Nghiên cứu đặc điểm phân tử hệ gen virus canine parvovirus 2 cpv 2 gây bệnh trên chó tại hà nội năm 2022

Nghiên cứu đặc điểm phân tử của virus canine parvovirus 2 gây bệnh trên chó tại Hà Nội năm 2022, cung cấp thông tin quan trọng cho y học thú y.

• Tác giả: Đỗ Thị Lan Hương
• Người hướng dẫn: TS. Đoàn Thị Thanh Hương
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Đặc Điểm Phân Tử Hệ Gen Virus Canine Parvovirus-2 (CPV-2) Gây Bệnh Trên Chó Tại Hà Nội Năm 2022
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1.1. Tổng quan về bệnh Parvo ở chó (Canine Parvovirus – CPV)
• 1.1.1.1. Lịch sử về bệnh Parvo ở chó
• 1.1.1.2. Triệu chứng lâm sàng
• 1.1.1.3. Con đường xâm nhập và cách lây lan
• 1.1.1.4. Phương pháp phòng và điều trị bệnh
• 1.1.2. Tổng quan về Canine Parvovirus 2 (CPV-2)
• 1.1.2.1. Cách gọi tên và phân loại
• 1.1.2.2. Đặc điểm sinh học của CPV-2
• 1.1.2.3. Các phương pháp chẩn đoán CPV-2
• 1.1.2.3.1. Chẩn đoán theo triệu chứng
• 1.1.2.3.2. Chẩn đoán huyết thanh học
• 1.1.2.3.3. Chẩn đoán bằng phương pháp sinh học phân tử
• 1.1.2.4. Tình hình nghiên cứu về CPV-2
• 1.1.2.4.1. Một số nghiên cứu về CPV-2 trên thế giới
• 1.1.2.4.2. Một số nghiên cứu về CPV-2 tại Việt Nam
• 1.2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm thực hiện nghiên cứu
• 1.2.2. Các bước tiến hành
• 1.2.3. Vật liệu nghiên cứu
• 1.2.4. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất
• 1.2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 1.2.5.1. Thu nhận và bảo quản mẫu
• 1.2.5.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
• 1.2.5.3. Phương pháp thiết kế mồi
• 1.2.5.4. Phương pháp PCR (polymerase chain reaction)
• 1.2.5.5. Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR
• 1.2.5.6. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR
• 1.2.5.7. Phương pháp giải trình tự
• 1.2.5.8. Phương pháp xử lý số liệu
• 1.3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 1.3.1. Kết quả chẩn đoán CPV-2 bằng phương pháp PCR
• 1.3.2. Kết quả thu nhận hệ gen hoàn chỉnh của một số chủng CPV-2 trong nghiên cứu
• 1.3.3. Kết quả thu nhận trình tự genome hoàn chỉnh của các chủng CPV-2 trong nghiên cứu
• 1.3.4. Thu nhận trình tự gen VP2 và xác định genotype của ba chủng nghiên cứu
• 1.3.5. So sánh tỷ lệ tương đồng về nucleotide và amino acid vùng gen VP2 của các mẫu CPV-2 nghiên cứu
• 1.3.6. Phân tích trình tự amino acid của VP2
• 1.3.7. Kết quả phân tích cây phả hệ nguồn gốc dựa vào gen VP2 và genome của các chủng CPV-2 trong nghiên cứu này
• 1.4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về virus canine parvovirus 2 CPV 2 tại Hà Nội 2022

Virus canine parvovirus 2 (CPV-2) là một trong những tác nhân gây bệnh nghiêm trọng ở chó, đặc biệt là ở chó con. Bệnh này có thể dẫn đến tỷ lệ tử vong cao nếu không được phát hiện và điều trị kịp thời. Nghiên cứu này nhằm cung cấp cái nhìn tổng quan về tình hình bệnh parvovirus ở chó tại Hà Nội trong năm 2022, từ đó giúp nâng cao nhận thức và biện pháp phòng ngừa cho người nuôi chó.

1.1. Lịch sử và sự phát triển của CPV 2 tại Việt Nam

CPV-2 được ghi nhận lần đầu vào cuối những năm 1970 và đã nhanh chóng lây lan ra toàn cầu. Tại Việt Nam, virus này đã xuất hiện từ năm 1994 và gây ra nhiều đợt bùng phát nghiêm trọng. Các nghiên cứu gần đây cho thấy sự xuất hiện của các biến thể mới như CPV-2a, CPV-2b và CPV-2c.

1.2. Đặc điểm sinh học của virus CPV 2

CPV-2 thuộc họ Parvoviridae, có cấu trúc capsid không có vỏ bao bọc và chứa DNA sợi đơn. Virus này có khả năng tồn tại lâu trong môi trường, làm tăng nguy cơ lây lan. Đặc biệt, protein VP2 là yếu tố quyết định tính kháng nguyên của virus.

II. Triệu chứng và cách lây lan của bệnh parvovirus ở chó

Bệnh do virus canine parvovirus 2 gây ra có thể biểu hiện qua nhiều triệu chứng khác nhau. Việc nhận diện sớm các triệu chứng này là rất quan trọng để có biện pháp can thiệp kịp thời. Bệnh lây lan chủ yếu qua tiếp xúc với phân của chó bệnh và có thể tồn tại lâu trong môi trường.

2.1. Triệu chứng lâm sàng của bệnh CPV 2

Các triệu chứng thường gặp bao gồm chán ăn, nôn mửa, tiêu chảy ra máu và sốt. Thời gian ủ bệnh dao động từ 3 đến 14 ngày, và bệnh có thể dẫn đến tử vong nhanh chóng nếu không được điều trị.

2.2. Con đường lây lan của virus CPV 2

Virus CPV-2 lây lan qua tiếp xúc trực tiếp với phân của chó bệnh hoặc gián tiếp qua các bề mặt ô nhiễm. Virus có khả năng chống lại nhiệt độ và chất tẩy rửa, do đó có thể tồn tại lâu trong môi trường.

III. Phương pháp điều trị và phòng ngừa bệnh CPV 2 hiệu quả

Việc điều trị và phòng ngừa bệnh do canine parvovirus 2 gây ra là rất quan trọng để bảo vệ sức khỏe cho chó. Tiêm vaccine là phương pháp hiệu quả nhất để ngăn ngừa bệnh. Ngoài ra, việc chăm sóc sức khỏe và vệ sinh môi trường cũng đóng vai trò quan trọng.

