BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN VĂN TẬP NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG XẠ KHUẨN TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH HÉO RŨ DO NẤM Fusarium sp. TRÊN KHOAI LANG LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH BẢO VỆ THỰC VẬT MÃ SỐ 62620112 NĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN VĂN TẬP NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG XẠ KHUẨN TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH HÉO RŨ DO NẤM Fusarium sp. TRÊN KHOAI LANG LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH BẢO VỆ THỰC VẬT MÃ SỐ 62620112 NGƢỜI HƢỚNG DẪN PGS.TS LÊ MINH TƢỜNG TS. NGUYỄN ĐỨC CƢƠNG NĂM 2022 LỜI CẢM ƠN Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc đến PGS.
Lê Minh Tƣờng và TS. Nguyễn Đức Cƣơng đã tận tình hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và viết luận án tốt nghiệp này. Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể quý thầy, cô Khoa Nông nghiệp và quý thầy cô trƣờng Đại học Cần Thơ đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Xin cảm ơn các bạn học viên cao học và sinh viên đã hỗ trợ, cộng tác cùng tôi trong suốt quá trình thực hiện Luận án.
Xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp và ngƣời thân luôn động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện tốt để tôi hoàn thành Luận án này. Chân thành cảm ơn và trân trọng kính chào. Cần Thơ, ngày tháng năm 2022 Ngƣời thực hiện Nguyễn Văn Tập Nguyễn Văn Tập TÓM TẮT Nghiên cứu đƣợc thực hiện từ tháng 3 năm 2016 đến tháng 10 năm 2018 nhằm tìm ra chủng xạ khuẩn có khả năng phòng trừ bệnh héo rũ hại khoai lang canh tác tại huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long Kết quả thu thập và phân lập đƣợc 10 dòng nấm Fusarium spp. gây bệnh héo rũ hại khoai lang tại các xã thuộc huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long.
Dựa vào đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh học cho thấy cả 10 dòng nấm phân lập đều thuộc Fusarium oxysporum. Mặt khác, các dòng nấm đều có khả năng gây bệnh trên cây khoai lang với triệu chứng điển hình của bệnh héo rũ và dòng nấm Fo.BT10 thể hiện khả năng gây hại nặng nhất trong tổng số 10 dòng nấm phân lập. Bên cạnh đó, trình tự gen vùng ITS của dòng Fo.BT10 có mức độ tƣơng đồng với loài Fusarium oxysporum f. Nhƣ vậy, dòng nấm gây bệnh héo rũ hại khoai lang ở huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long thuộc loài Fusarium oxysporum.
Kết quả phân lập đƣợc 120 chủng xạ khuẩn từ đất trồng khoai lang ở các xã thuộc huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long. Khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn đối với nấm Fusarium oxysporum gây bệnh héo rũ hại khoai lang đƣợc thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm. Kết quả cho thấy, có 28 trong tổng số 120 chủng xạ khuẩn thể hiện khả năng đối kháng với nấm F. oxysporum và 5 chủng TTr4; TL8; TTh15; TL10 và TĐ7 thể hiện khả năng đối kháng cao thông qua bán kính vòng vô khuẩn lần lƣợt là 7,4 mm; 6,6 mm; 4,2 mm; 6,4 mm và 6,2 mm và hiệu suất đối kháng lần lƣợt là 64,2%; 56,0%; 46,4%; 53,3% và 45,2% ở thời điểm 5 ngày sau khi bố trí thí nghiệm.
Khả năng ức chế sự mọc mầm và sự hình thành bào tử nấm F. oxysporum của 5 chủng xạ khuẩn (TTr4, TL8, TTh15, TL10 và TĐ7) đƣợc thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm với 4 lần lặp lại. Kết quả cho thấy, chủng TTr4 thể hiện khả năng ức chế sự mọc mầm và sự hình thành bào tử nấm cao với tỷ lệ bào tử mọc mầm thấp kéo dài đến thời điểm 24 giờ sau khi xử lý và mật số bào tử nấm hình thành thấp là 70,00 bào tử/ml ở thời điểm 7 ngày sau khi bố trí thí nghiệm. Ngoài ra, khả năng phân giải chitin của 5 chủng xạ khuẩn (TTr4, TL8, TTh15, TL10 và TĐ7) đƣợc thực hiện với 5 lần lặp lại.
