Luận văn thạc sĩ hay phân lập nấm aspergillus flavus và aspergillus paraciticus sinh độc tố từ hạt lạc

Nghiên cứu phân lập nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus sinh độc tố từ hạt lạc, góp phần nâng cao an toàn thực phẩm.

• Tác giả: Phạm Như Trọng
• Người hướng dẫn: PGS.TS. Phạm Xuân Đà
• Trường học: Viện Hàn Lâm Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam
• Chuyên ngành: Vi sinh vật
• Đề tài: Phân lập nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus từ hạt lạc
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. PHẦN THỨ NHẤT - MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục đích - Yêu cầu
• 2. PHẦN THỨ HAI - TỔNG QUAN
• 2.1. Giới thiệu chung về lạc
• 2.2. Cấu tạo của lạc
• 2.3. Giá trị và công dụng của lạc đối với đời sống của con người
• 2.4. Nấm mốc sinh độc tố aflatoxin trên lạc
• 2.4.1. Các loại nấm sinh aflatoxin trên lạc
• 2.4.2. Đặc điểm hình thái
• 2.4.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng
• 2.4.4. Điều kiện sinh độc tố
• 2.4.5. Lịch sử phát hiện aflatoxin
• 2.4.6. Cấu tạo và tính chất hóa lý của aflatoxin
• 3. PHẦN THỨ BA - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Chủng chuẩn nấm Aspergillus và mẫu lạc
• 3.2. Dụng cụ và thiết bị
• 3.3. Các môi trường chính sử dụng trong quá trình nghiên cứu
• 3.4. Phương pháp nghiên cứu
• 3.4.1. Phương pháp phân lập nấm mốc
• 3.4.2. Phương pháp định danh nấm mốc dựa vào hình thái và cấu tạo vi thể
• 3.4.3. Phương pháp định danh nấm mốc dựa vào trình tự gen ITS
• 3.4.4. Xác định khả năng sinh độc tố dựa vào phương pháp sắc ký khối phổ
• 4. PHẦN THỨ TƯ - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả phân lập nấm mốc
• 4.2. Kết quả định danh nấm mốc dựa vào hình thái và cấu tạo vi thể
• 4.3. Kết quả giải trình tự gen ITS định danh nấm
• 4.4. Kết quả tách chiết ADN
• 4.5. Kết quả khuếch đại bằng phản ứng PCR đặc hiệu
• 4.6. Kết quả giải trình tự
• 4.7. Kết quả chụp ảnh hiển vi điện tử quét
• 4.8. Kết quả phân tích khả năng sinh độc tố aflatoxin bằng sắc ký khối phổ
• 5. PHẦN NĂM - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về phân lập nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus từ hạt lạc

Phân lập nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus từ hạt lạc là một nghiên cứu quan trọng nhằm xác định sự hiện diện của các chủng nấm gây độc tố aflatoxin. Aflatoxin là một loại độc tố nguy hiểm, có thể gây ra nhiều vấn đề sức khỏe nghiêm trọng cho con người. Việc phân lập và định danh các chủng nấm này không chỉ giúp bảo vệ sức khỏe cộng đồng mà còn đảm bảo chất lượng thực phẩm. Nghiên cứu này cũng góp phần nâng cao nhận thức về an toàn thực phẩm trong sản xuất nông nghiệp.

1.1. Giới thiệu về nấm Aspergillus và hạt lạc

Nấm Aspergillus là một trong những loại nấm phổ biến nhất trong tự nhiên, đặc biệt là Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. Hạt lạc, hay còn gọi là đậu phộng, là nguồn thực phẩm giàu dinh dưỡng nhưng cũng là môi trường thuận lợi cho sự phát triển của nấm mốc. Việc hiểu rõ về mối quan hệ giữa nấm và hạt lạc là rất cần thiết để kiểm soát sự nhiễm độc tố aflatoxin.

1.2. Tầm quan trọng của việc phân lập nấm

Phân lập nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus từ hạt lạc giúp xác định mức độ ô nhiễm aflatoxin trong thực phẩm. Điều này không chỉ bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng mà còn hỗ trợ các nhà sản xuất trong việc cải thiện quy trình sản xuất và bảo quản nông sản.