3.1. Phương pháp điều trị bệnh CPV 2

Điều trị bệnh CPV-2 chủ yếu tập trung vào việc điều trị triệu chứng và phòng ngừa nhiễm khuẩn thứ phát. Việc truyền dịch và sử dụng thuốc kháng sinh là cần thiết để tăng cường sức khỏe cho chó bệnh.

3.2. Vaccine cho chó chống lại CPV 2

Tiêm vaccine là biện pháp phòng ngừa hiệu quả nhất. Vaccine sống giảm độc lực được khuyến cáo tiêm cho chó con từ 6-8 tuần tuổi và nhắc lại định kỳ để đảm bảo hiệu quả bảo vệ.

IV. Kết quả nghiên cứu về virus CPV 2 tại Hà Nội 2022

Nghiên cứu này đã thu thập và phân tích các mẫu virus CPV-2 tại Hà Nội trong năm 2022. Kết quả cho thấy sự hiện diện của các biến thể CPV-2c, cho thấy mối liên hệ chặt chẽ với các chủng virus ở châu Á. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển vaccine và phương pháp điều trị.

4.1. Phân tích gen và kiểu gen của CPV 2

Kết quả giải trình tự gen VP2 cho thấy các chủng virus CPV-2 tại Hà Nội có tỷ lệ tương đồng cao với các chủng CPV-2c ở châu Á. Điều này cho thấy sự biến đổi gen của virus có thể ảnh hưởng đến hiệu quả của vaccine.

4.2. Tình hình dịch bệnh CPV 2 tại Hà Nội

Tình hình dịch bệnh CPV-2 tại Hà Nội vẫn còn phức tạp, với nhiều trường hợp mắc bệnh được ghi nhận. Việc nâng cao nhận thức và biện pháp phòng ngừa là cần thiết để giảm thiểu tỷ lệ mắc và tử vong.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu về CPV 2

Nghiên cứu về virus canine parvovirus 2 tại Hà Nội năm 2022 đã cung cấp nhiều thông tin quý giá về đặc điểm phân tử của virus. Kết quả nghiên cứu không chỉ giúp nâng cao nhận thức về bệnh mà còn mở ra hướng đi mới cho các nghiên cứu tiếp theo.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu CPV 2

Nghiên cứu về CPV-2 là rất cần thiết để hiểu rõ hơn về sự biến đổi của virus và ảnh hưởng của nó đến sức khỏe chó. Điều này sẽ giúp cải thiện các biện pháp phòng ngừa và điều trị hiệu quả hơn.

5.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc phát triển vaccine mới và các phương pháp điều trị hiệu quả hơn. Đồng thời, việc theo dõi tình hình dịch bệnh cũng cần được thực hiện thường xuyên để có biện pháp ứng phó kịp thời.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Lý do chọn đề tài và bối cảnh thực tiễn

Theo thống kê từ Cục Thú y, trong 6 tháng đầu năm 2022, tổng đàn chó tại Việt Nam đạt xấp xỉ 7 triệu con. Cùng với sự phát triển kinh tế - xã hội, nhu cầu nuôi dưỡng chó cảnh làm thú cưng gia tăng nhanh chóng. Sự đa dạng về giống loài kéo theo sự khác biệt về sức đề kháng và khả năng thích nghi; kết hợp với điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng ẩm tại Việt Nam tạo môi trường thuận lợi cho các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm phát sinh và lây lan trên diện rộng.

Trong số các tác nhân gây bệnh truyền nhiễm ở loài chó, Canine parvovirus type 2 (CPV-2) là một trong những virus gây bệnh viêm ruột - dạ dày truyền nhiễm cấp tính nghiêm trọng nhất trên cả chó nhà và động vật hoang dã thuộc họ Chó. Bệnh có tỷ lệ lây nhiễm rất cao, chiếm tới 26% tỷ lệ tử vong trong tổng số các ca bệnh do virus ở chó; trong đó tỷ lệ tử vong lên tới 10% ở chó trưởng thành và đạt tới 91% ở chó con chưa được tiêm phòng hoặc chưa hoàn thiện hệ miễn dịch.

Kể từ khi được ghi nhận lần đầu vào cuối thập niên 1970 và xuất hiện tại Việt Nam vào năm 1994, virus CPV-2 liên tục biến đổi di truyền với tốc độ thay thế nucleotide xấp xỉ $10^{-4}$ vị trí/năm (tương đương tốc độ tiến hóa của các virus RNA). Chủng CPV-2 gốc ban đầu đã bị thay thế hoàn toàn bởi các biến thể kháng nguyên mới gồm CPV-2a, CPV-2b và CPV-2c (dựa trên đột biến amino acid tại vị trí 426 của protein kháng nguyên vỏ VP2). Tại Việt Nam, các nghiên cứu dịch tễ gần đây cho thấy biến thể CPV-2c đã trở thành kiểu gen lưu hành phổ biến nhất (chiếm trên 96% số ca nhiễm). Tuy nhiên, phần lớn các công trình công bố trong nước trước đây chủ yếu tập trung vào chẩn đoán lâm sàng hoặc giải mã cục bộ đoạn gen VP2, trong khi dữ liệu giải mã toàn bộ khung đọc mở (genome ORF) của virus CPV-2 còn rất hạn chế (mới chỉ có các công bố của Nguyễn Mạnh Tường và cộng sự năm 2020; Võ Văn Hải và cộng sự năm 2022). Do đó, việc nghiên cứu giải mã và phân tích đặc điểm phân tử hệ gen của các chủng CPV-2 đang lưu hành thực tế là yêu cầu cấp thiết nhằm phục vụ giám sát dịch tễ học phân tử và đánh giá hiệu lực phòng bệnh của vaccine.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu

Mục đích tổng quát của đề tài là giải mã và phân tích đặc điểm phân tử hệ gen của một số chủng virus CPV-2 gây bệnh trên chó tại Hà Nội năm 2022. Để đạt được mục đích trên, nghiên cứu thực hiện 4 nhiệm vụ cụ thể được đánh số trong văn bản:

1. Chẩn đoán phát hiện CPV-2 bằng phương pháp PCR.
2. Thu nhận, giải trình tự hệ gen của một số chủng virus CPV-2 đang lưu hành tại Hà Nội.
3. Phân tích đặc điểm phân tử và xác định kiểu gen của một số chủng CPV-2 đang lưu hành tại Hà Nội dựa trên dữ liệu gen kháng nguyên VP2.
4. Phân tích phả hệ nguồn gốc của các chủng virus CPV-2 nghiên cứu dựa trên dữ liệu gen VP2 và toàn bộ hệ gen.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Virus Canine Parvovirus type 2 (CPV-2) thu thập từ phân và nước phân của chó nghi nhiễm bệnh tại Phòng khám Thú y Mỹ Đình, Hà Nội.
• Phạm vi không gian: Phòng khám Thú y Mỹ Đình (Hà Nội); Phòng Miễn dịch học thuộc Viện Công nghệ sinh học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam); Bộ môn Công nghệ sinh học Động vật thuộc Khoa Công nghệ sinh học (Học viện Nông nghiệp Việt Nam).
• Phạm vi thời gian: Khóa luận được thực hiện từ tháng 8 năm 2022 đến tháng 2 năm 2023.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và phân loại sinh học

