Đặt vấn đề Lúa gạo (Oryza sativa L.) là cây lương thực quan trọng chiếm sản lượng lớn trên toàn thế giới và là cây lương thực chính yếu của nước ta. Hiện nay, hiện tượng thiếu vi chất dinh dưỡng trong khẩu phần ăn đang là một vấn đề được quan tâm, đặc biệt ở các nước sử dụng gạo làm lương thực chính. Việc nâng cao dinh dưỡng cho gạo cũng như các lương thực khác là một vấn đề cấp thiết để đảm bảo an ninh lương thực có chất lượng. Các nghiên cứu nâng cao giá trị dinh dưỡng của gạo đã được thực hiện từ cách đây gần 20 năm, bước đầu bằng các biện pháp canh tác cho đến phương pháp chọn giống, lai truyền thống và đến nay là áp dụng kỹ thuật di truyền và hiện đại nhất là kỹ thuật chỉnh sửa hệ gen.
Một số định hướng nghiên cứu đang bắt đầu được triển khai tại Trung tâm nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI) bao gồm: tạo các dòng lúa chứa đồng thời nhiều sắt, kẽm và beta-carotene; lúa chuyển gen có hàm lượng kẽm cao, lúa không chuyển gen có hàm lượng sắt cao,… (theo IRRI, 2021). Gần đây, nhóm nhà khoa học tại Trung Quốc đã có những kết quả ban đầu trong việc nghiên cứu các gen liên quan đến tăng cường tích lũy vi chất dinh dưỡng ở thực vật được công bố trên các tạp chí uy tín trên thế giới (Yun et al., 2021), (Tian et al. Đối tượng nghiên cứu được chọn bao gồm gen tiềm năng OsNramp2. OsNramp2 bước đầu đã được nhóm nghiên cứu chứng minh có chức năng liên quan đến hấp thu và vận chuyển sắt.
Việc triển khai các nghiên cứu bổ sung để củng cố chức năng nói trên của gen OsNramp2 trên các giống lúa chủ lực tại Việt Nam là cấp thiết và có ý nghĩa quan trọng đối với mục tiêu cải tạo di truyền cho cây lúa, tạo giống lúa có hàm lượng cao vi chất dinh dưỡng. Trên thế giới, việc nghiên cứu cải tiến các giống cây trồng bằng công nghệ sinh học đã được phát triển mạnh mẽ nhờ vào các kỹ thuật tiên tiến trên cơ sở phát huy và ứng dụng các nghiên cứu cơ bản. Công nghệ chỉnh sửa gen hiện nay cho phép cải biến DNA hệ gen tế bào, bao gồm cả thực vật, một cách chính xác và hiệu quả. Công nghệ CRISPR/Cas9 có thể được ứng dụng để thêm alen mong muốn hay loại bỏ các 1 alen không mong muốn thông qua cơ chế NHEJ hoặc HR trong hệ gen mục tiêu.
Hệ thống này mang đến một chiến lược đầy hứa hẹn để cải thiện đặc tính nông học của cây lúa cũng như nhiều loại cây trồng quan trọng khác. Với sự ứng dụng công nghệ chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas9, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu "Phân lập và thiết kế vector chỉnh sửa gen OsNramp2 liên quan đến tích lũy sắt ở giống lúa TBR225", với hi vọng tạo tiền đề cho nghiên cứu tạo cây lúa có hàm lượng cao vi chất dinh dưỡng, tăng hàm lượng sắt,…đáp ứng nhu cầu cải tiến chất lượng gạo trên một số giống lúa chủ lực của Việt Nam. Mục đích, yêu cầu, ý nghĩa của đề tài 1. Mục đích Nghiên cứu này được thực hiện nhằm thiết kế các cấu trúc biểu hiện phức hợp RNA-protein Cas9 chỉnh sửa gen OsNramp2.
