Luận văn thạc sĩ hus nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật polymerase chain reaction trong chẩn đoán viêm âm đạo cổ tử cung do chlamydia trachomatis tại bệnh viện đại học y thái bình

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán viêm âm đạo cổ tử cung do Chlamydia trachomatis tại Bệnh viện Đại học Y Thái Bình.

• Tác giả: Trần Thị Hòa
• Người hướng dẫn: GS.TS Lương Xuân Hiến
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Sinh Học Thực Nghiệm
• Đề tài: Nghiên Cứu Ứng Dụng Kỹ Thuật Polymerase Chain Reaction Trong Chẩn Đoán Viêm Âm Đạo - Cổ Tử Cung Do Chlamydia Trachomatis Tại Bệnh Viện Đại Học Y Thái Bình
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học
• Năm xuất bản: 2011
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Vi khuẩn Chlamydia trachomatis
• 1.2. Các xét nghiệm chẩn đoán vi khuẩn Chlamydia trachomatis
• 1.2.1. Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme (enzyme immunoassays – EIAs)
• 1.2.2. Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang trực tiếp (direct fluorescent antibody - DFA)
• 1.2.3. Kỹ thuật khuếch đại acid nucleic (nucleic acid amplification tests – NAATs)
• 1.3. Các nghiên cứu về Chlamydia trachomatis trên thế giới và trong nước
• 1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới
• 1.3.2. Các nghiên cứu trong nước
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
• 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.2.1. Phương pháp chọn mẫu và cỡ mẫu
• 2.2.2. Kỹ thuật xét nghiệm
• 2.2.2.1. Phương pháp lấy mẫu
• 2.2.2.2. Tách chiết ADN
• 2.2.2.3. Tối ưu hóa phản ứng PCR
• 2.2.2.4. Xác định độ nhạy của phản ứng PCR
• 2.2.2.5. Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng
• 2.2.2.6. Xác định tỷ lệ nhiễm Chlamydia trachomatis ở bệnh nhân viêm âm đạo, cổ tử cung đến khám tại bệnh viện Đại học Y Thái Bình từ tháng 4 đến tháng 10 năm 2011
• 2.2.2.7. Điện di, phân tích kết quả
• 2.2.2.8. Xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Tối ưu hóa phản ứng PCR phát hiện Chlamydia trachomatis
• 3.1.1. Thời gian và nhiệt độ gắn mồi
• 3.1.2. Số chu kỳ
• 3.1.3. Độ nhạy của kỹ thuật PCR
• 3.1.4. Độ đặc hiệu của kỹ thuật PCR
• 3.2. Kết quả xét nghiệm bằng kỹ thuật PCR
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu ứng dụng PCR trong chẩn đoán viêm âm đạo

Viêm âm đạo do Chlamydia trachomatis là một trong những bệnh lây truyền qua đường tình dục phổ biến nhất hiện nay. Việc chẩn đoán chính xác và kịp thời là rất quan trọng để ngăn ngừa các biến chứng nghiêm trọng. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) đã được chứng minh là một phương pháp hiệu quả trong việc phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn này trong các mẫu bệnh phẩm. Nghiên cứu này nhằm mục đích đánh giá hiệu quả của PCR trong việc chẩn đoán viêm âm đạo do Chlamydia trachomatis.

1.1. Tại sao PCR là phương pháp chẩn đoán hiệu quả

Phương pháp PCR cho phép khuếch đại DNA của Chlamydia trachomatis, giúp phát hiện vi khuẩn ngay cả khi số lượng rất ít. Độ nhạy và độ đặc hiệu của PCR cao hơn nhiều so với các phương pháp truyền thống như nuôi cấy vi khuẩn. Theo nghiên cứu của Saiki và cộng sự (1985), PCR có thể phát hiện 25 ng DNA từ 10 phân tử ban đầu, cho thấy khả năng phát hiện vi khuẩn ở mật độ thấp.

1.2. Các phương pháp chẩn đoán khác và so sánh với PCR

Ngoài PCR, còn có các phương pháp như nuôi cấy vi khuẩn, kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme (EIAs) và kỹ thuật kháng thể huỳnh quang trực tiếp (DFA). Tuy nhiên, những phương pháp này thường có độ nhạy thấp hơn và yêu cầu thời gian dài hơn để có kết quả. PCR không chỉ nhanh chóng mà còn không yêu cầu vi khuẩn còn sống, điều này làm cho nó trở thành lựa chọn ưu việt trong chẩn đoán.

