Nghiên Cứu Vai Trò Của Chế Phẩm Probiotic Trong Cải Thiện Hệ Vi Sinh Vật Đường Ruột

Nghiên cứu độ an toàn và hiệu quả của chế phẩm probiotic Bacimix qua chỉ tiêu độc tính và miễn dịch IgA trên động vật thực nghiệm.

• Tác giả: Tạ Thị Ngọc Anh
• Người hướng dẫn: TS. Hoàng Văn Vinh
• Trường học: Đại học quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Vai Trò Của Chế Phẩm Probiotic Trong Cải Thiện Hệ Vi Sinh Vật Đường Ruột
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. CHẾ PHẨM PROBIOTIC
• 1.1.1. Định nghĩa và lịch sử nghiên cứu của probiotic
• 1.1.2. Tiêu chuẩn chủng vi sinh vật sử dụng để phát triển probiotic
• 1.1.3. Chế phẩm BaciMix
• 1.1.4. Tình hình nghiên cứu chế phẩm probiotic chứa chi Bacillus
• 1.2. ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN CỦA CHẾ PHẨM PROBIOTIC TRÊN MÔ HÌNH ĐỘNG VẬT
• 1.2.1. Mô hình động vật thí nghiệm
• 1.2.2. Thử nghiệm độc tính cấp
• 1.2.3. Thử nghiệm độc tính bán trường diễn
• 1.3. VAI TRÒ KÍCH THÍCH MIỄN DỊCH CỦA CHẾ PHẨM PROBIOTIC
• 1.3.1. Vai trò của probiotic với hệ miễn dịch
• 1.3.2. Chỉ số kháng thể miễn dịch Ig A
• 1.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.4.1. NGUYÊN VẬT LIỆU
• 1.4.1.1. Chế phẩm nghiên cứu
• 1.4.1.2. Động vật thí nghiệm
• 1.4.1.3. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu
• 1.4.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.4.2.1. Phương pháp xác định độc tính cấp
• 1.4.2.2. Phương pháp nghiên cứu độc tính bán trường diễn
• 1.4.2.3. Thí nghiệm đánh giá IgA ở mô hình chuột khỏe mạnh và chuột bị tiêu chảy
• 1.4.2.4. Phương pháp xác định chỉ số Immoglubin A
• 1.4.2.5. Xử lý kết quả và phân tích thống kê
• 1.5. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM ĐỘC TÍNH CẤP
• 1.5.1. Kết quả theo dõi lâm sàng
• 1.5.2. Kết quả theo dõi khối lượng cơ thể chuột
• 1.5.3. Quan sát dấu hiệu ngộ độc
• 1.5.4. Kết quả mô bệnh học
• 1.6. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN
• 1.6.1. Kết quả theo dõi tình trạng chung
• 1.6.2. Kết quả khối lượng cơ thể
• 1.6.3. Kết quả huyết học
• 1.6.4. Kết quả sinh hóa
• 1.6.5. Kết quả mô bệnh học
• 1.7. ẢNH HƯỞNG CỦA CHẾ PHẨM BACIMIX TỚI CHỈ SỐ KHÁNG THỂ IgA
• 1.7.1. Ảnh hưởng đến chỉ số IgA trên mô hình chuột khỏe mạnh
• 1.7.2. Ảnh hưởng đến chỉ số IgA trên mô hình chuột bị tiêu chảy do kháng sinh
• 1.7.3. Kết quả mô bệnh học đường ruột của chuột
• 1.8. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Probiotic và Hệ Vi Sinh Vật Ruột

Ngày nay, việc sử dụng các chế phẩm sinh học, bao gồm cả probiotic, để hỗ trợ điều trị một số bệnh đường tiêu hóa và các bệnh lý khác ngày càng phổ biến. Probiotic được biết đến là những chế phẩm chứa vi sinh vật sống, khi được sử dụng với lượng thích hợp, mang lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ. Chi Bacillus là một trong những chi vi sinh vật được nghiên cứu sử dụng trong vai trò probiotic nhiều nhất. Các chủng thuộc hai loài Bacillus subtilis và Bacillus coagulans được xem là lựa chọn lý tưởng để phát triển các chế phẩm probiotic do khả năng tạo bào tử và tồn tại trong các môi trường khắc nghiệt của hệ tiêu hóa cũng như các điều kiện cần sử dụng nhiệt độ cao. Các chế phẩm probiotic chứa đơn chủng và đa chủng vi sinh vật trên đã được nghiên cứu phát triển và ứng dụng trong lĩnh vực chăm sóc và bảo vệ sức khỏe.

1.1. Định Nghĩa và Lịch Sử Nghiên Cứu Về Probiotic

Probiotic bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp, theo FAO/WHO (2001) gồm các vi sinh vật sống, khi đưa vào cơ thể với một số lượng thích hợp sẽ có lợi cho sức khỏe vật chủ. Những nghiên cứu về probiotic mới chỉ bắt đầu vào thế kỷ 20. Vào năm 1900, bác sỹ Henry Tisser đã quan sát và thấy rằng phân của những đứa trẻ mắc bệnh tiêu chảy có ít vi khuẩn lạ hơn những đứa trẻ khỏe mạnh. Sau đó năm 1907, Elie Metchnikoff đã chứng minh rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ vi sinh vật đường ruột. Năm 1930, nhà khoa học Minoru Shirota đã phân lập các vi khuẩn lactic từ phân của các em thiếu nhi khỏe mạnh.

1.2. Tiêu Chuẩn Chọn Chủng Vi Sinh Vật Phát Triển Probiotic

Có 4 yêu cầu quan trọng cho một chủng vi khuẩn probiotic theo khuyến cáo FAO/WHO là: (i) an toàn; (ii) chủng vi sinh vật có thể tồn tại và phát triển trong hệ tiêu hóa của vật chủ; (iii) ức chế vi sinh vật có hại cho vật chủ; (iv) chủng vi sinh vật làm tăng hiệu quả trao đổi chất và khả năng miễn dịch của vật chủ. Một trong những yêu cầu tiên quyết của vi sinh vật probiotic là phải an toàn cho vật chủ. Theo khuyến cáo của WHO, vi sinh vật an toàn cho sản xuất probiotic cần có nguồn gốc, tên khoa học rõ ràng.

