Nghiên cứu đặc điểm phân tử hệ gen virus canine parvovirus 2 cpv 2 gây bệnh trên chó tại hà nội năm 2022

Nghiên cứu đặc điểm phân tử của virus canine parvovirus 2 gây bệnh trên chó tại Hà Nội năm 2022, cung cấp thông tin quan trọng cho y học thú y.

• Tác giả: Đỗ Thị Lan Hương
• Người hướng dẫn: TS. Đoàn Thị Thanh Hương
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Đặc Điểm Phân Tử Hệ Gen Virus Canine Parvovirus-2 (CPV-2) Gây Bệnh Trên Chó Tại Hà Nội Năm 2022
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1.1. Tổng quan về bệnh Parvo ở chó (Canine Parvovirus – CPV)
• 1.1.1.1. Lịch sử về bệnh Parvo ở chó
• 1.1.1.2. Triệu chứng lâm sàng
• 1.1.1.3. Con đường xâm nhập và cách lây lan
• 1.1.1.4. Phương pháp phòng và điều trị bệnh
• 1.1.2. Tổng quan về Canine Parvovirus 2 (CPV-2)
• 1.1.2.1. Cách gọi tên và phân loại
• 1.1.2.2. Đặc điểm sinh học của CPV-2
• 1.1.2.3. Các phương pháp chẩn đoán CPV-2
• 1.1.2.3.1. Chẩn đoán theo triệu chứng
• 1.1.2.3.2. Chẩn đoán huyết thanh học
• 1.1.2.3.3. Chẩn đoán bằng phương pháp sinh học phân tử
• 1.1.2.4. Tình hình nghiên cứu về CPV-2
• 1.1.2.4.1. Một số nghiên cứu về CPV-2 trên thế giới
• 1.1.2.4.2. Một số nghiên cứu về CPV-2 tại Việt Nam
• 1.2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm thực hiện nghiên cứu
• 1.2.2. Các bước tiến hành
• 1.2.3. Vật liệu nghiên cứu
• 1.2.4. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất
• 1.2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 1.2.5.1. Thu nhận và bảo quản mẫu
• 1.2.5.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
• 1.2.5.3. Phương pháp thiết kế mồi
• 1.2.5.4. Phương pháp PCR (polymerase chain reaction)
• 1.2.5.5. Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR
• 1.2.5.6. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR
• 1.2.5.7. Phương pháp giải trình tự
• 1.2.5.8. Phương pháp xử lý số liệu
• 1.3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 1.3.1. Kết quả chẩn đoán CPV-2 bằng phương pháp PCR
• 1.3.2. Kết quả thu nhận hệ gen hoàn chỉnh của một số chủng CPV-2 trong nghiên cứu
• 1.3.3. Kết quả thu nhận trình tự genome hoàn chỉnh của các chủng CPV-2 trong nghiên cứu
• 1.3.4. Thu nhận trình tự gen VP2 và xác định genotype của ba chủng nghiên cứu
• 1.3.5. So sánh tỷ lệ tương đồng về nucleotide và amino acid vùng gen VP2 của các mẫu CPV-2 nghiên cứu
• 1.3.6. Phân tích trình tự amino acid của VP2
• 1.3.7. Kết quả phân tích cây phả hệ nguồn gốc dựa vào gen VP2 và genome của các chủng CPV-2 trong nghiên cứu này
• 1.4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về virus canine parvovirus 2 CPV 2 tại Hà Nội 2022

Virus canine parvovirus 2 (CPV-2) là một trong những tác nhân gây bệnh nghiêm trọng ở chó, đặc biệt là ở chó con. Bệnh này có thể dẫn đến tỷ lệ tử vong cao nếu không được phát hiện và điều trị kịp thời. Nghiên cứu này nhằm cung cấp cái nhìn tổng quan về tình hình bệnh parvovirus ở chó tại Hà Nội trong năm 2022, từ đó giúp nâng cao nhận thức và biện pháp phòng ngừa cho người nuôi chó.

1.1. Lịch sử và sự phát triển của CPV 2 tại Việt Nam

CPV-2 được ghi nhận lần đầu vào cuối những năm 1970 và đã nhanh chóng lây lan ra toàn cầu. Tại Việt Nam, virus này đã xuất hiện từ năm 1994 và gây ra nhiều đợt bùng phát nghiêm trọng. Các nghiên cứu gần đây cho thấy sự xuất hiện của các biến thể mới như CPV-2a, CPV-2b và CPV-2c.