II. Vấn đề và thách thức trong việc phân lập nấm Aspergillus

Việc phân lập nấm Aspergillus từ hạt lạc gặp nhiều thách thức, bao gồm điều kiện môi trường và phương pháp phân lập. Nấm Aspergillus có khả năng sinh trưởng mạnh mẽ trong điều kiện ẩm ướt và nhiệt độ cao, điều này làm tăng nguy cơ nhiễm độc tố aflatoxin. Hơn nữa, việc sử dụng các phương pháp phân lập truyền thống thường tốn thời gian và không đảm bảo độ chính xác cao.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm

Nhiệt độ, độ ẩm và pH là những yếu tố chính ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Aspergillus. Nấm này thường phát triển tốt trong điều kiện ẩm ướt và nhiệt độ từ 25 đến 35 độ C. Việc kiểm soát các yếu tố này là rất quan trọng để ngăn chặn sự phát triển của nấm.

2.2. Thách thức trong việc phát hiện nấm

Phương pháp phân lập truyền thống thường yêu cầu thời gian dài và không đảm bảo độ chính xác. Việc áp dụng các kỹ thuật hiện đại như PCR và sắc ký khối phổ có thể giúp cải thiện độ chính xác trong việc phát hiện nấm và độc tố aflatoxin.

III. Phương pháp phân lập nấm Aspergillus hiệu quả từ hạt lạc

Để phân lập nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus từ hạt lạc, các phương pháp hiện đại như PCR và sắc ký khối phổ được khuyến nghị. Những phương pháp này không chỉ giúp xác định chính xác các chủng nấm mà còn đánh giá khả năng sinh độc tố aflatoxin của chúng. Việc áp dụng các phương pháp này sẽ giúp nâng cao hiệu quả trong việc kiểm soát an toàn thực phẩm.

3.1. Phương pháp PCR trong phân lập nấm

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) cho phép nhân bản DNA của nấm Aspergillus, giúp xác định chính xác các chủng nấm gây độc tố. Kỹ thuật này nhanh chóng và có độ nhạy cao, giúp phát hiện nấm ngay cả trong mẫu có nồng độ thấp.

3.2. Sắc ký khối phổ trong phân tích độc tố aflatoxin

Sắc ký khối phổ là một phương pháp hiện đại được sử dụng để phân tích và xác định nồng độ aflatoxin trong mẫu. Phương pháp này cho phép phát hiện nhanh chóng và chính xác các loại độc tố, từ đó giúp đánh giá mức độ ô nhiễm thực phẩm.

IV. Ứng dụng thực tiễn và kết quả nghiên cứu về nấm Aspergillus

Nghiên cứu về phân lập nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus từ hạt lạc đã cho thấy nhiều kết quả tích cực. Việc áp dụng các phương pháp hiện đại đã giúp phát hiện nhanh chóng và chính xác các chủng nấm gây độc tố. Kết quả này không chỉ có ý nghĩa trong việc bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng mà còn hỗ trợ các nhà sản xuất trong việc cải thiện quy trình sản xuất.

4.1. Kết quả phân lập nấm từ hạt lạc

Kết quả nghiên cứu cho thấy nhiều chủng nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus được phân lập thành công từ các mẫu hạt lạc. Điều này cho thấy sự hiện diện của độc tố aflatoxin trong thực phẩm, cần có biện pháp kiểm soát chặt chẽ.

4.2. Ứng dụng trong sản xuất thực phẩm

Kết quả nghiên cứu có thể được áp dụng trong sản xuất thực phẩm để đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng. Việc kiểm soát nấm Aspergillus trong quá trình sản xuất và bảo quản hạt lạc là rất cần thiết để giảm thiểu nguy cơ nhiễm độc tố.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu về nấm Aspergillus

Nghiên cứu về phân lập nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus từ hạt lạc đã chỉ ra tầm quan trọng của việc kiểm soát độc tố aflatoxin trong thực phẩm. Tương lai của nghiên cứu này cần tiếp tục phát triển các phương pháp hiện đại để nâng cao hiệu quả trong việc phát hiện và kiểm soát nấm mốc. Điều này không chỉ bảo vệ sức khỏe cộng đồng mà còn đảm bảo chất lượng thực phẩm.

