Luận văn thạc sĩ hay phân lập gen mã hóa protein lc điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin từ cây ngô nếp địa phương

Luận văn thạc sĩ phân tích gen mã hóa protein lc điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin từ cây ngô nếp địa phương, khám phá tiềm năng ứng dụng.

• Tác giả: Nguyễn Thị Khuyên
• Người hướng dẫn: TS. Phạm Thị Thanh Nhàn
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Phân lập gen Lc điều hòa tổng hợp anthocyanin từ ngô nếp địa phương
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu của đề tài
• 1.2. Nội dung nghiên cứu
• 2. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Sơ lược về cây ngô
• 2.1.1. Đặc điểm sinh học của cây ngô
• 2.2. Giá trị dinh dưỡng và kinh tế của ngô nếp
• 2.3. Hạn và phản ứng của cây ngô trước tác động của hạn
• 2.3.1. Hạn và tính chống chịu stress oxy hóa
• 2.3.1.1. Mối liên quan giữa hạn và stress oxy hóa
• 2.4. Anthocyanin và vai trò chuyển hóa các dạng oxy hoạt hóa
• 2.5. Vai trò của anthocyanin khi thực vật bị hạn
• 2.6. Gen điều hoà tổng hợp anthocyanin ở cây ngô
• 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Hoá chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu
• 3.2. Địa điểm nghiên cứu
• 3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3.1. Phương pháp gây hạn nhân tạo
• 3.3.2. Phương pháp tách chiết RNA tổng số
• 3.3.3. Phương pháp RT-PCR
• 3.3.4. Tạo vector tái tổ hợp
• 3.3.5. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E.
• 3.3.6. Kiểm tra sản phẩm tách dòng
• 3.3.7. Phương pháp xác định trình tự gen
• 3.3.8. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả phân lập gen Lc từ giống ngô nếp địa phương NH
• 4.2. Kết quả tách dòng phân tử mang gen Lc từ giống NH
• 4.3. Kết quả xác định trình tự nucleotide của gen Lc ở giống ngô nếp NH
• 4.4. Đặc điểm trình tự gen Lc của giống ngô nếp địa phương NH
• 4.5. So sánh trình tự gen Lc của giống NH với các trình tự trên GenBank
• 4.6. Phân tích sự tương đồng gen Lc của giống NH với các gen khác trong họ bHLH
• 4.7. Đặc điểm trình tự protein Lc suy diễn của giống ngô nếp địa phương NH
• 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về phân lập gen Lc điều hòa tổng hợp anthocyanin

Phân lập gen Lc từ cây ngô nếp địa phương là một nghiên cứu quan trọng trong lĩnh vực di truyền học. Gen Lc có vai trò điều hòa quá trình tổng hợp anthocyanin, một loại sắc tố có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao. Nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế di truyền mà còn mở ra hướng đi mới cho việc phát triển giống ngô chịu hạn. Việc phân lập gen Lc từ ngô nếp địa phương sẽ cung cấp thông tin quý giá cho các nghiên cứu tiếp theo.

1.1. Đặc điểm của gen Lc và vai trò trong tổng hợp anthocyanin

Gen Lc mã hóa cho protein có khả năng điều hòa tổng hợp anthocyanin, giúp cây ngô nếp có màu sắc đặc trưng. Sự hiện diện của anthocyanin không chỉ tạo màu sắc mà còn có tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ cây khỏi các tác động tiêu cực từ môi trường.

1.2. Tầm quan trọng của ngô nếp địa phương trong nghiên cứu

Ngô nếp địa phương có khả năng chịu hạn tốt và chất lượng hạt cao. Việc nghiên cứu gen Lc từ giống ngô này không chỉ bảo tồn nguồn gen mà còn tạo ra các giống mới có khả năng thích ứng tốt hơn với điều kiện khí hậu khắc nghiệt.

II. Thách thức trong việc phân lập gen Lc từ ngô nếp địa phương

Việc phân lập gen Lc từ ngô nếp địa phương gặp nhiều thách thức. Đầu tiên, điều kiện môi trường và kỹ thuật tách chiết RNA có thể ảnh hưởng đến chất lượng mẫu. Thứ hai, sự đa dạng di truyền giữa các giống ngô nếp địa phương cũng làm cho quá trình phân lập gen trở nên phức tạp hơn. Những thách thức này cần được giải quyết để đảm bảo kết quả nghiên cứu chính xác.

