Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ chuyên ngành Công nghệ Sinh học (mã ngành: 94 20 201) của tác giả Hồ Thị Thu Ba, với đề tài "Thu thập, tuyển chọn và nghiên cứu quy trình nuôi trồng hai loại nấm ăn và nấm dược liệu hoang dại từ vùng Thất Sơn An Giang", được hoàn thành tại Trường Đại học Cần Thơ dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. TS. Trần Nhân Dũng và TS. Lại Thị Minh Diệu.

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Vùng rừng núi Thất Sơn (tỉnh An Giang) thuộc Đồng bằng sông Cửu Long có điều kiện khí hậu mát mẻ quanh năm và hệ sinh thái đa dạng, nơi tồn tại nhiều loài nấm hoang dại có giá trị thực phẩm và dược liệu. Tuy nhiên, nguồn tài nguyên nấm tự nhiên tại khu vực này chưa được điều tra và quy hoạch bài bản. Phần lớn các giống nấm trồng tại Việt Nam hiện nay có nguồn gốc nhập khẩu từ Nhật Bản, Đài Loan hoặc châu Âu, trong khi việc thuần hóa các loài nấm bản địa chưa được chú trọng đúng mức. Dưới tác động của biến đổi khí hậu và áp lực khai thác du lịch, việc sưu tầm, đánh giá an toàn, bảo tồn nguồn gen và xây dựng quy trình nuôi trồng nhân tạo cho các loài nấm hoang dại tại Thất Sơn là yêu cầu cấp thiết nhằm phục vụ sản xuất tiêu dùng nội địa và bảo tồn đa dạng sinh học.

Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu tổng quát của luận án là thu thập, tuyển chọn, đánh giá độc tính cấp, xác định thành phần dinh dưỡng, dược tính, kiểm tra độc tính bán trường diễn, thử nghiệm tác dụng kháng ung thư trên dòng tế bào invitro, từ đó thiết lập quy trình tối ưu nuôi trồng một loại nấm ăn và một loại nấm dược liệu mới thu thập hoang dại từ vùng Thất Sơn, An Giang.

Nghiên cứu được triển khai thông qua bốn nội dung cụ thể:

  1. Sưu tập các loài nấm lớn vùng Thất Sơn, điều tra các loài nấm được người dân địa phương sử dụng và định danh sơ bộ dựa vào hình thái.
  2. Xác định độc tính cấp trên chuột, phân lập giữ giống thuần khiết trên môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) và giải trình tự gen vùng Internal Transcribed Spacer (ITS) đối với các loài không mang độc tính.
  3. Xác định thành phần dinh dưỡng của các loài nấm được tuyển chọn; định lượng các hoạt chất dược tính chính trong các mẫu nấm dược liệu; kiểm tra độc tính bán trường diễn trên chuột và thử nghiệm khả năng gây độc tế bào của cao chiết nấm dược liệu lên dòng tế bào ung thư máu (K562) và ung thư đại trực tràng (HCT116).
  4. Nghiên cứu hoàn chỉnh quy trình công nghệ nuôi trồng nhân tạo ba cấp cho hai chủng nấm đã được tuyển chọn gồm nấm ăn và nấm dược liệu.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Các mẫu nấm lớn hoang dại (gồm nấm ăn và nấm dược liệu) thu thập tại các khu vực rừng tự nhiên vùng Thất Sơn, An Giang.
  • Phạm vi không gian: Thực địa thu mẫu tại 7 dãy núi thuộc vùng Thất Sơn, tỉnh An Giang gồm: Núi Cấm, Núi Dài, Núi Phượng Hoàng, Núi Dài Năm Giếng, Núi Két, Núi Tượng và Núi Nước; các thí nghiệm phân tích độc tính, hóa sinh, sinh học phân tử và nuôi trồng được thực hiện tại tỉnh An Giang và Trường Đại học Cần Thơ.
  • Phạm vi thời gian: Quá trình thu mẫu thực địa, phân tích phòng thí nghiệm và thử nghiệm nuôi trồng được tiến hành từ năm 2014 đến năm 2017.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước đây

Tác giả đã hệ thống hóa các tài liệu khoa học trong nước và quốc tế liên quan đến sinh học nấm lớn, giá trị dinh dưỡng, hoạt tính sinh học và công nghệ nuôi trồng:

  • Cơ sở sinh học và phân loại nấm lớn: Luận án dẫn xuất hệ thống phân loại 5 giới của Whittaker (1969) và 3 lãnh giới của Woese (1977) dựa trên trình tự 16S rRNA. Định nghĩa nấm lớn được căn cứ theo Chang và Miles (2004). Cách phân chia tạm thời nguồn tài nguyên nấm lớn Việt Nam thành 4 nhóm (nấm ăn, nấm dược liệu, nấm độc và nấm chưa rõ giá trị sử dụng) được trích dẫn từ Trịnh Tam Kiệt (2011).
  • Lịch sử và thực trạng nghề trồng nấm: Tài liệu của Chang và Miles (2004), Shu-Ting Chang (2008), Akanuma và ctv (2006) được sử dụng để phân tích sự phát triển sản lượng nấm thế giới từ năm 1960 đến năm 2004. Báo cáo của Lê Xuân Thám và ctv (2013) cung cấp số liệu sản lượng nấm của Việt Nam năm 2012 (nấm rơm khoảng 20.000 tấn, nấm sò 1.800 tấn, nấm mỡ 300 tấn, nấm mèo 5.500 tấn khô, nấm linh chi 25 tấn khô).
  • Giá trị dược liệu và hóa sinh nấm: Hoạt tính của polysaccharide-protein complex (PSPC) được dẫn theo Liu (2007); các hợp chất triterpene, ganoderic acid T và cơ chế kích hoạt apoptosis tế bào HeLa qua protein 14-3-3 zeta được tổng hợp từ Xu và ctv, Chen và ctv (2010), Tang và ctv (2006), Yue và ctv (2008); cấu trúc beta-glucan (liên kết beta-1,3 và beta-1,6 ở nấm) cùng thử nghiệm ức chế tế bào nội mô được trích từ Chen và Seviour (2007), Cao và ctv (2006), Stanley và ctv (2005), Kao và ctv.
  • Nghiên cứu khu hệ nấm Việt Nam: Các công trình của Phạm Hoàng Hộ (1960), Nguyễn Văn Diễn (1965), Trịnh Văn Mão (1965), Trịnh Tam Kiệt (1965, 1966, 1978, 1995, 1998, 2000, 2011), Lê Lăng Dũng (1977, 2001, 2003), Lê Văn Liễu (1977), Trần Văn Mão (1990), Phan Huy Dục (1991, 1994, 2001), Ngô Anh (1991, 1996, 1998, 1999, 2000, 2001), Phạm Quang Thu (1994).
  • Nghiên cứu thuần hóa nấm tại Việt Nam: Nghiên cứu thuần hóa nấm hương chịu nhiệt của Phạm Thành Hổ (2002); nấm linh chi của Nguyễn Thị Chính (2005); nấm hầu thủ chịu nhiệt của Cổ Đức Trọng (2007); nấm lụa bạc Volvariella bombycina của Trần Thị Kim Dung và Phạm Thành Hổ (2009).

Khoảng trống nghiên cứu được luận án giải quyết

Mặc dù khu hệ nấm Việt Nam đã được ghi nhận với hàng nghìn loài, các nghiên cứu trước đây chủ yếu tập trung khảo sát hệ sinh thái nấm tại miền Bắc và miền Trung (Thừa Thiên Huế, Nghệ An, Thanh Hóa). Vùng rừng núi Thất Sơn (An Giang) thuộc Tây Nam Bộ chưa có các nghiên cứu toàn diện kết hợp giữa khảo sát bản địa, phân loại hình thái, kiểm chứng trình tự gen phân tử, sàng lọc độc tính an toàn và xây dựng quy trình nuôi trồng hoàn chỉnh từ meo cấp một đến ra quả thể. Luận án giải quyết trực tiếp khoảng trống này trên hai đối tượng nấm bản địa chưa từng được nuôi trồng thương mại tại địa phương: nấm dai (Lentinus squarrosolus) và nấm thượng hoàng (Phellinus sp.).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và khái niệm sử dụng

  • Cơ sở sinh lý dinh dưỡng lignocellulose: Nấm lớn phân giải cellulose, hemicellulose và lignin nhờ phức hệ enzyme ngoại bào (cellulase, laccase, peroxidase), sử dụng tỷ lệ C/N thích hợp để phát triển hệ sợi và hình thành thể quả (Chang và Miles, 2004; Phạm Thành Hổ, 2004).
  • Cơ sở định danh sinh học phân tử: Cấu trúc vùng gen ribosomal RNA (rDNA) gồm các đoạn mã hóa xen kẽ vùng không mã hóa Internal Transcribed Spacer (ITS1 - 5.8S - ITS2) có tính biến dị cao giữa các loài, được ứng dụng làm mã vạch phân tử (DNA barcode) để xác định loài (Guarro và ctv, 1999; White và ctv, 1990).
  • Cơ sở đánh giá an toàn và dược lý học: Đánh giá độc tính cấp đường uống theo quy chuẩn của Viện Dược liệu (Bộ Y tế, 2006) và tài liệu của Đỗ Trung Đàm (1996); cơ chế gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis) kích nổ bởi dịch chiết nấm dược liệu trên tế bào ung thư (Simon, 2004).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Luận án kết hợp đồng thời phương pháp định tính và định lượng qua các bước thực nghiệm:

Thu thập mẫu thực địa (7 ngọn núi, 3 đợt mùa mưa) 
  --> Khảo sát kinh nghiệm dân gian (11 hộ dân) 
  --> Phân loại hình thái & Đánh giá độc tính cấp trên chuột 
  --> Phân lập thuần khiết trên PDA & Giữ giống
  --> Định danh phân tử bằng giải trình tự gen đoạn ITS 
  --> Phân tích dinh dưỡng & Định lượng Triterpenoid / Polysaccharide 
  --> Đánh giá độc tính bán trường diễn & Thử nghiệm ức chế tế bào ung thư K562, HCT116 
  --> Nghiên cứu quy trình nuôi trồng 3 cấp (cấp 1 thạch, cấp 2 hạt lúa, cấp 3 bịch mùn cưa cao su)

  1. Phương pháp thu thập và điều tra dân tộc học nấm:

    • Thực hiện tại 7 núi: Núi Cấm, Núi Dài, Núi Phượng Hoàng, Núi Dài Năm Giếng, Núi Két, Núi Tượng, Núi Nước vào các tháng 6 (đầu mùa mưa), tháng 8 (giữa mùa mưa) và tháng 10 (cuối mùa mưa). Thu mỗi mẫu khoảng 5 cá thể; sấy mẫu ở 45°C hoặc bảo quản mẫu tươi trong formol 15%.
    • Điều tra khảo sát thông tin qua phiếu phỏng vấn 11 hộ dân sinh sống tại khu vực rừng núi Thất Sơn về tên gọi, cách dùng, giá trị ăn uống và trị bệnh.
    • Quan sát cấu trúc đệm bào tử và bào tử bằng kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 40X, nhuộm mẫu bằng dung dịch Lactophenol cotton blue theo kỹ thuật của Trịnh Tam Kiệt.

  2. Phương pháp đánh giá độc tính cấp:

    • Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng đực 5-6 tuần tuổi, trọng lượng 22±2g, thích nghi 1 tuần trước thí nghiệm.
    • Điều chế cao chiết: Mẫu sấy khô ở 60°C; chia đôi để chiết nước (nấu cách thủy 60°C trong 1 giờ, cô cách thủy 60°C) và chiết cồn 96% (ngâm lạnh 72 giờ, cô cách thủy 60°C).
    • Thử nghiệm: Cho chuột uống liều 20 ml/kg thể trọng (không vượt quá 0,5 ml/chuột), theo dõi phản ứng toàn ứng/bất ứng sau 72 giờ và tiếp tục giám sát các triệu chứng bất thường trong 14 ngày; xác định liều tối đa không gây chết ($D_{max}$) hoặc tính toán $LD_{50}$ theo công thức Karber - Behrens nếu có tử vong.

  3. Phương pháp phân lập và định danh phân tử:

    • Phân lập mô nấm trên môi trường thạch PDA ở 25-30°C.
    • Tách chiết DNA bằng dung dịch đệm ly giải chứa CTAB (100 mM Tris, 1,4 M NaCl, 20 mM EDTA, 2% w/v CTAB), tinh sạch bằng phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) và tủa bằng isopropanol lạnh cùng ethanol 70%.
    • Khuếch đại vùng ITS bằng phản ứng PCR với cặp mồi ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') và ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3').
    • Điều kiện phản ứng PCR và chu trình nhiệt:
Thành phần phản ứng PCR (thể tích 25 µL) Nồng độ trong phản ứng Thể tích (µL)
Đệm phản ứng (Buffer 10X) 1X 2,5
dNTP 200 µM 0,5
Taq polymerase 0,05 units/µL 0,25
Mồi ITS1 0,2 µM 0,5
Mồi ITS4 0,2 µM 0,5
Mẫu DNA khuôn 200 pg/µL 1,0
Nước cất vô trùng - 19,75

Chu trình nhiệt thiết lập: Biến tính ban đầu ở 94°C trong 5 phút; tiếp nối 35 chu kỳ gồm biến tính 94°C (30 giây), gắn mồi 56°C (35 giây), kéo dài 72°C (2 phút); kéo dài kết thúc ở 72°C trong 10 phút; bảo quản ở 4°C. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,2% trong 30 phút, gửi giải trình tự tại Công ty Macrogen (Hàn Quốc) và phân tích đồng nhất bằng công cụ BLAST trên NCBI.

