Luận văn thạc sĩ vnua nghiên cứu ứng dụng kĩ thuât nuôi cấy tế bào trên hệ thống microcarrier trong sản xuất vacxin tai xanh

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu vnua nghiên cứu ứng dụng kĩ thuât nuôi cấy tế bào trên hệ thống microcarrier trong sản xuất vacxin, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất

• Tác giả: Trần Thị Vân Anh
• Người hướng dẫn: PGS. Bùi Trần Anh Đào
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy tế bào trên hệ thống Microcarrier trong sản xuất vacxin Tai Xanh
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. Lời cam đoan
• 1.2. Mục lục
• 1.3. Danh mục chữ viết tắt
• 1.4. Danh mục bảng
• 1.5. Danh mục hình
• 1.6. Trích yếu luận văn
• 1.7. Thesis abstract
• 1.8. Tính cấp thiết của đề tài
• 1.9. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.10. Tổng quan tài liệu
• 1.10.1. Tổng quan nuôi cấy tế bào
• 1.10.2. Một số đặc điểm của tế bào động vật
• 1.10.3. Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy tế bào
• 1.10.4. Các loại môi trường nuôi cấy tế bào
• 1.10.5. Điều kiện nuôi cấy tế bào
• 1.10.6. Sự tạp nhiễm và cách hạn chế
• 1.10.7. Sự sinh trưởng của tế bào động vật trong nuôi cấy
• 1.10.8. Virus tai xanh
• 1.10.9. Hình thái và cấu trúc của virus PRRS
• 1.10.10. Đặc tính nuôi cấy virus Tai Xanh
• 1.10.11. Nuôi cấy virus tai xanh trên môi trường tế bào
• 1.10.12. Các dòng tế bào nuôi cấy thích hợp virus Tai Xanh
• 1.10.13. Nuôi cấy virus Tai Xanh trên môi trường tế bào Marc-145
• 1.10.14. Các yếu tố ảnh hưởng trong nuôi cấy tế bào và virus tai xanh
• 1.10.14.1. Bề mặt nuôi cấy
• 1.10.14.2. Yếu tố không khí môi trường xung quanh
• 1.10.15. Các hệ thống nuôi cấy tế bào
• 1.10.15.1. Hệ thống nuôi cấy tế bào hiện nay
• 1.10.15.2. Hệ thống Microcarrier
• 1.10.15.3. Bình nuôi cấy
• 1.10.15.4. Các loại hạt Cytodex
• 1.11. Vật liệu - phương pháp nghiên cứu
• 1.11.1. Nội dung nghiên cứu
• 1.11.2. Nghiên cứu quy trình nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier
• 1.11.3. Nghiên cứu tính thích ứng của virus Tai Xanh nuôi cấy trên tế bào Marc-145 bằng hệ thống Microcarrier
• 1.11.4. Nghiên cứu quy trình thu hoạch và xử lí dịch virus sau khi thu hoạch
• 1.11.5. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
• 1.11.5.1. Đối tượng nghiên cứu
• 1.11.5.2. Vật liệu nghiên cứu
• 1.11.5.3. Địa điểm nghiên cứu
• 1.11.5.4. Thời gian nghiên cứu
• 1.11.6. Phương pháp nghiên cứu
• 1.11.6.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào
• 1.11.6.2. Phương pháp gây nhiễm
• 1.11.6.3. Phương pháp thu hoạch
• 1.11.6.4. Phương pháp kiểm tra độ thuần khiết (TCVN8684:2011)
• 1.11.6.5. Phương pháp xác định chỉ số TCID50
• 1.11.6.6. Phương pháp xử lý số liệu
• 1.12. Kết quả và thảo luận
• 1.12.1. Nghiên cứu quy trình nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier
• 1.12.1.1. Xác định tốc độ khuấy thích hợp để nuôi tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier
• 1.12.1.2. Xác định giá trị DO thích hợp để nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier
• 1.12.1.3. Xác định lưu lượng khí cấp vào thích hợp để nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier
• 1.12.1.4. Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp cho tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier
• 1.12.1.5. Xác định lượng tế bào Marc-145 cấy vào hạt Cytodex trên hệ thống Microcarrier
• 1.12.2. Nghiên cứu tính thích ứng của virus tai xanh nuôi cấy trên tế bào Marc-145 bằng hệ thống Microcarrier
• 1.12.2.1. Xác định thời gian hấp phụ virus vào tế bào, xử lí dịch hấp phụ virus
• 1.12.2.2. Xác định môi trường duy trì sau gây nhiễm virus
• 1.12.2.3. Xác định liều gây nhiễm, thời gian thu hoạch virus thích hợp
• 1.12.3. Nghiên cứu quy trình thu hoạch-thu dồn dịch virus tai xanh
• 1.13. Kết luận và kiến nghị
• Tài liệu tham khảo