1.2. Đặc điểm sinh học của virus CPV 2

CPV-2 thuộc họ Parvoviridae, có cấu trúc capsid không có vỏ bao bọc và chứa DNA sợi đơn. Virus này có khả năng tồn tại lâu trong môi trường, làm tăng nguy cơ lây lan. Đặc biệt, protein VP2 là yếu tố quyết định tính kháng nguyên của virus.

II. Triệu chứng và cách lây lan của bệnh parvovirus ở chó

Bệnh do virus canine parvovirus 2 gây ra có thể biểu hiện qua nhiều triệu chứng khác nhau. Việc nhận diện sớm các triệu chứng này là rất quan trọng để có biện pháp can thiệp kịp thời. Bệnh lây lan chủ yếu qua tiếp xúc với phân của chó bệnh và có thể tồn tại lâu trong môi trường.

2.1. Triệu chứng lâm sàng của bệnh CPV 2

Các triệu chứng thường gặp bao gồm chán ăn, nôn mửa, tiêu chảy ra máu và sốt. Thời gian ủ bệnh dao động từ 3 đến 14 ngày, và bệnh có thể dẫn đến tử vong nhanh chóng nếu không được điều trị.

2.2. Con đường lây lan của virus CPV 2

Virus CPV-2 lây lan qua tiếp xúc trực tiếp với phân của chó bệnh hoặc gián tiếp qua các bề mặt ô nhiễm. Virus có khả năng chống lại nhiệt độ và chất tẩy rửa, do đó có thể tồn tại lâu trong môi trường.

III. Phương pháp điều trị và phòng ngừa bệnh CPV 2 hiệu quả

Việc điều trị và phòng ngừa bệnh do canine parvovirus 2 gây ra là rất quan trọng để bảo vệ sức khỏe cho chó. Tiêm vaccine là phương pháp hiệu quả nhất để ngăn ngừa bệnh. Ngoài ra, việc chăm sóc sức khỏe và vệ sinh môi trường cũng đóng vai trò quan trọng.

3.1. Phương pháp điều trị bệnh CPV 2

Điều trị bệnh CPV-2 chủ yếu tập trung vào việc điều trị triệu chứng và phòng ngừa nhiễm khuẩn thứ phát. Việc truyền dịch và sử dụng thuốc kháng sinh là cần thiết để tăng cường sức khỏe cho chó bệnh.

3.2. Vaccine cho chó chống lại CPV 2

Tiêm vaccine là biện pháp phòng ngừa hiệu quả nhất. Vaccine sống giảm độc lực được khuyến cáo tiêm cho chó con từ 6-8 tuần tuổi và nhắc lại định kỳ để đảm bảo hiệu quả bảo vệ.

IV. Kết quả nghiên cứu về virus CPV 2 tại Hà Nội 2022

Nghiên cứu này đã thu thập và phân tích các mẫu virus CPV-2 tại Hà Nội trong năm 2022. Kết quả cho thấy sự hiện diện của các biến thể CPV-2c, cho thấy mối liên hệ chặt chẽ với các chủng virus ở châu Á. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển vaccine và phương pháp điều trị.

4.1. Phân tích gen và kiểu gen của CPV 2

Kết quả giải trình tự gen VP2 cho thấy các chủng virus CPV-2 tại Hà Nội có tỷ lệ tương đồng cao với các chủng CPV-2c ở châu Á. Điều này cho thấy sự biến đổi gen của virus có thể ảnh hưởng đến hiệu quả của vaccine.

4.2. Tình hình dịch bệnh CPV 2 tại Hà Nội

Tình hình dịch bệnh CPV-2 tại Hà Nội vẫn còn phức tạp, với nhiều trường hợp mắc bệnh được ghi nhận. Việc nâng cao nhận thức và biện pháp phòng ngừa là cần thiết để giảm thiểu tỷ lệ mắc và tử vong.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu về CPV 2

Nghiên cứu về virus canine parvovirus 2 tại Hà Nội năm 2022 đã cung cấp nhiều thông tin quý giá về đặc điểm phân tử của virus. Kết quả nghiên cứu không chỉ giúp nâng cao nhận thức về bệnh mà còn mở ra hướng đi mới cho các nghiên cứu tiếp theo.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu CPV 2

Nghiên cứu về CPV-2 là rất cần thiết để hiểu rõ hơn về sự biến đổi của virus và ảnh hưởng của nó đến sức khỏe chó. Điều này sẽ giúp cải thiện các biện pháp phòng ngừa và điều trị hiệu quả hơn.