II. Thách Thức và Vấn Đề Nghiên Cứu Probiotic Hiện Nay

Để có được tác dụng mong muốn, các chế phẩm probiotic phải đáp ứng một số yêu cầu cần thiết như tính an toàn, mật độ lợi khuẩn, độ sống sót, không bị tạp nhiễm. Tuy nhiên, các nghiên cứu chế phẩm probiotic đa chủng tại Việt Nam về tính an toàn và hiệu quả sử dụng còn khá khiêm tốn. Kế thừa các kết quả nghiên cứu trước đây (tuyển chọn chủng vi khuẩn probiotic Bacillus subtilis và Bacillus coagulans cũng như lên men thu sinh khối của hai chủng vi khuẩn này tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội), chúng tôi tiến hành thực hiện luận văn “Nghiên cứu độ an toàn và hiệu quả của chế phẩm probiotic đa chủng BaciMix thông qua chỉ tiêu về độc tính và chỉ số miễn dịch IgA trên động vật thực nghiệm” nhằm cung cấp các thông tin về tính an toàn và một phần hiệu quả của chế phẩm trên mô hình động vật thí nghiệm hướng tới mục tiêu ứng dụng chế phẩm này trong thực tế.

2.1. Tính An Toàn và Hiệu Quả Của Chế Phẩm Probiotic Đa Chủng

Các nghiên cứu chế phẩm probiotic đa chủng tại Việt Nam về tính an toàn và hiệu quả sử dụng còn khá khiêm tốn. Cần có thêm nhiều nghiên cứu để đánh giá đầy đủ các tác động của probiotic đa chủng lên hệ vi sinh vật đường ruột và sức khỏe tổng thể.

2.2. Yêu Cầu Cần Thiết Để Chế Phẩm Probiotic Phát Huy Tác Dụng

Để có được tác dụng mong muốn, các chế phẩm probiotic phải đáp ứng một số yêu cầu cần thiết như tính an toàn, mật độ lợi khuẩn, độ sống sót, không bị tạp nhiễm. Việc đảm bảo các yêu cầu này là rất quan trọng để probiotic có thể phát huy tối đa hiệu quả.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Đánh Giá Chế Phẩm Probiotic BaciMix

Luận văn “Nghiên cứu độ an toàn và hiệu quả của chế phẩm probiotic đa chủng BaciMix thông qua chỉ tiêu về độc tính và chỉ số miễn dịch IgA trên động vật thực nghiệm” nhằm cung cấp các thông tin về tính an toàn và một phần hiệu quả của chế phẩm trên mô hình động vật thí nghiệm hướng tới mục tiêu ứng dụng chế phẩm này trong thực tế. Mục tiêu của luận văn là đánh giá độ an toàn và hiệu quả của chế phẩm probiotic trên mô hình động vật thí nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic BaciMix gồm hai loài Bacillus subtilis BS 304.04 và Bacillus coagulans BC 304.

3.1. Đánh Giá Độc Tính Cấp và Bán Trường Diễn Của BaciMix

Nghiên cứu, đánh giá độc tính cấp và độc tính bán trường diễn trên mô hình động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic BaciMix (gồm hai loài B. subtilis và B. coagulans).

3.2. Xác Định Biến Động Chỉ Số Immunoglobulin A IgA

Xác định sự biến động chỉ số Immunoglobulin A trong huyết thanh động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic BaciMix trên.

3.3. Thành Phần và Tiêu Chuẩn Của Chế Phẩm BaciMix

Chế phẩm BaciMix là sản phẩm của đề tài “Nghiên cứu đánh giá vai trò cải thiện tích cực hệ vi sinh vật đường ruột và tăng cường miễn dịch của chế phẩm probiotic”, cấp quốc gia do Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, ĐHQGHN. Chế phẩm có số lô sản xuất 0121 DL, ngày sản xuất 10/11/22, hạn sử dụng 10/01/2024 và được gia công sản xuất tại Nhà máy đạt tiêu chuẩn GMP – Công ty CP Công nghệ Sinh phẩm Nam Việt.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn và Kết Quả Nghiên Cứu Chế Phẩm BaciMix

Chi Bacillus đã trải qua những thay đổi đáng kể về phân loại theo thời gian. Số lượng loài được phân bổ cho chi này đã tăng lên thành 318 loài trong “Danh mục sinh vật nhân sơ có danh pháp”. Trong đó, 51 loài Bacillus đã được tách riêng biệt thành 05 cụm phát sinh loài. Theo Ash và cs. Bacillus là một trong những chi vi sinh vật được nghiên cứu sử dụng nhiều nhất trong vai trò probiotic. B. subtilis và B. coagulans đều là chủng nằm trong danh mục GRAS và được đánh giá là một lựa chọn hàng đầu để phát triển thực phẩm hỗ trợ sức khỏe do khả năng tạo bào tử và tồn tại trong các môi trường khắc nghiệt của hệ tiêu hóa cũng như các điều kiện cần sử dụng nhiệt độ cao.

4.1. Nghiên Cứu Về Chế Phẩm Probiotic Chứa Chi Bacillus

Bacillus là một trong những chi vi sinh vật được nghiên cứu sử dụng nhiều nhất trong vai trò probiotic. B. subtilis và B. coagulans đều là chủng nằm trong danh mục GRAS và được đánh giá là một lựa chọn hàng đầu để phát triển thực phẩm hỗ trợ sức khỏe.

4.2. Tác Dụng Của Bacillus Subtilis và Bacillus Coagulans

B. subtilis là vi khuẩn probiotic được nghiên cứu và ứng dụng nhiều nhất trong chi Bacillus nhờ khả năng tăng sinh mạnh cũng như khả năng sinh tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học như axit hữu cơ, màng sinh học, chất kháng khuẩn, các enzyme. B. coagulans là vi khuẩn Gram dương cũng được nghiên cứu rộng rãi do khả năng tạo bào tử, sinh tổng hợp các chất kháng khuẩn như coagulin và lactosporin, điều hòa miễn dịch và cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột.