Virus CPV-2 được phân loại thuộc chi Protoparvovirus, phân họ Parvovirinae, họ Parvoviridae, loài Carnivore protoparvovirus 1 (theo ICTV, 2021). Hạt virus có cấu trúc hình cầu đối xứng khối 20 mặt, không có vỏ bọc ngoài, đường kính khoảng 25 nm. Vật chất di truyền là phân tử DNA sợi đơn (ssDNA) dạng mạch thẳng với kích thước xấp xỉ 5,2 kb.

Hệ gen của CPV-2 chứa hai khung đọc mở (ORF) chính:

• ORF1 (ở đầu 3'): Mã hóa hai protein phi cấu trúc là NS1 (Non-structural protein 1) và NS2 (Non-structural protein 2), đóng vai trò thiết yếu trong quá trình nhân đôi DNA của virus, đóng gói vỏ capsid và kích hoạt quá trình chết theo chương trình (apoptosis) của tế bào vật chủ.
• ORF2 (ở đầu 5'): Mã hóa hai protein cấu trúc vỏ capsid là VP1 (Viral protein 1, chiếm khoảng 10%) và VP2 (Viral protein 2, chiếm khoảng 90%). Capsid hoàn chỉnh được cấu thành từ 60 tiểu phần (khoảng 6 bản sao VP1 và 54 bản sao VP2). Protein VP2 là yếu tố độc lực chính, quyết định tính kháng nguyên, tính hướng mô và tương tác trực tiếp với thụ thể trên tế bào vật chủ.

Phân loại các biến thể CPV-2 dựa trên sai khác amino acid tại vị trí 426 trên protein VP2:

• CPV-2a: Mang amino acid Asparagine (Asn - N).
• CPV-2b: Mang amino acid Axit aspartic (Asp - D).
• CPV-2c: Mang amino acid Axit glutamic (Glu - E).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Nghiên cứu sử dụng quy trình thực nghiệm sinh học phân tử chuẩn, bao gồm các phương pháp và kỹ thuật sau:

• Chẩn đoán nhanh ban đầu: Sử dụng bộ kít sắc ký miễn dịch Canine Parvovirus Antigen Test Kit, Blot Test (hãng BIONOTE) để kiểm tra kháng nguyên CPV-2 trong mẫu phân tươi.
• Tách chiết DNA tổng số: Sử dụng bộ sinh phẩm GeneJET Genomic DNA Purification Kit (Thermo Scientific, MA, Hoa Kỳ). Mẫu bệnh phẩm được ly giải tế bào, tiêu hóa protein bằng Proteinase K kết hợp xử lý RNase A, gắn cột silica, rửa sạch tạp chất qua hai bước đệm và thu nhận DNA tinh sạch ở thể tích $30\ \mu\text{l}$.
• Kỹ thuật PCR khuếch đại gen: Thực hiện trên máy luân nhiệt MJ PTC-100 (USA) sử dụng bộ kít DreamTaq PCR Master Mix (2X) (Thermo Scientific). Hỗn hợp phản ứng gồm $25\ \mu\text{l}$ DreamTaq Master Mix, $2\ \mu\text{l}$ DMSO, $2\ \mu\text{l}$ mồi xuôi ($10\ \text{pmol}/\mu\text{l}$), $2\ \mu\text{l}$ mồi ngược ($10\ \text{pmol}/\mu\text{l}$), $3\ \mu\text{l}$ khuôn DNA và $16\ \mu\text{l}\ \text{H}_2\text{O}$ (tổng thể tích $50\ \mu\text{l}$). Chu trình nhiệt: Biến tính ban đầu $94^\circ\text{C}$ (5 phút); 35 chu kỳ gồm biến tính $94^\circ\text{C}$ (1 phút), gắn mồi $52^\circ\text{C}$ (1 phút), kéo dài $68^\circ\text{C}$ (4 phút); kéo dài kết thúc $72^\circ\text{C}$ (10 phút) và giữ mẫu ở $4^\circ\text{C}$.
• Điện di kiểm tra sản phẩm PCR: Điện di trên gel agarose 1% pha trong đệm TAE 1X ở điện áp 110V trong 25–30 phút, nhuộm Ethidium Bromide (10 phút) và soi đọc dưới hệ thống chụp ảnh điện di Dolphin (Đài Loan), đối chiếu kích thước bằng thang chuẩn Lambda DNA/HindIII Marker (Thermo Scientific).
• Tinh sạch sản phẩm PCR: Sử dụng bộ GeneJET PCR Purification Kit cho các sản phẩm đơn băng và bộ GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific) cắt thạch tinh sạch cho các phản ứng xuất hiện băng phụ.
• Giải trình tự gen: Sản phẩm tinh sạch được giải trình tự nucleotide trực tiếp theo phương pháp kết thúc chuỗi dideoxy của Sanger trên hệ thống máy đọc tự động ABI-3100 Avant Genetic Analyzer và ABI3500 (Applied Biosystems, Hoa Kỳ) thông qua dịch vụ của hãng 1st BASE (Singapore).
• Phân tích tin sinh học:
  • Kiểm tra và gióng hàng chuỗi bằng các phần mềm BioEdit và GeneDoc 2.7.
  • Tìm kiếm mức độ tương đồng chuỗi qua công cụ BLAST trên cơ sở dữ liệu NCBI GenBank.
  • Phân tích di truyền tiến hóa và xây dựng cây phả hệ nguồn gốc bằng phần mềm MEGA 7 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis), sử dụng mô hình thay thế nucleotide Kimura 2-parameter, thuật toán Maximum Likelihood (ML) với giá trị lặp lại bootstrap 1000 lần.

