNA?
Ba mươi sáu dòng vi khuẩn tuyển chọn được định danh thuộc 11 chi: Enterobacter, Burkholderia, Bacillus, Stenotrophomonas, Kosakonia, Serratia, Advenella, Paraburkholderia, Chitinophaga, Herbaspirillum, và Acinetobacter, với độ tương đồng trình tự từ 95% đến 100% so với cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI).

3. Hai dòng vi khuẩn nào cho hiệu quả tốt nhất trong các thử nghiệm in vivo và danh tính khoa học của chúng là gì?
Hai dòng vi khuẩn cho hiệu quả tốt nhất là dòng vi khuẩn nội sinh thân mía CT4bd, được nhận diện là Serratia oryzae, và dòng vi khuẩn đất vùng rễ TPD3b, được nhận diện là Bacillus subtilis.

4. Hiệu quả thực tế của việc chủng phối hợp 2 dòng CT4bd và TPD3b đối với năng suất mía và chữ đường ngoài đồng ruộng ra sao?
Khi phối hợp 2 dòng vi khuẩn CT4bd và TPD3b kết hợp với mức bón 75% phân đạm và lân hóa học, năng suất mía đạt tương đương với nghiệm thức bón 100% phân N và P hóa học. Đồng thời, năng suất đường tăng thêm 14% (tương đương 1,02 tấn đường/ha) trong điều kiện trồng ngoài đồng 12 tháng.

5. Vì sao tác giả sử dụng phương pháp nuôi cấy mô mía in vitro trước khi thử nghiệm vi khuẩn trong nhà lưới?
Do mía không gieo trồng bằng hạt, bước nuôi cấy mô đỉnh sinh trưởng giúp tạo ra nguồn cây con đồng đều và sạch khuẩn (gnotobiotic condition), loại trừ sự ảnh hưởng của các vi khuẩn ngoại nhiễm, từ đó đánh giá chính xác tác động thúc đẩy tăng trưởng của từng dòng vi khuẩn được chủng vào bình Leonard.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Hoàng Minh Tâm đã khảo sát hệ thống khu hệ vi khuẩn vùng rễ và nội sinh cây mía trên đất xám tỉnh Tây Ninh, phân lập thành công 422 dòng vi khuẩn bản địa có khả năng cố định đạm và hòa tan lân. Nghiên cứu đã định danh 36 dòng tiềm năng qua giải trình tự gene 16S rRNA và tuyển chọn được 2 dòng ưu việt là Serratia oryzae CT4bd và Bacillus subtilis TPD3b. Kết quả thực nghiệm ngoài đồng chứng minh tổ hợp 2 dòng vi khuẩn này kết hợp cùng 75% liều lượng phân N, P hóa học giúp duy trì năng suất mía tương đương bón 100% phân hóa học và làm tăng năng suất đường 14%, cung cấp cơ sở khoa học và nguồn giống vi sinh vật giá trị cho việc phát triển phân bón sinh học phục vụ canh tác mía bền vững trên đất xám.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Mía là một cây công nghiệp có giá trị kinh tế quan trọng được trồng tại hơn 110 nước nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thế giới. Ngày nay, ngoài sản xuất đường, nhiều sản phẩm có giá trị khác đã được tạo ra từ cây mía như ethanol, nhựa, xơ sợi; đặc biệt là nhiên liệu sinh học (Viện Nghiên cứu mía đường, 2020). Chính vì thế, việc duy trì và gia tăng năng suất mía đã trở thành trọng tâm nghiên cứu của nhiều quốc gia (Mehnaz, 2011). Nhìn chung tổng diện tích trồng mía trên thế giới tăng dần qua các năm, từ 44.000 nghìn ha ở năm 1961 lên đến 269.

Ở một số năm như 1999, 2002, 2003, diện tích trồng mía tăng hơn 300 nghìn ha. Tuy nhiên, trong những năm gần đây diện tích trồng mía đường có phần giảm nhẹ (FAOSTAT, 2020). Trong công nghiệp sản xuất đường, đường mía hiện chiếm trên 60% tổng sản lượng đường thô của toàn thế giới. Ở Việt Nam, nghề trồng mía để sản xuất đường bắt đầu từ những năm 1990.

Do thích nghi với điều kiện tự nhiên, cây mía có thể được trồng ở nhiều vùng, miền khắp nước ta (Viện Nghiên cứu mía đường, 2020). Năng suất mía bình quân của cả nước vào năm 2018 là khoảng 66,6 tấn/ha và sản lượng là 17. Năm 2018, theo thống kê sơ bộ từ các Cục thống kê, tổng diện tích trồng mía ở Đông Nam Bộ là khoảng 24. Trong đó, Tây Ninh là tỉnh có diện tích trồng mía lớn nhất, gồm 14.

Chính vì vậy, Tây Ninh có cơ sở để trở thành một vùng mía đường quan trọng của cả nước và của khu vực. Hiện nay, phương thức tổ chức sản xuất và cải tiến kỹ thuật mà các nước, trong đó có Việt Nam, đã áp dụng thành công để tăng năng suất mía là: sản xuất tập trung chuyên canh, cải thiện giống mía, hóa học hóa, thủy lợi hóa và cơ giới hóa, trong đó đặc biệt coi trọng công tác nghiên cứu khoa học. Tuy vậy, theo Thaweenut và cộng sự (2011), ở các nước đang phát triển vẫn có tập quán bón nhiều phân hóa học cho cây mía ở giai đoạn sớm nhằm tăng cường sản lượng và chữ đường. Ở Việt Nam, nghiên cứu cho thấy năng suất mía tơ tăng lên tỷ lệ thuận với lượng phân bón.

Lượng phân NPK bón cho 1 ha mía tơ đạt năng suất 70 – 80 tấn là: 180– 200 kg N, 60 – 80 kg P2O5 và 150 – 180 kg K2O. Nếu muốn năng suất tăng lên 90 – 100 tấn/ha, thì lượng phân tương ứng sẽ là: 200 – 250, 80 – 100, và 180 – 220. Ngoài ra, tùy theo loại đất và mức độ thâm canh mà phân bón hoá học được sử dụng với hàm lượng khác nhau. Với đất xám cát và đất xám bạc màu có mức độ thâm canh cao, lượng NPK/ha khuyến cáo là khoảng 200 – 250 kg N, 90 – 100 kg P2O5 và 180 – 200 kg K2O (Viện Nghiên cứu mía đường, 2020).

1 Việc sử dụng quá nhiều phân hóa học cũng như các chất bảo vệ thực vật không những làm tăng chi phí sản xuất mà còn gây bất lợi đối với cây trồng, ảnh hưởng đến hệ sinh thái, môi trường và sức khỏe con người. Chính vì thế, việc nghiên cứu và ứng dụng các vi khuẩn có lợi là một phần trong chiến lược nông nghiệp sinh thái hiện nay. Theo Singh và Singh (2012), việc sử dụng các vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật như là các chế phẩm chủng cho cây trồng có khả năng thay thế hoặc bổ sung một phần cho phân bón hóa học, thuốc trừ sâu và thuốc diệt cỏ, đồng thời giúp duy trì tính bền vững của năng suất cây trồng và sự an toàn của môi trường.