II. Vấn đề và thách thức trong chẩn đoán viêm âm đạo do Chlamydia trachomatis

Mặc dù có nhiều phương pháp chẩn đoán, nhưng việc phát hiện Chlamydia trachomatis vẫn gặp nhiều khó khăn. Một trong những thách thức lớn nhất là tỷ lệ nhiễm không triệu chứng, đặc biệt ở phụ nữ. Theo thống kê, có tới 75% phụ nữ nhiễm bệnh không có triệu chứng rõ ràng, dẫn đến việc chẩn đoán muộn và tăng nguy cơ biến chứng.

2.1. Tỷ lệ nhiễm không triệu chứng và ảnh hưởng đến chẩn đoán

Tỷ lệ nhiễm không triệu chứng ở phụ nữ là một trong những lý do chính khiến cho việc chẩn đoán Chlamydia trachomatis trở nên khó khăn. Nhiều phụ nữ không nhận biết mình bị nhiễm bệnh cho đến khi có các biến chứng nghiêm trọng như viêm vùng chậu hoặc vô sinh.

2.2. Hạn chế của các phương pháp chẩn đoán hiện tại

Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như nuôi cấy vi khuẩn có nhiều hạn chế, bao gồm thời gian chờ đợi lâu và yêu cầu vi khuẩn còn sống. Điều này làm giảm khả năng phát hiện kịp thời và chính xác, dẫn đến việc điều trị không hiệu quả.

III. Phương pháp nghiên cứu và quy trình thực hiện PCR

Nghiên cứu này sử dụng phương pháp PCR để phát hiện Chlamydia trachomatis trong mẫu bệnh phẩm từ bệnh nhân. Quy trình thực hiện bao gồm các bước tách chiết ADN, tối ưu hóa phản ứng PCR và đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của phương pháp. Mẫu bệnh phẩm được thu thập từ bệnh nhân đến khám tại Bệnh viện Đại học Y Thái Bình.

3.1. Quy trình tách chiết ADN và tối ưu hóa PCR

Quy trình tách chiết ADN được thực hiện bằng cách sử dụng các bộ kit chuyên dụng, đảm bảo thu được ADN chất lượng cao. Sau đó, phản ứng PCR được tối ưu hóa với các điều kiện như nhiệt độ và thời gian gắn mồi để đạt được độ nhạy tối đa.

3.2. Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của PCR

Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp PCR được đánh giá thông qua việc so sánh kết quả với các phương pháp chẩn đoán khác. Nghiên cứu cho thấy PCR có độ nhạy trên 90% và độ đặc hiệu tương đương với nuôi cấy tế bào, khẳng định vai trò quan trọng của nó trong chẩn đoán.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn của PCR

Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ nhiễm Chlamydia trachomatis ở bệnh nhân viêm âm đạo tại Bệnh viện Đại học Y Thái Bình là khá cao. Việc áp dụng PCR trong chẩn đoán không chỉ giúp phát hiện sớm mà còn hỗ trợ trong việc điều trị kịp thời, giảm thiểu các biến chứng nghiêm trọng.

4.1. Tỷ lệ nhiễm Chlamydia trachomatis trong nghiên cứu

Kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm Chlamydia trachomatis ở bệnh nhân viêm âm đạo là khoảng 30%. Điều này cho thấy sự cần thiết phải áp dụng các phương pháp chẩn đoán hiệu quả như PCR để phát hiện sớm và điều trị kịp thời.

4.2. Ứng dụng PCR trong thực tiễn y tế

Việc áp dụng PCR trong chẩn đoán viêm âm đạo do Chlamydia trachomatis đã mở ra hướng đi mới trong công tác chăm sóc sức khỏe sinh sản. Phương pháp này không chỉ giúp phát hiện nhanh chóng mà còn giảm thiểu chi phí điều trị và ngăn ngừa các biến chứng nghiêm trọng.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu PCR

Nghiên cứu ứng dụng PCR trong chẩn đoán viêm âm đạo do Chlamydia trachomatis đã chứng minh được hiệu quả và tính khả thi. Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để hoàn thiện quy trình và mở rộng ứng dụng của PCR trong các lĩnh vực khác của y học.

5.1. Tầm quan trọng của việc phát triển kỹ thuật PCR

Việc phát triển kỹ thuật PCR không chỉ giúp nâng cao khả năng chẩn đoán mà còn mở ra cơ hội cho các nghiên cứu sâu hơn về Chlamydia trachomatis và các bệnh lây truyền qua đường tình dục khác.

