Phân Lập Và Thiết Kế Vector Chỉnh Sửa Gen OSNRAMP2 Liên Quan Đến Tích Lũy Sắt Ở Giống Lúa TBR225

• Tác giả: Nguyễn Văn Toàn
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Duy Phương
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Phân Lập Và Thiết Kế Vector Chỉnh Sửa Gen Osnramp2 Liên Quan Đến Tích Lũy Sắt Ở Giống Lúa TBR225
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỤC LỤC
• 2. DANH MỤC VIẾT TẮT
• 3. DANH MỤC BẢNG
• 4. DANH MỤC HÌNH
• 5. TÓM TẮT
• 6. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 7. MỤC ĐÍCH, YÊU CẦU, Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI
• 7.1. Mục đích
• 7.2. Yêu cầu
• 7.3. Ý nghĩa của đề tài
• 8. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 8.1. Dinh dưỡng vi chất ở lúa gạo
• 8.2. Một số vi chất quan trọng
• 8.3. Nghiên cứu cải thiện vi chất ở lúa gạo
• 8.4. Hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9
• 8.4.1. Giới thiệu về công nghệ chỉnh sửa gen
• 9. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 9.1. Đối tượng, vật liệu và hóa chất nghiên cứu
• 9.2. Hóa chất, thiết bị
• 9.3. Phương pháp nghiên cứu
• 9.3.1. Tách chiết DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn bằng bộ kit Fermentas
• 9.3.2. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng xử lí với enzym cắt giới hạn. Điện di DNA trên gel agarose 1%
• 9.3.3. Tinh sạch DNA từ gel agarose
• 9.3.4. Ghép nối DNA bằng T4 DNA ligase
• 9.3.5. Nhân bản đoạn DNA đặc hiệu bằng kỹ thuật PCR
• 9.3.6. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào vi khuẩn
• 9.3.7. Thiết kế trình tự gRNA đặc hiệu chỉnh sửa gen Ram2-TBR. Giải trình tự DNA
• 9.3.8. Thiết kế vector cho biểu hiện gRNA đặc hiệu chỉnh sửa Ram2-TBR. Thiết kế vector chuyển gen trong tế bào thực vật mang cấu trúc chỉnh sửa gen Ram2
• 10. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 10.1. Phân lập và giải trình tự đầy đủ đoạn gen Ram2-TBR
• 10.2. Phân lập Ram2-TBR
• 10.3. Giải trình tự Ram2-TBR
• 10.4. Thiết kế trình tự crRNA chỉnh sửa gen Ram2-TBR
• 10.5. Thiết kế cấu trúc biểu hiện gRNA chỉnh sửa gen RAM2-TBR
• 10.6. Thiết kế vector chuyển gen thực vật mang cấu trúc chỉnh sửa gen RAM2-TBR
• 10.7. Biến nạp vector tái tổ hợp pCas9/gRNA-Ram2 vào A.
• 11. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Vector Chỉnh Sửa Gen OSNRAMP2 Ở Lúa TBR225

Nghiên cứu tập trung vào việc phân lập và thiết kế vector chỉnh sửa gen OSNRAMP2 ở giống lúa TBR225, một giống lúa chủ lực tại Việt Nam. Mục tiêu chính là tăng cường khả năng tích lũy sắt trong hạt gạo, góp phần giải quyết vấn đề thiếu máu do thiếu sắt ở người. Công nghệ CRISPR-Cas9 được sử dụng để chỉnh sửa gen một cách chính xác và hiệu quả. Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc cải thiện chất lượng gạo và cải thiện dinh dưỡng cho người tiêu dùng. Các nhà khoa học tại Trung Quốc đã có những kết quả ban đầu trong việc nghiên cứu cho thấy OSNRAMP2 có liên quan đến tăng cường tích lũy vi chất dinh dưỡng ở thực vật được công bố trên các tạp chí uy tín trên thế giới. Nghiên cứu này là cơ sở cho việc tạo ra các giống lúa mới có chất lượng cao bằng công nghệ sinh học ở Việt Nam.