5.1. Tương lai của nghiên cứu nấm Aspergillus

Nghiên cứu cần tiếp tục phát triển các phương pháp mới và hiệu quả hơn trong việc phát hiện nấm Aspergillus và độc tố aflatoxin. Việc áp dụng công nghệ sinh học và các phương pháp hiện đại sẽ giúp nâng cao độ chính xác và nhanh chóng trong việc kiểm soát an toàn thực phẩm.

5.2. Đề xuất các biện pháp kiểm soát

Cần có các biện pháp kiểm soát chặt chẽ trong sản xuất và bảo quản hạt lạc để ngăn chặn sự phát triển của nấm Aspergillus. Việc nâng cao nhận thức về an toàn thực phẩm trong cộng đồng cũng là một yếu tố quan trọng để bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Nấm mốc là nguyên nhân chính gây giảm chất lượng và phá hủy nông sản sau thu hoạch, đồng thời nhiều chủng nấm còn sinh độc tố nấm (mycotoxin) ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người. Trong đó, chi Aspergillus, đặc biệt là Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus, có khả năng sinh độc tố aflatoxin trên nhiều loại nông sản như ngô, lạc, bông, đậu tương. Lạc là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao, được trồng trên diện tích lớn ở hơn 100 quốc gia, cung cấp năng lượng 573 Kcal/100g, đạm và chất béo quan trọng cho con người. Tuy nhiên, điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa tại Việt Nam cùng việc bảo quản lạc chưa được kiểm soát nghiêm ngặt tạo điều kiện thuận lợi cho nấm Aspergillus phát triển và sinh độc tố aflatoxin, một loại độc tố bền vững, không bị phân hủy trong điều kiện đun nấu thông thường và có khả năng gây ung thư gan khi sử dụng lâu dài.

Mục tiêu nghiên cứu là phân lập và định danh các chủng nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus sinh độc tố aflatoxin từ hạt lạc thu thập tại các chợ Hà Nội, sử dụng phương pháp hình thái học kết hợp giải trình tự gen ITS, đồng thời xác định khả năng sinh độc tố aflatoxin bằng sắc ký lỏng khối phổ. Nghiên cứu được thực hiện trong năm 2015 tại Hà Nội, nhằm góp phần nâng cao chất lượng sản phẩm lạc, bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và hỗ trợ công tác kiểm soát an toàn thực phẩm.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Lý thuyết về sinh trưởng và phát triển của nấm Aspergillus: Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus là các loài nấm mốc ưa nhiệt, phát triển tốt ở nhiệt độ 25-35ºC và độ ẩm 80-85%. Chúng sinh độc tố aflatoxin trong điều kiện pH 4,5-6,5 và hàm lượng nước trong cơ chất từ 15-30%.

• Mô hình sinh tổng hợp aflatoxin: Quá trình sinh tổng hợp aflatoxin được mã hóa bởi cụm 25 gen trong đoạn 66 kb, với các gen đóng vai trò xúc tác và điều khiển phiên mã. Sự biểu hiện gen này được phát hiện bằng kỹ thuật PCR dựa trên trình tự DNA đặc hiệu.

• Khái niệm chính: Aflatoxin (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2), độc tố aflatoxin B1 là chất gây ung thư gan nhóm 1; phương pháp định danh nấm dựa trên hình thái học và giải trình tự gen ITS; kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) để xác định nồng độ aflatoxin.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: 30 mẫu lạc nhân thu thập từ 3 chợ tại Hà Nội (Trâu Quỳ, Phố Huế, Phạm Đình Hổ). Chủng chuẩn nấm Aspergillus flavus ATCC 204304 được sử dụng làm đối chứng.

• Phương pháp phân tích: Phân lập nấm mốc trên môi trường DG18, nuôi cấy ở 25±1ºC trong 5-7 ngày. Định danh nấm dựa trên đặc điểm hình thái khuẩn lạc và cấu tạo vi thể dưới kính hiển vi quang học, kết hợp giải trình tự gen ITS bằng PCR và giải trình tự Sanger. Xác định khả năng sinh độc tố aflatoxin bằng sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS.

• Timeline nghiên cứu: Thu thập mẫu và phân lập nấm trong vòng 1 tháng; tách chiết ADN, PCR và giải trình tự trong 2 tháng; phân tích sắc ký khối phổ trong 1 tháng; tổng hợp và báo cáo kết quả trong 1 tháng.