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào trên microcarrier

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào trên microcarrier trong sản xuất vaccine tai xanh đang trở thành một trong những lĩnh vực quan trọng trong ngành thú y. Kỹ thuật này không chỉ giúp nâng cao năng suất sản xuất vaccine mà còn đảm bảo chất lượng và hiệu quả trong việc phòng chống dịch bệnh. Việc áp dụng công nghệ nuôi cấy tế bào trên microcarrier cho phép sản xuất vaccine với quy mô lớn, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường.

1.1. Khái niệm về nuôi cấy tế bào và microcarrier

Nuôi cấy tế bào là quá trình duy trì và phát triển tế bào ngoài cơ thể sống. Microcarrier là các hạt nhỏ được sử dụng để hỗ trợ sự phát triển của tế bào trong môi trường lỏng, giúp tăng cường hiệu quả nuôi cấy và thu hoạch tế bào.

1.2. Lợi ích của việc sử dụng microcarrier trong sản xuất vaccine

Việc sử dụng microcarrier trong sản xuất vaccine tai xanh mang lại nhiều lợi ích như tăng cường khả năng bám dính của tế bào, giảm thiểu tạp nhiễm và nâng cao hiệu suất thu hoạch virus. Điều này giúp giảm chi phí sản xuất và thời gian sản xuất vaccine.

II. Thách thức trong sản xuất vaccine tai xanh bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào

Mặc dù có nhiều lợi ích, nhưng việc sản xuất vaccine tai xanh bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào trên microcarrier cũng gặp phải nhiều thách thức. Các vấn đề như tạp nhiễm, điều kiện nuôi cấy không ổn định và sự phát triển không đồng đều của tế bào là những yếu tố cần được giải quyết.

2.1. Vấn đề tạp nhiễm trong nuôi cấy tế bào

Tạp nhiễm là một trong những vấn đề nghiêm trọng trong nuôi cấy tế bào. Việc kiểm soát tạp nhiễm từ môi trường nuôi cấy và thiết bị là rất cần thiết để đảm bảo chất lượng sản phẩm cuối cùng.

2.2. Điều kiện nuôi cấy không ổn định

Điều kiện nuôi cấy như pH, nhiệt độ và nồng độ oxy hòa tan cần được kiểm soát chặt chẽ. Sự thay đổi đột ngột có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của tế bào và hiệu suất sản xuất vaccine.

III. Phương pháp nuôi cấy tế bào trên microcarrier hiệu quả

Để đạt được hiệu quả cao trong sản xuất vaccine tai xanh, việc áp dụng các phương pháp nuôi cấy tế bào trên microcarrier là rất quan trọng. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy có thể nâng cao đáng kể năng suất và chất lượng sản phẩm.

3.1. Quy trình nuôi cấy tế bào Marc 145

Quy trình nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống microcarrier bao gồm các bước như chuẩn bị môi trường nuôi cấy, cấy tế bào và theo dõi sự phát triển của tế bào. Tốc độ khuấy và nồng độ oxy hòa tan là những yếu tố quan trọng cần được điều chỉnh.