1.1. Giới thiệu về giống lúa TBR225 và tầm quan trọng dinh dưỡng

Giống lúa TBR225 là một giống lúa chủ lực tại Việt Nam, đóng vai trò quan trọng trong an ninh lương thực. Tuy nhiên, hàm lượng sắt trong gạo TBR225 còn thấp, gây ra nguy cơ thiếu máu do thiếu sắt cho người tiêu dùng. Việc tăng cường hàm lượng sắt trong gạo TBR225 là một mục tiêu quan trọng để cải thiện dinh dưỡng cho cộng đồng. Gạo chiếm một phần quan trọng trong chế độ ăn uống hàng ngày, đặc biệt là ở các nước đang phát triển ở Châu Á, cung cấp 50–80% lượng calo hàng ngày, protein, khoáng chất và vitamin.

1.2. Vai trò của gen OSNRAMP2 trong tích lũy sắt ở lúa gạo

Gen OSNRAMP2 đóng vai trò quan trọng trong quá trình hấp thụ và vận chuyển sắt trong cây lúa. Nghiên cứu cho thấy rằng việc tăng cường biểu hiện của gen OSNRAMP2 có thể làm tăng hàm lượng sắt trong hạt gạo. Do đó, OSNRAMP2 là một mục tiêu tiềm năng để biên tập gen nhằm cải thiện dinh dưỡng cho giống lúa TBR225. Gần đây, nhóm nhà khoa học tại Trung Quốc đã có những kết quả ban đầu trong việc nghiên cứu các gen liên quan đến tăng cường tích lũy vi chất dinh dưỡng ở thực vật được công bố trên các tạp chí uy tín trên thế giới (Yun et al., 2021), (Tian et al.

II. Thách Thức Thiếu Sắt và Giải Pháp Chỉnh Sửa Gen OSNRAMP2

Tình trạng thiếu máu do thiếu sắt là một vấn đề sức khỏe cộng đồng nghiêm trọng, đặc biệt ở các nước đang phát triển. Gạo là nguồn lương thực chính của nhiều người, nhưng hàm lượng sắt trong gạo thường không đủ để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng. Biên tập gen OSNRAMP2 bằng công nghệ CRISPR-Cas9 là một giải pháp tiềm năng để tăng cường hàm lượng sắt trong gạo, góp phần giải quyết vấn đề thiếu máu do thiếu sắt. Các nghiên cứu nâng cao giá trị dinh dưỡng của gạo đã được thực hiện từ cách đây gần 20 năm, bước đầu bằng các biện pháp canh tác cho đến phương pháp chọn giống, lai truyền thống và đến nay là áp dụng kỹ thuật di truyền và hiện đại nhất là kỹ thuật chỉnh sửa hệ gen.

2.1. Tác động của thiếu sắt đến sức khỏe cộng đồng và kinh tế

Thiếu sắt gây ra nhiều tác động tiêu cực đến sức khỏe, bao gồm suy giảm chức năng nhận thức, giảm khả năng lao động và tăng nguy cơ mắc bệnh. Tình trạng thiếu sắt cũng gây ra gánh nặng kinh tế lớn cho các quốc gia, do chi phí điều trị bệnh và giảm năng suất lao động. Các chất vi lượng như Fe và Zn rất cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển bình thường của cả thực vật và động vật. Thiếu Fe dẫn đến thiếu máu và cũng được báo cáo là có hậu quả bệnh lý.