• Cỡ mẫu và chọn mẫu: 30 mẫu lạc được chọn ngẫu nhiên từ các chợ khác nhau nhằm đảm bảo tính đại diện. Phương pháp chọn mẫu pha loãng và cấy bề mặt trên môi trường DG18 để phân lập nấm mốc.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Phân lập và định danh nấm mốc: Từ 30 mẫu lạc, phân lập được 30 chủng nấm mốc nghi ngờ là Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. Qua quan sát hình thái và cấu tạo vi thể, xác định 18 chủng là A. flavus và 12 chủng là A. parasiticus.

2. Giải trình tự gen ITS: 7 chủng được chọn giải trình tự, trong đó 4 chủng được định danh chính xác là A. flavus với độ tương đồng trên 98% so với dữ liệu trên ngân hàng gen quốc tế. Một số chủng chưa định danh do lỗi kỹ thuật.

3. Khả năng sinh độc tố aflatoxin: Phân tích sắc ký lỏng khối phổ cho thấy 2 chủng A. flavus (M45 và M33) sinh aflatoxin B1 với nồng độ lần lượt là 6,8 ppb và 8,6 ppb, vượt mức an toàn quy định trong thực phẩm.

4. Đặc điểm hình thái và vi thể: A. flavus có khuẩn lạc đường kính 5,5-6,5 cm, màu vàng đậm đến lục vàng, bào tử đính hình cầu đến gần cầu, thể bình 1 hoặc 2 lớp. A. parasiticus có khuẩn lạc nhỏ hơn (4-5 cm), màu lục vàng đến xanh lục, bào tử đính hình cầu, thể bình 1 lớp.

Thảo luận kết quả

Kết quả phân lập và định danh nấm mốc phù hợp với các nghiên cứu trước đây cho thấy Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus là hai loài phổ biến trên hạt lạc tại Việt Nam. Việc sử dụng kết hợp phương pháp hình thái học và giải trình tự gen ITS giúp tăng độ chính xác trong định danh chủng nấm, khắc phục hạn chế của phương pháp truyền thống mất nhiều thời gian và dễ nhầm lẫn.

Nồng độ aflatoxin B1 được phát hiện ở mức 6,8-8,6 ppb cho thấy nguy cơ ô nhiễm aflatoxin trên lạc tại Hà Nội là hiện hữu, tương tự với các báo cáo quốc tế về mức độ ô nhiễm aflatoxin trong lạc và sản phẩm lạc. Dữ liệu này có thể được trình bày qua biểu đồ cột so sánh nồng độ aflatoxin giữa các chủng phân lập, giúp minh họa rõ ràng mức độ nguy hiểm.

Sự khác biệt nhỏ trong kết quả định danh hình thái và gen của một số chủng có thể do biến dị gen hoặc sai số kỹ thuật, cần nghiên cứu sâu hơn bằng các phương pháp phân tử khác. Kết quả này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc kiểm soát chất lượng và bảo quản lạc nhằm hạn chế sự phát triển của nấm mốc sinh độc tố.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tăng cường kiểm soát chất lượng bảo quản lạc: Áp dụng các biện pháp kiểm soát độ ẩm (dưới 15%) và nhiệt độ bảo quản (dưới 25ºC) trong kho chứa lạc để hạn chế sự phát triển của nấm Aspergillus, giảm nguy cơ sinh aflatoxin. Thời gian thực hiện: ngay lập tức, chủ thể: các doanh nghiệp và hộ kinh doanh.

2. Xây dựng quy trình phân lập và định danh nấm mốc chuẩn: Áp dụng phương pháp kết hợp hình thái học và giải trình tự gen ITS trong các phòng kiểm nghiệm an toàn thực phẩm để phát hiện sớm và chính xác các chủng nấm sinh độc tố. Thời gian: 6 tháng, chủ thể: Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm.

3. Đào tạo nâng cao nhận thức cho người sản xuất và kinh doanh lạc: Tổ chức các khóa tập huấn về tác hại của aflatoxin và biện pháp phòng ngừa, nhằm nâng cao ý thức bảo quản và xử lý sản phẩm. Thời gian: 1 năm, chủ thể: Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, các tổ chức liên quan.