Thông tin các cặp mồi thiết kế

Các cặp mồi được thiết kế dựa trên chuỗi chuẩn của CPV-2 trên GenBank và tổng hợp tại Công ty Cổ phần Công nghệ Sinh học Phù Sa (Cần Thơ):

Tên cặp mồi	Chiều	Trình tự nucleotide (5' $\rightarrow$ 3')	Vị trí bám trên genome (nt)	Kích thước sản phẩm dự kiến (bp)
PCV-F1 / PCV-R1	Xuôi Ngược	5'-AGTCACACGTCATACGTACG-3' 5'-GCTGCATTATAACAACCAAC-3'	74–93 1531–1550	1476
PCV-F2 / PCV-R2	Xuôi Ngược	5'-TGTCACGCTATAGCATGTGT-3' 5'-GTCTGCTTGAGTTTGCTGTG-3'	1408–1427 2970–2990	1582
PCV-F3 / PCV-R3 (chẩn đoán)	Xuôi Ngược	5'-ATGGAGCAGTTCAACCAGAC-3' 5'-GCATTTACATGAAGTCTTGG-3'	2795–2814 4225–4244	1449
PCV-F4 / PCV-R4	Xuôi Ngược	5'-ACCAACAGATCCAATTGGAG-3' 5'-TATAGACAGTATACGAGGCC-3'	4082–4101 5023–5042	960

---

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Phần Mở đầu thiết lập tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ sự bùng nổ của bệnh viêm ruột do CPV-2 gây ra trên đàn chó tại Việt Nam, đặc biệt là sự thiếu hụt các công trình phân tích toàn bộ khung đọc mở hệ gen của virus. Tác giả xác định rõ mục đích giải mã, phân tích đặc điểm phân tử và xây dựng cây phát sinh loài của các chủng CPV-2 phân lập tại Hà Nội năm 2022, đồng thời liệt kê 4 yêu cầu cụ thể của khóa luận.

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp các tài liệu khoa học trong nước và quốc tế liên quan đến CPV-2 theo 4 nội dung chính:

• Tổng quan về bệnh Parvo ở chó: Lịch sử ghi nhận virus từ năm 1978 trên thế giới và năm 1994 tại Việt Nam; phân tích 3 thể biểu hiện lâm sàng (thể ruột phổ biến ở chó 5–10 tuần tuổi gây tiêu chảy ra máu mùi tanh; thể viêm cơ tim ở chó 4–8 tuần tuổi gây hoại tử cơ tim và chết đột ngột; thể kết hợp tim - ruột ở chó 6–16 tuần tuổi gây chết sau 24 giờ); cơ chế bệnh sinh phá hủy mô lympho, tủy xương và bào mòn biểu mô ruột non.
• Đặc điểm sinh học của CPV-2: Vị trí phân loại học, cấu trúc hạt virus dạng 20 mặt đường kính 25 nm, cấu trúc bộ gen ssDNA 5,2 kb chứa 2 ORF mã hóa cho NS1, NS2, VP1, VP2. Tiến trình tiến hóa kháng nguyên chuyển dịch từ CPV-2 gốc $\rightarrow$ CPV-2a (1980) $\rightarrow$ CPV-2b (1984) $\rightarrow$ CPV-2c (2000 tại Ý mang đột biến D426E).
• Các phương pháp chẩn đoán: So sánh ưu - nhược điểm của chẩn đoán lâm sàng, chẩn đoán huyết thanh học (ELISA, sắc ký miễn dịch IC, ngưng kết hồng cầu HA) và chẩn đoán sinh học phân tử bằng PCR/giải trình tự gen.
• Tình hình nghiên cứu về CPV-2: Tổng kết các nghiên cứu quốc tế tiêu biểu (Buonavoglia et al., 2001; Decaro et al., 2007; Moon et al., 2019; Liu et al., 2021 tại Thượng Hải xác định biến thể "CPV-2c châu Á" mang 4 đột biến 5Gly, 267Tyr, 324Ile, 370Arg) và các nghiên cứu tại Việt Nam (Nakamura et al., 2004; Trần Ngọc Bích et al., 2013; Nguyễn Văn Dũng et al., 2018; Minh Hoàng et al., 2019 xác định CPV-2c chiếm 96,54%; Nguyễn Mạnh Tường et al., 2020; Đoàn Thị Thanh Hương et al., 2021; Võ Văn Hải et al., 2022).

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết toàn bộ vật liệu sinh học, trang thiết bị, hóa chất và quy trình thực nghiệm:

• Mẫu nghiên cứu: 3 mẫu bệnh phẩm từ chó nhiễm CPV-2 tại Hà Nội có mã hiệu Par1-VN-2022 (chó Fox, 3 tháng tuổi, tiêu chảy phân lẫn máu, chưa tiêm vaccine), Par2-VN-2022 (chó Corgi, 2 tháng tuổi, nôn mửa, tiêu chảy, đã tiêm đủ vaccine phòng 7 bệnh Vanguard), Par4-VN-2022 (chó Fox sóc, 3 tháng tuổi, tiêu chảy, chưa tiêm vaccine).
• Hệ thống thiết bị và kít thương mại: Liệt kê nguồn gốc 18 danh mục máy móc và các bộ kít của Thermo Scientific.
• Quy trình chi tiết 12 bước tách chiết DNA tổng số, quy trình phản ứng PCR 35 chu kỳ, điện di trên thạch agarose 1%, quy trình 7 bước tinh sạch sản phẩm PCR đơn băng và 10 bước trích ly DNA từ gel agarose cho sản phẩm đa băng.
• Phương pháp giải trình tự Sanger và các phần mềm xử lý dữ liệu tin sinh học (GeneDoc, MEGA 7).

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương Kết quả và thảo luận thể hiện toàn bộ dữ liệu thực nghiệm thu được:

• Kết quả chẩn đoán PCR: Phản ứng PCR với cặp mồi PCV-F3/PCV-R3 khuếch đại thành công đoạn gen kích thước xấp xỉ 1,4 kb trên cả 3 mẫu bệnh phẩm. Kết quả kiểm tra xác nhận chó mắc bệnh ở lứa tuổi nhỏ (2–3 tháng tuổi) ở cả cá thể chưa tiêm và đã tiêm đầy đủ vaccine Vanguard.
• Khuếch đại và giải mã toàn bộ genome: Sử dụng 3 đoạn khuếch đại gối đầu (PCV-F1/R1: 1476 bp; PCV-F2/R2: 1582 bp; PCV-F3/R4: 2247 bp). Điện di cho thấy các băng sản phẩm sắc nét, đúng kích thước thiết kế.
• Đặc điểm khung đọc mở (ORF): Đã thu nhận hoàn chỉnh toàn bộ vùng mã hóa dài 4269 bp của cả 3 chủng Par1-VN-2022, Par2-VN-2022, Par4-VN-2022. Đối chiếu với chủng tham chiếu CPV-SH1516 (Trung Quốc, dài 5059 bp), vùng mã hóa của 3 chủng nghiên cứu tương ứng từ vị trí nucleotide 270 đến 4538.
• Cấu trúc chi tiết các gen thành phần:
  • Gen NS1: Kích thước 2007 nt (vị trí 270–2276).
  • Gen NS2: Kích thước 1972 nt (vị trí 270–2239).
  • Gen VP1: Kích thước 2256 nt (vị trí 2283–4538).
  • Gen VP2: Kích thước 1755 nt (vị trí 2784–4538), mã hóa 584 amino acid, mã mở đầu là ATG và kết thúc là TAA.
• Thành phần nucleotide: Phân tích chủng Par1-VN-2022 cho thấy tỷ lệ A (36,3%), T (27,1%), G (16,2%), C (20,4%). Tỷ lệ A+T đạt tới 63,4%, trong khi tỷ lệ G+C thấp (36,6%). Điều này dẫn đến cấu trúc DNA kém bền vững do ít liên kết hydro 3 nối (G-C), giải thích nguyên nhân CPV-2 dễ phát sinh đột biến điểm trong quá trình tiến hóa.
• Xác định kiểu gen và đột biến protein VP2: Cả 3 chủng đều mang amino acid Axit glutamic (Glu - E) tại codon 426 $\rightarrow$ xác định thuộc kiểu gen CPV-2c. Đặc biệt, các chủng mang hai đột biến đặc trưng: A5G (Alanine $\rightarrow$ Glycine ở vị trí 5) và I447M (Isoleucine $\rightarrow$ Methionine ở vị trí 447).
• Mức độ tương đồng: Trình tự gen VP2 của 3 chủng nghiên cứu có độ tương đồng nucleotide và amino acid rất cao ($> 99,54%$) với các chủng CPV-2c nhóm châu Á (như chủng PCV28 tại Nghệ An, HCM01 tại TP.HCM, các chủng từ Đài Loan, Hàn Quốc). Ngược lại, mức độ tương đồng thấp hơn đáng kể khi so sánh với chủng vaccine thương mại VanguardPlus ($97,43% - 98,58%$).
• Phân tích phả hệ di truyền: Cây phả hệ Maximum Likelihood (1000 bootstrap) xây dựng trên dữ liệu gen VP2 (1755 bp) và toàn bộ ORF hệ gen (4269 bp) đều chỉ ra cả 3 chủng phân lập tại Hà Nội năm 2022 nằm cùng một phân nhóm tiến hóa độc lập thuộc nhánh CPV-2c châu Á, tách biệt rõ ràng với các phân nhóm CPV-2c từ Châu Âu, Bắc Mỹ, Nam Mỹ cũng như các biến thể CPV-2a, CPV-2b và CPV-2 nguyên thủy.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính kèm số liệu thực nghiệm

1. Chẩn đoán phát hiện: Xác định thành công 3/3 mẫu phân chó nghi nhiễm tại Hà Nội dương tính với CPV-2 bằng PCR khuếch đại đoạn gen VP2 kích thước 1,4 kb.
2. Kích thước và tọa độ các gen trên hệ gen: Thu nhận hoàn chỉnh trình tự khung đọc mở (ORF) dài 4269 bp cho cả 3 chủng Par1-VN-2022, Par2-VN-2022 và Par4-VN-2022.

Khung đọc mở	Gen mã hóa	Vị trí nucleotide	Độ dài (nt)	Chức năng sinh học
ORF 1	NS1 NS2	270–2276 270–2239	2007 1972	Protein phi cấu trúc: tham gia sao chép DNA, đóng gói virus và gây apoptosis tế bào.
ORF 2	VP1 VP2	2283–4538 2784–4538	2256 1755	Protein cấu trúc: tạo vỏ capsid (VP2 mã hóa 584 aa, quyết định kháng nguyên và độc lực).

3. Xác định biến thể và đột biến đặc trưng: Cả 3 chủng được xác định thuộc biến thể kháng nguyên CPV-2c (mang amino acid Glutamic acid tại vị trí 426 của VP2). Các chủng nghiên cứu mang các đột biến đặc trưng của phân nhóm châu Á gồm A5G và I447M.
4. Tỷ lệ tương đồng phân tử:
   • So với các chủng CPV-2c phân lập tại châu Á (Việt Nam, Hàn Quốc, Đài Loan): Tương đồng nucleotide và amino acid đạt trên 99,54%.
   • So với chủng vaccine VanguardPlus: Tương đồng chỉ đạt từ 97,43% đến 98,58%.
5. Cây phát sinh loài: Khẳng định 3 chủng nghiên cứu nằm trong nhánh "CPV-2c châu Á" với hệ số tin cậy bootstrap cao.

Đóng góp của đề tài

• Cập nhật dữ liệu phân tử mới nhất về hệ gen hoàn chỉnh của virus CPV-2 đang lưu hành trên đàn chó tại khu vực Hà Nội năm 2022.
• Cung cấp bằng chứng thực nghiệm giải thích hiện tượng thất bại miễn dịch (chó đã tiêm phòng đủ vaccine thương mại như Vanguard vẫn mắc bệnh), cho thấy các đột biến kháng nguyên quan trọng trên protein bề mặt VP2 (A5G, I447M, D426E) có thể làm suy giảm khả năng bảo hộ chéo của kháng thể từ vaccine thế hệ cũ.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế của nghiên cứu:
  • Dung lượng mẫu giải trình tự toàn bộ khung đọc mở còn hạn chế ($n = 3$ mẫu) và mới chỉ thu thập tại một phòng khám thú y trên địa bàn quận Nam Từ Liêm (Mỹ Đình), Hà Nội trong khoảng thời gian từ tháng 8/2022 đến tháng 2/2023.
  • Nghiên cứu tập trung giải mã toàn bộ vùng khung đọc mở (ORF dài 4269 bp), chưa giải mã trọn vẹn hai đầu cấu trúc telomere/vùng không dịch mã (non-coding regions) đạt kích thước toàn phần ~5,2 kb của virus CPV-2.
• Hướng nghiên cứu tiếp theo:
  • Mở rộng phạm vi thu thập mẫu bệnh phẩm trên nhiều địa bàn quận, huyện khác tại Hà Nội và các tỉnh lân cận nhằm có bức tranh dịch tễ học phân tử toàn diện hơn.
  • Tăng số lượng mẫu được giải trình tự hệ gen hoàn chỉnh để theo dõi liên tục sự xuất hiện của các đột biến mới trên các gen NS1, NS2, VP1 và VP2.
  • Tiến hành các thử nghiệm trung hòa huyết thanh học in vitro và in vivo để đánh giá chính xác mức độ bảo hộ chéo của các loại vaccine thương phẩm hiện hành đối với biến thể CPV-2c mang đột biến A5G/I447M đang lưu hành tại Việt Nam.