2.1. Khó khăn trong việc tách chiết RNA từ mẫu ngô

Quá trình tách chiết RNA từ ngô nếp địa phương có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như độ tuổi của cây, điều kiện sinh trưởng và phương pháp tách chiết. Điều này có thể dẫn đến sự suy giảm chất lượng RNA, ảnh hưởng đến kết quả phân tích gen.

2.2. Đặc điểm di truyền đa dạng của ngô nếp địa phương

Ngô nếp địa phương có sự đa dạng di truyền cao, điều này có thể gây khó khăn trong việc xác định gen Lc. Sự khác biệt về trình tự gen giữa các giống có thể dẫn đến những kết quả không đồng nhất trong nghiên cứu.

III. Phương pháp phân lập gen Lc điều hòa tổng hợp anthocyanin

Để phân lập gen Lc, các phương pháp hiện đại như RT-PCR và tạo vector tái tổ hợp được áp dụng. Những phương pháp này giúp khuếch đại gen Lc từ mẫu RNA, sau đó tách dòng và xác định trình tự gen. Việc sử dụng công nghệ sinh học hiện đại sẽ nâng cao độ chính xác và hiệu quả trong nghiên cứu.

3.1. Kỹ thuật RT PCR trong phân lập gen Lc

RT-PCR là một kỹ thuật quan trọng trong việc khuếch đại cDNA từ RNA. Kỹ thuật này cho phép xác định sự biểu hiện của gen Lc trong các điều kiện khác nhau, từ đó giúp hiểu rõ hơn về vai trò của nó trong tổng hợp anthocyanin.

3.2. Tạo vector tái tổ hợp để tách dòng gen Lc

Tạo vector tái tổ hợp là bước quan trọng trong việc tách dòng gen Lc. Vector này sẽ giúp đưa gen Lc vào tế bào chủ, từ đó tạo ra các dòng tế bào có khả năng biểu hiện gen Lc, phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.

IV. Ứng dụng thực tiễn của gen Lc trong nghiên cứu và phát triển giống ngô

Gen Lc không chỉ có giá trị trong nghiên cứu mà còn có ứng dụng thực tiễn trong phát triển giống ngô mới. Việc hiểu rõ về gen này sẽ giúp tạo ra các giống ngô có khả năng chịu hạn tốt hơn, từ đó nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm. Điều này đặc biệt quan trọng trong bối cảnh biến đổi khí hậu hiện nay.

4.1. Tạo giống ngô chịu hạn từ gen Lc

Việc ứng dụng gen Lc trong tạo giống ngô chịu hạn sẽ giúp cải thiện khả năng sinh trưởng và năng suất của cây trồng. Các giống ngô mới này có thể đáp ứng tốt hơn với điều kiện khí hậu khắc nghiệt, góp phần đảm bảo an ninh lương thực.

4.2. Nâng cao giá trị dinh dưỡng của ngô nếp

Gen Lc cũng có thể được sử dụng để nâng cao giá trị dinh dưỡng của ngô nếp. Sự tăng cường tổng hợp anthocyanin sẽ không chỉ cải thiện màu sắc mà còn tăng cường hoạt tính sinh học, mang lại lợi ích cho sức khỏe người tiêu dùng.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu về gen Lc

Nghiên cứu về gen Lc điều hòa tổng hợp anthocyanin từ ngô nếp địa phương mở ra nhiều triển vọng mới trong lĩnh vực di truyền học và nông nghiệp. Việc phân lập và ứng dụng gen này không chỉ giúp bảo tồn nguồn gen quý mà còn tạo ra các giống ngô mới có giá trị kinh tế cao. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều lợi ích cho ngành nông nghiệp Việt Nam.

5.1. Tương lai của nghiên cứu gen Lc trong nông nghiệp

Nghiên cứu gen Lc sẽ tiếp tục được mở rộng để tìm hiểu sâu hơn về cơ chế điều hòa tổng hợp anthocyanin. Điều này sẽ giúp phát triển các giống ngô mới có khả năng thích ứng tốt hơn với điều kiện môi trường.