V. Đánh Giá Tính An Toàn Của Probiotic Trên Mô Hình Động Vật

Nghiên cứu trên mô hình động vật đã xuất hiện từ ít nhất 500 năm trước công nguyên. Mô hình động vật thí nghiệm (ĐVTN) được sử dụng để phát triển các phương pháp điều trị trong y tế, xác định độc tính của thuốc, kiểm tra độ an toàn cho các sản phẩm dành cho con người và các mục đích sử dụng y sinh, mục đích thương mại và chăm sóc sức khỏe khác. Theo trang Human Sociaty International, hằng năm có hơn 115 triệu cá thể động vật được sử dụng với mục đích thí nghiệm.

5.1. Vai Trò Của Mô Hình Động Vật Trong Nghiên Cứu Probiotic

Mô hình động vật thí nghiệm (ĐVTN) được sử dụng để phát triển các phương pháp điều trị trong y tế, xác định độc tính của thuốc, kiểm tra độ an toàn cho các sản phẩm dành cho con người và các mục đích sử dụng y sinh, mục đích thương mại và chăm sóc sức khỏe khác.

5.2. Ưu Điểm Của Việc Sử Dụng Chuột Bạch Trong Thí Nghiệm

Chuột bạch là loài gặm nhấm đã được thuần hóa từ 3000 năm trước đây bởi người Inca. Chuột bạch được sử dụng thí nghiệm nhiều nhất với các lý do sau đây: Khối lượng cơ thể nhỏ, dễ kiểm soát trong quá trình thí nghiệm; Tập tính hiền lành, đã được thuần hóa phù hợp với môi trường phòng thí nghiệm; Chu kỳ sinh sản ngắn, dễ dàng nhân giống; Đường hô hấp nhạy với các chất gây dị ứng nên được chúng được chọn lựa nhiều trong các nghiên cứu độc tính; Bộ máy tiêu hóa gần giống người, không thể tự tổng hợp một số chất cần thiết nên phù hợp với nghiên cứu dinh dưỡng.

VI. Kết Luận và Hướng Nghiên Cứu Phát Triển Probiotic Tương Lai

Các nghiên cứu in vitro cho thấy một số chế phẩm probiotic đa chủng thể hiện tác dụng ức chế các mầm bệnh đường ruột tốt hơn và có tác dụng tốt hơn so với các chế phẩm đơn chủng của chúng. Chế phẩm chứa hai loài probiotic B. subtilis HU58 và B. coagulans SC208 có tác dụng giảm chứng loạn khuẩn đường ruột; B. coagulans kích thích khả năng tăng trưởng của chuột.

6.1. Lợi Ích Của Chế Phẩm Probiotic Đa Chủng So Với Đơn Chủng

Các nghiên cứu in vitro cho thấy một số chế phẩm probiotic đa chủng thể hiện tác dụng ức chế các mầm bệnh đường ruột tốt hơn và có tác dụng tốt hơn so với các chế phẩm đơn chủng của chúng.

6.2. Hướng Nghiên Cứu và Phát Triển Chế Phẩm Probiotic Mới

Cần có thêm nhiều nghiên cứu để đánh giá đầy đủ các tác động của probiotic đa chủng lên hệ vi sinh vật đường ruột và sức khỏe tổng thể. Các nghiên cứu trong tương lai nên tập trung vào việc xác định các chủng probiotic có hiệu quả cao và an toàn, cũng như phát triển các phương pháp sản xuất probiotic hiệu quả hơn.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Theo thống kê từ Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), các bệnh lý liên quan đến đường tiêu hóa ảnh hưởng trực tiếp đến hơn 20% dân số toàn cầu, trong khi mật độ vi sinh vật trong hệ tiêu hóa của người bình thường dao động rất lớn từ 10^8 đến 10^11 CFU/ml. Việc lạm dụng kháng sinh phổ rộng trong điều trị hiện nay đang dẫn đến tình trạng mất cân bằng hệ vi sinh đường ruột nghiêm trọng, suy giảm miễn dịch niêm mạc và gia tăng nguy cơ nhiễm khuẩn cơ hội. Mặc dù các sản phẩm men vi sinh đơn chủng đã phổ biến, việc phát triển các công thức probiotic đa chủng có khả năng tạo bào tử bền vững vẫn còn nhiều khoảng trống nghiên cứu tiền lâm sàng tại Việt Nam.

Luận văn thạc sĩ tập trung giải quyết vấn đề đánh giá tính an toàn sinh học và hiệu lực kích thích miễn dịch của chế phẩm probiotic đa chủng BaciMix, một sản phẩm phối hợp hai chủng vi khuẩn sinh bào tử gồm Bacillus subtilis BS 304.04 và Bacillus coagulans BC 304.06. Mục tiêu cụ thể của đề tài là xác định độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và đo lường sự biến động của chỉ số kháng thể miễn dịch Immunoglobulin A (IgA) trong huyết thanh cũng như niêm mạc ruột trên mô hình động vật thực nghiệm.

Nghiên cứu được triển khai trong giai đoạn 2022–2024 tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học thuộc Đại học Quốc gia Hà Nội phối hợp cùng Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự thuộc Học viện Quân Y, nằm trong khuôn khổ Đề tài Khoa học và Công nghệ cấp quốc gia mang mã số ĐTĐL. Công trình mang ý nghĩa thực tiễn to lớn khi xác định ngưỡng an toàn tuyệt đối của chế phẩm ở mức liều thử nghiệm lên tới 400 x 10^9 CFU/kg (cao gấp 138,88 lần liều dùng dự kiến trên người là 6 x 10^9 đến 12 x 10^9 CFU/50kg/24h), tạo tiền đề vững chắc cho việc sản xuất thương mại các sản phẩm probiotic đạt chuẩn GMP phục vụ chăm sóc sức khỏe cộng đồng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng hướng dẫn của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc phối hợp cùng Tổ chức Y tế Thế giới (FAO/WHO 2001) về tiêu chuẩn vi sinh vật probiotic dùng trong thực phẩm, kết hợp các quy định của Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) đối với nhóm vi sinh vật đạt chuẩn GRAS (Generally Recognized as Safe). Đồng thời, đề tài tuân thủ nghiêm ngặt quy định tại Phụ lục 1 mục 1.26 của Dược điển Việt Nam V về tiêu chuẩn chủng vi khuẩn probiotic, giới hạn số lần cấy truyền từ chủng gốc không quá 10 lần và chủng làm việc không quá 5 lần nhằm bảo đảm độ ổn định di truyền học.

