Tổng quan nghiên cứu

Ngô (Zea mays L.) là một trong ba cây ngũ cốc quan trọng nhất trên thế giới, đóng vai trò thiết yếu trong cung cấp lương thực và thức ăn cho gia súc. Ở Việt Nam, ngô là cây lương thực thứ hai sau lúa, đặc biệt phổ biến ở các vùng trung du và miền núi phía Bắc. Theo số liệu của Tổng cục Thống kê năm 2016, diện tích trồng ngô tại các tỉnh miền núi như Hà Giang, Cao Bằng, Sơn La và Lào Cai lần lượt là 53.500 ha, 40.100 ha, 152.400 ha và 37.600 ha, vượt trội so với diện tích trồng lúa. Tuy nhiên, do đặc điểm địa hình đồi núi chiếm khoảng 75% diện tích và lượng mưa không đồng đều, tình trạng hạn hán thường xuyên xảy ra đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất ngô, đặc biệt là các giống ngô nếp địa phương.

Ngô nếp địa phương có chất lượng hạt cao và khả năng chịu hạn tốt, phù hợp với điều kiện đất dốc ở miền núi, nhưng năng suất thấp khiến nhiều giống quý có nguy cơ bị mai một. Anthocyanin, một loại sắc tố flavonoid, không chỉ tạo màu sắc cho cây mà còn có khả năng chống oxy hóa mạnh, giúp tế bào thực vật duy trì cân bằng nước khi chịu stress hạn. Do đó, anthocyanin được xem là chỉ thị sinh học quan trọng trong nghiên cứu tính chịu hạn của cây trồng.

Mục tiêu nghiên cứu là phân lập và phân tích đặc điểm trình tự gen Lc mã hóa protein điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin từ giống ngô nếp địa phương Nà Hạo (NH), nhằm góp phần bảo tồn nguồn gen quý và phát triển các giống ngô chịu hạn hiệu quả. Nghiên cứu được thực hiện tại Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên và Viện Khoa học sự sống – Đại học Nông lâm, trong năm 2018. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển giống ngô nếp địa phương có khả năng chịu hạn, nâng cao năng suất và giá trị kinh tế cho nông dân vùng núi.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình về sinh tổng hợp anthocyanin và cơ chế chịu hạn ở thực vật. Anthocyanin là nhóm flavonoid có cấu trúc aglucon đặc trưng, có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 510-540 nm, màu sắc thay đổi theo pH môi trường. Anthocyanin không chỉ tạo màu mà còn có vai trò chống oxy hóa, bảo vệ tế bào khỏi các gốc oxy hoạt hóa (ROS) sinh ra trong điều kiện stress hạn.

Quá trình sinh tổng hợp anthocyanin ở ngô được điều hòa bởi các gen cấu trúc như CHS, DFR, ANS và các yếu tố phiên mã (TF) thuộc họ MYB, bHLH (MYC) và WD40. Gen Lc thuộc họ bHLH, mã hóa protein điều hòa các enzyme xúc tác tổng hợp anthocyanin, có vai trò quan trọng trong việc tăng cường biểu hiện các gen cấu trúc và nâng cao hàm lượng anthocyanin. Protein Lc có cấu trúc gồm các vùng chức năng như MIR (vùng tương tác với MYB), bHLH (vùng liên kết DNA) và vùng dimer hóa đầu C, có tín hiệu định vị nhân quan trọng.

Cơ chế chịu hạn ở ngô liên quan đến khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu, phát triển bộ rễ, tổng hợp các chất hòa tan và protein đặc hiệu, cũng như hệ thống enzyme chống oxy hóa như SOD, APX. Anthocyanin đóng vai trò như chất chống oxy hóa mạnh, giúp giảm thiểu tổn thương do ROS trong điều kiện hạn.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là giống ngô nếp địa phương Nà Hạo (NH), được lựa chọn dựa trên khả năng chịu hạn tốt trong số 10 giống nghiên cứu trước đó. Thí nghiệm được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Di truyền và Công nghệ gen, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên và Viện Khoa học sự sống – Đại học Nông lâm.

Phương pháp gây hạn nhân tạo được áp dụng trên cây ngô non giai đoạn 3 lá, trồng trên giá thể cát và đất mùn, tưới đủ nước ban đầu rồi ngừng tưới để tạo stress hạn trong 7 ngày. Mẫu thân và bẹ lá được thu thập, bảo quản ở -30°C.

RNA tổng số được tách chiết bằng phương pháp Trizol, sau đó tổng hợp cDNA từ mRNA bằng kỹ thuật RT-PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu LcF/LcR thiết kế dựa trên trình tự gen Lc trên ngân hàng gen quốc tế. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di gel agarose 1%, sau đó gắn vào vector pBT, biến nạp vào chủng E.coli DH5α để tạo dòng tái tổ hợp.