4. Nghiên cứu và ứng dụng công nghệ xử lý aflatoxin: Khuyến khích nghiên cứu các phương pháp xử lý aflatoxin hiệu quả, an toàn và kinh tế như xử lý hóa học, sinh học hoặc vật lý để giảm thiểu độc tố trong sản phẩm lạc trước khi đưa ra thị trường. Thời gian: 2 năm, chủ thể: các viện nghiên cứu và doanh nghiệp công nghệ sinh học.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Vi sinh vật và An toàn thực phẩm: Nghiên cứu cung cấp phương pháp phân lập, định danh và đánh giá độc tố aflatoxin trên nấm Aspergillus, hỗ trợ phát triển các đề tài liên quan.

2. Cơ quan quản lý an toàn thực phẩm và nông nghiệp: Thông tin về mức độ ô nhiễm aflatoxin và các chủng nấm phổ biến giúp xây dựng chính sách kiểm soát và quản lý chất lượng nông sản.

3. Doanh nghiệp sản xuất, kinh doanh và bảo quản lạc: Hiểu rõ về nguy cơ nấm mốc và độc tố aflatoxin để áp dụng biện pháp bảo quản, xử lý nhằm đảm bảo an toàn sản phẩm.

4. Người tiêu dùng và các tổ chức bảo vệ sức khỏe cộng đồng: Nâng cao nhận thức về tác hại của aflatoxin và cách phòng tránh qua việc lựa chọn và bảo quản thực phẩm an toàn.

Câu hỏi thường gặp

1. Aflatoxin là gì và tại sao nó nguy hiểm?
   Aflatoxin là nhóm độc tố do nấm Aspergillus flavus và parasiticus sinh ra, có khả năng gây ung thư gan, suy giảm miễn dịch và các bệnh nghiêm trọng khác. Ví dụ, aflatoxin B1 là chất gây ung thư gan nhóm 1 theo WHO.

2. Làm thế nào để phát hiện nấm Aspergillus sinh độc tố trên lạc?
   Phương pháp kết hợp quan sát hình thái học và giải trình tự gen ITS qua PCR giúp định danh chính xác các chủng nấm sinh aflatoxin. Ngoài ra, sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS được dùng để xác định nồng độ độc tố.

3. Điều kiện nào thuận lợi cho nấm Aspergillus phát triển và sinh aflatoxin?
   Nấm phát triển tốt ở nhiệt độ 25-35ºC, độ ẩm 80-85%, pH 4,5-6,5 và hàm lượng nước trong hạt lạc từ 15-30%. Bảo quản không đúng cách tạo điều kiện cho nấm sinh độc tố.

4. Có thể loại bỏ aflatoxin trong lạc bằng cách nào?
   Một số phương pháp xử lý hóa học như dùng amoniac hoặc Ca(OH)2 có thể giảm 90% aflatoxin, nhưng chi phí cao và có thể ảnh hưởng đến mùi vị. Nghiên cứu công nghệ xử lý an toàn và hiệu quả đang được phát triển.

5. Tại sao cần kết hợp phương pháp hình thái và gen trong định danh nấm?
   Phương pháp hình thái truyền thống mất nhiều thời gian và dễ nhầm lẫn do đặc điểm tương đồng giữa các chủng. Giải trình tự gen ITS giúp tăng độ chính xác và nhanh chóng trong việc xác định loài nấm sinh độc tố.

Kết luận

• Đã phân lập và định danh thành công 30 chủng nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus từ hạt lạc tại Hà Nội bằng phương pháp hình thái học kết hợp giải trình tự gen ITS.
• Xác định được 2 chủng A. flavus sinh độc tố aflatoxin B1 với nồng độ 6,8 ppb và 8,6 ppb qua sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS.
• Phương pháp nghiên cứu kết hợp giúp nâng cao độ chính xác và hiệu quả trong phát hiện nấm sinh độc tố aflatoxin trên nông sản.
• Kết quả nghiên cứu góp phần quan trọng trong kiểm soát an toàn thực phẩm, bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và phát triển ngành sản xuất lạc.
• Đề xuất các giải pháp kiểm soát bảo quản, đào tạo và nghiên cứu công nghệ xử lý aflatoxin nhằm giảm thiểu nguy cơ ô nhiễm trong thực tế.