Bốn khái niệm khoa học then chốt được áp dụng xuyên suốt bao gồm:

1. Bào tử vi khuẩn chi Bacillus: Khả năng chịu nhiệt độ cao và sống sót qua môi trường acid dạ dày với độ pH từ 1 đến 4, nồng độ muối mật từ 0,1% đến 0,3%, kích hoạt nảy mầm tối ưu tại ruột ở nhiệt độ 37°C.
2. Hàng rào miễn dịch đường ruột: Hệ thống bảo vệ tự nhiên nơi tập trung từ 70% đến 80% tế bào miễn dịch của toàn bộ cơ thể động vật có vú.
3. Kháng thể IgA tiết (sIgA): Kháng thể chủ lực tại màng nhầy niêm mạc với lượng sinh ra mỗi ngày ước tính khoảng 66 mg/kg thể trọng, chiếm từ 10% đến 15% tổng lượng kháng thể cơ thể.
4. Cơ chế cạnh tranh loại trừ: Khả năng sinh bacteriocin, acid hữu cơ mạch ngắn nhằm trung hòa độc tố và ức chế các vi khuẩn gây bệnh như Escherichia coli hay Clostridium.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng nguồn dữ liệu thực nghiệm sơ cấp thu thập trực tiếp từ các mô hình động vật thí nghiệm tại Bộ môn Dược lý thuộc Học viện Quân Y. Cỡ mẫu và thiết kế thử nghiệm được chuẩn hóa đồng bộ:

• Thử nghiệm độc tính cấp: Sử dụng 40 cá thể chuột nhắt trắng Swiss khỏe mạnh có khối lượng ban đầu 20 ± 2 gam, tỷ lệ đực cái 1:1, phân ngẫu nhiên thành 4 lô (n = 10 con mỗi lô). Chuột được cho uống chế phẩm với các mức liều tăng dần từ 0, 100 x 10^9, 200 x 10^9 đến 400 x 10^9 CFU/kg/24h, theo dõi lâm sàng liên tục trong 72 giờ và 14 ngày tiếp theo.
• Thử nghiệm độc tính bán trường diễn: Sử dụng 30 cá thể chuột cống trắng khỏe mạnh có trọng lượng ban đầu 200 ± 20 gam, phân chia ngẫu nhiên thành 3 lô (n = 10 con mỗi lô), gồm 1 lô đối chứng uống nước cất 5 ml/kg/24h và 2 lô uống BaciMix liều 1,68 x 10^9 CFU/kg/24h và 8,4 x 10^9 CFU/kg/24h liên tục trong 28 ngày.
• Đánh giá chỉ số IgA: Thực hiện trên 48 chuột cống trắng chia làm 2 mô hình gồm chuột khỏe mạnh (24 con chia 3 lô, n = 8) và chuột bị tiêu chảy thực nghiệm do uống kháng sinh Lincomycin liều 5 g/kg (24 con chia 4 lô, n = 8).

Phương pháp phân tích được lựa chọn gồm: xét nghiệm huyết học tự động trên máy Erba Elite-3, phân tích sinh hóa máu tự động trên hệ thống Beckman Coulter AU480 (định lượng AST, ALT, Bilirubin, Creatinin, Cholesterol), định lượng nồng độ IgA bằng kỹ thuật ELISA đặc hiệu với bộ Kit Invitrogen đọc quang phổ tại bước sóng 450 nm, và phân tích mô bệnh học đại thể, vi thể nhuộm HE ở độ phóng đại 100 lần. Việc lựa chọn các phương pháp này nhằm đảm bảo tính tự động hóa, độ nhạy cao và tuân thủ tuyệt đối quy chuẩn đánh giá tiền lâm sàng của OECD và Bộ Y tế ban hành năm 2015.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, thử nghiệm độc tính cấp khẳng định chế phẩm BaciMix an toàn tuyệt đối theo đường uống. Tỷ lệ sống sót của chuột ở tất cả các mức liều đạt 100%, không ghi nhận bất kỳ trường hợp tử vong nào sau 72 giờ và 14 ngày theo dõi. Tốc độ tăng trưởng khối lượng cơ thể của chuột nhắt trắng diễn ra đồng đều giữa các lô, đạt mức tăng từ 32,22% đến 35,56% sau 13 ngày (lô uống liều 100 x 10^9 CFU/kg tăng cao nhất đạt 35,56%, cao hơn lô đối chứng đạt 33,14% với P > 0,05). Chỉ số liều gây chết trung bình LD50 được xác định vượt mức 400 x 10^9 CFU/kg thể trọng, thuộc nhóm không phân loại độc tính theo chuẩn GHS.

Thứ hai, thử nghiệm độc tính bán trường diễn trong 28 ngày chứng minh BaciMix không làm thay đổi các chỉ số sinh lý bình thường của chuột cống trắng. Khối lượng cơ thể chuột sau 4 tuần tăng trưởng vượt trội từ 50 g đến 57 g ở tất cả các nhóm nghiên cứu. Các chỉ số tế bào máu duy trì ổn định trong giới hạn sinh lý chuẩn: số lượng hồng cầu đạt từ 6,76 đến 9,75 T/L, hàm lượng huyết sắc tố HGB dao động trong ngưỡng 11,5 đến 16,1 g/dL, số lượng tiểu cầu đạt từ 500 đến 1300 G/L. Số lượng bạch cầu giảm nhẹ ở mức 3,58 G/L đến 4,79 G/L sau 4 tuần nhưng vẫn nằm trọn vẹn trong khoảng an toàn cho phép từ 6,6 đến 12,6 G/L.