5.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc phát triển vaccine mới và các phương pháp điều trị hiệu quả hơn. Đồng thời, việc theo dõi tình hình dịch bệnh cũng cần được thực hiện thường xuyên để có biện pháp ứng phó kịp thời.

Trích đoạn nội dung tài liệu

mở đầu tiên mã hóa hai gen phi cấu trúc là NS1 (non-structural protein 1) và NS2 (non-structural protein 2) nằm ở đầu 3’ của hệ gen, trong khi khung đọc mở thứ hai nằm ở đầu 5’ mã hóa cho hai gen cấu trúc là VP1 (viral protein 1) và VP2 (viral protein 2) (Reed và cs., 1988; Shackelton và cs. Cấu trúc của Canine parvovirus (Nguồn: http://www.edu/virusworld/viruslist.php?virus=cpv) Hai gen không cấu trúc NS1 và NS2 đóng vai trò thiết yếu cho sự nhân lên của virus và gây ra quá trình ―chết theo chương trình‖ (apoptosis) trong tế bào vật chủ (Callaway và cs. NS1 là loại protein đa chức năng, cần thiết để bắt đầu và điều khiển quá trình sao chép DNA của virus. Ngoài ra, NS1 còn có vai trò trong quá trình đóng gói virus và chuyển hóa một số chất xúc tác.

NS2 được tạo ra từ khung đọc mở bên trái của bộ gen virus, chứa 87 acid amin đầu tận cùng với protein không cấu trúc 1 (NS1) liên kết với 78 acid amin từ một khung đọc mở tiếp theo. Tuy nhiên, các đặc tính và chức năng của NS2 hiện vẫn chưa được nghiên cứu chính xác (Wang và cs. Khung đọc mở thứ hai mã hóa cho hai gen cấu trúc VP1 và VP2, với vai trò cấu tạo nên vỏ capsid, ghép từ 6 bản sao của VP1 và 54 bản sao của VP2. Chúng là kháng nguyên chính tạo nên các kháng thể trung hòa và cũng là yếu tố gây độc lực (Nakamura và cs., 2004; Zhou và cs.

VP1 chiếm khoảng 10%, đóng vai trò chủ chốt trong quá trình lây nhiễm của capsid trong tế bào, nhưng lại không đóng góp cao trong việc hình thành vỏ virus. Chúng thường nằm sâu bên trong capsid và khó bị phát hiện bởi kháng thể. Vùng kết thúc của VP1 chứa một số nhóm acid amin cơ bản giống với trình tự hạt nhân cổ điển, bao gồm trình tự được bảo tồn gần đầu cuối vùng kết thúc, bao gồm bốn acid amin cơ bản, mà trong một peptit có thể hoạt động để vận chuyển các protein khác vào nhân tế bào (Vihinen-Ranta và cs. VP2 chiếm khoảng 90% 8 protein capsid, rất quan trọng đối với sự tương tác giữa virus và tế bào vật chủ, tính dinh dưỡng của mô và khả năng sinh miễn dịch.

Protein VP2 của virus CPV-2 rất đa dạng về mặt di truyền và kháng nguyên. Các đột biến ở một số vị trí quan trọng có thể gây ra những thay đổi acid amin làm thay đổi phạm vi vật chủ và tính kháng nguyên của virus (Callaway và cs. Các protein capsid có lõi trung tâm được bảo tồn cao, linh hoạt giữa các sợi β tương tác với nhau để tạo nên hầu hết bề mặt capsid. Các đặc điểm bề mặt của capsid bao gồm một vùng nhô lên dài 22 Å (spike) trên các trục gấp ba, một chỗ lõm sâu 15 Å (canyon) xung quanh các cấu trúc hình trụ ở các trục gấp năm và một chỗ lõm sâu 15 Å (dimple) ở hai trục gấp đôi.

Ngoài ra, các trục gấp ba là vùng kháng nguyên nhất của capsid và là mục tiêu để trung hòa các kháng thể (Miranda và cs. Sơ đồ minh họa genome của chủng CPV-2 1. Các biến chủng của CPV-2 Mặc dù CPV-2 là một virus DNA, nhưng tỷ lệ thay thế bộ gen của nó là khoảng 10-4 trên mỗi vị trí mỗi năm, tương tự như virus RNA (Zhou và cs. Năm 1978, CPV-2 lần đầu được xác định từ sự bùng nổ dịch ở chó tại Hoa Kỳ và Úc (Appel và cs., 1979), sau đó, nó đã được báo cáo tại nhiều quốc gia trong năm 1978 và 1979.