5.2. Đề xuất hướng nghiên cứu tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc xác định các gen khác liên quan đến khả năng chịu hạn và tổng hợp anthocyanin. Việc kết hợp các công nghệ sinh học hiện đại sẽ giúp nâng cao hiệu quả nghiên cứu và phát triển giống ngô.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ngô (Zea mays L.) là một trong ba cây ngũ cốc quan trọng nhất trên thế giới, đóng vai trò thiết yếu trong cung cấp lương thực và thức ăn cho gia súc. Ở Việt Nam, ngô là cây lương thực thứ hai sau lúa, đặc biệt phổ biến ở các vùng trung du và miền núi phía Bắc. Theo số liệu của Tổng cục Thống kê năm 2016, diện tích trồng ngô tại các tỉnh miền núi như Hà Giang, Cao Bằng, Sơn La và Lào Cai lần lượt là 53.500 ha, 40.100 ha, 152.400 ha và 37.600 ha, vượt trội so với diện tích trồng lúa. Tuy nhiên, do đặc điểm địa hình đồi núi chiếm khoảng 75% diện tích và lượng mưa không đồng đều, tình trạng hạn hán thường xuyên xảy ra đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất ngô, đặc biệt là các giống ngô nếp địa phương.

Ngô nếp địa phương có chất lượng hạt cao và khả năng chịu hạn tốt, phù hợp với điều kiện đất dốc ở miền núi, nhưng năng suất thấp khiến nhiều giống quý có nguy cơ bị mai một. Anthocyanin, một loại sắc tố flavonoid, không chỉ tạo màu sắc cho cây mà còn có khả năng chống oxy hóa mạnh, giúp tế bào thực vật duy trì cân bằng nước khi chịu stress hạn. Do đó, anthocyanin được xem là chỉ thị sinh học quan trọng trong nghiên cứu tính chịu hạn của cây trồng.

Mục tiêu nghiên cứu là phân lập và phân tích đặc điểm trình tự gen Lc mã hóa protein điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin từ giống ngô nếp địa phương Nà Hạo (NH), nhằm góp phần bảo tồn nguồn gen quý và phát triển các giống ngô chịu hạn hiệu quả. Nghiên cứu được thực hiện tại Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên và Viện Khoa học sự sống – Đại học Nông lâm, trong năm 2018. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển giống ngô nếp địa phương có khả năng chịu hạn, nâng cao năng suất và giá trị kinh tế cho nông dân vùng núi.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình về sinh tổng hợp anthocyanin và cơ chế chịu hạn ở thực vật. Anthocyanin là nhóm flavonoid có cấu trúc aglucon đặc trưng, có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 510-540 nm, màu sắc thay đổi theo pH môi trường. Anthocyanin không chỉ tạo màu mà còn có vai trò chống oxy hóa, bảo vệ tế bào khỏi các gốc oxy hoạt hóa (ROS) sinh ra trong điều kiện stress hạn.

Quá trình sinh tổng hợp anthocyanin ở ngô được điều hòa bởi các gen cấu trúc như CHS, DFR, ANS và các yếu tố phiên mã (TF) thuộc họ MYB, bHLH (MYC) và WD40. Gen Lc thuộc họ bHLH, mã hóa protein điều hòa các enzyme xúc tác tổng hợp anthocyanin, có vai trò quan trọng trong việc tăng cường biểu hiện các gen cấu trúc và nâng cao hàm lượng anthocyanin. Protein Lc có cấu trúc gồm các vùng chức năng như MIR (vùng tương tác với MYB), bHLH (vùng liên kết DNA) và vùng dimer hóa đầu C, có tín hiệu định vị nhân quan trọng.

Cơ chế chịu hạn ở ngô liên quan đến khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu, phát triển bộ rễ, tổng hợp các chất hòa tan và protein đặc hiệu, cũng như hệ thống enzyme chống oxy hóa như SOD, APX. Anthocyanin đóng vai trò như chất chống oxy hóa mạnh, giúp giảm thiểu tổn thương do ROS trong điều kiện hạn.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là giống ngô nếp địa phương Nà Hạo (NH), được lựa chọn dựa trên khả năng chịu hạn tốt trong số 10 giống nghiên cứu trước đó. Thí nghiệm được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Di truyền và Công nghệ gen, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên và Viện Khoa học sự sống – Đại học Nông lâm.

Phương pháp gây hạn nhân tạo được áp dụng trên cây ngô non giai đoạn 3 lá, trồng trên giá thể cát và đất mùn, tưới đủ nước ban đầu rồi ngừng tưới để tạo stress hạn trong 7 ngày. Mẫu thân và bẹ lá được thu thập, bảo quản ở -30°C.

RNA tổng số được tách chiết bằng phương pháp Trizol, sau đó tổng hợp cDNA từ mRNA bằng kỹ thuật RT-PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu LcF/LcR thiết kế dựa trên trình tự gen Lc trên ngân hàng gen quốc tế. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di gel agarose 1%, sau đó gắn vào vector pBT, biến nạp vào chủng E.coli DH5α để tạo dòng tái tổ hợp.