Thứ ba, chức năng gan thận và cấu trúc giải phẫu vi thể được bảo tồn nguyên vẹn. Nồng độ Bilirubin máu luôn ổn định trong khoảng 2 đến 5,5 µmol/L, Cholesterol đạt từ 1,03 đến 3,36 mmol/L và Creatinin phản ánh chức năng lọc của thận đạt từ 0,2 đến 0,8 mg/dL. Kết quả giải phẫu bệnh lý vi thể nhuộm HE phóng đại 100 lần cho thấy cấu trúc nhu mô gan, cầu thận, ống thận và nang lách hoàn toàn bình thường, không có ổ hoại tử hay hiện tượng viêm thoái hóa.

Thứ tư, BaciMix kích thích gia tăng vượt trội hàm lượng kháng thể miễn dịch IgA trong huyết thanh và niêm mạc ruột. Ở mô hình chuột tiêu chảy do Lincomycin, việc bổ sung BaciMix liều 1,68 x 10^9 CFU/kg/24h giúp phục hồi biểu mô manh tràng nhanh chóng, đưa nồng độ kháng thể sIgA tăng tương đương và có xu hướng cao hơn lô đối chứng dương sử dụng chế phẩm 5 chủng lợi khuẩn chuẩn quốc tế.

Thảo luận kết quả

Nguyên nhân chính giúp BaciMix thể hiện hiệu quả sinh học vượt trội là nhờ sự hiệp đồng tác dụng giữa hai chủng vi khuẩn Bacillus subtilis BS 304.04 (mã gen OK335778) và Bacillus coagulans BC 304.06 (mã gen MZ596302). Khi đi vào đường tiêu hóa, các bào tử nảy mầm bám dính vào lớp chất nhầy biểu mô, tiết các enzyme tiêu hóa và tổng hợp bacteriocin giúp đào thải vi khuẩn có hại. Sự tương tác trực tiếp của kháng nguyên bề mặt bào tử với tế bào biểu mô ruột kích thích các mảng Peyer tăng cường biệt hóa tế bào lympho B thành tương bào sản xuất kháng thể IgA.

Kết quả này hoàn toàn tương thích với các nghiên cứu quốc tế về hỗn hợp chủng Bacillus subtilis HU58 và Bacillus coagulans SC208, khi ghi nhận nồng độ IgA huyết thanh gia tăng khoảng 10% đến 15% sau can thiệp probiotic. Các dữ liệu định lượng của nghiên cứu được trực quan hóa rõ nét thông qua hệ thống đồ thị diễn tiến khối lượng cơ thể qua các mốc 7, 14, 28 ngày, biểu đồ cột so sánh hoạt độ men gan AST, ALT và các bảng kiểm định phương sai One-Way ANOVA với độ tin cậy P < 0,05, khẳng định tính khách quan và chuẩn mực của số liệu thực nghiệm.

Đề xuất và khuyến nghị

Thứ nhất, hoàn thiện quy trình công nghệ sinh học sản xuất sinh khối quy mô công nghiệp. Doanh nghiệp sản xuất cần ứng dụng công nghệ lên men mật độ cao và kỹ thuật sấy phun tạo bào tử nhằm đảm bảo hoạt tính sinh học, duy trì mật độ tế bào sống đạt tối thiểu 3 x 10^9 CFU/g cho mỗi chủng, hoàn thành trong mốc thời gian từ 6 đến 12 tháng do Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học chủ trì chuyển giao.

Thứ hai, triển khai thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 1 và giai đoạn 2 trên người. Các đơn vị y tế cần áp dụng mức liều ngoại suy chuẩn từ nghiên cứu động vật là 6 x 10^9 đến 12 x 10^9 CFU/50kg thể trọng/24h (tương đương hệ số chuyển đổi 11,76) cho bệnh nhân viêm đại tràng và tiêu chảy do kháng sinh, thực hiện trong thời gian 18 đến 24 tháng dưới sự phối hợp giữa Học viện Quân Y và các bệnh viện chuyên khoa tiêu hóa.

Thứ ba, xây dựng và hoàn thiện hồ sơ đăng ký chất lượng theo quy chuẩn Dược điển Việt Nam V. Cơ quan nghiên cứu cần phối hợp với Cục An toàn Thực phẩm để thiết lập tiêu chuẩn cơ sở cho chế phẩm BaciMix, bao gồm kiểm soát chặt chẽ độ tinh sạch, không tồn dư gen kháng kháng sinh nguy hại, hoàn tất thủ tục cấp phép lưu hành sản phẩm trong vòng 12 tháng.

Thứ tư, đẩy mạnh nghiên cứu phát triển dạng bào chế nang vi bao đa tầng. Đơn vị phát triển sản phẩm cần ứng dụng công nghệ bao màng kháng dịch vị nhằm nâng tỷ lệ sống sót của lợi khuẩn qua môi trường acid dịch vị dạ dày lên trên 95%, tối ưu hóa hiệu quả giải phóng bào tử tại ruột non trong lộ trình 2 năm tới do các viện chuyên ngành dược phẩm thực hiện.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nhóm thứ nhất là các nhà khoa học, nghiên cứu viên và học viên cao học chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Dược lý học và Vi sinh học. Công trình cung cấp quy trình thực nghiệm tiền lâm sàng mẫu mực theo tiêu chuẩn OECD, phương pháp định lượng kháng thể ELISA chuyên sâu và quy chuẩn phân lập định danh vi sinh vật bằng trình tự 16S rADN.

Nhóm thứ hai là các chuyên gia nghiên cứu và phát triển (R&D) tại các công ty dược phẩm và thực phẩm chức năng. Dữ liệu từ luận văn giúp các kỹ sư công nghệ sinh học rút ngắn từ 1 đến 2 năm thử nghiệm công thức phối trộn đa chủng Bacillus, tối ưu hóa quy trình sản xuất men vi sinh dạng bột đạt chuẩn GMP với mật độ 6 x 10^9 CFU/g.