CPV-2 có liên quan chặt chẽ với parovirus ở mèo (FPV), vì thế, nó được giả định là biến thể vật chủ của FPV. CPV-2 được đặt tên để phân biệt với Canine minute virus (CPV-1). Các protein VP2 của virus CPV-2 rất đa dạng về mặt di truyền và tính kháng nguyên. Đột biến ở vị trí quan trọng có thể gây ra những thay đổi về acid amin ảnh hưởng đến phạm vi vật chủ, tính kháng nguyên cũng như độc lực của virus, đồng thời làm phức tạp quá trình phân tích phát sinh gen và xác định kiểu gen của các chủng CPV-2.

9 Năm 1980, CPV-2 ban đầu được thay thế hoàn toàn bằng hai biến thể kháng nguyên mới, được gọi là CPV loại 2a (CPV-2a) và 2b (CPV-2b). Năm 2000, CPV-2c với sự thay thế acid glutamic ở vị trí 426 (Asn ở 2a, Asp ở 2b) được báo cáo ở Ý (Zhou và cs. Khi biến thể mới xuất hiện, chúng sẽ rất nhanh chóng thay thế cho biến thể cũ. Cho đến nay, cả ba biến thể CPV-2 đều được phân bố trên toàn thế giới, với tỷ lệ tương đối khác nhau theo năm và quốc gia thu nhận.

Phân tích dòng thời gian của các biến thể kháng nguyên CPV-2 cho thấy CPV-2 được đặc trưng bởi các đột biến so với FPV là K80R, K93N, V103A, D323N, N564S và A568D trong VP2, sau đó, nó được thay thế bởi CPV-2a tại M87L , I101T, A300G, D305Y, V555I. Năm 1984, CPV-2a được thay thế bằng CPV-2b (N426D và I555V) và cuối những năm 1990, đầu những năm 2000, CPV-2b được thay thế bởi CPV-2c, chỉ mang đột biến duy nhất D426E (Miranda và cs. Một số quá trình tiến hóa của CPV-2 ở chó 10 1. Cơ chế gây bệnh Khi chó bị nhiễm CPV-2, thời gian ủ bệnh ngắn 3 – 7 ngày và sau đó sẽ xuất hiện các triệu chứng lâm sàng.

CPV-2 sẽ sử dụng nguyên liệu của tế bào vật chủ để nhân lên hàng loạt. Trước tiên, virus tấn công hạch bạch huyết tại vùng hầu họng rồi tiếp tục xâm nhập vào tế bào lympho (Prittie và cs. Những virus này sẽ cản trở đường đi của các tế bào lympho, đồng thời lẩn tránh khỏi hệ thống phòng thủ của vật chủ và tiếp tục xâm nhập vào máu. Nhiều tế bào lympho bị nhiễm CPV-2 sẽ bị tiêu diệt, dẫn đến số lượng bạch cầu giảm.

Khi đi vào máu, virus nhanh chóng tấn công vào tủy xương phá hủy tế bào miễn dịch non và giảm số lượng bạch cầu làm suy yếu khả năng miễn dịch của vật chủ. Cùng với đó, virus tấn công vào biểu mô của ruột non làm vô hiệu hóa khả năng bổ sung chất dinh dưỡng và khả năng chống mất nước của cơ thể vật chủ. Chu kỳ nhân lên của CPV-2 xảy ra trong nhân của tế bào vật chủ đang phân chia tại cuối pha S hoặc đầu pha G2. Sự lây nhiễm và nhân lên diễn ra nhanh chóng, thường tác động trên tủy xương và đường ruột của vật chủ.

Một gram phân của con chó nhiễm trùng nặng có thể chứa đủ vật chất virus để lây nhiễm cho hơn 10 triệu con chó khác qua tiếp xúc đường tiêu hóa (Prittie và cs. Virus bắt đầu nhân lên ở mô bạch huyết hầu họng và đi vào huyết tương, tiếp đó là biểu mô đường ruột thường nhiễm ở ngày thứ 4. Kháng thể có thể xuất hiện khoảng ngày thứ 5 sau khi nhiễm bệnh và tăng lên đối đa từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 10. Các dấu hiệu lâm sàng xuất hiện từ ngày 4 đến ngày 10 sau khi nhiễm virus (Prittie và cs.