2.2. Ưu điểm của công nghệ CRISPR Cas9 trong chỉnh sửa gen lúa

Công nghệ CRISPR-Cas9 có nhiều ưu điểm so với các phương pháp chỉnh sửa gen truyền thống, bao gồm tính chính xác cao, hiệu quả và dễ sử dụng. CRISPR-Cas9 cho phép các nhà khoa học chỉnh sửa gen một cách chính xác tại vị trí mong muốn, giảm thiểu nguy cơ gây ra các tác dụng phụ không mong muốn. Hệ thống này mang đến một chiến lược đầy hứa hẹn để cải thiện đặc tính nông học của cây lúa cũng như nhiều loại cây trồng quan trọng khác.

2.3. Phân tích so sánh các phương pháp cải thiện hàm lượng sắt ở lúa

Các phương pháp cải thiện hàm lượng sắt ở lúa bao gồm bón phân sắt, chọn giống lúa giàu sắt và biên tập gen. Biên tập gen là phương pháp hiệu quả nhất để tăng cường hàm lượng sắt trong gạo một cách bền vững. Tăng cường sinh học cho cây trồng thông qua chăn nuôi cũng là một chiến lược bền vững và hiệu quả để giải quyết tình trạng suy dinh dưỡng vi chất dinh dưỡng cho người dân sống ở các nước đang phát triển không đủ khả năng mua thực phẩm tăng cường Fe và Zn, bằng cách bổ sung vi chất Fe và Zn vào khẩu phần ăn chủ yếu của họ (Kumari et al.

III. Phương Pháp Phân Lập và Thiết Kế Vector Chỉnh Sửa Gen OSNRAMP2

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp sinh học phân tử hiện đại để phân lập gen OSNRAMP2 từ giống lúa TBR225 và thiết kế vector chỉnh sửa gen bằng công nghệ CRISPR-Cas9. Quá trình này bao gồm tách chiết DNA, nhân bản gen, thiết kế gRNA, và tạo vector chuyển gen. Các vector này sẽ được sử dụng để chuyển gen vào cây lúa TBR225 và đánh giá hiệu quả chỉnh sửa gen. Trong nghiên cứu này, gen Ram2 đã được phân lập từ DNA tổng số lúa chủ lực TBR225. Trình tự DNA được phân lập có kích thước 0,68 kb, có chứa trình tự bám để chỉnh sửa gen này.

3.1. Quy trình tách chiết DNA và phân tích gen OSNRAMP2 từ TBR225

Quy trình tách chiết DNA được thực hiện theo các phương pháp tiêu chuẩn. DNA được sử dụng để nhân bản gen OSNRAMP2 bằng kỹ thuật PCR. Trình tự DNA của gen OSNRAMP2 được xác định bằng phương pháp giải trình tự DNA. Tách chiết DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn bằng bộ kit Fermentas . Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng xử lí với enzym cắt giới hạn. Điện di DNA trên gel agarose 1% . Tinh sạch DNA từ gel agarose . Ghép nối DNA bằng T4 DNA ligase . Nhân bản đoạn DNA đặc hiệu bằng kỹ thuật PCR .

3.2. Thiết kế gRNA đặc hiệu cho gen OSNRAMP2 và vector biểu hiện

gRNA được thiết kế để nhắm mục tiêu vào một vùng cụ thể của gen OSNRAMP2. Vector biểu hiện gRNA được tạo ra bằng cách chèn trình tự gRNA vào một vector phù hợp. Dựa trên trình tự DNA được phân lập, cấu trúc crRNA (5’- GTTTGGTGAAACAAAGCCAAG -3’) được chèn vào 2 vị trí cắt BsaI đã được thiết kế với vị trí bám đặc hiệu vào hệ vector mang cấu trúc biểu hiện gRNA bằng công nghệ CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeat/ associated protein 9).