  1. Phương pháp phân tích hóa sinh và dược tính:

    • Xác định thành phần dinh dưỡng: Định lượng chất béo, chất đạm, vitamin A, vitamin C, các amino acid và khoáng chất (canxi, sắt, kẽm, kali) bằng phương pháp sắc ký và đo quang phổ.
    • Định lượng triterpenoid toàn phần theo phương pháp cân (Hiai và Oura, 1993): Chiết mẫu bằng cồn 45% (tỷ lệ 1:20), làm sạch dịch chiết lần lượt qua diethyl ether và n-butanol; n-butanol chứa triterpenoid được làm bay hơi ở 50°C để xác định khối lượng; kiểm tra chất lượng bằng sắc ký lớp mỏng (bản mỏng silica gel, thuốc thử $H_2SO_4$ 10%/EtOH, sấy 110°C trong 10 phút).
    • Định lượng polysaccharide thô: Chiết hồi lưu bằng nước trong 6 giờ (tỷ lệ 1:20), tủa dịch chiết bằng cồn 96% (tỷ lệ 1:5), thu tủa và sấy khô.
    • Định lượng đường tự do và đường khử: Sử dụng phương pháp so màu với phenol - sulfuric acid theo thang chuẩn glucose (20-90 µg/mL) theo Lâm Thị Kim Châu và ctv (2004).

  2. Phương pháp đánh giá độc tính bán trường diễn và hoạt tính tế bào:

    • Độc tính bán trường diễn: Cho chuột uống cao nấm liên tục trong 1 tháng; đánh giá khối lượng cơ thể; lấy máu kiểm tra các chỉ số huyết học (hồng cầu, hemoglobin, hematocrit, tiểu cầu, MCV, MCH, MCHC, RDW, bạch cầu lympho, bạch cầu hạt, bạch cầu mono) và chỉ số sinh hóa (GOT, GPT, protein toàn phần, creatinin, urea, triglyceride); giải phẫu bệnh học vi thể mô gan và thận.
    • Khảo sát độc tính tế bào ung thư: Cao chiết nấm thượng hoàng được ủ cùng dòng tế bào ung thư máu (K562) và tế bào ung thư đại trực tràng (HCT116) trên đĩa 96 giếng để đánh giá tỷ lệ sống sót và cảm ứng apoptosis.

  3. Phương pháp nghiên cứu quy trình nuôi trồng:

    • Giống cấp một (ống thạch): Khảo sát môi trường PDA, Potato Dextrose Agar bổ sung nước dừa (PDD), Potato Dextrose Agar bổ sung khoáng (PDK).
    • Giống cấp hai (chai meo hạt): Khảo sát cơ chất hạt lúa bổ sung 5% cám gạo.
    • Nuôi trồng thể quả (cấp ba): Khảo sát các công thức cơ chất phối trộn từ mùn cưa cao su gồm mùn cưa bổ sung 5% bột bắp (B5), mùn cưa bổ sung 5% bột bắp và 5% cám gạo (B5C5), mùn cưa bổ sung 5% tấm và 5% cám gạo (T5C5), theo dõi thời gian lan kín tơ và thời gian hình thành thể quả.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Giới thiệu

Chương này nêu bối cảnh phát triển của ngành nấm trên thế giới và Việt Nam, nhấn mạnh vai trò của nấm ăn và nấm dược liệu đối với phát triển nông nghiệp bền vững thông qua việc tái sử dụng sinh khối lignocellulose. Tác giả chỉ rõ thực trạng nguồn nấm hoang dại tại vùng Thất Sơn An Giang chưa được điều tra và nghiên cứu thuần hóa. Từ đó, xác định rõ mục tiêu tổng quát, 4 nội dung nghiên cứu, đối tượng nghiên cứu (nấm hoang dại Thất Sơn), phạm vi nghiên cứu thực địa tại 7 ngọn núi và ý nghĩa khoa học, thực tiễn của luận án trong việc bảo tồn nguồn gen bản địa và làm chủ quy trình công nghệ nhân tạo.

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Chương 2 trình bày tổng quan lý thuyết về sinh học nấm lớn, cấu tạo hệ sợi và thể quả, nhu cầu sinh lý sinh hóa (C/N, nhiệt độ, độ ẩm, độ thông khí, pH). Phân tích chi tiết giá trị dinh dưỡng (protein đạt 19-35% trọng lượng khô, chứa 9 loại acid amin không thay thế, vitamin nhóm B, khoáng chất) và giá trị dược liệu của các loài nấm phổ biến (Agaricus bisporus, Flammulina velutipes, Lentinula edodes, Ganoderma lucidum, Hericium erinaceus).