Các phƣơng pháp chẩn đoán CPV-2 Vì CPV-2 lây nhiễm rất nhanh nên việc phát hiện sớm, chính xác để cách ly và điều trị những con chó bệnh là vô cùng quan trọng. Dưới đây là một số phương pháp có thể áp dụng để chẩn đoán CPV-2. Chẩn đoán theo triệu chứng CPV-2 ở chó gây ra những triệu chứng như ủ rũ, chán ăn, sốt, nôn mửa và tiêu chảy, phân có lẫn máu và chất nhầy, mùi tanh. Tuy nhiên, chẩn đoán theo 11 triệu chứng chỉ có thể áp dụng trong số ít trường hợp, bởi vì không chỉ có CPV- 2 gây ra các triệu chứng bệnh như trên (Mylonakis và cs.

Chẩn đoán huyết thanh học Kỹ thuật ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent assay): dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể và được thực hiện bằng những bước cơ bản sau: Kháng nguyên hoặc kháng thể đã biết được gắn trên một giá thể rắn, sau đó cho mẫu có chứa kháng thể hoặc kháng nguyên cần tìm vào giếng. Bổ sung thêm kháng thể có gắn với enzyme. Bước cuối cùng thêm cơ chất, enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu màu có thể xác định được bằng máy đo huỳnh quang (Prittie, 2004; Dik và Şimşek, 2021). Kỹ thuật sắc ký miễn dịch (immunochromatographic – IC): Khi nhỏ huyết thanh cần xác định kháng thể lên bản sắc ký, kháng thể đặc hiệu (nếu có) trong huyết thanh sẽ kết hợp với kháng nguyên gắn màu, phức hợp miễn dịch kháng thể - kháng nguyên (Dik và Şimşek, 2021).

Xét nghiệm ngưng kết hồng cầu (hemagglutination – HA) cũng là một xét nghiệm nhanh chóng và đơn giản để phát hiện CPV-2 (Dik và Şimşek, 2021). Tuy nhiên, các kỹ thuật trên có độ nhạy tương đối thấp (Decaro và Buonavoglia, 2012). Chẩn đoán bằng phƣơng pháp sinh học phân tử Kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction – PCR) được sử dụng rộng rãi để chẩn đoán nhiễm trùng do CPV-2. Phương pháp này chẩn đoán nhanh chóng và có độ chính xác cao.

Ngoài ra, PCR có thể giúp xác định được kiểu gen của virus gây bệnh thông qua việc sử dụng các cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm của phản ứng PCR được sử dụng để giải trình tự trực tiếp, cho kết quả là trình tự nucleotide. Qua việc sử dụng các phần mềm tin sinh học, có thể xác định tỷ lệ tương đồng và phân tích nguồn gốc của các chủng CPV-2 (Decaro và Buonavoglia, 2012). Tình hình nghiên cứu về CPV-2 1.

Một số nghiên cứu về CPV-2 trên thế giới Năm 2001, Buonavoglia và cộng sự đã phân lập được 2 chủng CPV từ chó bệnh. Nghiên cứu này đã xác định được sự thay đổi acid amin ở vị trí 426 (Asp thành Glu), trong vị trí kháng nguyên chính của capsid virus, đánh dấu sự xuất hiện của chủng mới CPV-2c tại Ý, cung cấp bằng chứng tiến hóa của CPV (Buonavoglia và cs. Năm 2006, Chinchkar và cộng sự đã nghiên cứu, phân tích trình tự gen VP2 từ chó nhiễm CPV-2 phân lập tại Ấn Độ. Kết quả cho thấy các chủng phân lập tại Ấn Độ thuộc CPV-2a, ngoại trừ có bốn chủng thuộc CPV-2b.

So sánh trình tự gen VP2 cho thấy các dòng phân lập ở Ấn Độ có sự khác biệt so với các dòng phân lập ở Đông Nam Á và dường như các chủng phân lập ở Ấn Độ tiến hóa độc lập (Chinchkar và cs. Nghiên cứu của Nicola Decaro và cộng sự năm 2007 cho thấy biến thể mới CPV-2c phổ biến ở một số quốc gia châu Âu (Ý, Bồ Đào Nha, Đức) và xuất hiện không thường xuyên tại Anh; CPV-2a thường xuất hiện ở Bỉ. Sự lan rộng của CPV-2c trên thế giới cho thấy rằng đột biến Glu-426 mang lại lợi thế nhất định trong việc nhân lên của virus (Decaro và cs.