---

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị ứng dụng và tham khảo cụ thể đối với các nhóm đối tượng sau:

• Sinh viên và học viên cao học ngành Công nghệ sinh học, Thú y, Bệnh học động vật: Tham khảo cấu trúc khóa luận thực nghiệm, quy trình chuẩn về thiết kế mồi PCR phân đoạn phủ kín genome virus, quy trình tách chiết DNA từ bệnh phẩm phân, kỹ thuật tinh sạch gel và phương pháp phân tích tin sinh học (BLAST, GeneDoc, MEGA 7).
• Các nhà nghiên cứu dịch tễ học và sinh học phân tử: Sử dụng hệ thống 4 cặp mồi thiết kế (PCV-F1/R1 đến PCV-F4/R4) làm công cụ khuếch đại phục vụ giải trình tự hệ gen CPV-2. Dữ liệu trình tự 3 chủng Par1-VN-2022, Par2-VN-2022, Par4-VN-2022 là nguồn dữ liệu đối chiếu quan trọng cho các nghiên cứu biến động di truyền virus tại Đông Nam Á.
• Bác sĩ thú y lâm sàng và các nhà sản xuất vaccine thú y: Cung cấp cơ sở khoa học để tư vấn phòng bệnh cho người nuôi thú cưng; đồng thời là căn cứ thực tiễn để nghiên cứu, phát triển các chủng vaccine mới tương thích với biến thể kháng nguyên CPV-2c lưu hành tại Việt Nam.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Ba chủng virus CPV-2 thu thập tại Hà Nội trong nghiên cứu này thuộc biến thể (genotype) nào và mang các đột biến amino acid đặc trưng gì trên gen VP2?

Cả 3 chủng virus (Par1-VN-2022, Par2-VN-2022, Par4-VN-2022) đều thuộc biến thể kháng nguyên CPV-2c, được đặc trưng bởi việc mang gốc amino acid Axit glutamic (Glu - E) tại vị trí 426 trên protein vỏ VP2 (thay vì Asn ở CPV-2a hay Asp ở CPV-2b). Bên cạnh đó, các chủng này mang các đột biến đặc trưng của nhánh CPV-2c châu Á gồm A5G (Alanine chuyển thành Glycine tại vị trí số 5) và I447M (Isoleucine chuyển thành Methionine tại vị trí 447).

2. Kích thước toàn bộ khung đọc mở (ORF) và các gen thành phần của các chủng CPV-2 trong khóa luận được xác định cụ thể là bao nhiêu?

Toàn bộ khung đọc mở hệ gen của 3 chủng nghiên cứu có kích thước 4269 bp (tương ứng với tọa độ nucleotide từ 270 đến 4538 khi đối chiếu với chủng chuẩn CPV-SH1516). Kích thước từng gen cụ thể gồm:

• Gen phi cấu trúc NS1: 2007 nt (vị trí 270–2276).
• Gen phi cấu trúc NS2: 1972 nt (vị trí 270–2239).
• Gen cấu trúc VP1: 2256 nt (vị trí 2283–4538).
• Gen kháng nguyên VP2: 1755 nt (vị trí 2784–4538), mã hóa chuỗi peptide gồm 584 amino acid.

3. Tại sao mẫu chó Par2-VN-2022 đã được tiêm phòng đầy đủ vaccine Vanguard 7 bệnh nhưng vẫn bị nhiễm CPV-2 và phát bệnh?

Kết quả phân tích phân tử cho thấy mức độ tương đồng về nucleotide và amino acid vùng gen VP2 giữa chủng thực địa Par2-VN-2022 và chủng vaccine VanguardPlus chỉ đạt từ 97,43% đến 98,58%. Các đột biến kháng nguyên quan trọng trên protein VP2 (đặc biệt là đột biến tại các vị trí 426, 5 và 447 nằm trên các cấu trúc nhô của vỏ capsid) có thể làm thay đổi cấu hình kháng nguyên, dẫn đến việc kháng thể trung hòa do vaccine tạo ra không thể nhận diện và vô hiệu hóa tối ưu biến thể CPV-2c mới đang lưu hành.

4. Tỷ lệ thành phần các loại nucleotide (A, T, G, C) trong hệ gen chủng CPV-2 nghiên cứu có đặc điểm gì nổi bật?

Phân tích thành phần nucleotide trên chủng Par1-VN-2022 cho thấy tỷ lệ A chiếm 36,3%, T chiếm 27,1%, G chiếm 16,2% và C chiếm 20,4%. Tỷ lệ tổng $(\text{A} + \text{T})$ đạt tới 63,4%, trong khi tỷ lệ $(\text{G} + \text{C})$ rất thấp (36,6%). Do cặp base G-C có 3 liên kết hydro còn A-T chỉ có 2 liên kết, tỷ lệ G-C thấp làm cho chuỗi DNA của CPV-2 kém bền vững về mặt cấu trúc và dễ phát sinh các đột biến điểm trong quá trình nhân đôi.

5. Nghiên cứu đã sử dụng phương pháp nào để phân tích quan hệ di truyền và cây phả hệ cho kết quả như thế nào?

Nghiên cứu sử dụng phần mềm MEGA 7, áp dụng mô hình tiến hóa nucleotide Kimura 2-parameter và phương pháp dựng cây Maximum Likelihood (ML) với hệ số tin cậy bootstrap 1000 lần lặp. Cây phả hệ phân tích trên cả dữ liệu gen VP2 (1755 bp) và toàn bộ khung đọc mở (4269 bp) đều xếp 3 chủng tại Hà Nội vào chung một nhóm tiến hóa với các chủng CPV-2c phân nhóm châu Á, có quan hệ họ hàng gần gũi nhất với các chủng tại Trung Quốc, Đài Loan, Hàn Quốc và các chủng CPV-2c phân lập trước đó tại Việt Nam.