Hành động tiếp theo: Áp dụng quy trình phân lập và định danh trong các phòng kiểm nghiệm, triển khai các biện pháp bảo quản nghiêm ngặt, đồng thời thúc đẩy nghiên cứu xử lý aflatoxin hiệu quả. Đề nghị các cơ quan chức năng và doanh nghiệp phối hợp thực hiện để nâng cao chất lượng sản phẩm lạc trên thị trường.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Nấm mốc là nguyên nhân hàng đầu gây nên sự giảm chất lượng và phá hủy nông sản sau thu hoạch, hơn thế nữa nhiều chủng nấm còn sinh độc tố nấm (mycotoxin) nhiễm vào thực phẩm ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe con người khi không may ăn phải, phổ biến nhất là chi Aspergillus (A. parasiticus; …) có khả năng sinh độc tố aflatoxin, các chủng nấm thuộc chi này có phổ hoạt động rất rộng vì vậy có khả năng lây nhiễm trên nhiều loại nông sản như ngô, lạc, bông, đậu tương … Các loại hạt có dầu (đặc biệt như lạc) rất thích hợp cho sự phát triển của nấm Aspergillus cũng như sự hình thành độc tố aflatoxin, đây là một loại độc tố không bị phân hủy trong điều kiện đun nấu thông thường, có khả năng gây ung thư đối với người sử dụng lâu dài [4]. Cây lạc là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao. Cây lạc chiếm một vị trí quan trọng trong nền kinh tế thế giới không chỉ do được gieo trồng trên diện tích lớn ở trên 100 nước, mà còn vì lạc là nguồn cung cấp năng lượng (573 Kcal/100g), bổ sung đạm và chất béo quan trọng cho con người, do vậy hạt lạc được sử dụng rộng rãi để làm thực phẩm và nguyên liệu cho công nghiệp như sản xuất bánh kẹo.

Tuy nhiên trong điều kiện khí hậu nước ta, khí hậu nhiệt đới gió mùa, điều kiện bảo quản lạc trong các kho nhỏ lẻ chưa được quan tâm. Đó là điều kiện thuận lợi cho các loài nấm mốc phát triển, xâm nhiễm nếu không có biện pháp kiểm soát nghiêm ngặt. Trong những năm gần đây công tác vệ sinh an toàn thực phẩm đã có những tiến bộ rõ rệt và ngày càng được chú trọng. Từ những năm 70 các nhà khoa học dựa vào hình thái đã xây dựng được hệ thống phân loại nấm khá đầy đủ, phương pháp truyền thống dựa trên các kỹ thuật vi sinh cơ bản và hình thái học của sợi nấm, chồi và túi bào tử [4].

Tuy nhiên phương pháp truyền thống đòi hỏi thời gian tiến hành lâu thường 5 đến 10 ngày hệ sợi nấm mới phát triển đầy đủ. Do đó, các nhà khoa học đã phát triển kỹ thuật sinh học phân tử như kỹ thuật PCR, giải trình gen… để phát hiện và định danh nấm sinh độc tố aflatoxin. Và phương pháp sắc ký lỏng khối phổ được dùng để xác định khả năng sinh độc tố aflatoxin của các chủng nấm. 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Xuất phát từ thực tế trên, để đảm bảo chất lượng sản phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng chúng tôi tiến hành đề tài " phân lập nấm Aspergillus flavus và Aspergillus paraciticus sinh độc tố từ hạt lạc ".

Mục đích - Yêu cầu 1. Mục đích Phân lập, định danh chủng nấm sinh độc tố aflatoxin trên lạc bằng phương pháp hình thái học kết hợp giải trình tự gen ITS. Từ đó xác định khả năng sinh độc tố aflatoxin của các chủng nấm. Yêu cầu - Phân lập được chủng nấm mốc A.

parasiticus có khả năng sinh độc tố afatoxin của các mẫu lạc thu thập từ các chợ tại Hà Nội; - Xây dựng được phương pháp định danh nấm mốc sinh độc tố aflatoxin dựa vào hình thái kết hợp giải trình tự gen ITS; - Phân tích khả năng sinh độc tố afatoxin bằng sắc ký lỏng khối phổ. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] PHẦN THỨ HAI - TỔNG QUAN 2. Giới thiệu chung về lạc 2. Cấu tạo của lạc Lạc còn được gọi là đậu phộng hay đậu phụng (tên khoa học là Arachis hypogaea L), là một loài cây thực phẩm thuộc họ Đậu có nguồn gốc tại Trung và Nam Mỹ.