Các dòng khuẩn lạc được chọn lọc dựa trên màu sắc khuẩn lạc và kiểm tra bằng phản ứng clony-PCR, enzyme giới hạn BamHI để xác định sự có mặt của đoạn gen Lc. Trình tự nucleotide của gen Lc được xác định bằng phương pháp giải trình tự Sanger trên thiết bị ABIPRISM 3100.

Phân tích dữ liệu trình tự gen và protein suy diễn được thực hiện bằng phần mềm BioEdit, DNAstar, so sánh với các trình tự trên GenBank để đánh giá sự tương đồng và khác biệt. Cỡ mẫu RNA và số lượng dòng khuẩn lạc được chọn lọc đảm bảo độ tin cậy của kết quả. Thời gian nghiên cứu kéo dài trong năm 2018.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Phân lập thành công gen Lc từ giống ngô nếp NH: Sản phẩm RT-PCR có kích thước khoảng 1,8 kb, tương ứng với đoạn cDNA gen Lc. Dòng plasmid tái tổ hợp mang gen Lc được xác nhận qua phản ứng clony-PCR và enzyme BamHI, với đoạn DNA cắt rời có kích thước 1,8 kb, phù hợp với kích thước gen mong đợi.

  2. Trình tự nucleotide gen Lc: Gen Lc của giống NH dài 9539 bp (bao gồm intron và exon), cDNA dài 1833 nucleotide, mã hóa protein 610 amino acid. So sánh trình tự gen Lc của NH với các trình tự trên GenBank cho thấy độ tương đồng cao từ 99,23% đến 99,56%. Có 14 vị trí nucleotide khác biệt so với trình tự NM001111869 và KJ726800, 8 vị trí khác so với M26227.

  3. Phân tích protein Lc suy diễn: Protein Lc suy diễn gồm 610 amino acid, có 8 vị trí amino acid khác biệt so với trình tự NM001111869 và KJ726800, 5 vị trí khác so với M26227. Các vị trí sai khác chủ yếu nằm trong vùng có tính axit và vùng bHLH, vùng bHLH là vùng bảo thủ quan trọng cho chức năng liên kết DNA và điều hòa phiên mã.

  4. Mối quan hệ di truyền: Trình tự gen và protein Lc của giống NH có sự tương đồng rất cao với các gen thuộc họ bHLH và gen R đã công bố trên GenBank, với hệ số tương đồng di truyền từ 98,6% đến 99%. Điều này khẳng định gen Lc phân lập từ giống NH thuộc nhóm gen điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin.

Thảo luận kết quả

Sự thành công trong phân lập gen Lc từ giống ngô nếp địa phương NH khẳng định khả năng ứng dụng kỹ thuật RT-PCR và công nghệ tái tổ hợp trong nghiên cứu gen điều hòa tính chịu hạn. Độ tương đồng cao của trình tự gen và protein Lc với các trình tự đã công bố cho thấy tính bảo thủ của gen Lc trong họ bHLH, đồng thời các vị trí sai khác nucleotide và amino acid có thể liên quan đến sự khác biệt về khả năng chịu hạn và tổng hợp anthocyanin của giống NH.

Các vị trí amino acid khác biệt trong vùng bHLH và vùng MIR có thể ảnh hưởng đến hoạt động phiên mã của protein Lc, từ đó điều hòa biểu hiện các gen cấu trúc tổng hợp anthocyanin, góp phần tăng cường khả năng chống oxy hóa và chịu hạn. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây trên các loài thực vật khác, cho thấy sự thay đổi nhỏ trong protein bHLH có thể làm tăng hàm lượng anthocyanin lên nhiều lần.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh trình tự nucleotide và amino acid, bảng hệ số tương đồng di truyền, cũng như sơ đồ cây phân loại di truyền để minh họa mối quan hệ giữa gen Lc của giống NH và các gen họ bHLH khác. Những phát hiện này mở ra hướng nghiên cứu sâu hơn về biểu hiện gen Lc và chức năng điều hòa trong điều kiện hạn, góp phần phát triển giống ngô nếp địa phương có khả năng chịu hạn cao.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Tiếp tục nghiên cứu biểu hiện gen Lc: Thực hiện các thí nghiệm định lượng biểu hiện gen Lc và các gen cấu trúc liên quan trong điều kiện hạn để làm rõ vai trò điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin. Thời gian thực hiện trong 1-2 năm, chủ thể là các nhóm nghiên cứu sinh học phân tử.

  2. Phân tích chức năng protein Lc: Sử dụng kỹ thuật đột biến điểm và biến đổi gen để đánh giá ảnh hưởng của các vị trí amino acid sai khác đến hoạt động phiên mã và tổng hợp anthocyanin. Mục tiêu nâng cao hàm lượng anthocyanin và khả năng chịu hạn, thực hiện trong 2-3 năm.

