MỞ ĐẦU Khi xã hội ngày càng phát triển thì vấn đề sức khoẻ của con người ngày càng được chú trọng, trong đó vấn đề an toàn thực phẩm và vệ sinh môi trường được đặt lên hàng đầu vì nó có ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ của con người. Sự tồn dư của các chất độc hại có trong thực phẩm đang là vấn đề đáng lo ngại đối với người tiêu dùng. Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhiều kỹ thuật phân tích mới, hiện đại đã được áp dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau đặc biệt trong đánh giá, kiểm định các chất độc trong thực phẩm. Trong quá trinh chế biến thực phẩm, để tạo cho thực phẩm màu sắc đẹp, bắt mắt, người ta sử dụng phẩm màu công nghiệp.
Phẩm màu công nghiệp nói chung, rhodamine B nói riêng đều độc hại, bị cấm sử dụng trong thực phẩm vì khó phân huỷ, ảnh hưởng đến gan, thận hoặc tồn dư lâu ngày gây độc hại đến cơ thể con người, đặc biệt có thể gây ung thư. Phẩm màu thực phẩm và tự nhiên có độ bền kém hơn, lại đắt hơn phẩm màu công nghiệp. Do vậy nhiều người đã lạm dụng phẩm màu công nghiệp mặc dù chất này đã bị cấm sử dụng trong thực phẩm. Vì vậy việc nghiên cứu xác định hàm lượng của các rhodamine B là vấn đề cần thiết để bảo vệ sức khoẻ cộng đồng.
Tuy nhiên, ngoài sự có mặt của rhodamine B còn có các thành phần hoá học khác có trong phẩm nhuộm như Sudan- I, Sudan- IV,…Phương pháp tối ưu nhất để xác định rhodamine B là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Đây là một phương pháp được ứng dụng nhiều nhất trong những năm gần đây. Nó được áp dụng để tách nhận dạng và xác định hàng loạt các hợp chất mà một số phương pháp khác gặp nhiều khó khăn như các hợp chất không bền với nhiệt, các hợp chất có tính chất hoá học tương tự nhau,…Phương pháp HPLC cũng có nhiều ưu 1 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.VIS Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích điểm mà các phương pháp khác không có như: xác định đồng thời được nhiều chất, tốn ít mẫu, thao tác đơn giản,… Trong phân tích bằng phương pháp HPLC có hai loại cột tách thường sử dụng là cột trao đổi ion và cột tách pha đảo. Trong luận văn này, chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình tách và xác định hàm lượng của rhodamine B trong một số mẫu thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ghép nối detetor UV- Vis.
Phương pháp này có độ chọn lọc cao, độ nhạy tốt và được trang bị ở nhiều cơ sở kiểm nghiệm ở nước ta, có tính khả thi và tính ứng dụng thực tế cao. Phân tích một số mẫu thực phẩm như hạt dưa, bánh xu xê, mứt, …và các mẫu thực phẩm khác nhằm đánh giá hàm lượng rhodamine B trong các mẫu thực phẩm này. Dựa trên các kết quả nghiên cứu về phân tích hàm lượng rhodamine B trong các mẫu thực phẩm mà có thể đánh giá vấn đề an toàn thực phẩm của các cơ sở sản xuất. 2 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.VIS Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.
Một vài nét về rhodamine B 1. Công thức cấu tạo Rhodamine B là một hợp chất hóa học, là một thành phần của phẩm màu công nghiệp. Công thức phân tử là C28H31ClN2O3 Phân tử khối là 479,02g/mol. Công thức cấu tạo của rhodamine B [9-(2-carboxyphenyl)-6-diethylamino-3-xanthenylidene]-diethylammonium chloride 1.