Các dòng khuẩn lạc được chọn lọc dựa trên màu sắc khuẩn lạc và kiểm tra bằng phản ứng clony-PCR, enzyme giới hạn BamHI để xác định sự có mặt của đoạn gen Lc. Trình tự nucleotide của gen Lc được xác định bằng phương pháp giải trình tự Sanger trên thiết bị ABIPRISM 3100.

Phân tích dữ liệu trình tự gen và protein suy diễn được thực hiện bằng phần mềm BioEdit, DNAstar, so sánh với các trình tự trên GenBank để đánh giá sự tương đồng và khác biệt. Cỡ mẫu RNA và số lượng dòng khuẩn lạc được chọn lọc đảm bảo độ tin cậy của kết quả. Thời gian nghiên cứu kéo dài trong năm 2018.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Phân lập thành công gen Lc từ giống ngô nếp NH: Sản phẩm RT-PCR có kích thước khoảng 1,8 kb, tương ứng với đoạn cDNA gen Lc. Dòng plasmid tái tổ hợp mang gen Lc được xác nhận qua phản ứng clony-PCR và enzyme BamHI, với đoạn DNA cắt rời có kích thước 1,8 kb, phù hợp với kích thước gen mong đợi.

2. Trình tự nucleotide gen Lc: Gen Lc của giống NH dài 9539 bp (bao gồm intron và exon), cDNA dài 1833 nucleotide, mã hóa protein 610 amino acid. So sánh trình tự gen Lc của NH với các trình tự trên GenBank cho thấy độ tương đồng cao từ 99,23% đến 99,56%. Có 14 vị trí nucleotide khác biệt so với trình tự NM001111869 và KJ726800, 8 vị trí khác so với M26227.

3. Phân tích protein Lc suy diễn: Protein Lc suy diễn gồm 610 amino acid, có 8 vị trí amino acid khác biệt so với trình tự NM001111869 và KJ726800, 5 vị trí khác so với M26227. Các vị trí sai khác chủ yếu nằm trong vùng có tính axit và vùng bHLH, vùng bHLH là vùng bảo thủ quan trọng cho chức năng liên kết DNA và điều hòa phiên mã.

4. Mối quan hệ di truyền: Trình tự gen và protein Lc của giống NH có sự tương đồng rất cao với các gen thuộc họ bHLH và gen R đã công bố trên GenBank, với hệ số tương đồng di truyền từ 98,6% đến 99%. Điều này khẳng định gen Lc phân lập từ giống NH thuộc nhóm gen điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin.

Thảo luận kết quả

Sự thành công trong phân lập gen Lc từ giống ngô nếp địa phương NH khẳng định khả năng ứng dụng kỹ thuật RT-PCR và công nghệ tái tổ hợp trong nghiên cứu gen điều hòa tính chịu hạn. Độ tương đồng cao của trình tự gen và protein Lc với các trình tự đã công bố cho thấy tính bảo thủ của gen Lc trong họ bHLH, đồng thời các vị trí sai khác nucleotide và amino acid có thể liên quan đến sự khác biệt về khả năng chịu hạn và tổng hợp anthocyanin của giống NH.

Các vị trí amino acid khác biệt trong vùng bHLH và vùng MIR có thể ảnh hưởng đến hoạt động phiên mã của protein Lc, từ đó điều hòa biểu hiện các gen cấu trúc tổng hợp anthocyanin, góp phần tăng cường khả năng chống oxy hóa và chịu hạn. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây trên các loài thực vật khác, cho thấy sự thay đổi nhỏ trong protein bHLH có thể làm tăng hàm lượng anthocyanin lên nhiều lần.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh trình tự nucleotide và amino acid, bảng hệ số tương đồng di truyền, cũng như sơ đồ cây phân loại di truyền để minh họa mối quan hệ giữa gen Lc của giống NH và các gen họ bHLH khác. Những phát hiện này mở ra hướng nghiên cứu sâu hơn về biểu hiện gen Lc và chức năng điều hòa trong điều kiện hạn, góp phần phát triển giống ngô nếp địa phương có khả năng chịu hạn cao.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tiếp tục nghiên cứu biểu hiện gen Lc: Thực hiện các thí nghiệm định lượng biểu hiện gen Lc và các gen cấu trúc liên quan trong điều kiện hạn để làm rõ vai trò điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin. Thời gian thực hiện trong 1-2 năm, chủ thể là các nhóm nghiên cứu sinh học phân tử.