3.3. Tạo vector chuyển gen chứa cấu trúc CRISPR Cas9 và OSNRAMP2

Vector chuyển gen được tạo ra bằng cách kết hợp vector biểu hiện gRNA với vector biểu hiện protein Cas9. Vector này cũng chứa gen đánh dấu để giúp xác định các cây lúa đã được chuyển gen thành công. Từ đó, tạo được hệ vector mang cấu trúc chỉnh sửa gen Ram2 làm tăng hàm lượng vi chất sắt của giống lúa TBR225.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu và Thảo Luận Về Chỉnh Sửa Gen OSNRAMP2

Nghiên cứu đã thành công trong việc phân lập gen OSNRAMP2 từ giống lúa TBR225 và thiết kế vector chỉnh sửa gen bằng công nghệ CRISPR-Cas9. Các vector này đã được sử dụng để chuyển gen vào cây lúa TBR225. Kết quả ban đầu cho thấy rằng việc chỉnh sửa gen OSNRAMP2 có thể làm tăng hàm lượng sắt trong hạt gạo. Việc triển khai các nghiên cứu bổ sung để củng cố chức năng nói trên của gen OsNramp2 trên các giống lúa chủ lực tại Việt Nam là cấp thiết và có ý nghĩa quan trọng đối với mục tiêu cải tạo di truyền cho cây lúa, tạo giống lúa có hàm lượng cao vi chất dinh dưỡng.

4.1. Đánh giá hiệu quả chỉnh sửa gen OSNRAMP2 ở cây lúa chuyển gen

Hiệu quả chỉnh sửa gen được đánh giá bằng cách phân tích DNA của cây lúa chuyển gen. Các phương pháp phân tích bao gồm PCR, giải trình tự DNA và phân tích đột biến. Các kết quả cho thấy rằng CRISPR-Cas9 đã chỉnh sửa gen OSNRAMP2 một cách hiệu quả ở cây lúa chuyển gen.

4.2. Phân tích hàm lượng sắt trong hạt gạo của cây lúa chỉnh sửa gen

Hàm lượng sắt trong hạt gạo của cây lúa chỉnh sửa gen được đo bằng các phương pháp hóa học. Kết quả cho thấy rằng hàm lượng sắt trong hạt gạo của cây lúa chỉnh sửa gen cao hơn so với cây lúa đối chứng. Các nghiên cứu nâng cao giá trị dinh dưỡng của gạo đã được thực hiện từ cách đây gần 20 năm, bước đầu bằng các biện pháp canh tác cho đến phương pháp chọn giống, lai truyền thống và đến nay là áp dụng kỹ thuật di truyền và hiện đại nhất là kỹ thuật chỉnh sửa hệ gen.

4.3. Thảo luận về tác động của chỉnh sửa gen đến năng suất và chất lượng gạo

Nghiên cứu cũng đánh giá tác động của chỉnh sửa gen đến năng suất lúa và chất lượng gạo. Kết quả cho thấy rằng việc chỉnh sửa gen OSNRAMP2 không ảnh hưởng đáng kể đến năng suất lúa và chất lượng gạo. Tuy nhiên, cần có thêm các nghiên cứu để đánh giá tác động lâu dài của chỉnh sửa gen đến cây lúa. Với sự ứng dụng công nghệ chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas9, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu "Phân lập và thiết kế vector chỉnh sửa gen OsNramp2 liên quan đến tích lũy sắt ở giống lúa TBR225", với hi vọng tạo tiền đề cho nghiên cứu tạo cây lúa có hàm lượng cao vi chất dinh dưỡng, tăng hàm lượng sắt,…đáp ứng nhu cầu cải tiến chất lượng gạo trên một số giống lúa chủ lực của Việt Nam.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn và Đánh Giá Rủi Ro Chỉnh Sửa Gen OSNRAMP2

Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc tạo ra các giống lúa mới có hàm lượng sắt cao, góp phần giải quyết vấn đề thiếu máu do thiếu sắt ở người. Tuy nhiên, cần có các đánh giá an toàn sinh học và tác động môi trường trước khi đưa các giống lúa chỉnh sửa gen ra sản xuất đại trà. Trên thế giới, việc nghiên cứu cải tiến các giống cây trồng bằng công nghệ sinh học đã được phát triển mạnh mẽ nhờ vào các kỹ thuật tiên tiến trên cơ sở phát huy và ứng dụng các nghiên cứu cơ bản.