Tính chất vật lý Rhodamin B là những tinh thể màu tối có ánh xanh hay ở dạng bột màu nâu đỏ. Nhiệt độ nóng chảy khoảng từ 2100 C đến 2110C Rhodamine B là một thuốc nhuộm lưỡng tính, độc hại, tan tốt trong methanol, ethanol, nước (khoảng 50 g/l). Dung dịch nước và rượu etylic có màu đỏ ánh xanh nhạt phát huỳnh quang màu đỏ mạnh, đặc biệt rõ trong các dung dịch loãng. Dung dịch nước hấp thụ cực đại với ánh sáng có = 526 và 517 nm.
3 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.VIS Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích 1. Tính chất sinh học Rhodamine B gây độc cấp và mãn tính. Qua tiếp xúc, nó gây dị ứng hoặc làm mẩn ngứa da, mắt,. Qua đường hô hấp, nó gây ho, ngứa cổ, khó thở, đau ngực.
Qua đường tiêu hóa, nó gây nôn mửa, có hại cho gan và thận. Nếu tích tụ dần trong cơ thể nó gây nhiều tác hại đối với gan, thận, hệ sinh sản, hệ thần kinh cũng như có thể gây ung thư [17,21]. Thực nghiệm trên chuột cho thấy rhodamine B gây ung thư với liều lượng 89,5mg/kg qua đường uống hoặc tiêm vào tĩnh mạch [21], khi rhodamine B đi vào cơ thể có thể chuyển hóa thành amin thơm tương ứng có phần độc hại hơn loại rhodamine B thường, gây ung thư và phát triển khối u dạ dầy. Tại đây rhodamine B và dẫn xuất của nó sẽ tác động mạnh mẽ đến các quá trình sinh hóa của tế bào gây ung thư gan, vì gan là cơ quan tạng đầu tiên lọc chất rhodamine B [29].
Một số thực nghiệm khác cho thấy rhodamine B tác động phá vỡ cấu trúc ADN và nhiễm sắc thể khi đưa vào nuôi cấy tế bào [24,19]. Ứng dụng Rhodamine B thường được sử dụng trong nước để xác định tốc độ và hướng của dòng chảy vận chuyển [22]. Được sử dụng rộng rãi trong các ứng dụng công nghệ sinh học như kính hiển vi huỳnh quang, đếm tế bào dòng chảy, quang phổ huỳnh quang [22]. Rhodamine B đang được thử nghiệm để sử dụng trong vắcxin bệnh dại cho động vật hoang dã [22].
Nó cũng được trộn vào thuốc diệt cỏ. Ngoài ra Rhodamine B còn được sử dụng để tạo mầu và nhuộm mầu trong công nghiệp sợi, nhuộm màu trong phòng thí nghiệm, để xét nghiệm tế bào do tính bền mầu [23]. Rhodamine B được sử dụng trong sinh học như là một thuốc nhuộm huỳnh quang. Tận dụng đặc tính phát quang của rhodamine B, người ta dùng 4 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.VIS Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích chúng để giúp kiểm soát lượng thuốc bảo vệ thực vật phun lên cây ớt, cây lấy dầu [23].
Tại Indonesia, phẩm mầu được đưa vào thực phẩm làm cho món hàng hấp dẫn hơn, đánh lừa cảm quan của người dân Indonesia. Việc tổng hợp màu ngày càng tăng trong một số loại thực phẩm do chi phí rất rẻ [21]. Kết quả phân tích Hóa Lý cho thấy việc sử dụng phẩm màu tổng hợp trong đồ ăn nhẹ và thức uống chứng minh rhodamine B là phẩm màu được sử dụng rộng rãi tại Jakarta. Thông tin này dựa trên những nghiên cứu chứng minh rằng trong 20 đồ ăn nhẹ, 10 loại thức uống và 8 thương hiệu của chất màu đều có chứa rhodamine B [21].