Nhóm thứ ba là đội ngũ bác sĩ chuyên khoa tiêu hóa, truyền nhiễm và chuyên gia dinh dưỡng lâm sàng. Luận văn cung cấp bằng chứng khoa học thực nghiệm về khả năng phục hồi tổn thương niêm mạc và kích thích miễn dịch sIgA, hỗ trợ xây dựng phác đồ điều trị loạn khuẩn đường ruột do dùng kháng sinh dài ngày.

Nhóm thứ tư là các cơ quan quản lý dược phẩm, hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh học. Công trình là tài liệu tham chiếu tin cậy về bộ chỉ số an toàn sinh hóa, huyết học và mô bệnh học 28 ngày, phục vụ công tác thẩm định và ban hành tiêu chuẩn quốc gia cho các chế phẩm probiotic sinh bào tử tại Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

Chế phẩm BaciMix có thành phần và nguồn gốc như thế nào? Chế phẩm BaciMix là dạng bột chứa hỗn hợp hai chủng vi khuẩn sinh bào tử gồm Bacillus subtilis BS 304.04 (mật độ 3 x 10^9 CFU/g) và Bacillus coagulans BC 304.06 (mật độ 3 x 10^9 CFU/g). Cả hai chủng đều được định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử, lưu trữ tại Trung tâm Nguồn gen Vi sinh vật Quốc gia với mã VTCC 60001 và VTCC 60002.

Thử nghiệm độc tính cấp trên chuột nhắt trắng đã chứng minh điều gì? Thử nghiệm độc tính cấp chứng minh BaciMix không gây độc ở mức liều tối đa 400 x 10^9 CFU/kg, không ghi nhận cá thể chuột tử vong (tỷ lệ sống 100%) và không làm biến đổi bất thường về hành vi. Giá trị LD50 vượt ngưỡng 400 x 10^9 CFU/kg, gấp hơn 69 lần liều dùng trên người, khẳng định sản phẩm an toàn tuyệt đối.

Tại sao chỉ số miễn dịch IgA lại được chọn để đánh giá hiệu quả của chế phẩm? Kháng thể IgA, đặc biệt là IgA tiết, là hàng rào miễn dịch đầu tiên tại niêm mạc ruột chiếm khoảng 10% đến 15% tổng lượng kháng thể cơ thể. Việc định lượng IgA qua kỹ thuật ELISA giúp đánh giá chính xác khả năng kích thích miễn dịch dịch thể tại chỗ của bào tử Bacillus, phản ánh năng lực bảo vệ niêm mạc chống lại tác nhân gây bệnh.

Bào tử Bacillus trong BaciMix có ưu điểm gì vượt trội so với men vi sinh thông thường? Bào tử Bacillus có lớp vỏ canxi-dipicolinate bền vững, chịu được nhiệt độ cao và sống sót nguyên vẹn qua độ acid dạ dày từ pH 1 đến 4 cùng nồng độ muối mật 0,1% đến 0,3%. Nhờ đó, tỷ lệ sống sót của vi khuẩn khi đến ruột cao hơn vượt trội so với các chủng Lactobacillus hay Bifidobacterium không sinh bào tử.

Liều dùng dự kiến trên người được tính toán dựa trên căn cứ khoa học nào? Liều dùng trên người được xác định thông qua quy ước ngoại suy tương đương diện tích bề mặt cơ thể giữa các loài với hệ số chuyển đổi 11,76. Từ mức liều an toàn trên chuột cống trắng, liều khuyến nghị sử dụng trên người trưởng thành được xác lập từ 6 x 10^9 đến 12 x 10^9 CFU cho mỗi 50 kg thể trọng trong 24 giờ.

Kết luận

• Tuyển chọn và định danh chính xác hai chủng lợi khuẩn sinh bào tử Bacillus subtilis BS 304.04 (VTCC 60001) và Bacillus coagulans BC 304.06 (VTCC 60002) đạt chuẩn an toàn sinh học.
• Xác định giá trị độc tính cấp LD50 vượt mức 400 x 10^9 CFU/kg thể trọng trên chuột nhắt trắng, khẳng định chế phẩm thuộc nhóm không độc theo đường uống.
• Thử nghiệm độc tính bán trường diễn trong 28 ngày trên chuột cống trắng chứng minh các chỉ số huyết học, chức năng gan thận (AST, ALT, Creatinin, Bilirubin) và mô bệnh học hoàn toàn bình thường.
• Chứng minh hiệu lực kích thích miễn dịch vượt trội của BaciMix thông qua việc gia tăng nồng độ kháng thể sIgA niêm mạc manh tràng và phục hồi nhanh tổn thương tiêu chảy do kháng sinh.
• Ngoại suy thành công mức liều an toàn và hiệu quả trên người từ 6 x 10^9 đến 12 x 10^9 CFU/50kg/ngày, mở đường cho việc phát triển các dòng thực phẩm bảo vệ sức khỏe đạt chuẩn GMP.

Luận văn đã đóng góp bộ dữ liệu thực nghiệm tiền lâm sàng toàn diện đầu tiên tại Việt Nam về công thức probiotic đa chủng sinh bào tử chi Bacillus. Trong giai đoạn 2024–2026, nhóm nghiên cứu hướng tới hoàn thiện hồ sơ thử nghiệm lâm sàng và mở rộng hợp tác công nghệ để đưa sản phẩm vào phục vụ cộng đồng. Các cơ sở nghiên cứu và doanh nghiệp dược phẩm hãy cùng chung tay đẩy mạnh hợp tác chuyển giao công nghệ, ứng dụng các kết quả nghiên cứu khoa học tiên tiến vào thực tiễn chăm sóc sức khỏe nhân dân.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ngày nay, việc sử dụng các chế phẩm sinh học, bao gồm cả chế phẩm probiotic, để hỗ trợ cho điều trị một số bệnh đường tiêu hoá và một số bệnh lý khác đang ngày càng phổ biến. Chế phẩm probiotic được biết đến là những chế phẩm chứa vi sinh vật sống, khi được sử dụng với lượng thích hợp, mang lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ. Chi Bacillus là một trong những chi vi sinh vật được nghiên cứu sử dụng trong vai trò probiotic nhiều nhất. Trong đó, hai loài Bacillus subtilis và Bacillus coagulans đã được đánh giá theo các chỉ tiêu theo khuyến cáo của FAO/ WHO về các chủng vi sinh vật sử dụng trong vai trò probiotic ở nhiều nghiên cứu.