3.2. Kỹ thuật thu hoạch virus tai xanh

Kỹ thuật thu hoạch virus tai xanh từ tế bào nuôi cấy trên microcarrier cần được thực hiện một cách cẩn thận để đảm bảo hiệu giá virus cao nhất. Việc xác định thời gian thu hoạch và điều kiện môi trường là rất quan trọng.

IV. Ứng dụng thực tiễn của vaccine tai xanh sản xuất từ kỹ thuật nuôi cấy tế bào

Vaccine tai xanh sản xuất từ kỹ thuật nuôi cấy tế bào trên microcarrier đã được áp dụng thành công trong thực tiễn. Các nghiên cứu cho thấy vaccine này có hiệu quả cao trong việc phòng chống bệnh tai xanh ở lợn, giúp giảm thiểu thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi.

4.1. Hiệu quả phòng bệnh của vaccine tai xanh

Vaccine tai xanh sản xuất từ kỹ thuật nuôi cấy tế bào đã cho thấy khả năng phòng bệnh hiệu quả, giúp giảm tỷ lệ mắc bệnh và thiệt hại cho đàn lợn. Nghiên cứu cho thấy vaccine này có thể giảm thời gian tồn tại của virus trong cơ thể lợn.

4.2. Tác động kinh tế từ việc sử dụng vaccine

Việc sử dụng vaccine tai xanh không chỉ giúp bảo vệ sức khỏe đàn lợn mà còn mang lại lợi ích kinh tế cho người chăn nuôi. Giảm thiểu thiệt hại do dịch bệnh giúp tăng cường sản lượng và chất lượng thịt lợn.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào trên microcarrier trong sản xuất vaccine tai xanh mở ra nhiều triển vọng cho ngành thú y. Việc phát triển công nghệ này không chỉ giúp nâng cao năng suất sản xuất mà còn đảm bảo chất lượng vaccine, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường.

5.1. Tương lai của công nghệ nuôi cấy tế bào

Công nghệ nuôi cấy tế bào trên microcarrier có tiềm năng lớn trong việc sản xuất vaccine cho nhiều loại bệnh khác nhau. Nghiên cứu và phát triển công nghệ này sẽ giúp nâng cao hiệu quả phòng bệnh trong ngành chăn nuôi.

5.2. Định hướng nghiên cứu tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất vaccine, giảm thiểu chi phí và nâng cao hiệu quả. Việc áp dụng công nghệ mới và cải tiến quy trình sản xuất sẽ là chìa khóa để đáp ứng nhu cầu thị trường.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Dịch sốt đỏ hay hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) là một trong những dịch bệnh truyền nhiễm nguy hiểm hàng đầu trong ngành chăn nuôi, gây thiệt hại kinh tế ước tính hàng trăm tỷ đồng mỗi năm tại Việt Nam. Mặc dù các loại vacxin nhập ngoại đã được đưa vào sử dụng, chi phí đắt đỏ cùng sự biến đổi di truyền phức tạp của các chủng virus nội địa đặt ra yêu cầu cấp thiết về việc tự chủ sản xuất vacxin trong nước. Phương pháp sản xuất vacxin nhược độc truyền thống trên các hệ thống nuôi cấy tĩnh như chai T-flask (T225cm2) hoặc chai nhiều tầng bộc lộ nhiều hạn chế về năng suất. Cụ thể, để thu được 10 lít nguyên dịch virus, quy trình thủ công đòi hỏi tới 200 chai T225cm2, gây tốn kém diện tích phòng ấm, tiêu hao vật tư sử dụng một lần và tiềm ẩn rủi ro tạp nhiễm vi sinh vật rất cao.