Một số loại phẩm mầu sử dụng tại Indonesia được cho vào các loại thực phẩm như: thức ăn snack, tôm, kẹo bông, siro,…Nghiên cứu cũng chỉ ra trong đồ uống được bán tại các trường tiểu học tiểu bang Bangdung có chứa phẩm mầu công nghiệp với hàm lượng từ 7,841- 3226,55 ppm [21]. Theo Ủy ban an toàn thực phẩm châu Âu, nhiều thuốc nhuộm màu thuộc nhóm azo có khả năng gây ung thư. Năm 2005, Ủy ban châu Âu đã quy định rất rõ các chất nhuộm màu nhóm azo không được dùng trong thực phẩm và mỹ phẩm [11,17] nên không có giới hạn chấp nhận đối với nhóm chất nhuộm này. Do tính độc hại của rhodamine B nên ở các nước thuộc khối EU và hầu hết các nước trên thế giới đều cấm sử dụng rhodamine B cho sản xuất và chế biến thực phẩm [24, 19].
Các phƣơng pháp xác định rhodamine B Hiện nay trên thế giới có nhiều phương pháp phân tích rhodamine B đã được triển khai và chuẩn hóa tại phòng thí nghiệm bao gồm các phương pháp vi sinh và hóa học. Phương pháp vi sinh phân tích rhodamine B cho độ nhạy và độ chọn lọc kém [12]. Vì vậy, các phương pháp hóa học được áp dụng rất rộng rãi trên thế giới như: phương pháp sắc ký bản mỏng, phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC- MS), phương pháp sắc ký lỏng sử dụng detectơ huỳnh quang. 5 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.VIS Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích Nhưng phương pháp sắc ký bản mỏng có độ nhạy, độ chọn lọc kém, thời gian xử lý mẫu lâu, sử dụng nhiều hóa chất gây độc hại và tốn kém [21, 15, 10].
Vì vậy phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC- MS), phương pháp sắc ký lỏng sử dụng detectơ huỳnh quang là các phương pháp được sử dụng hiện nay [19]… Tuy các phương pháp này có độ nhạy và độ chọn lọc cao với giới hạn phát hiện 10ppb, giới hạn định lượng 35 ppb [27] nhưng đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, thường phải chiết bởi các dung môi độc hại, làm sạch qua cột chiết pha rắn (SPE) [12] trước khi bơm vào cột sắc ký. Năm 2006, Brian Stuart và M Walker [11] đã đưa ra một phương pháp xử lý mẫu nhanh, đơn giản, ít phải sử dụng đến các dung môi độc. Rhodamine B có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng khả kiến rất nhạy nên thiết bị sắc ký lỏng với detectơ UV- Vis là rất phù hợp cho việc phân tích rhodamine B. Vì vậy chúng tôi chọn phương pháp của Brian Stuat và M.Walker để áp dụng cho nghiên cứu này.
Hiện nay các phương pháp phân tích rhodamine B trong gia vị vẫn tiếp tục được hoàn thiện nhằm cung cấp cơ sở dữ liệu phục vụ cho các nghiên cứu trong lĩnh vực khoa học thực phẩm và y học. Tại Việt Nam, do ý thức chủ quan của con người, môi trường và thực phẩm ngày càng bị ô nhiễm, nhiều chất độc hại làm ảnh hưởng đến sức khỏe và gia tăng số người mắc bệnh ung thư. Đặc biệt là việc lạm dụng các chất phụ gia trong chế biến thực phẩm như sử dụng rhodamine B để làm tăng màu đỏ của gia vị: bột điều xay, ớt đỏ, bột sa tế, các loại gia vị nấu bò kho, nấu thịt hầm ragu và hạt dưa đỏ làm cho món hàng hấp dẫn hơn. Ngày 02 tháng 02 năm 2010, sở y tế Thành phố Hồ Chí Minh đã lấy mẫu ớt bột và mẫu gia vị có mầu đỏ tại cơ sở Kim Nga- quận Bình Tân để kiểm tra kết quả đã phát hiện mẫu ớt bột sản xuất ngày 20 tháng 01 năm 2010 có chứa 51 mg/kg rhodamine B và các mẫu bột gia vị nhuộm màu đỏ lấy cùng ngày có chứa 33,4 mg/kg.