Từ đó, tạo ra các dòng lúa chuyển gen để xác định đặc tính cũng như chức năng của OsNramp2 đối với sự tích lũy vi chất ở giống lúa TBR225. Yêu cầu Đề tài gồm các yêu cầu chính như sau: - Phân lập và giải trình tự đầy đủ các gen mục tiêu trên gen OsNramp2 trên giống lúa chủ lực TBR225. - Thiết kế hệ vector chỉnh sửa gen OsNramp2 cho giống lúa chủ lực TBR225. Ý nghĩa của đề tài - Thiết kế được một số gRNA nhắm mục tiêu gen OsNramp2 liên quan đến tích lũy sắt trên giống lúa chủ lực.
- Thiết kế được một số vector biểu hiện cấu trúc chỉnh sửa gen OsNramp2 liên quan đến tích lũy sắt, ở lúa để phục vụ nghiên cứu tạo giống lúa chất lượng cao. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Dinh dưỡng vi chất ở lúa gạo 2. Một số vi chất quan trọng Gạo chiếm một phần quan trọng trong chế độ ăn uống hàng ngày, đặc biệt là ở các nước đang phát triển ở Châu Á, cung cấp 50–80% lượng calo hàng ngày, protein, khoáng chất và vitamin, v.
Sản lượng gạo toàn cầu hàng năm là 700 triệu tấn được sản xuất trên diện tích 158 triệu ha vào năm 2017. Tuy nhiên, sản lượng lúa phải tăng thêm 8-10 triệu tấn mỗi năm và có động lực mạnh mẽ để nâng cao giá trị dinh dưỡng với nhiều vitamin và khoáng chất cần thiết đáp ứng nhu cầu lương thực và dinh dưỡng của dân số ngày càng tăng. Do đó, nhu cầu cấp thiết phải tạo ra các giống lúa có năng suất và giá trị dinh dưỡng được cải thiện để duy trì an ninh lương thực và dinh dưỡng toàn cầu (Calayugan et al. Các vi chất dinh dưỡng không chỉ cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng mà còn không thể thiếu đối với sức khỏe con người và động vật.
Trong hai thập kỷ gần đây, khái niệm đói tiềm ẩn (thiếu hụt một số vitamin và chất dinh dưỡng vi lượng mặc dù đã ăn đủ calo) đã được hình thành rõ ràng (Bashir et al. Các chất vi lượng như Fe và Zn rất cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển bình thường của cả thực vật và động vật. Thiếu Fe dẫn đến thiếu máu và cũng được báo cáo là có hậu quả bệnh lý. Thiếu Zn gây chậm lớn, thiểu năng sinh dục, rối loạn chức năng miễn dịch và suy giảm nhận thức.
Thiếu Fe và Zn là một trong những tình trạng thiếu vi chất dinh dưỡng phổ biến nhất ở người, ảnh hưởng đến hai tỷ người và gây ra hơn 0,8 triệu ca tử vong hàng năm (Bashir et al. Lượng Fe và Zn được khuyến nghị cho con người là 15 mg mỗi ngày. Tuy nhiên, điều này hiếm khi được đáp ứng bởi chế độ ăn dựa trên gạo được tiêu thụ ở người dân Châu Á. Gạo đánh bóng chứa trung bình chỉ có 2 mg Fe/kg gạo và 12 mg Zn/kg gạo, trong khi lượng Fe được khuyến nghị trong chế độ ăn uống cho người là 10–15 mg; trẻ sơ sinh, trẻ em và thanh thiếu niên cần nhiều Fe hơn vì chúng đang phát triển nhanh chóng; phụ nữ mang thai cần 3 đủ Fe cho bản thân và thai nhi đang lớn, và đây là đặc biệt đúng vào cuối thai kỳ khi em bé đang phát triển nhanh chóng nhất; và những cô gái và phụ nữ hành kinh cần nhiều Fe hơn do mất máu.
Zn đóng vai trò là đồng yếu tố của hơn 300 enzym tham gia vào quá trình chuyển hóa carbohydrate, lipid, protein và axit nucleic, do đó tầm quan trọng của nó đối với sự tăng trưởng và phát triển bình thường của động thực vật. Do đó, có ý kiến cho rằng tăng hàm lượng Fe trong các loại thực phẩm chủ yếu như gạo có thể đóng một vai trò quan trọng trong việc cải thiện sức khỏe. Ngày càng có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng các gen họ Nramp có thể tham gia vào quá trình hấp thụ và vận chuyển các kim loại như Fe, Zn, Mn, Cd trên nhiều đối tượng nghiên cứu khác nhau như khoai tây, ca cao, lúa mì. (Tian et al., 2021), (Bashir et al., 2013), (Herlihy et al., 2020), (Ullah et al., 2018), (Takahashi et al.