Nó là loài cây thân thảo hàng năm có thể cao từ 3-50 cm. Hoa dạng hoa đậu điển hình màu vàng có điểm gân đỏ, cuống hoa dài 2-4 cm. Sau khi thụ phấn, quả phát triển thành một dạng quả đậu dài 3-7 cm, chứa 1-4 hạt (ánh), và quả (củ) thường dấu xuống đất để phát triển. Hạt lạc là loại thực phẩm rất giàu năng lượng vì có chứa nhiều lipid.

Theo bảng thành phần dinh dưỡng các chất trong thực phẩm, hạt lạc có chứa nước 7,5%; protein 27,5%; chất béo 44,5%; glucid 15,5%; cellulose 2,5% và một lượng nhỏ vitamin (PP, E, B5, B1, B2, B6, Folat ), các axid amin và các nguyên tố vi lượng ( K, P, Mg , Mn, Fe, Na, Zn, Cu. Trong thành phần chất đạm (protein) có một globulin là arachin (60-70%) và một albumin là conarachin (25-40%) cả hai chất này đều không tan trong nước. Cả arachin và conarachin đều cho các acid amin như methionin, tryptophan và d-threonin. Thành phần chủ yếu trong nhân lạc là dầu lạc.

Nó gồm các glycerid của acid béo no và không no, với tỷ lệ thay đổi rất nhiều tuỳ theo loại lạc, acid oleic 51-79%; acid linoleic 7,4-26%, acid palmitic 8,5% acid stearic 4,5- 6,2%, acid hexaconic 0,1-0,4% và 2 acid chỉ thấy trong dầu lạc là acid arachidic và acid lignoceric [11]. Giá trị và công dụng của lạc đối với đời sống của con người Lạc là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao. Cây lạc chiếm một vị trí quan trọng trong nền kinh tế thế giới không chỉ do được gieo trồng trên diện tích lớn ở trên 100 nước, mà còn vì lạc là nguồn cung cấp năng lượng (573 Kcal/100g), bổ sung đạm và chất béo quan trọng cho con người, do vậy hạt lạc được sử dụng rộng rãi để làm thực phẩm và nguyên liệu cho công nghiệp. Với giá trị dinh dưỡng của lạc, con người đã sử dụng như một nguồn thực phẩm quan trọng.

Ngoài việc dùng để ăn dưới nhiều hình thức như luộc, rang, nấu xôi, làm bánh kẹo, chao dầu… Lạc được dùng để ép dầu ăn và khô dầu để chế biến nước chấm và chế biến các mặt hàng khác. Sản phẩm phụ của lạc là thức ăn quý cho động vật 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Khi ép dầu sản phẩm phụ là khô dầu với lượng dinh dưỡng khá cao làm thức ăn cho gia súc gia cầm. Khi phân tích thân lá lạc thì có 47% đường bột, trên 15% chất hữu cơ chứa nitơ và 1,8% chất béo nên thân lá lạc cũng có thể dùng làm thức ăn cho gia súc.

Gần đây nhờ công nghiệp thực phẩm phát triển, người ta chế biến nhiều mặt hàng thực phẩm có giá trị từ lạc như lạc rút dầu, bơ lạc, chao, phomat sữa, sữa lạc…, được sử dụng chế biến nhiều loại thuốc trong y dược, dùng làm dầu nhờn để xoa máy, bỏ trục xe, loại dầu xấu dùng để nấu xà phòng. Bên cạnh giá trị dinh dưỡng cho con người và là tài nguyên cho các ngành khác. Cây lạc còn là cây quan trọng nhất trong hệ thống luân canh cây trồng đạt hiệu quả cao vì nó có tác dụng cải tạo đất tốt. Nhu cầu sử dụng và tiêu thụ lạc ngày càng tăng đã và đang khuyến khích đầu tư phát triển sản phẩm lạc với quy mô ngày càng mở rộng ở các quốc gia trên thế giới.