Trước thực tế đó, nghiên cứu được triển khai nhằm chuẩn hóa quy trình công nghệ nuôi cấy dòng tế bào Marc-145 và quy trình nhân giống virus PRRS trên hệ thống bioreactor Microcarrier quy mô 10 lít. Đề tài được thực hiện tại Phòng Tế bào thuộc Trung tâm Nghiên cứu - Công ty TNHH Dược Hanvet (Khu công nghiệp Phố Nối A, Hưng Yên) phối hợp cùng Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam trong thời gian từ tháng 06/2018 đến tháng 05/2019.

Mục tiêu trọng tâm của nghiên cứu là xác định bộ thông số vận hành tối ưu (tốc độ khuấy, nồng độ oxy hòa tan DO, lưu lượng cấp khí, tỷ lệ hạt mang và mật độ tế bào đầu vào), đồng thời thiết lập các điều kiện cảm nhiễm virus để thu được hiệu giá kháng nguyên cao. Kết quả nghiên cứu đóng vai trò là bước đột phá công nghệ, nâng tỷ suất sinh sản tế bào lên 42 lần và tạo ra nguyên dịch virus đạt hiệu giá từ 10^7,2 đến 10^7,5 TCID50/ml, làm tiền đề vững chắc cho việc công nghiệp hóa sản xuất các dòng vacxin thú y vô trùng tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên lý thuyết động học tăng trưởng tế bào động vật có vú trên giá thể vi mang (Microcarrier) và cơ chế sinh học phân tử của quá trình nhân lên của virus PRRS. Hệ thống vi mang sử dụng hạt Cytodex-1 (cấu tạo từ hạt dextran tích điện dương với nhóm N,N-diethylaminoethyl) cung cấp diện tích bề mặt tiếp xúc cực lớn lên tới 4.400 cm2/g, cho phép tế bào bám dính và phát triển dạng huyền phù mật độ cao trong môi trường dinh dưỡng chuyển động liên tục. Động học sinh trưởng của tế bào động vật trải qua 4 pha tiêu chuẩn: pha tiềm phát (Lag phase), pha số mũ (Log phase), pha cân bằng (Stationary phase) và pha suy vong (Death phase).

Về mặt virus học, PRRSV là virus ARN chuỗi đơn dương thuộc họ Arteriviridae. Cơ chế xâm nhập của virus vào tế bào Marc-145 diễn ra qua quá trình nhập bào thông qua thụ thể vimentin. Bộ gen mã hóa 9 khung đọc mở (ORF), trong đó protein GP5 (25 kDa) và protein N (19 kDa) đóng vai trò trung tâm tạo đáp ứng miễn dịch và kích hoạt quá trình chết theo chương trình (apoptosis) của tế bào chủ. Quá trình này tạo nên bệnh tích tế bào đặc trưng (CPE - Cyto Pathogenic Effect), biểu hiện qua hiện tượng co tròn, thoái hóa nhân và bong tróc thảm tế bào. Hiệu lực gây nhiễm được định lượng thông qua chỉ số liều gây nhiễm 50% mô nuôi cấy (TCID50) và bội số nhiễm (MOI - Multiplicity of Infection).

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng giống tế bào chuẩn Marc-145 (Working Cell Bank) và chủng virus PRRS nhược độc Hanvet1.vn (Product Seed) có hiệu giá ban đầu 10^7,0 TCID50/ml. Cỡ mẫu nghiên cứu được thiết kế với 3 lần lặp lại độc lập (n=3) cho từng biến số thực nghiệm nhằm đảm bảo tính lặp lại và độ tin cậy thống kê. Phương pháp đếm tế bào sống sử dụng buồng đếm hồng cầu kết hợp thuốc nhuộm Trypan Blue theo tiêu chuẩn TCVN 4884-2:2015, thu thập dữ liệu trên 8 ô đếm thuộc 2 vùng đo.