2. Phân tích chức năng protein Lc: Sử dụng kỹ thuật đột biến điểm và biến đổi gen để đánh giá ảnh hưởng của các vị trí amino acid sai khác đến hoạt động phiên mã và tổng hợp anthocyanin. Mục tiêu nâng cao hàm lượng anthocyanin và khả năng chịu hạn, thực hiện trong 2-3 năm.

3. Ứng dụng công nghệ gen trong chọn tạo giống: Tạo các dòng ngô chuyển gen Lc có biểu hiện vượt trội để phát triển giống ngô nếp địa phương chịu hạn, tăng năng suất và chất lượng hạt. Chủ thể thực hiện là các trung tâm nghiên cứu giống cây trồng, thời gian 3-5 năm.

4. Bảo tồn và phát triển nguồn gen ngô nếp địa phương: Sưu tập, đánh giá và bảo tồn các giống ngô nếp có khả năng chịu hạn tốt, đồng thời phổ biến kỹ thuật nhân giống và canh tác phù hợp cho nông dân vùng núi. Thời gian liên tục, phối hợp giữa các viện nghiên cứu và địa phương.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu di truyền học và sinh học phân tử: Có thể ứng dụng phương pháp phân lập gen và phân tích trình tự để nghiên cứu các gen điều hòa khác liên quan đến tính chịu hạn và chất lượng cây trồng.

2. Chuyên gia phát triển giống cây trồng: Sử dụng kết quả nghiên cứu để phát triển giống ngô nếp địa phương có khả năng chịu hạn cao, nâng cao năng suất và giá trị kinh tế.

3. Nông dân và cán bộ kỹ thuật vùng miền núi: Áp dụng kiến thức về đặc điểm sinh học và khả năng chịu hạn của giống ngô nếp địa phương để lựa chọn giống phù hợp và kỹ thuật canh tác hiệu quả.

4. Sinh viên và học viên cao học ngành sinh học, công nghệ sinh học: Tham khảo quy trình nghiên cứu, kỹ thuật phân lập gen, phân tích trình tự và ứng dụng công nghệ gen trong nghiên cứu thực vật.

Câu hỏi thường gặp

1. Gen Lc có vai trò gì trong sinh tổng hợp anthocyanin?
   Gen Lc mã hóa protein thuộc họ bHLH, điều hòa biểu hiện các gen cấu trúc xúc tác tổng hợp anthocyanin, từ đó tăng hàm lượng sắc tố này trong cây, góp phần bảo vệ cây khỏi stress oxy hóa.

2. Tại sao chọn giống ngô nếp Nà Hạo để nghiên cứu?
   Giống Nà Hạo được xác định có khả năng chịu hạn tốt nhất trong số 10 giống ngô nếp địa phương nghiên cứu trước đó, phù hợp làm vật liệu nghiên cứu gen điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin.

3. Phương pháp gây hạn nhân tạo được thực hiện như thế nào?
   Cây ngô non giai đoạn 3 lá được trồng trên giá thể cát và đất mùn, tưới đủ nước ban đầu, sau đó ngừng tưới trong 7 ngày để tạo stress hạn, mô phỏng điều kiện hạn thực tế.

4. Sự khác biệt về trình tự amino acid ảnh hưởng thế nào đến chức năng protein Lc?
   Các vị trí amino acid sai khác trong vùng bHLH và MIR có thể làm thay đổi khả năng liên kết DNA và tương tác với protein MYB, ảnh hưởng đến hoạt động phiên mã và hiệu quả tổng hợp anthocyanin.

5. Kết quả nghiên cứu có thể ứng dụng thực tiễn ra sao?
   Kết quả giúp phát triển giống ngô nếp địa phương chịu hạn, bảo tồn nguồn gen quý, đồng thời cung cấp cơ sở khoa học cho công nghệ gen trong chọn tạo giống cây trồng có năng suất và chất lượng cao.