Chương này cũng tổng kết lịch sử thuần hóa nấm qua bảng niên đại:

Loài nấm Chức năng sử dụng Thời gian ghi nhận nuôi trồng lần đầu Nơi nuôi trồng đầu tiên
Agrocybe cylindracea Thực phẩm Năm 600 trước Công nguyên Nam Âu (South Europe)
Auricularia auricula Thực phẩm, dược liệu Từ năm 600 Trung Quốc
Flammulina velutipes Thực phẩm Từ năm 800 Trung Quốc
Lentinula edodes Thực phẩm, dược liệu Từ năm 1000 Trung Quốc
Poria cocos Dược liệu Từ năm 1232 Trung Quốc
Agaricus bisporus Thực phẩm, dược liệu Từ năm 1600 Pháp
Ganoderma spp. Dược liệu Từ năm 1621 Trung Quốc
Volvariella volvacea Thực phẩm Từ năm 1700 Trung Quốc
Pleurotus ostreatus Thực phẩm, dược liệu Từ năm 1900 Đức
Hericium erinaceus Thực phẩm, dược liệu Từ năm 1960 Trung Quốc
Agaricus brasiliensis Thực phẩm, dược liệu Từ năm 1970 Nhật Bản

(Nguồn: Luận án trích dẫn từ Shu-Ting Chang, 2008)

Ngoài ra, chương 2 tổng hợp nguyên lý phân loại sinh học phân tử dựa trên vùng ITS trong rDNA, kỹ thuật PCR, cơ chế chống ung thư của triterpenoid và beta-glucan (kích hoạt tế bào NK, tế bào T độc, TNF, ức chế yếu tố tạo mạch VEGF), đồng thời điểm lại toàn bộ các công trình nghiên cứu khu hệ nấm Việt Nam từ năm 1890 đến năm 2013.

Chương 3: Phương tiện và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết địa điểm thực hiện (vùng Thất Sơn, Đại học Cần Thơ), thời gian nghiên cứu (2014-2017), các nguyên vật liệu và hóa chất tinh khiết sử dụng trong tách chiết DNA, phản ứng PCR, sắc ký hóa học. Mô tả tường minh các quy trình kỹ thuật:

  • Thu mẫu thực địa và phỏng vấn 11 hộ dân theo bảng câu hỏi tiêu chuẩn.
  • Quy trình chiết xuất cao nước và cao cồn 96% để thử nghiệm độc tính cấp trên chuột nhắt trắng (liều 20 ml/kg).
  • Kỹ thuật phân lập mô sẹo nấm trên thạch PDA.
  • Phản ứng PCR nhân đoạn ITS bằng cặp mồi ITS1/ITS4, chu trình nhiệt và điện di gel agarose 1,2%.
  • Phương pháp cân định lượng triterpenoid theo Hiai và Oura (1993), phương pháp tủa cồn định lượng polysaccharide thô, phương pháp phenol-sulfuric acid xác định đường.
  • Thí nghiệm độc tính bán trường diễn kéo dài 30 ngày trên chuột và các phép đo 12 chỉ số huyết học, 6 chỉ số hóa sinh men gan/thận.
  • Bố trí thí nghiệm nuôi cấy in vitro cấp 1, cấp 2 và cấp 3 trên cơ chất mùn cưa cao su phối trộn phụ gia (B5, B5C5, T5C5).

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương 4 là phần nội dung trọng tâm của luận án, được chia thành 4 tiểu mục kết quả:

  1. Sưu tập và điều tra nấm lớn Thất Sơn:

    • Thu thập được 28 mẫu nấm hoang dại tại 7 dãy núi. Phân loại sơ bộ thành 4 nhóm: 5 mẫu nấm ăn, 7 mẫu nấm dược liệu, 5 mẫu nấm độc và 11 mẫu chưa rõ công dụng.
    • Kết hợp kết quả khảo sát từ 11 hộ dân địa phương và phân tích vi thể hình thái đệm bào tử, bào tử, tác giả lựa chọn được 5 loài nấm tiêu biểu để nghiên cứu tiếp: Linh chi tầng (Ganoderma applanatum), nấm Vân chi (Trametes sp.), nấm Thượng hoàng (Phellinus sp.), nấm Dai (Lentinus squarrosolus) và nấm Mộc bá huê.