Quy trình phân lập và nuôi cấy virus tuân thủ nghiêm ngặt tiêu chuẩn TCVN 8400-21:2014. Chỉ số TCID50 được xác định bằng phương pháp chuẩn độ sinh học trên đĩa 96 giếng và tính toán theo công thức Karber - Spearman. Độ thuần khiết và tính vô trùng của nguyên dịch vacxin sau thu hoạch được kiểm định toàn diện theo tiêu chuẩn TCVN 8684:2011, bao gồm kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn trên môi trường thioglycollate, trypticase đậu tương, thạch máu (theo dõi 7-10 ngày), kiểm tra nấm mốc trên thạch Sabouraud (theo dõi 14 ngày) và kiểm tra Mycoplasma trên canh thang và đĩa thạch PPLO (theo dõi 14-28 ngày). Toàn bộ dữ liệu định lượng được phân tích phương sai (ANOVA) và tính độ lệch chuẩn bằng phần mềm Minitab 16 và Microsoft Excel 2010.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình tối ưu hóa các thông số kỹ thuật nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier 10 lít đã mang lại các phát hiện cốt lõi sau:

• Tốc độ khuấy và kiểm soát tạo bọt: Tốc độ khuấy 60 vòng/phút (rpm) được xác định là tối ưu nhất. Ở dải tốc độ thấp 20-40 rpm, hạt Cytodex bị lắng nhanh xuống đáy bình, khiến độ bám tế bào sau 96 giờ chỉ đạt 80-90%. Ở tốc độ 80 rpm, lực cắt cơ học mạnh làm môi trường bị tạo bọt nghiêm trọng và tế bào phân bố không đồng đều. Tại 60 rpm, môi trường hoàn toàn không tạo bọt, hạt duy trì lơ lửng lý tưởng và tế bào phủ kín 100% diện tích bề mặt hạt sau 72-96 giờ.
• Nồng độ oxy hòa tan (DO) và lưu lượng cấp khí: Thiết lập DO ở mức 50% giúp tế bào phát triển vượt trội. Sau 72 giờ nuôi, tỷ suất sinh sản tế bào tại DO 50% đạt 22,2 ± 0,41 lần (tăng từ 750x10^6 lên 16.653x10^6 tế bào), cao hơn đáng kể so với mức 12,6 ± 0,63 lần ở DO 20% và 13,2 ± 0,84 lần ở DO 30%. Lưu lượng khí hỗn hợp (O2, N2, CO2, không khí) ở mức 0,25 - 0,5 lít/phút giúp ổn định DO và pH (7,2 ± 0,2) chỉ sau 3 giờ 50 phút mà không gây bọt trào.
• Môi trường sinh trưởng và mật độ tế bào đầu vào: Môi trường MEM bổ sung 5% FBS cho tỷ suất nhân tế bào đạt 30-31 lần, vượt trội hơn so với môi trường M199 (20-22 lần), DMEM (17-18 lần) và LH (17-18 lần). Mật độ cấy đầu vào tối ưu là 15x10^6 tế bào trên 1,5 gam hạt Cytodex (tương đương 300x10^6 tế bào/30g Cytodex trong 10 lít môi trường), đem lại hệ số nhân cực đại lên đến 42 lần sau 72-96 giờ.
• Quy trình nhân dòng và thu hoạch virus PRRS: Điều kiện sản xuất virus đạt đỉnh khi sử dụng liều gây nhiễm 0,01 MOI trong môi trường duy trì MEM bổ sung 1% FBS, thời gian hấp phụ 60 phút (không hút bỏ dịch hấp phụ). Thu hoạch sau 72 giờ gây nhiễm khi bệnh tích tế bào hủy hoại đạt trên 95% kết hợp phương pháp đông tan 1 chu kỳ cho hiệu giá virus cao nhất, đạt từ 10^7,2 đến 10^7,5 TCID50/ml.

Thảo luận kết quả

Khả năng sinh trưởng vượt bậc của tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier bắt nguồn từ việc hạt Cytodex-1 cung cấp diện tích bề mặt riêng cực lớn (4.400 cm2/g), kết hợp với hệ thống cảm biến tự động duy trì liên tục độ pH 7,2 và mức DO 50%. Nhờ đó, môi trường vi mô luôn được cung cấp đủ dưỡng chất đồng đều, loại bỏ hiện tượng thiếu hụt oxy cục bộ vốn thường gặp trong các bình nuôi cấy tĩnh truyền thống.