Kết luận

• Đã phân lập thành công gen Lc dài 1833 bp từ giống ngô nếp địa phương Nà Hạo bằng kỹ thuật RT-PCR và tạo dòng tái tổ hợp trong E.coli.
• Trình tự gen Lc có độ tương đồng cao (99,23% - 99,56%) với các gen họ bHLH đã công bố, với 14 vị trí nucleotide và 8 vị trí amino acid khác biệt so với trình tự tham chiếu.
• Protein Lc suy diễn gồm 610 amino acid, các vị trí sai khác tập trung ở vùng bHLH và MIR, có thể ảnh hưởng đến chức năng điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin.
• Mối quan hệ di truyền cho thấy gen Lc của giống NH thuộc nhóm gen điều hòa anthocyanin, có tiềm năng ứng dụng trong chọn tạo giống ngô chịu hạn.
• Đề xuất nghiên cứu tiếp tục về biểu hiện gen và chức năng protein Lc để phát triển giống ngô nếp địa phương có khả năng chịu hạn cao, nâng cao năng suất và giá trị kinh tế.

Luận văn mở ra hướng nghiên cứu mới về cơ chế điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin liên quan đến tính chịu hạn ở ngô nếp địa phương, góp phần bảo tồn nguồn gen quý và phát triển nông nghiệp bền vững vùng miền núi. Các nhà nghiên cứu và chuyên gia được khuyến khích tiếp tục triển khai các nghiên cứu sâu hơn và ứng dụng công nghệ gen trong chọn tạo giống cây trồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Sơ lược về cây ngô 1. Đặc điểm sinh học của cây ngô Cây ngô có tên khoa học là Zea mays L, thuộc chi Zea, họ Hoà thảo (Poaceae), bộ Hoà thảo (Poales).

Từ loài Zea mays Line, dựa vào cấu trúc nội nhũ của hạt và hình thái bên ngoài, ngô được phân thành các loài phụ: ngô đá rắn, ngô răng ngựa, ngô nếp, ngô đường, ngô nổ, ngô bột, ngô nửa răng ngựa. Từ các loài phụ dựa vào màu hạt và màu lõi ngô được phân chia thành các thứ. Ngoài ra, ngô còn được phân loại theo sinh thái học, nông học, thời gian sinh trưởng và thương phẩm [7]. Ngô có lá hình mũi mác rộng bản, dài 50–100 cm và rộng 5-10 cm.

Thân cây thẳng, cao 2–3 m, nhiều mấu, các lá tỏa ra từ mỗi mấu với bẹ nhẵn. Dưới các lá này và ôm sát thân cây là các bắp. Từ các đốt ở phía dưới sinh ra một số rễ [7]. Các bắp ngô là các cụm hoa cái hình bông được bao bọc trong một số lớp lá, và được các lá này bao chặt vào thân đến mức chúng không lộ ra cho đến khi xuất hiện các râu ngô.

Râu ngô là các núm nhụy thuôn dài, ban đầu màu xanh lục và sau đó chuyển dần sang màu hung đỏ hay hung vàng. Hạt ngô là dạng quả thóc với vỏ quả hợp nhất với lớp áo hạt. Các hạt ngô bám chặt thành các hàng tương đối đều xung quanh một lõi trắng để tạo ra bắp ngô. Mỗi bắp ngô dài khoảng 10- 25cm, chứa khoảng 200- 400 hạt.

Các hạt có màu như ánh đen, xám xanh, đỏ, trắng và vàng. Khi được nghiền thành bột, ngô tạo ra nhiều bột và ít cám hơn so với lúa mì [7]. Ngô nếp (Zea mays L. Ceratina Kulesh), là một trong những loài phụ chính của Zea mays L.

Bề ngoài hạt ngô nếp tương tự với ngô đá, nhưng bóng hơn. Lớp ngoài cùng của mặt cắt nội nhũ không có lớp sừng như ở ngô tẻ, có tính chất quang học giống như lớp sáp. Do vậy, ngô nếp còn có tên gọi 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] khác là ngô sáp. Tinh bột của ngô nếp chứa gần như 100% amylopectin, trong khi ngô thường chỉ chứa 75% amylopectin và 25% amylase [7].

Theo Peter Thompson (2005), đặc tính của ngô nếp được quy định bởi đơn gen lặn đó là gen wx [52]. Ngô có 10 cặp nhiễm sắc thể (n=10). Chiều dài tổng cộng của các nhiễm sắc thể là 1500 cM. Một số nhiễm sắc thể của ngô có "bướu nhiễm sắc thể" - các vùng lặp lại cao với vết màu sẫm.

Mỗi bướu riêng biệt là đa hình trong số các giống của cả ngô lẫn cỏ ngô. Barbara McClintock đã sử dụng các bướu này để chứng minh thuyết “Yếu tố di truyền vận động” [66]. Năm 2005, Quỹ Khoa học Quốc gia Hoa Kỳ (NSF), Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ và Bộ Năng lượng Hoa Kỳ (DOE) đã xác định trình tự chuỗi bộ gen của ngô. Bộ gen ngô có 50000– 60000 gen nằm rải rác trong 2,5 tỷ base [65].