Kết quả cho thấy 3 chủng TTr4, TL8 và TTh15 thể hiện khả năng tiết ra enzyme phân giải chitin cao thông qua bán kính vòng phân giải lần lƣợt là 19,67 mm; 20,40 mm và 18,53 mm và hàm lƣợng enzyme chitinase tiết ra lần lƣợt là 107,80 UI/ml; 103,61 UI/ml và 55,44UI/ml ở thời điểm 7 ngày sau khi bố trí thí nghiệm. Khả năng phân giải β-glucan của 5 chủng xạ khuẩn trên cũng đƣợc thực hiện với 5 lần lặp lại. Kết quả cho thấy 3 chủng TTr4, TL8 và TTh15 có khả năng tiết ra phân giải β-glucan cao thông qua bán kính vòng phân giải lần lƣợt là 15,80 mm; 12,80 mm và 11,13 mm và hàm lƣợng enzyme β-glucanase tiết ra lần lƣợt là 0,754 IU/ml; 0,678 IU/ml và 0,682 IU/ml ở thời điểm 14 ngày sau khi bố trí thí nghiệm. Khả nảng phòng trừ bệnh héo rũ trên khoai lang của 3 chủng xạ khuẩn (TTr4, TL8 và TTh15) đƣợc thực hiện trong điều kiện nhà lƣới với 5 lần lặp lại.
Kết quả cho thấy 3 chủng xạ khuẩn thí nghiệm khi đƣợc xử lý kết hợp ở thời điểm 2 ngày trƣớc và i 2 ngày sau khi lây bệnh nhân tạo cho tỷ lệ bệnh thấp lần lƣợt là 25,0%; 48,0% và 48,0%; chỉ số bệnh thấp lần lƣợt là 21,5%; 44,0% và 41,0% và hiệu quả giảm bệnh cao lần lƣợt là 75,0%; 52,0% và 52,0% ở thời điểm 10 ngày sau khi lây bệnh nhân tạo. Ba chủng xạ khuẩn (TTr4, TL8 và TTh15) đƣợc định danh dựa vào đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh hoá và giải trình tự gen vùng 16S-rRNA. Kết quả quan sát đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh hóa cho thấy 3 chủng xạ khuẩn thí nghiệm thuộc chi Streptomyces và khi so sánh trình tự gene vùng 16S-rDNA của ba mẫu xạ khuẩn trong nghiên cứu này với các trình tự sẵn có trên ngân hàng gene (GenBank) cho thấy rằng mẫu TTr4 là loài Streptomyces bacillaris với mức tƣơng đồng là 99%; mẫu TL8 là loài Streptomyces lavendulae với mức tƣơng đồng là 99% và mẫu TTh15 là loài Streptomyces violaceoruber với mức tƣơng đồng là 99%. Đánh giá khả năng phòng trừ bệnh héo rũ hại khoai lang của 2 chủng xạ khuẩn TTr4 và TTh15 trong điều kiện ngoài đồng tại ấp Tân Trung, xã Tân ình, huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long đƣợc thực hiện 2 vụ từ tháng 11/2017 đến tháng 10/2018.
Kết quả cho thấy 2 chủng xạ khuẩn TTh15 và TTr4 đều có khả năng phòng trừ bệnh héo rũ do nấm Fusarium oxysporum ở điều kiện ngoài đồng. Nghiệm thức đƣợc xử lý kết hợp ở giai đoạn 20 NSKT + 40 NSKT + 60 NSKT của chủng TTr4 cho khả năng phòng trừ bệnh héo rũ cao hơn và khác biệt ý nghĩa thống kê so với đối chứng và tƣơng đƣơng với nghiệm thức xử lý thuốc hóa học. Mặt khác, các nghiệm thức đƣợc xử lý xạ khuẩn không làm ảnh hƣởng đến sự phát triển về chiều dài và số chồi dây khoai lang. Đồng thời, các nghiệm thức đƣợc xử lý chủng xạ khuẩn TTh15, TTr4 ở giai đoạn 20 NSKT + 40 NSKT + 60 NSKT cho năng suất cao tƣơng đƣơng so với nghiệm thức xử lý thuốc hóa học.