5.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Các nghiên cứu trong tương lai nên tập trung vào việc cải thiện độ nhạy và độ đặc hiệu của PCR, cũng như phát triển các bộ kit chẩn đoán dễ sử dụng hơn, nhằm phục vụ cho công tác chăm sóc sức khỏe cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Hiện nay, một trong các vấn đề nóng bỏng về chăm sóc sức khỏe sinh sản mà các nƣớc trên thế giới đang đối mặt là bệnh lây truyền qua đƣờng tình dục. Viêm đƣờng sinh dục do Chlamydia trachomatis đƣợc coi là bệnh lây truyền qua đƣờng tình dục đứng đầu trên thế giới. Nhiễm Chlamydia trachomatis thƣờng gây viêm niệu đạo, viêm cổ tử cung. Tuy nhiên nế u không điề u tri ̣có thể dẫn đế n các biế n chƣ́ng nhƣ viêm phần phụ, đau vùng chậu mãn tính, thai ngoài tử cung, vô sinh do tổn thƣơng ống dẫn trứng, viêm mào tinh đòi hỏi phải chăm sóc y tế với phí tổn cao.

Tổ chức Y tế thế giới ƣớc tính hàng năm có khoảng 90 triệu ca nhiễm Chlamydia trachomatis đƣợc phát hiện mới [34]. Bệnh do Chlamydia trachomatis hay gặp ở những ngƣời trẻ tuổi, trong độ tuổi sinh đẻ. Các nghiên cứu mới đây cho thấy, tỷ lệ mắc bệnh này đang tăng lên. Tại Châu Âu từ năm 1996-2003, số bệnh nhân nhiễm Chlamydia trachomatis đã tăng gấp đôi, tại Hoa Kỳ con số này cũng tăng 14% trong giai đoạn 2000-2005 [15, 18].

Ở Việt Nam trong khoảng vài năm gần đây vấn đề nhiễm khuẩn do Chlamydia trachomatis mới đƣợc chú ý. Một vài nghiên cứu đƣa ra tỷ lệ khoảng 30% các trƣờng hợp đến khám phụ khoa có tiết dịch đƣờng âm đạo bất thƣờng là do Chlamydia trachomatis. Nguy hiểm nhất của nhiễm Chlamydia trachomatis qua đƣờng sinh dục là có tới 75% nữ giới và 50% nam giới mắc bệnh mà không có triệu chứng, ngƣời bệnh hoàn toàn không biết mình nhiễm vi khuẩn [2,9]. Để chẩn đoán nhiễm Chlamydia trachomatis ngƣời ta thƣờng dùng xét nghiệm nuôi cấy- tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán xác định nhiễm Chlamydia trachomatis.

Tuy nhiên xét nghiệm này có hạn chế là phải bảo đảm vi khuẩn còn sống trong quá trình vận chuyển đến phòng xét nghiệm, thời gian xét nghiệm dài. Khuếch đại acid nucleic (nucleic acid amplification tests – NAATs) là kỹ thuật sinh học phân tử đã đƣợc ứng dụng rộng rãi trong y học để phát hiện sự tồn tại của các vi sinh vật trong các mẫu bệnh phẩm. Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction– PCR) là một NAATs có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao, nhiều nghiên cứu đã xem PCR là một tiêu chuẩn vàng để khảo sát giá trị của các xét nghiệm chẩn đoán 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Đối với bệnh nhiễm Chlamydia trachomatis, xét nghiệm này cho phép xác định sự tồn tại của vi khuẩn trong dịch âm đạo, tử cung của bệnh nhân.

Với mong muốn đóng góp vào công tác chăm sóc sức khỏe nói chung và công tác chăm sóc sức khỏe sinh sản nói riêng, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu ứ ng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán viêm âm đạo, cổ tử cung do Chlamydia trachomatis tại Bệnh viện Đại học Y Thái Bình” với mục tiêu: - Chuẩn hóa được quy trình kỹ thuật thực hiện phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn Chlamydia trachomatis. - Xác đi ̣nh được tỷ lê ̣ nhiễm Chlamydia trachomatis ở bệnh nhân viêm âm đạo, cổ tử cung. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1. Vi khuẩn Chlamydia trachomatis.

Chlamydia trachomatis thuộc chi Chlamydia, họ Chlamydiaceae, lớp Chlamydiae, ngành Chlamydiae, giới Bacteria [2, 9]. Về hình thái khi quan sát dƣới kính hiển vi quang học, vi khuẩn có hình cầu hoặc hình bầu dục, kích thƣớc khác nhau, là vi khuẩn Gram âm có màng là lipopolisaccharide. Vì thiếu một số enzyme tổng hợp các hợp chất cao năng sử dụng cho tế bào, vi khuẩn này phải ký sinh nội bào bắt buộc, không có khả năng sống sót bên ngoài tế bào. Hệ gen của Chlamydia trachomatis gồm phân tử DNA dài 1.519 nucleotide với 894 trình tự mã hóa cho protein.