Giá trị dinh dưỡng và kinh tế của ngô nếp Ngô nếp được sử dụng chủ yếu làm lương thực và thức ăn cho con người. Khi nấu chín có độ dẻo, mùi vị thơm ngon, giá trị dinh dưỡng cao, dễ hấp thu hơn so với tinh bột của ngô tẻ [68]. Một trong những nguyên nhân là do trong ngô nếp có hàm lượng các amino acid không thay thế như triptophan và lyzin cao. Hàm lượng lipit cao (3,5- 7%) và phụ thuộc vào từng giống, điều kiện tự nhiên.

Lipit được tập trung ở phôi và tầng alơron. Dầu ngô chứa đến 50% axit linoleic liên kết với các glyxerit, axit oleic, panmitic, rixinic. Hàm lượng lipit là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng hạt. Protein của ngô được chia thành ba loại chính: protein hoạt tính (chủ yếu là enzyme), protein cấu trúc và protein dự trữ, trong đó protein dự trữ chiếm tỷ lệ cao nhất.

Hàm lượng protein dao động từ 4,8- 16,6% ở mỗi giống. Lợi dụng tính chất hoà tan của protein trong các dung môi, người ta có thể tách chiết protein tan từ ngô phục vụ cho nhiều mục đích nghiên cứu như đánh giá chất lượng, khả năng chịu hạn. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Thân cây ngô được sử dụng chủ yếu để nuôi gia cầm và gia súc: cỏ khô, cỏ ủ chua. Hạt ngô cũng có nhiều ứng dụng trong công nghiệp như: tổng hợp chất dẻo hay vải sợi; sản xuất xi rô chứa nhiều fructose, chưng cất một số dạng rượu.

Ethanol từ ngô cũng được dùng ở hàm lượng thấp (10% hoặc ít hơn) như là phụ gia của xăng làm nhiên liệu cho một số động cơ để gia tăng chỉ số octan, giảm ô nhiễm và giảm mức tiêu thụ xăng (ngày nay gọi chung là "các nhiên liệu sinh học"). Trong nhiều nền văn hóa, người ta sử dụng các món cháo ngô, bánh ngô, bánh mèn mén. Một vài dạng ngô cũng được trồng làm cây cảnh do lá hay bắp nhiều màu, kích thước lớn, bắp dài [65]. Cũng như tình trạng chung trên thế giới, các nghiên cứu về ngô ở Việt Nam tập trung chủ yếu vào ngô tẻ.

Đối với các giống ngô nếp địa phương, đến nay chỉ có một số ít công trình được công bố [3]. Thời gian gần đây, các nhà tạo giống Việt Nam đã bắt đầu chuyển sang hướng tạo giống nếp lai và đã tạo được một số giống nếp lai không quy ước có triển vọng như các giống lai VN2, MX2, MX4, Bạch ngọc. Trong khi đó, các giống ngô nếp địa phương có ưu điểm chất lượng hạt cao, khả năng chịu hạn và kháng sâu bệnh tốt, có thể gieo trồng trên nhiều loại đất khác nhau đang đứng trên nguy cơ bị suy giảm quỹ gen vì năng suất thường thấp. Vì vậy, việc sưu tập, nghiên cứu và đánh giá một cách toàn diện nguồn gen các giống ngô địa phương là hết sức cần thiết cho công tác giống và bảo tồn nguồn gen quý.

Hạn và phản ứng của cây ngô trước tác động của hạn 1. Hạn và tính chống chịu stress oxy hóa 1. Mối liên quan giữa hạn và stress oxy hóa Hạn đối với thực vật là khái niệm dùng để chỉ sự thiếu nước do môi trường gây nên làm ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển. Những cây có khả năng duy trì sự phát triển và cho năng suất ổn định trong điều kiện khô hạn gọi là cây chịu hạn và khả năng của thực vật có thể làm giảm thiếu hụt mức độ tổn thương do thiếu nước gây ra gọi là tính chịu hạn.

5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Có hai loại hạn cơ bản: hạn thật (gồm hạn đất, hạn không khí, hạn toàn diện), và hạn sinh lí. Hạn đất là do lượng nước trong đất giảm làm hệ rễ của cây không thể lấy nước từ đất vào tế bào dẫn đến cây có hiện tượng bị héo lâu dài. Hạn đất tác động mạnh lên bộ rễ của cây. Hiện tượng này gây ra các biểu hiện thích ứng tại vùng xảy ra yếu tố cực đoan và ở mức độ cao hơn, biểu hiện thích ứng toàn cơ thể.