  2. Xác định độc tính cấp, phân lập giống và định danh phân tử:

    • Độc tính cấp: Kết quả thử nghiệm trên chuột nhắt trắng đực bằng đường uống đối với cả cao nước và cao cồn của 5 loài nấm cho thấy không có chuột nào chết sau 72 giờ và không biểu hiện triệu chứng bất thường trong suốt 14 ngày theo dõi. Cả 5 loài nấm đều được kết luận là không mang độc tính cấp ở liều khảo sát cao nhất ($D_{max}$).
    • Phân lập giống thuần: Phân lập thành công 4 loài trên môi trường PDA gồm Linh chi tầng, Vân chi, Thượng hoàng và Nấm dai. Mẫu nấm Mộc bá huê không phân lập thành công hệ sợi trên môi trường nhân tạo.
    • Giải trình tự ITS: Kết quả giải trình tự 12 dòng nấm (mỗi loài 3 dòng) và đối chiếu BLAST trên ngân hàng gen NCBI kết hợp đặc điểm hình thái đã định danh chính xác 4 chủng: nấm dai (Lentinus squarrosolus), nấm linh chi tầng (Ganoderma applanatum), nấm vân chi (Trametes sp.) và nấm thượng hoàng (Phellinus sp.).

  3. Thành phần dinh dưỡng, dược tính, độc tính bán trường diễn và hoạt tính tế bào:

    • Dinh dưỡng và hoạt chất: Phân tích cho thấy nấm dai (Lentinus squarrosolus) chứa hàm lượng protein, amino acid và khoáng chất cao, phù hợp chọn làm nấm ăn. Trong khi đó, mẫu nấm thượng hoàng (Phellinus sp.) và linh chi tầng (Ganoderma applanatum) thể hiện hàm lượng triterpenoid toàn phần, polysaccharide thô và đường khử vượt trội; nấm thượng hoàng được tuyển chọn tiếp tục cho các nghiên cứu dược lý chuyên sâu.
    • Độc tính bán trường diễn của nấm thượng hoàng: Chuột uống cao nấm liên tục 1 tháng có trọng lượng cơ thể tăng trưởng bình thường. Các chỉ số huyết học (hồng cầu, hemoglobin, hematocrit, bạch cầu, tiểu cầu, MCV, MCH, MCHC, RDW) và chỉ số sinh hóa máu (GOT, GPT, creatinin, urea, protein toàn phần, triglyceride) giữa lô thử nghiệm và lô đối chứng không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê. Kết quả giải phẫu vi thể mô gan và thận chuột sau 1 tháng thử nghiệm không ghi nhận tổn thương cấu trúc tế bào.
    • Hoạt tính trên dòng tế bào ung thư: Cao chiết nấm thượng hoàng (Phellinus sp.) thể hiện khả năng ức chế sinh trưởng tế bào ung thư máu dòng K562 và ung thư đại trực tràng dòng HCT116 phụ thuộc vào nồng độ xử lý; tỷ lệ tế bào ung thư giảm dần khi tăng nồng độ cao chiết thông qua cơ chế kích hoạt hiện tượng chết theo chương trình (apoptosis).

  4. Nghiên cứu quy trình công nghệ nuôi trồng hoàn chỉnh: Tác giả hoàn thiện quy trình nhân nuôi ba cấp cho nấm dai và nấm thượng hoàng:

Chỉ tiêu công nghệ Nấm dai (Lentinus squarrosolus) Nấm thượng hoàng (Phellinus sp.)
Giống cấp 1 (In vitro) Môi trường PDA bổ sung nước dừa (PDD) Môi trường PDA tiêu chuẩn
Thời gian lan kín ống thạch 6 ngày 6 ngày
Giống cấp 2 (Meo hạt) Cơ chất hạt lúa bổ sung 5% cám gạo Cơ chất hạt lúa bổ sung 5% cám gạo
Thời gian lan kín chai meo 12 ngày 12 ngày
Cơ chất nuôi trồng (Cấp 3) 90% mùn cưa cao su + 5% cám gạo + 5% bột bắp (B5C5) 90% mùn cưa cao su + 5% cám gạo + 5% bột bắp (B5C5)
Thời gian hệ sợi ăn trắng bịch 70 ngày 50 ngày
Thời gian hình thành và thu hái thể quả 28 ngày 70 ngày

Chương 5: Kết luận và kiến nghị

Tổng kết toàn bộ các kết quả đạt được về thu thập, sàng lọc độc tính, định danh gen ITS, định lượng hoạt chất và hoàn thiện quy trình nuôi trồng nhân tạo hai loài nấm bản địa. Đề xuất các kiến nghị khoa học nhằm mở rộng thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư khác và đánh giá hiệu quả kinh tế ở quy mô bán công nghiệp.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học