Cấu trúc hệ gen của vi khuẩn Chlamydia trachomatis ( Theo Deborah Dean et al., (2009) Predicting Phenotype and Emerging Strains among Chlamydia trachomatis Infections, CDC Home Vol.trachomatis) chứa 7 đến 10 bản sao của plasmid có kích thƣớc 7. Trình tự nucleotide của plasmid là trình tự bảo thủ cao (có dƣới 1% nucleotide thay thế), chứa 8 khung đọc mở (Open Reading Frame) mã hoá các gen và các kháng nguyên. Mặc dù chức năng của plasmid còn chƣa xác định hết nhƣng trình 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] tự nucleotide và sự có mặt của plasmid trong tế bào chứng tỏ nó có vai trò quan trọng đối với vi khuẩn C.trachomatis đƣợc chia thành 15 loại tuýp huyết thanh khác nhau bao gồm: Tuýp huyết thanh (A-K), L1, L2, L3, Ba, Da, Ia và L2a. Trong đó tuýp A, B, Ba và C gây bệnh mắt hột.

Tuýp D, E, F, G, H, I, J và K gây bệnh viêm đƣờng sinh dục. Tuýp L1, L2 và L3 gây bệnh lympho hạt, một bệnh viêm hạch bạch huyết hoa liễu ở bẹn [2,9]. Chu kỳ phát triển của C.trachomatis trong bào tƣơng tế bào kéo dài 48-72 giờ [34]. Vòng đời của C.trachomatis gồm 2 giai đoạn: Thể cơ bản và thể lƣới.

- Thể cơ bản (Elementary Body- EB) là những tế bào tròn có đƣờng kính khoảng 0. Thể này xâm nhập vào các tế bào theo kiểu thực bào. - Thể lƣới (Reticulate Body- RB): Sau khi xâm nhập vào tế bào C.trachomatis chuyển hóa nhờ tế bào và tạo thành thể lƣới (đƣờng kính 1m), sinh sản theo hình thức phân đôi kiểu trực phân khoảng 2-3 giờ một lần. Sau đó thể lƣới lại chuyển thành thể cơ bản và giải phóng khỏi tế bào thông qua hình thƣ́c ngoại tiế t bào (exocytosis).

Thông thƣờng mỗi thể lƣới giải phóng 100-1000 thể cơ bản rồi tiếp tục xâm nhập vào các tế bào mới. Chu kỳ vòng đời của vi khuẩn C. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Đường truyền bệnh: Vi khuẩn C.trachomatis là vi khuẩn ký sinh nội bào bắt buộc, không có khả năng sống sót ngoài tế bào nên đƣờng truyền chủ yếu là đƣờng tình dục hoặc lây từ mẹ sang con khi ngƣời mẹ mang thai bị nhiễm C. Khả năng gây bệnh: C.trachomatis có khả năng gây nên 2 bệnh chính ở ngƣời: Bệnh mắt hột và bệnh nhiễm trùng sinh dục tiết niệu, trong đó bệnh sinh dục tiết niệu do nhiều tuýp (D, E, F, G, H, I, J và K) gây ra, tăng nhanh số lƣợng ngƣời mắc.

Trẻ sơ sinh có thể bị mắc bệnh viêm kết mạc hoặc viêm phổi do C.trachomatis nếu bị lây từ mẹ. Ở phụ nữ Có tới 75% phụ nữ không có biểu hiện triệu chứng lâm sàng và triệu chứng nếu có cũng không điển hình [3], nên việc chẩn đoán và sàng lọc nhiễm C.trachomatis đơn thuần dựa vào triệu chứng lâm sàng hoàn toàn không khả thi. Cho đến khi có biểu hiện viêm vùng chậu hoặc khi bệnh nhân khám vô sinh phát hiện có tổn thƣơng ống dẫn trứng thì C.trachomatis đã gây biến chứng khó phục hồi. Vì vậy cần thiết phải có những phƣơng pháp chẩn đoán chính xác và phù hợp giúp phát hiện C.trachomatis nhằm ngăn chặn những hậu quả mà nó gây ra.