  3. Ứng dụng công nghệ gen trong chọn tạo giống: Tạo các dòng ngô chuyển gen Lc có biểu hiện vượt trội để phát triển giống ngô nếp địa phương chịu hạn, tăng năng suất và chất lượng hạt. Chủ thể thực hiện là các trung tâm nghiên cứu giống cây trồng, thời gian 3-5 năm.

  4. Bảo tồn và phát triển nguồn gen ngô nếp địa phương: Sưu tập, đánh giá và bảo tồn các giống ngô nếp có khả năng chịu hạn tốt, đồng thời phổ biến kỹ thuật nhân giống và canh tác phù hợp cho nông dân vùng núi. Thời gian liên tục, phối hợp giữa các viện nghiên cứu và địa phương.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Nhà nghiên cứu di truyền học và sinh học phân tử: Có thể ứng dụng phương pháp phân lập gen và phân tích trình tự để nghiên cứu các gen điều hòa khác liên quan đến tính chịu hạn và chất lượng cây trồng.

  2. Chuyên gia phát triển giống cây trồng: Sử dụng kết quả nghiên cứu để phát triển giống ngô nếp địa phương có khả năng chịu hạn cao, nâng cao năng suất và giá trị kinh tế.

  3. Nông dân và cán bộ kỹ thuật vùng miền núi: Áp dụng kiến thức về đặc điểm sinh học và khả năng chịu hạn của giống ngô nếp địa phương để lựa chọn giống phù hợp và kỹ thuật canh tác hiệu quả.

  4. Sinh viên và học viên cao học ngành sinh học, công nghệ sinh học: Tham khảo quy trình nghiên cứu, kỹ thuật phân lập gen, phân tích trình tự và ứng dụng công nghệ gen trong nghiên cứu thực vật.

Câu hỏi thường gặp

  1. Gen Lc có vai trò gì trong sinh tổng hợp anthocyanin?
    Gen Lc mã hóa protein thuộc họ bHLH, điều hòa biểu hiện các gen cấu trúc xúc tác tổng hợp anthocyanin, từ đó tăng hàm lượng sắc tố này trong cây, góp phần bảo vệ cây khỏi stress oxy hóa.

  2. Tại sao chọn giống ngô nếp Nà Hạo để nghiên cứu?
    Giống Nà Hạo được xác định có khả năng chịu hạn tốt nhất trong số 10 giống ngô nếp địa phương nghiên cứu trước đó, phù hợp làm vật liệu nghiên cứu gen điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin.

  3. Phương pháp gây hạn nhân tạo được thực hiện như thế nào?
    Cây ngô non giai đoạn 3 lá được trồng trên giá thể cát và đất mùn, tưới đủ nước ban đầu, sau đó ngừng tưới trong 7 ngày để tạo stress hạn, mô phỏng điều kiện hạn thực tế.

  4. Sự khác biệt về trình tự amino acid ảnh hưởng thế nào đến chức năng protein Lc?
    Các vị trí amino acid sai khác trong vùng bHLH và MIR có thể làm thay đổi khả năng liên kết DNA và tương tác với protein MYB, ảnh hưởng đến hoạt động phiên mã và hiệu quả tổng hợp anthocyanin.

  5. Kết quả nghiên cứu có thể ứng dụng thực tiễn ra sao?
    Kết quả giúp phát triển giống ngô nếp địa phương chịu hạn, bảo tồn nguồn gen quý, đồng thời cung cấp cơ sở khoa học cho công nghệ gen trong chọn tạo giống cây trồng có năng suất và chất lượng cao.

Kết luận

  • Đã phân lập thành công gen Lc dài 1833 bp từ giống ngô nếp địa phương Nà Hạo bằng kỹ thuật RT-PCR và tạo dòng tái tổ hợp trong E.coli.
  • Trình tự gen Lc có độ tương đồng cao (99,23% - 99,56%) với các gen họ bHLH đã công bố, với 14 vị trí nucleotide và 8 vị trí amino acid khác biệt so với trình tự tham chiếu.
  • Protein Lc suy diễn gồm 610 amino acid, các vị trí sai khác tập trung ở vùng bHLH và MIR, có thể ảnh hưởng đến chức năng điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin.
  • Mối quan hệ di truyền cho thấy gen Lc của giống NH thuộc nhóm gen điều hòa anthocyanin, có tiềm năng ứng dụng trong chọn tạo giống ngô chịu hạn.
  • Đề xuất nghiên cứu tiếp tục về biểu hiện gen và chức năng protein Lc để phát triển giống ngô nếp địa phương có khả năng chịu hạn cao, nâng cao năng suất và giá trị kinh tế.

Luận văn mở ra hướng nghiên cứu mới về cơ chế điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin liên quan đến tính chịu hạn ở ngô nếp địa phương, góp phần bảo tồn nguồn gen quý và phát triển nông nghiệp bền vững vùng miền núi. Các nhà nghiên cứu và chuyên gia được khuyến khích tiếp tục triển khai các nghiên cứu sâu hơn và ứng dụng công nghệ gen trong chọn tạo giống cây trồng.