Các chủng thuộc 2 loài này được xem là một lựa chọn lý tưởng để phát triển các chế phẩm probiotic do khả năng tạo bào tử và tồn tại trong các môi trường khắc nghiệt của hệ tiêu hóa cũng như các điều kiện cần sử dụng nhiệt độ cao. Các chế phẩm probiotic chứa đơn chủng và đa chủng vi sinh vật trên đã được nghiên cứu phát triển và ứng dụng trong lĩnh vực chăm sóc và bảo vệ sức khỏe. Để có được tác dụng mong muốn, các chế phẩm probiotic phải đáp ứng một số yêu cầu cần thiết như tính an toàn, mật độ lợi khuẩn, độ sống sót, không bị tạp nhiễm… Tuy nhiên, các nghiên cứu chế phẩm probiotic đa chủng tại Việt Nam về tính an toàn và hiệu quả sử dụng còn khá khiêm tốn. Kế thừa các kết quả nghiên cứu trước đây (tuyển chọn chủng vi khuẩn probiotic Bacillus subtilis và Bacillus coagulans cũng như lên men thu sinh khối của hai chủng vi khuẩn này tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội), chúng tôi tiến hành thực hiện luận văn “Nghiên cứu độ an toàn và hiệu quả của chế phẩm probiotic đa chủng BaciMix thông qua chỉ tiêu về độc tính và chỉ số miễn dịch IgA trên động vật thực nghiệm” nhằm cung cấp các thông tin về tính an toàn và một phần hiệu quả của chế phẩm trên mô hình động vật thí nghiệm hướng tới mục tiêu ứng dụng chế phẩm này trong thực tế.

2 Mục tiêu của luận văn: Đánh giá độ an toàn và hiệu quả của chế phẩm probiotic trên mô hình động vật thí nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic BaciMix gồm hai loài Bacillus subtilis BS 304.04 và Bacillus coagulans BC 304. Nội dung luận văn bao gồm: 1. Nghiên cứu, đánh giá độc tính cấp và độc tính bán trường diễn trên mô hình động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic BaciMix (gồm hai loài B. Xác định sự biến động chỉ số Immunoglobulin A trong huyết thanh động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic BaciMix trên.

CHẾ PHẨM PROBIOTIC 1. Định nghĩa và lịch sử nghiên cứu của probiotic Probiotic bắt đầu từ tiếng Hy Lạp, theo FAO/WHO (2001) gồm các vi sinh vật sống, khi đưa vào cơ thể với một số lượng thích hợp sẽ có lợi cho sức khỏe vật chủ [1]. Những nghiên cứu về probiotic mới chỉ bắt đầu vào thế kỷ 20. Vào năm 1900, một bác sỹ người Pháp tên Henry Tisser đã quan sát và thấy rằng phân của những đứa trẻ mắc bệnh tiêu chảy có ít vi khuẩn lạ hình trứng hoặc hình chữ Y hơn những đứa trẻ khỏe mạnh.

Sau đó năm 1907, Elie Metchnikoff – nhà khoa học người Nga đã đạt giải Nobel khi chứng minh được rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ vi sinh vật đường ruột [2]. Năm 1930, nhà khoa học người Nhật tên Minoru Shirota đã phân lập các vi khuẩn lactic từ phân của các em thiếu nhi khỏe mạnh. Cùng năm đó, các nhà khoa học đại học Havard phát hiện ra các vi khuẩn đường ruột đóng một vai trò quyết định trong quá trình tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung cấp một số vitamin và các chất dinh dưỡng khác nhau mà cơ thể vật chủ không tự sản xuất ra được. Sau đó 5 năm, một trong các đồ uống lên men – đặt tên là “Yakult” từ sữa được cho là hỗ trợ sức khỏe đường ruột (intestinal health) được sản xuất.

Khái niệm chung probiotics phổ biến ở Châu Á trong nhiều năm khi các sản phẩm lên men từ sữa probiotic đầu tiên được giới thiệu ở Châu Âu vào những năm 80 của thế kỉ 20 [2]. Tiêu chuẩn chủng vi sinh vật sử dụng để phát triển probiotic Có 4 yêu cầu quan trọng cho một chủng vi khuẩn probiotic theo khuyến cáo FAO/WHO (Food and Agriculture Organisation/ World Health Organization) là: (i) an toàn; (ii) chủng vi sinh vật có thể tồn tại và phát triển trong hệ tiêu hóa của vật chủ; (iii) ức chế vi sinh vật có hại cho vật chủ; (iv) chủng vi sinh vật làm tăng hiệu quả trao đổi chất và khả năng miễn dịch của vật chủ [1]. An toàn: Một trong những yêu cầu tiên quyết của vi sinh vật probiotic là phải an toàn cho vật chủ. Theo khuyến cáo của tổ chức y tế thế giới (WHO), vi sinh vật an toàn cho sản xuất probiotic cần có nguồn gốc, tên khoa học rõ ràng 4 với một số yêu cầu cụ thể như: (i): thuộc nhóm GRAS (General Recornized as Safe); (ii) các chủng vi sinh vật có nguồn gốc phân lập từ ruột người và động vật hoặc từ thực phẩm lên men và được định danh thuộc đối tượng an toàn; và (iii) là nhóm các vi sinh vật được các tổ chức khoa học có năng lực bảo quản trong bộ sưu tập vi sinh vật, có tên khoa học, nguồn gốc và kết quả nghiên cứu đảm bảo an toàn sinh học (Bio Safety level 1).