Ở lúa, OsNramp2 đã được nhóm nhà khoa học tại Trung Quốc những bước đầu chỉ ra là có liên quan đến tăng cường tích lũy Fe nghiên cứu được công bố trên các tạp chí uy tín trên thế giới (Yun et al. Nghiên cứu cải thiện vi chất ở lúa gạo Chất lượng lúa gạo không phải lúc nào cũng dễ xác định vì nó phụ thuộc vào người tiêu dùng và mục đích sử dụng của lúa gạo. Gần đây, nhu cầu của người tiêu dùng về gạo chất lượng tốt hơn đã tăng lên, các nước xuất khẩu đang cố gắng trở thành nhà xuất khẩu gạo lớn và do đó có nhiều áp lực đối với các nhà sản xuất và chế biến để sản xuất ra gạo chất lượng tốt hơn. Hàm lượng vi chất dinh dưỡng trong gạo cũng đã được quan tâm nhiều hơn (theo Rice knowledge Bank, 2021).
Từ khoảng 20 năm trước, để cải thiện giá trị dinh dưỡng ở lúa gạo, các nhà nghiên cứu đã sử đụng tới các biện pháp canh tác, phương pháp chọn giống lai truyền thống. Hiện nay phương pháp chủ yếu là sử dụng kĩ thuật di truyền và hiện đại nhất là kỹ thuật chỉnh sủa hệ gen. Một số định hướng nghiên cứu đang bắt đầu được triển khai tại Trung tâm nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI) bao gồm : tạo dòng lúa chứa Fe, Zn, beta-carotene; lúa chuyển gen có hàm lượng cao, lúa 4 không chuyển gen có hàm lượng Fe cao. Tăng cường sinh học cho cây trồng thông qua chăn nuôi cũng là một chiến lược bền vững và hiệu quả để giải quyết tình trạng suy dinh dưỡng vi chất dinh dưỡng cho người dân sống ở các nước đang phát triển không đủ khả năng mua thực phẩm tăng cường Fe và Zn, bằng cách bổ sung vi chất Fe và Zn vào khẩu phần ăn chủ yếu của họ (Kumari et al.
Hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 2. Giới thiệu về công nghệ chỉnh sửa gen Công nghệ chỉnh sửa bộ gen cho phép sửa đổi chính xác trình tự DNA in vivo và đưa ra một hứa hẹn tuyệt vời cho việc khai thác các gen thực vật trong cải tiến cây trồng (Shan et al., 2013) (Tian et al,. Phương pháp này lợi dụng hệ thống sửa chữa DNA của tế bào để tạo ra những thay đổi nhỏ trong trình tự DNA đích, thông qua việc sử dụng nuclease tổng hợp để tạo ra các đột biến đứt gãy DNA sợi đôi (double stranded breaks DSB) tại vị trí xác định trong hệ gen. Thao tác chính xác đối với bộ gen thực vật dựa vào sự cảm ứng của đứt gãy chuỗi kép DNA bởi các nuclease trình tự cụ thể để bắt đầu các phản ứng sửa chữa DNA dựa trên sự nối kết cuối không tương đồng (NHEJ) (non homologous end joining NHEJ) hoặc sửa chữa theo hướng tương đồng (HDR) (homologous directed recombination HDR).
Hệ thống sửa chữa DNA HDR đòi hỏi phải có một trình tự khuôn tương đồng để sửa chữa DSB; trong khi đó hệ thống NHEJ sẽ ghép nối trực tiếp 2 đầu phân tử DNA bị đứt. Mặc dù xảy ra phổ biến hơn, nhưng nhiều nghiên cứu đã cho thấy cơ chế NHEJ thường xảy ra những sai sót không mong muốn.