Lạc còn có nhiều công dụng tốt cho sức khỏe, đặc biệt là đối với những người ăn kiêng và mắc bệnh tim mạch [11]. Trên thị trường thương mại thế giới lạc là mặt hàng xuất khẩu đem lại kim ngạch cao của nhiều nước. Do giá trị nhiều mặt của hạt lạc nên chưa bao giờ lạc mất thị trường tiêu thụ. Theo số liệu của FAO 1999, có 100 nước đang trồng và xuất khẩu lạc.

Ở Senegal, giá trị lạc chiếm 80% giá trị xuất khẩu, ở Nigieria chiếm 60% giá trị xuất khẩu. Hiện nay có 4 nước xuất khẩu lạc chủ yếu, đó là: Trung Quốc, Mỹ, Ấn Độ và Việt Nam. Các nước phải nhập khẩu lạc là Nhật Bản , Canada, Philipin, Đức… Ở Việt Nam sản lượng lạc xuất khẩu dao động từ 100-130 nghìn tấn/ năm [21]. Nấm mốc sinh độc tố aflatoxin trên lạc 2.

Các loại nấm sinh aflatoxin trên lạc Nấm mốc sinh độc tố aflatoxin trên sản phẩm nông sản (đặc biệt là lạc) thuộc chi Aspergillus gồm A. parasiticus có mối quan hệ chặt chẽ về cấu trúc gen và là hai loài có khả năng sinh độc tố aflatoxin mạnh nhất. Việc xác định các loài sinh aflatoxin hiện tại dựa vào đặc điểm hình thái và loại mycotoxin sản sinh ra hoặc dựa vào trình tự ADN (Ito và cộng sự, 2000). Đặc điểm hình thái A.

parasiticus đều thuộc họ nấm cúc có khả năng sinh độc tố aflatoxin trong môi trường tự nhiên và môi trường nuôi cấy. Đặc điểm hình thái của A. flavus 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. flavus phân bố ở khắp nơi trên trái đất: Dưới đất, trên các nông sản thực phẩm đặc biệt là trên lạc và sản phẩm từ lạc là nơi phát triển ưa thích của chúng.

Con đường xâm nhập của A. flavus là chúng xâm nhập qua các điểm tiếp hợp nhờ những chỗ do côn trùng hủy hoại gây ra. Tuy nhiên ở cây lạc tươi A. flavus khó xâm nhập hơn vì vậy mà chúng xâm nhập khi củ lạc già, nhất là sau khi thu hoạch.

flavus xâm nhập vào hạt lạc chứa 15- 30 % nước, tức là vào thời gian đầu của việc làm khô [4]. flavus có khả năng sinh các loại độc tố AFB1, AFB2 và axid cyclopyazonic (CPA). Đặc điểm hình thái của A. parasiticus có đặc điểm hình thái tương tự A.

flavus song bào tử của A. parasiticus thường có màu xanh lục, có khả năng sinh các loại độc tố AFB1, AFB2 nhưng không có khả năng sinh axid cyclopyazonic (CPA). Mặc dù có sự tương đồng khá lớn về đặc điểm hình thái nhưng người ta vẫn tìm được một số khác biệt nhỏ giữa A. Sự khác biệt giữa hai chủng này có thể tóm tắt trong bảng dưới đây: Bảng 2.

Đặc điểm hình thái nấm A. parasiticus [6,7] Đặc điểm A. parasiticus Đường kính - d = 3-5 cm - d = 2- 3 cm Màu sắc - Ban đầu hơi vàng cuối - Khóm nấm xanh lục, hơi Đại xanh lục hoặc vàng lục vàng thể - Đôi khi hóa nâu khi già - Không bao giờ hóa nâu khi già Bông - Lớn, cầu, tỏa tia, đôi khi - Nhỏ, cầu hoặc tỏa tia tạo cột không rõ Bọng - Cầu - gần cầu - Hình gần cầu Vi thể Thể bình - 1 hoặc 2 tầng - 1 tầng Vách cuống - Xù xì - Xù xì Hạt đính - Cầu đến gần cầu, trơn hoặc Cầu, vách có gai 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] có gai Theo các kết quả nghiên cứu không phải tất cả các loại A. flavus đều có khả năng sinh độc tố aflatoxin nhưng phần lớn các chủng A.

parasiticus phân lập được lại đều sinh tổng hợp aflatoxin. flavus tạo thành aflatoxin lạc chiếm 40 - 50 %. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng A.