---

Kết luận

Khóa luận đã thực hiện thành công việc chẩn đoán, khuếch đại và giải mã toàn bộ khung đọc mở hệ gen dài 4269 bp của 3 chủng virus CPV-2 gây bệnh trên chó tại Hà Nội năm 2022. Kết quả phân tích phân tử và phả hệ di truyền xác định cả 3 chủng đều thuộc biến thể CPV-2c phân nhóm châu Á, mang các đột biến kháng nguyên đặc trưng A5G và I447M trên gen VP2. Dữ liệu về sự sai khác di truyền giữa các chủng thực địa với chủng vaccine thương mại cung cấp cơ sở khoa học quan trọng cho công tác giám sát dịch tễ phân tử và định hướng nghiên cứu phát triển vaccine phòng bệnh parvo ở chó tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

mở đầu tiên mã hóa hai gen phi cấu trúc là NS1 (non-structural protein 1) và NS2 (non-structural protein 2) nằm ở đầu 3’ của hệ gen, trong khi khung đọc mở thứ hai nằm ở đầu 5’ mã hóa cho hai gen cấu trúc là VP1 (viral protein 1) và VP2 (viral protein 2) (Reed và cs., 1988; Shackelton và cs. Cấu trúc của Canine parvovirus (Nguồn: http://www.edu/virusworld/viruslist.php?virus=cpv) Hai gen không cấu trúc NS1 và NS2 đóng vai trò thiết yếu cho sự nhân lên của virus và gây ra quá trình ―chết theo chương trình‖ (apoptosis) trong tế bào vật chủ (Callaway và cs. NS1 là loại protein đa chức năng, cần thiết để bắt đầu và điều khiển quá trình sao chép DNA của virus. Ngoài ra, NS1 còn có vai trò trong quá trình đóng gói virus và chuyển hóa một số chất xúc tác.

NS2 được tạo ra từ khung đọc mở bên trái của bộ gen virus, chứa 87 acid amin đầu tận cùng với protein không cấu trúc 1 (NS1) liên kết với 78 acid amin từ một khung đọc mở tiếp theo. Tuy nhiên, các đặc tính và chức năng của NS2 hiện vẫn chưa được nghiên cứu chính xác (Wang và cs. Khung đọc mở thứ hai mã hóa cho hai gen cấu trúc VP1 và VP2, với vai trò cấu tạo nên vỏ capsid, ghép từ 6 bản sao của VP1 và 54 bản sao của VP2. Chúng là kháng nguyên chính tạo nên các kháng thể trung hòa và cũng là yếu tố gây độc lực (Nakamura và cs., 2004; Zhou và cs.

VP1 chiếm khoảng 10%, đóng vai trò chủ chốt trong quá trình lây nhiễm của capsid trong tế bào, nhưng lại không đóng góp cao trong việc hình thành vỏ virus. Chúng thường nằm sâu bên trong capsid và khó bị phát hiện bởi kháng thể. Vùng kết thúc của VP1 chứa một số nhóm acid amin cơ bản giống với trình tự hạt nhân cổ điển, bao gồm trình tự được bảo tồn gần đầu cuối vùng kết thúc, bao gồm bốn acid amin cơ bản, mà trong một peptit có thể hoạt động để vận chuyển các protein khác vào nhân tế bào (Vihinen-Ranta và cs. VP2 chiếm khoảng 90% 8 protein capsid, rất quan trọng đối với sự tương tác giữa virus và tế bào vật chủ, tính dinh dưỡng của mô và khả năng sinh miễn dịch.

Protein VP2 của virus CPV-2 rất đa dạng về mặt di truyền và kháng nguyên. Các đột biến ở một số vị trí quan trọng có thể gây ra những thay đổi acid amin làm thay đổi phạm vi vật chủ và tính kháng nguyên của virus (Callaway và cs. Các protein capsid có lõi trung tâm được bảo tồn cao, linh hoạt giữa các sợi β tương tác với nhau để tạo nên hầu hết bề mặt capsid. Các đặc điểm bề mặt của capsid bao gồm một vùng nhô lên dài 22 Å (spike) trên các trục gấp ba, một chỗ lõm sâu 15 Å (canyon) xung quanh các cấu trúc hình trụ ở các trục gấp năm và một chỗ lõm sâu 15 Å (dimple) ở hai trục gấp đôi.

Ngoài ra, các trục gấp ba là vùng kháng nguyên nhất của capsid và là mục tiêu để trung hòa các kháng thể (Miranda và cs. Sơ đồ minh họa genome của chủng CPV-2 1. Các biến chủng của CPV-2 Mặc dù CPV-2 là một virus DNA, nhưng tỷ lệ thay thế bộ gen của nó là khoảng 10-4 trên mỗi vị trí mỗi năm, tương tự như virus RNA (Zhou và cs. Năm 1978, CPV-2 lần đầu được xác định từ sự bùng nổ dịch ở chó tại Hoa Kỳ và Úc (Appel và cs., 1979), sau đó, nó đã được báo cáo tại nhiều quốc gia trong năm 1978 và 1979.

CPV-2 có liên quan chặt chẽ với parovirus ở mèo (FPV), vì thế, nó được giả định là biến thể vật chủ của FPV. CPV-2 được đặt tên để phân biệt với Canine minute virus (CPV-1). Các protein VP2 của virus CPV-2 rất đa dạng về mặt di truyền và tính kháng nguyên. Đột biến ở vị trí quan trọng có thể gây ra những thay đổi về acid amin ảnh hưởng đến phạm vi vật chủ, tính kháng nguyên cũng như độc lực của virus, đồng thời làm phức tạp quá trình phân tích phát sinh gen và xác định kiểu gen của các chủng CPV-2.

9 Năm 1980, CPV-2 ban đầu được thay thế hoàn toàn bằng hai biến thể kháng nguyên mới, được gọi là CPV loại 2a (CPV-2a) và 2b (CPV-2b). Năm 2000, CPV-2c với sự thay thế acid glutamic ở vị trí 426 (Asn ở 2a, Asp ở 2b) được báo cáo ở Ý (Zhou và cs. Khi biến thể mới xuất hiện, chúng sẽ rất nhanh chóng thay thế cho biến thể cũ. Cho đến nay, cả ba biến thể CPV-2 đều được phân bố trên toàn thế giới, với tỷ lệ tương đối khác nhau theo năm và quốc gia thu nhận.

Phân tích dòng thời gian của các biến thể kháng nguyên CPV-2 cho thấy CPV-2 được đặc trưng bởi các đột biến so với FPV là K80R, K93N, V103A, D323N, N564S và A568D trong VP2, sau đó, nó được thay thế bởi CPV-2a tại M87L , I101T, A300G, D305Y, V555I. Năm 1984, CPV-2a được thay thế bằng CPV-2b (N426D và I555V) và cuối những năm 1990, đầu những năm 2000, CPV-2b được thay thế bởi CPV-2c, chỉ mang đột biến duy nhất D426E (Miranda và cs. Một số quá trình tiến hóa của CPV-2 ở chó 10 1. Cơ chế gây bệnh Khi chó bị nhiễm CPV-2, thời gian ủ bệnh ngắn 3 – 7 ngày và sau đó sẽ xuất hiện các triệu chứng lâm sàng.