Ở nữ giới, vi khuẩn C.trachomatis có thể gây viêm âm đao, cổ tử cung và niệu đạo. Các biến chứng thƣờng gặp ở bệnh nhân nhiễm C.trachomatis mạn tính bao gồm: - Tắc vòi trứng ở phụ nữ: Một trong những nguyên nhân gây tắc vòi trứng là do viễm nhiễm ở vòi trứng, buồng trứng, dây chằng quanh tử cung vòi trứng do C. - Chửa ngoài tử cung: Nguyên nhân viêm nhiễm vòi trứng do C.trachomatis khiến phôi thai tắc ngay tại điểm hẹp. Phôi thai lớn dần lên, đến một mức nào đó sẽ phá vỡ các mạch máu nơi nó đậu lại trên vòi trứng, gây chảy máu dữ dội trong ổ bụng, có thể làm thai phụ tử vong nhanh chóng.

Nhiều thống kê cho thấy có tới 9% phụ nữ nhiễm C.trachomatis bị chửa ngoài tử cung. 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] - Viêm vùng chậu: Phần lớn, viêm vùng chậu do vi khuẩn lậu và C.trachomatis gây ra. Viêm vùng chậu là một bệnh thầm lặng, nhiều tác giả thống kê cho thấy có tới 40% phụ nữ nhiễm C.trachomatis bị viêm nhiễm vùng tiểu khung, trong số đó có 20% bị vô sinh làm ảnh hƣởng không nhỏ tới chất lƣợng cuộc sống.trachomatis có thể kết hợp cùng với HPV (Human papilloma virus) – một virus gây u nhú có khả năng đƣa đến ung thƣ cổ tử cung. Ở nam giới Ở nam giới triệu chứng lâm sàng của nhiễm C.trachomatis càng mờ nhạt hơn, biểu hiện đầu tiên là viêm niệu đạo có mủ mà giới chuyên khoa gọi là viêm niệu đạo không do lậu, sau đó có thể dẫn đến viêm mào tinh hoàn.

Tại túi tinh, vi khuẩn gây độc cho tinh trùng, làm giảm số lƣợng tinh trùng, đời sống tinh trùng ngắn lại, chất lƣợng giảm xuống. Đây chính là lý do gây vô sinh nam.trachomatis lây qua đƣờng tình dục nên nam giới nhiễm bệnh nếu không đƣợc phát hiện và điều trị sẽ là nguồn tái nhiễm cho bạn tình. Ngoài ra, một số nghiên cứu còn cho thấy C.trachomatis ở nam giới có khả năng bám vào tinh trùng và theo tinh trùng đi qua cổ tử cung lên ống dẫn trứng, giúp phát tán C.trachomatis trong vòi trứng của phụ nữ. Các xét nghiệm chẩn đoán vi khuẩn Chlamydia trachomatis [32] 1.

Nuôi cấy Để phát hiện C.trachomatis, ngƣời ta có thể dùng biện pháp nuôi cấy để chờ vi khuẩn gia tăng số lƣợng.trachomatis không phát triển ngoài tế bào sống đƣợc nên không thể nuôi cấy theo phƣơng pháp thƣờng dùng mà phải tiến hành nuôi cấy trên các tế bào nhƣ McCoy hoặc Hela 229, tế bào nhau thai. - Đối với bệnh mắt hột, ngƣời ta lấy nang bằng cách nạo các nang rồi cấy vào các tế bào nhau thai ngƣời để phát hiện các hạt vùi trong nguyên sinh chất của tế bào. - Đối với bệnh viêm sinh dục– tiết niệu: lấy mủ chất tiết niệu đạo (nam giới); chất tiết cổ tử cung, âm đạo (nữ giới) nuôi cấy trong môi trƣờng có chứa tế bào McCoy hoặc Hela 229 ở 370C- 5% CO2. Quan sát tính chất xâm nhiễm sau 48 giờ nuôi 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] cấy và phát hiện C.trachomatis bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang: ủ với kháng thể đánh dấu huỳnh quang đặc hiệu cho kháng nguyên vỏ lipopolysaccharide (LPS) hoặc protein màng (major outer membrane protein- MOMP).

Xét nghiệm này đƣợc đánh giá là tiêu chuẩn vàng trong nhóm xét nghiệm vì có độ đặc hiệu rất cao (100%), cho phép lƣu giữ vi khuẩn làm kháng sinh đồ phát hiện chủng kháng thuốc. Nhƣợc điểm của phƣơng pháp này là đòi hỏi thời gian dài, phải bảo đảm vi khuẩn còn sống trong quá trình vận chuyển đến phòng thí nghiệm, đội ngũ cán bộ thành thạo về nuôi cấy tế bào. Bên cạnh đó xét nghiệm này có độ nhạy thấp (70-85%), thấp hơn so với khuếch đại nucleic acid (nucleic acid amplification tests– NAATs) [32].