  • Cung cấp dẫn liệu khoa học đầu tiên về thành phần nấm lớn hoang dại tại vùng rừng núi Thất Sơn (An Giang) với 28 mẫu thu thập, xác định được 5 loài nấm được người dân bản địa sử dụng gồm Linh chi tầng (Ganoderma applanatum), Vân chi (Trametes sp.), Thượng hoàng (Phellinus sp.), Nấm dai (Lentinus squarrosolus) và Mộc bá huê.
  • Chứng minh cả 5 loài nấm bản địa khảo sát đều an toàn, không có độc tính cấp đường uống trên mô hình chuột thí nghiệm.
  • Thiết lập dữ liệu phân tử về trình tự đoạn gen ITS cho các chủng nấm phân lập tại Thất Sơn, bổ sung vào cơ sở dữ liệu định danh loài nấm lớn tại Việt Nam.
  • Cung cấp bằng chứng thực nghiệm về độ an toàn bán trường diễn (qua các chỉ số huyết học, sinh hóa chức năng gan GOT/GPT, chức năng thận urea/creatinin và mô bệnh học vi thể gan, thận) và chứng minh khả năng kích hoạt apoptosis ức chế sinh trưởng tế bào ung thư máu K562 và ung thư đại trực tràng HCT116 của cao chiết nấm thượng hoàng (Phellinus sp.) hoang dại bản địa.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn

  • Lần đầu tiên phân lập thuần khiết và xây dựng thành công quy trình công nghệ nuôi trồng nhân tạo nấm dai (Lentinus squarrosolus) từ nguồn giống hoang dại nội địa, mở ra triển vọng bổ sung một loại nấm ăn thuần chủng Việt Nam có giá trị dinh dưỡng cao vào cơ cấu cây trồng.
  • Xây dựng thành công quy trình nuôi trồng nấm dược liệu thượng hoàng (Phellinus sp.) trên cơ chất mùn cưa cao su bổ sung cám gạo và bột bắp với tỷ lệ sống và tạo thể quả ổn định, tạo cơ sở thực nghiệm cho việc chủ động sản xuất nguồn nấm dược liệu quý phục vụ hỗ trợ điều trị bệnh tại vùng Đồng bằng sông Cửu Long.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

  • Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các hợp chất tinh khiết tách từ nấm thượng hoàng (Phellinus sp.) và thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư khác để làm sáng tỏ cơ chế phân tử.
  • Tiến hành thử nghiệm quy trình nuôi trồng nấm dai và nấm thượng hoàng ở quy mô trang trại hoặc nông hộ tại vùng Thất Sơn nhằm đánh giá hiệu quả kinh tế và độ ổn định năng suất trước khi nhân rộng.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế của luận án:

    • Nghiên cứu thực địa chỉ giới hạn trong phạm vi 7 dãy núi tại khu vực Thất Sơn (An Giang); chưa thể bao quát toàn bộ các sinh cảnh rừng lân cận.
    • Trong 5 mẫu nấm được chọn lọc từ điều tra bản địa, mẫu nấm Mộc bá huê chưa được phân lập thành công hệ sợi trên môi trường thạch nhân tạo, do đó chưa thể tiến hành định danh phân tử và nghiên cứu quy trình nuôi trồng đối với loài này.
    • Đối với nấm thượng hoàng, kết quả phân loại phân tử kết hợp hình thái mới định danh được đến mức độ chi (Phellinus sp.), chưa xác định chính xác danh pháp loài.
    • Thử nghiệm ức chế tế bào ung thư mới dừng lại ở mức độ invitro trên 2 dòng tế bào nuôi cấy (K562 và HCT116), chưa thực hiện các thử nghiệm in vivo đánh giá khả năng ức chế khối u trên động vật sống.
    • Thử nghiệm nuôi trồng mới được tiến hành trong điều kiện phòng thí nghiệm, chưa đánh giá biến thiên năng suất theo mùa vụ trên diện rộng.

  • Hướng nghiên cứu tiếp theo:

    • Nghiên cứu môi trường chuyên biệt để phân lập hệ sợi nấm Mộc bá huê.
    • Giải trình tự thêm các vùng gen mã hóa khác để xác định danh pháp loài cụ thể cho chủng nấm thượng hoàng (Phellinus sp.).
    • Mở rộng thử nghiệm độc tính tế bào trên nhiều dòng ung thư khác và đánh giá hiệu quả ức chế khối u in vivo trên động vật thực nghiệm.
    • Tối ưu hóa các thông số độ ẩm, ánh sáng, thông khí trong nhà trồng ở quy mô bán công nghiệp để nâng cao hiệu suất sinh học của thể quả nấm dai và nấm thượng hoàng.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn cụ thể cho nhiều đối tượng:

  • Đối với nghiên cứu sinh và học viên cao học ngành Công nghệ Sinh học, Sinh học thực nghiệm và Nông học: Có thể tham khảo phương pháp luận kết hợp giữa điều tra dân tộc học nấm bản địa, phân tích độc tính học, định danh phân tử bằng đoạn mã vạch ITS và quy trình tối ưu hóa cơ chất nhân giống 3 cấp.
  • Đối với các nhà nghiên cứu dược học và hóa hợp chất tự nhiên: Phần phân tích hàm lượng triterpenoid toàn phần, polysaccharide thô và kỹ thuật thử nghiệm độc tính bán trường diễn (huyết học, sinh hóa máu, mô bệnh học) cung cấp quy trình thực nghiệm chuẩn mực để đánh giá các nguồn dược liệu nấm hoang dại.
  • Đối với cơ sở sản xuất meo giống và người trồng nấm tại Đồng bằng sông Cửu Long: Bản hướng dẫn tỷ lệ phối trộn cơ chất giá rẻ (mùn cưa cao su, lúa, cám gạo, bột bắp) cùng các mốc thời gian phát triển hệ sợi (6 ngày thạch, 12 ngày meo hạt, 28-70 ngày ra quả thể) là căn cứ trực tiếp để ứng dụng sản xuất nấm dai và nấm thượng hoàng trong thực tế.

Câu hỏi thường gặp

1. Trong số 28 mẫu nấm hoang dại thu thập được tại Thất Sơn, tỷ lệ phân chia giữa các nhóm nấm như thế nào?
Trong 28 mẫu nấm thu thập được từ tự nhiên tại 7 dãy núi vùng Thất Sơn, tác giả ghi nhận có 5 mẫu nấm ăn, 7 mẫu nấm dược liệu, 5 mẫu nấm độc và 11 mẫu nấm chưa xác định được công dụng.

2. Loài nấm nào trong số 5 loài được người dân sử dụng đã không thể phân lập thuần khiết được trên môi trường nhân tạo?
Đó là loài nấm Mộc bá huê. Dù không biểu hiện độc tính cấp trên chuột thí nghiệm, mô nấm Mộc bá huê khi cấy trên môi trường thạch PDA đã không phát triển hệ sợi thuần khiết, do đó bị loại khỏi các bước nghiên cứu phân tử và nuôi trồng tiếp theo.

3. Kết quả đánh giá an toàn bán trường diễn của cao chiết nấm thượng hoàng (Phellinus sp.) trên chuột cho thấy điều gì?
Sau 1 tháng uống cao nấm liên tục, chuột thí nghiệm phát triển bình thường về trọng lượng; các chỉ số huyết học (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, hemoglobin...) và các chỉ số men gan (GOT, GPT), chức năng thận (creatinin, urea) đều nằm trong giới hạn bình thường, không có sự sai khác có ý nghĩa so với lô đối chứng; giải phẫu vi thể mô gan và thận chuột không ghi nhận tổn thương bệnh lý nào.

4. Môi trường tối ưu cho từng giai đoạn nhân giống và nuôi trồng thể quả nấm dai (Lentinus squarrosolus) là gì?
Quy trình nuôi trồng nấm dai được tối ưu hóa qua ba cấp: môi trường nhân giống cấp 1 là PDA bổ sung nước dừa (PDD) với thời gian ăn kín thạch 6 ngày; môi trường nhân giống cấp 2 là hạt lúa bổ sung 5% cám gạo với thời gian phát triển 12 ngày; cơ chất nuôi trồng quả thể (cấp 3) gồm 90% mùn cưa cao su + 5% cám gạo + 5% bột bắp (B5C5) với thời gian ăn trắng bịch 70 ngày và thu hái quả thể sau 28 ngày.

5. Cặp mồi và chu trình nhiệt được luận án sử dụng để nhân bản đoạn gen định danh phân tử nấm là gì?
Luận án sử dụng cặp mồi ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') và ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'). Chu trình nhiệt PCR gồm 35 chu kỳ: biến tính ở 94°C trong 30 giây, gắn mồi ở 56°C trong 35 giây, kéo dài ở 72°C trong 2 phút; bước biến tính ban đầu là 94°C trong 5 phút và kéo dài kết thúc ở 72°C trong 10 phút.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Hồ Thị Thu Ba đã giải quyết trọn vẹn mục tiêu nghiên cứu thông qua việc thu thập, sàng lọc độc tính an toàn và định danh thành công các loài nấm hoang dại có giá trị tại vùng rừng núi Thất Sơn (An Giang). Đề tài đã làm sáng tỏ giá trị dinh dưỡng cao của nấm dai (Lentinus squarrosolus) cùng hàm lượng dược chất và khả năng ức chế tế bào ung thư máu K562, ung thư đại trực tràng HCT116 của nấm thượng hoàng (Phellinus sp.). Đồng thời, luận án đã xây dựng hoàn chỉnh công nghệ nhân giống ba cấp và cơ chất nuôi trồng thể quả trên phế phẩm mùn cưa cao su cho hai loài nấm này, đóng góp thiết thực vào công tác bảo tồn nguồn gen bản địa và phát triển nghề trồng nấm bền vững tại Việt Nam.