CPV-2 sẽ sử dụng nguyên liệu của tế bào vật chủ để nhân lên hàng loạt. Trước tiên, virus tấn công hạch bạch huyết tại vùng hầu họng rồi tiếp tục xâm nhập vào tế bào lympho (Prittie và cs. Những virus này sẽ cản trở đường đi của các tế bào lympho, đồng thời lẩn tránh khỏi hệ thống phòng thủ của vật chủ và tiếp tục xâm nhập vào máu. Nhiều tế bào lympho bị nhiễm CPV-2 sẽ bị tiêu diệt, dẫn đến số lượng bạch cầu giảm.

Khi đi vào máu, virus nhanh chóng tấn công vào tủy xương phá hủy tế bào miễn dịch non và giảm số lượng bạch cầu làm suy yếu khả năng miễn dịch của vật chủ. Cùng với đó, virus tấn công vào biểu mô của ruột non làm vô hiệu hóa khả năng bổ sung chất dinh dưỡng và khả năng chống mất nước của cơ thể vật chủ. Chu kỳ nhân lên của CPV-2 xảy ra trong nhân của tế bào vật chủ đang phân chia tại cuối pha S hoặc đầu pha G2. Sự lây nhiễm và nhân lên diễn ra nhanh chóng, thường tác động trên tủy xương và đường ruột của vật chủ.

Một gram phân của con chó nhiễm trùng nặng có thể chứa đủ vật chất virus để lây nhiễm cho hơn 10 triệu con chó khác qua tiếp xúc đường tiêu hóa (Prittie và cs. Virus bắt đầu nhân lên ở mô bạch huyết hầu họng và đi vào huyết tương, tiếp đó là biểu mô đường ruột thường nhiễm ở ngày thứ 4. Kháng thể có thể xuất hiện khoảng ngày thứ 5 sau khi nhiễm bệnh và tăng lên đối đa từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 10. Các dấu hiệu lâm sàng xuất hiện từ ngày 4 đến ngày 10 sau khi nhiễm virus (Prittie và cs.

Các phƣơng pháp chẩn đoán CPV-2 Vì CPV-2 lây nhiễm rất nhanh nên việc phát hiện sớm, chính xác để cách ly và điều trị những con chó bệnh là vô cùng quan trọng. Dưới đây là một số phương pháp có thể áp dụng để chẩn đoán CPV-2. Chẩn đoán theo triệu chứng CPV-2 ở chó gây ra những triệu chứng như ủ rũ, chán ăn, sốt, nôn mửa và tiêu chảy, phân có lẫn máu và chất nhầy, mùi tanh. Tuy nhiên, chẩn đoán theo 11 triệu chứng chỉ có thể áp dụng trong số ít trường hợp, bởi vì không chỉ có CPV- 2 gây ra các triệu chứng bệnh như trên (Mylonakis và cs.

Chẩn đoán huyết thanh học Kỹ thuật ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent assay): dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể và được thực hiện bằng những bước cơ bản sau: Kháng nguyên hoặc kháng thể đã biết được gắn trên một giá thể rắn, sau đó cho mẫu có chứa kháng thể hoặc kháng nguyên cần tìm vào giếng. Bổ sung thêm kháng thể có gắn với enzyme. Bước cuối cùng thêm cơ chất, enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu màu có thể xác định được bằng máy đo huỳnh quang (Prittie, 2004; Dik và Şimşek, 2021). Kỹ thuật sắc ký miễn dịch (immunochromatographic – IC): Khi nhỏ huyết thanh cần xác định kháng thể lên bản sắc ký, kháng thể đặc hiệu (nếu có) trong huyết thanh sẽ kết hợp với kháng nguyên gắn màu, phức hợp miễn dịch kháng thể - kháng nguyên (Dik và Şimşek, 2021).

Xét nghiệm ngưng kết hồng cầu (hemagglutination – HA) cũng là một xét nghiệm nhanh chóng và đơn giản để phát hiện CPV-2 (Dik và Şimşek, 2021). Tuy nhiên, các kỹ thuật trên có độ nhạy tương đối thấp (Decaro và Buonavoglia, 2012). Chẩn đoán bằng phƣơng pháp sinh học phân tử Kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction – PCR) được sử dụng rộng rãi để chẩn đoán nhiễm trùng do CPV-2. Phương pháp này chẩn đoán nhanh chóng và có độ chính xác cao.

Ngoài ra, PCR có thể giúp xác định được kiểu gen của virus gây bệnh thông qua việc sử dụng các cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm của phản ứng PCR được sử dụng để giải trình tự trực tiếp, cho kết quả là trình tự nucleotide. Qua việc sử dụng các phần mềm tin sinh học, có thể xác định tỷ lệ tương đồng và phân tích nguồn gốc của các chủng CPV-2 (Decaro và Buonavoglia, 2012). Tình hình nghiên cứu về CPV-2 1.

Một số nghiên cứu về CPV-2 trên thế giới Năm 2001, Buonavoglia và cộng sự đã phân lập được 2 chủng CPV từ chó bệnh. Nghiên cứu này đã xác định được sự thay đổi acid amin ở vị trí 426 (Asp thành Glu), trong vị trí kháng nguyên chính của capsid virus, đánh dấu sự xuất hiện của chủng mới CPV-2c tại Ý, cung cấp bằng chứng tiến hóa của CPV (Buonavoglia và cs. Năm 2006, Chinchkar và cộng sự đã nghiên cứu, phân tích trình tự gen VP2 từ chó nhiễm CPV-2 phân lập tại Ấn Độ. Kết quả cho thấy các chủng phân lập tại Ấn Độ thuộc CPV-2a, ngoại trừ có bốn chủng thuộc CPV-2b.

So sánh trình tự gen VP2 cho thấy các dòng phân lập ở Ấn Độ có sự khác biệt so với các dòng phân lập ở Đông Nam Á và dường như các chủng phân lập ở Ấn Độ tiến hóa độc lập (Chinchkar và cs. Nghiên cứu của Nicola Decaro và cộng sự năm 2007 cho thấy biến thể mới CPV-2c phổ biến ở một số quốc gia châu Âu (Ý, Bồ Đào Nha, Đức) và xuất hiện không thường xuyên tại Anh; CPV-2a thường xuất hiện ở Bỉ. Sự lan rộng của CPV-2c trên thế giới cho thấy rằng đột biến Glu-426 mang lại lợi thế nhất định trong việc nhân lên của virus (Decaro và cs.