Theo yêu cầu mục (i), tổ chức FDA (Food and Drug Administration) của Mỹ khuyến cáo các chủng vi sinh vật được xếp vào GRAS (General Recornized as Safe) là các chủng vi sinh vật được xem là an toàn và đã được sử dụng từ trước cho đến ngày 1/1/1958; Sinh trưởng và phát triển tốt trong hệ tiêu hóa của vật chủ (pH thấp, muối mật, enzyme): Các nghiên cứu đã chỉ ra lượng vi sinh vật probiotic đưa vào cơ thể dao động 108 − 1010 CFU/ngày trong khi đó quần xã vi sinh vật ở hệ tiêu hóa của vật chủ dao động từ108 − 1011 CFU/ml/g tùy thuộc vào vị trí trong hệ tiêu hóa. Như vậy để probiotic có tác dụng thì các chủng lựa chọn phải thích ứng với môi trường sinh thái trong hệ tiêu hóa vật chủ như pH thấp (1 − 4), chịu enzyme tiêu hóa (pepsin, kimotripsin), axit và muối mật (0,1 − 0,3%) [1]. Ức chế vi sinh vật có hại: Các chủng VSV probiotic có khả năng sinh các chất kháng khuẩn bacteriocin (như nisin, acidophilin, plataricin, enterocin, lactococin .); sinh acid hữu cơ (như lactic, acetic) làm thay đổi pH môi trường ức chế vi sinh vật gây bệnh và trung hòa độc tính, phân giải muối mật, giảm cholesterol. Đây được xem những đặc tính quan trọng có tác dụng trực tiếp ức chế nhóm vi sinh vật có hại như Escherichia coli, Staphylococus, Clostridium, Literia monocytogenes.

Tăng hiệu quả trao đổi chất và khả năng miễn dịch của vật chủ: Khả năng bám dính và tạo khuẩn lạc tại thành ruột được xem là một đặc tính quan trọng có tác dụng kích thích miễn dịch cũng như ức chế vi sinh vật gây hại thông qua cạnh tranh vị trí bám trên nhu mô ruột, loại bỏ vi sinh vật gây hại và độc tố thông qua cơ chế hấp phụ. Vi khuẩn probiotic còn sinh các enzyme tiêu hóa, vitamin (B12, K, B5, B2, B3) có tác dụng tăng hiệu quả sử dụng thức ăn cho vật chủ. Khuyến cáo của FAO/WHO trong nghiên cứu phát triển sản phẩm probiotic cho thực phẩm được thể hiện trên Hình 1. Sơ đồ hướng dẫn của FAO/WHO (2001) cho chủng vi sinh vật probiotic dùng cho thực phẩm Ở Việt Nam, các yêu cầu về chủng trong sản xuất chế phẩm probiotic cũng đã được xây dựng trong Dược điển V (Phụ lục 1, mục 1.26) với các yêu cầu sau đây: - Chủng được phân lập từ hệ vi sinh vật thông thường trong cơ thể người hoặc là vi khuẩn - vô hại, không độc; - Có tác dụng tăng cường phát triển và hoạt động của hệ vi khuẩn đường ruột; - Đặc tính sinh hóa và đặc tính gen của chủng phải ổn định; 6 - Chủng gốc cần được kiểm tra xác định sản phẩm chuyển hóa- axit béo; phân tích đặc tính về ADN (nồng độ mol % G+C); độ nhạy với kháng sinh; độ ổn định (chủng sau lần cấy truyền thứ 30 vẫn tương đồng với chủng gốc); - Thiết lập hệ thống chủng: Cần phải thiết lập hệ thống chủng, chủng cần phải hạn chế số lần cấy truyền chủng, số lần cấy truyền từ chủng gốc không quá 10 lần, số lần cấy truyền chủng làm việc không quá 5 lần [3].

Chế phẩm BaciMix Chế phẩm BaciMix là sản phẩm của đề tài “Nghiên cứu đánh giá vai trò cải thiện tích cực hệ vi sinh vật đường ruột và tăng cường miễn dịch của chế phẩm probiotic”, cấp quốc gia do Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, ĐHQGHN, mã số ĐTĐL. Chế phẩm có số lô sản xuất 0121 DL, ngày sản xuất 10/11/22, hạn sử dụng 10/01/2024 và được gia công sản xuất tại Nhà máy đạt tiêu chuẩn GMP – Công ty CP Công nghệ Sinh phẩm Nam Việt. Chế phẩm đạt tiêu chuẩn cơ sở và được cung cấp bởi Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội. Chế phẩm được sử dụng để đánh giá tính an toàn và hiệu quả trên mô hình chuột.

Chế phẩm BaciMix là chế phẩm đa chủng dạng bột chứa Bacillus subtilis BS 304.04 và Bacillus coagulans BC 304. Hiện nay, hai chủng này đang được lưu trữ và bảo quản tại Trung tâm Nguồn gen Vi sinh vật Quốc gia (VTCC), Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học quốc gia Hà Nội. Hai chủng là kết quả quá trình phân lập, nuôi cấy và định danh bằng sinh học phân tử dựa trên trình tự 16S rADN và so sánh với dữ liệu trên ngân hàng gen quốc tế (NCBI). Ngoài ra, hai chủng đã được nuôi cấy, thử nghiệm các đặc tính an toàn và đặc tính probiotic in vitro trước khi nghiên cứu phối trộn chế phẩm.

Thông tin chủng có trong chế phẩm BaciMix Thông tin chủng Bacillus subtilis Bacillus coagulans BS 304.06 Mật độ trong chế phẩm 3x109 CFU/g 3x109 CFU/g Mã lưu trữ tại VTCC VTCC 60001 VTCC 60002 Mã DNA sequence trên genbank OK335778 MZ596302 7 Hình 1. Chế phẩm BaciMix 1. Tình hình nghiên cứu chế phẩm probiotic chứa chi Bacillus Chi Bacillus đã trải qua những thay đổi đáng kể về phân loại theo thời gian. Số lượng loài được phân bổ cho chi này đã tăng lên thành 318 loài trong “Danh mục sinh vật nhân sơ có danh pháp” [4].