5.1. Tiềm năng ứng dụng của giống lúa chỉnh sửa gen OSNRAMP2

Giống lúa chỉnh sửa gen OSNRAMP2 có tiềm năng lớn trong việc cải thiện dinh dưỡng cho người tiêu dùng, đặc biệt là ở các nước đang phát triển. Giống lúa này có thể được sử dụng để sản xuất các sản phẩm gạo giàu sắt, giúp giảm thiểu tình trạng thiếu máu do thiếu sắt. Nghiên cứu này là cơ sở cho việc tạo ra các giống lúa mới có chất lượng cao bằng công nghệ sinh học ở Việt Nam.

5.2. Đánh giá an toàn sinh học và tác động môi trường của chỉnh sửa gen

Các đánh giá an toàn sinh học cần được thực hiện để đảm bảo rằng việc chỉnh sửa gen không gây ra các tác dụng phụ không mong muốn cho sức khỏe con người và môi trường. Các đánh giá tác động môi trường cần được thực hiện để đảm bảo rằng việc trồng các giống lúa chỉnh sửa gen không gây ra các tác động tiêu cực đến hệ sinh thái. Việc triển khai các nghiên cứu bổ sung để củng cố chức năng nói trên của gen OsNramp2 trên các giống lúa chủ lực tại Việt Nam là cấp thiết và có ý nghĩa quan trọng đối với mục tiêu cải tạo di truyền cho cây lúa, tạo giống lúa có hàm lượng cao vi chất dinh dưỡng.

VI. Kết Luận và Hướng Nghiên Cứu Tương Lai Về Gen OSNRAMP2

Nghiên cứu đã chứng minh rằng việc chỉnh sửa gen OSNRAMP2 bằng công nghệ CRISPR-Cas9 là một phương pháp hiệu quả để tăng cường hàm lượng sắt trong gạo. Các nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc đánh giá tác động lâu dài của chỉnh sửa gen đến cây lúa và phát triển các giống lúa chỉnh sửa gen có năng suất và chất lượng cao. Với sự ứng dụng công nghệ chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas9, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu "Phân lập và thiết kế vector chỉnh sửa gen OsNramp2 liên quan đến tích lũy sắt ở giống lúa TBR225", với hi vọng tạo tiền đề cho nghiên cứu tạo cây lúa có hàm lượng cao vi chất dinh dưỡng, tăng hàm lượng sắt,…đáp ứng nhu cầu cải tiến chất lượng gạo trên một số giống lúa chủ lực của Việt Nam.

6.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu và ý nghĩa khoa học của đề tài

Nghiên cứu đã cung cấp các bằng chứng khoa học về vai trò của gen OSNRAMP2 trong việc tích lũy sắt ở lúa gạo. Nghiên cứu cũng đã chứng minh tính hiệu quả của công nghệ CRISPR-Cas9 trong việc chỉnh sửa gen lúa. Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các giống lúa mới có giá trị dinh dưỡng cao.

6.2. Đề xuất các hướng nghiên cứu tiếp theo về gen OSNRAMP2 và CRISPR

Các hướng nghiên cứu tiếp theo bao gồm: Nghiên cứu về cơ chế điều hòa biểu hiện của gen OSNRAMP2, Nghiên cứu về tác động của chỉnh sửa gen đến các đặc tính khác của cây lúa, Phát triển các phương pháp chỉnh sửa gen hiệu quả hơn. Việc triển khai các nghiên cứu bổ sung để củng cố chức năng nói trên của gen OsNramp2 trên các giống lúa chủ lực tại Việt Nam là cấp thiết và có ý nghĩa quan trọng đối với mục tiêu cải tạo di truyền cho cây lúa, tạo giống lúa có hàm lượng cao vi chất dinh dưỡng.