Từ khóa: Bệnh héo rũ hại khoai lang, chitin, Fusarium oxysporum, ức chế sự hình thành bào tử, ức chế sự mọc mầm bào tử, xạ khuẩn, β-glucan. ii ABSTRACT The research was carried out from March 2016 to October 2018. The objective of this research was to investigate the actinomycetes able to control Fusarium oxysporum fungus causing Fusarium wilt disease on Sweet Potato in Binh Tan district, Vinh Long province. There were 10 Fusarium spp.
strains that were collected in some villages of Binh Tan district, Vinh Long province. The samples were determined based on morphological and biological characteristics. The results showed that all 10 strains belonged to Fusarium oxysporum species. Beside, they induced typical symptoms of Fusarium wilt disease on Sweet Potato and the Fo.BT10 strain was high pathogenicity in 10 strains testing.
On the other hand, the nucleotide sequences of ITS region of Fo.BT10 train showed 100% similarity with Fusarium oxysporum f. Therefore, the pathogen caused the Fusarium wilt disease in Binh Tan district, Vinh Long province belong to Fusarium oxysporum species. One hundred and twenty actinomycetes isolates were collected from Sweet Potato field in some villages of Binh Tan district, Vinh Long province. The antagonistic ability against Fusarium oxysporum fungus of these actinomyces isolates were determined in laboratory.
The results showed that 28 of 120 isolates in total presented antagonistic activity against F. oxysporum and 5 isolates, TTr4, TL8, TTh15, TL10 and TĐ7 showed higher stabler antagonistic ability with radiuses of inhibition zones reach 7.2 mm and antagonistic efficacy of 64.2% respectively at 5 days after co- culture.The ability of inhibiting conidia germination and inhibiting sporulation of F. oxyporum by 5 actinomycetes isolates (TTr4, TL8, TTh15, TL10 and TĐ7) was examined in Laboratory condition with 4 replications. The resultes indicated that TTr4 isolate have the highest inhibition effecicacy with the lowest rate’s conidia germination at 24 hour after inoculation and the lowest conidia concentration reaches 70.00 at 7 days after testing.
Chitinase activity of 5 actinomycetes isolates, TTr4, TL8, TTh15, TL10 and TĐ7 was performed with five replicates. The result indicated that, 5 actinomyces isolates had the chitinolytic activity and 3 isolates, TTr4, TL8 and TTh15 showed the highest chitinolytic activity with the chitin lyse halo radius of 19.53 mm and dose of chitinase reach 107.61 IU/ml and 55.44 IU/ml reach at 7 days after testing. eside, the testing β-glucanase productivity of these actinomycetes was conducded with 5 replications. The resultes found that 3 isolates TTr4, TL8 and TTh15 showed the highest β-glucanolytic activity with the β- glucan lyse halo radius of 15.13 mm and dose of β-glucanase reach 0.678 IU/ml and 0.682 IU/ml at 14 days after testing.
The biocontrol ability of 3 actinomycete isolates (TTr4, TL8 and TTh15) was tested in the nethouse conditions. The results indicated that 3 isolates TTr4, TL8 and TTh15 which were applied twice (2 days before and 2 days after pathogen inoculation) iii gave the highest ability to control the disease through three criteria: low ratio of disease incidence was 25.0%; low disease index was 21.0% and high efficiency of disease reduction was 75.0% at 10 days after testing on sweet potato in nethouse condition. Three actinomyces TTr4, TL8 and TTh15 isolates were identified based on morphological and biochemical characteristics. In addition, the these isolates were also identified based on the 16S-rRNA gene sequence.
The results showed that 3 isolates TTr4, TL8 and TTh15 belongs to Streptomyces genus. Beside, comparison of the 16S- rDNA gene sequence with existing on Gene bank indicated that TTr4 isolate showed 99% similarity with Streptomyces bacillaris isolate, TL8 isolate showed 99% similarity with Streptomyces lavendulae isolate and TTh15 isolate showed 100% similarity with Streptomyces violaceoruber isolate. Investigation of the ability of 2 isolates TTr4 and TTh15 to control the Fusarium wilt disease on Sweet potato in field condition. The experiment was carried out 2 seasons from November 2017 to October 2018 in Tan Trung hamlet, Tan Binh commune, Binh Tan district, Vinh Long province.
This experiment was performed as a randomized completely block design with 18 treatments with 4 replications.