Hạn có thể tạo ra những hạt khô, nhăn nheo, không có phẩm chất tốt và thậm chí mất mùa hoàn toàn. Ở ngô sự trỗ cờ và phun râu phải xảy ra đồng thời. Hiện tượng phun râu ngô chậm gắn liền với sự chịu hạn bởi vì râu ngô chứa phần lớn là nước. Chọn giống theo hướng phun râu đồng thời (không bị chậm) là phương pháp hữu hiệu để chọn được giống chịu hạn ở ngô ở các vùng Mỹ, Canada [6].

Hạn không khí thường xảy ra ở những vùng gió nóng, nhiệt độ cao (39- 42oC) và độ ẩm thấp <62%. Hạn không khí tác động chủ yếu lên các bộ phận bên trên mặt đất như lá, hoa. Phản ứng của cây theo chiều hướng giảm cường độ thoát hơi nước và như vậy sẽ làm tăng nhiệt độ cơ thể. Đồng thời với tăng nhiệt độ không khí, yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng lớn nhất đến quá trình hình thành hạt phấn và thụ phấn của ngô.

Cần phải nhấn mạnh rằng trong quá trình phát triển của cây có những giai đoạn bị khủng hoảng: bắt đầu từ lúc hình thành các cơ quan sinh sản, kết thúc vào lúc thụ phấn hoàn toàn. Đây là thời kỳ cây cần nước nhất và kém chịu đựng nhất. Hạn xảy ra trong thời gian này làm giảm năng suất một cách đáng kể. Hạn sinh lí khác với hai loại hạn trên ở chỗ môi trường vẫn đầy đủ nước nhưng rễ cây không có khả năng hút nước do mất cân bằng áp suất thẩm thấu giữa môi trường nội bào và ngoại bào.

Nước tồn tại ở dạng liên kết trong tế bào. Màng tế bào là nơi bị tổn thương đầu tiên khi xảy ra mất nước. Thiếu nước nhẹ chỉ làm thay đổi một phần cấu trúc của protein, lipit trên màng tế bào. Lớp lipit cấu trúc chuyển từ trạng thái hoạt hoá tinh thể lỏng sang dạng gel không còn linh hoạt, và kém 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] nhất là chuyển sang trạng thái lục lăng ngược.

Trong trạng thái cuối cùng màng lipit kép bị gián đoạn, các phức enzyme bị phá hủy, dịch tế bào có thể dò rỉ ra ngoài. Tiếp sau đó, các hệ thống màng khác trong tế bào như màng lưới nội chất, màng lục lạp, màng ty thể cũng bị thiếu nước và không còn khả năng trao đổi chất [6]. Hiện tượng nóng hạn còn tạo ra các gốc tự do của hydroxyl, superoxide. oxy hoá các đại phân tử và làm mất hoạt tính của chúng.

Ngoài ra, các sản phẩm phân hủy của các đại phân tử và nồng độ ion cao khi mất nước gây độc cho tế bào. Khi bắt đầu mất nước sự tổng hợp protein được tăng cường, nhưng hạn kéo dài sẽ xảy ra hiện tượng thủy phân protein. Stress oxy hóa xảy ra trong điều kiện hạn tạo ra hàng loạt các dạng oxy hoạt hóa (ROS) gây tổn thương, thậm chí làm chết tế bào [45]. Những yếu tố môi trường gây stress oxy hóa có thể kể đến là: nồng độ ozon hoặc SO2 quá cao, chất diệt cỏ bị ôxy hóa, kim loại nặng, hạn, nóng, lạnh, tổn thương cơ học, UV, chiếu sáng liên tục, sự xâm nhập của mầm bệnh, sự lão hóa.

Ở những điều kiện này, chúng thúc đẩy hiện tượng ức chế quang hợp [26]. Các dạng oxy hoạt hóa (ROS) và hệ thống bảo vệ cây trồng khỏi tác động của của oxy hóa ROS tồn tại trong tự nhiên và cơ thể sống có thể kể đến là: oxy phân tử (O2); oxy dạng đơn (singlet oxy), superoxide anion (O 2-), hydro peroxide tự do (OH*), hydro peroxide (H2O2), pehydroxyl tự do (O2H*), ozon (O3).