Các dữ liệu thực nghiệm về động học sinh trưởng có thể được minh họa trực quan thông qua đồ thị đường cong phát triển tế bào theo thời gian (24h, 48h, 72h, 96h) và biểu đồ cột so sánh tỷ suất nhân giữa các công thức môi trường. Đồ thị cho thấy tế bào bước vào pha logarit mạnh nhất trong khoảng 48-72 giờ trước khi đạt pha cân bằng ở 96 giờ.

Khi so sánh với các nghiên cứu nuôi cấy cổ điển trên chai T-flask (vốn chỉ đạt hiệu giá virus khoảng 10^6,5 - 10^7,0 TCID50/ml), việc ứng dụng hệ thống Microcarrier kín 10 lít không chỉ tăng hiệu giá kháng nguyên thêm 0,5 - 0,7 log mà còn loại bỏ hoàn toàn nguy cơ nhiễm chéo vi sinh vật. Toàn bộ các lô nguyên dịch sau thu hoạch đều vượt qua các thử nghiệm vô trùng khắt khe theo tiêu chuẩn TCVN 8684:2011, không phát hiện vi khuẩn, nấm mốc hay Mycoplasma. Kết quả này hoàn toàn tương thích với các báo cáo công nghệ sinh học quốc tế về nuôi cấy tế bào động vật của GE Healthcare.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm hoàn thiện và mở rộng khả năng thương mại hóa công nghệ nuôi cấy vi mang trong sản xuất sinh phẩm thú y, các giải pháp cụ thể được đề xuất như sau:

• Chuẩn hóa và nâng quy mô sản xuất (Scale-up): Đội ngũ R&D và quản lý sản xuất tại các nhà máy dược thú y cần tiến hành nâng cấp quy trình từ dung tích 10 lít hiện tại lên quy mô bioreactor 50 - 100 lít. Mục tiêu duy trì ổn định hiệu giá kháng nguyên trên 10^7,5 TCID50/ml trong thời gian triển khai từ 6 đến 12 tháng.
• Tối ưu hóa chi phí môi trường dinh dưỡng: Bộ phận công nghệ sinh học cần đẩy mạnh thử nghiệm giảm dần tỷ lệ huyết thanh thai bò (FBS) từ 5% xuống 2-3%, hoặc nghiên cứu ứng dụng môi trường không huyết thanh (serum-free media). Giải pháp này hướng tới mục tiêu cắt giảm 15 - 20% chi phí nguyên liệu sản xuất trong vòng 18 tháng tới.
• Tự động hóa hệ thống kiểm soát quy trình: Ban kỹ thuật cơ điện tử cần tích hợp hệ thống điều khiển giám sát và thu thập dữ liệu tự động (SCADA) đa điểm cho các sensor pH, DO và lưu lượng khí, đảm bảo độ trễ phản hồi dưới 1 giây nhằm kiểm soát chất lượng mẻ nuôi theo chuẩn cGMP-WHO trước quý IV năm tiếp theo.
• Mở rộng danh mục vacxin ứng dụng vi mang: Các viện nghiên cứu thú y và doanh nghiệp sản xuất sinh phẩm cần áp dụng quy trình vi mang trên nền tế bào Marc-145 và Vero để sản xuất các loại vacxin virus quan trọng khác như dịch tả lợn cổ điển, Parvovirus và Newcastle trong lộ trình 2-3 năm tới.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và số liệu thực nghiệm trong luận văn mang lại giá trị thực tiễn cao cho 4 nhóm đối tượng chuyên môn:

• Kỹ sư công nghệ sinh học và chuyên viên R&D dược phẩm: Nắm bắt chính xác các thông số kỹ thuật chi tiết (tốc độ khuấy 60 rpm, DO 50%, tỷ lệ hạt Cytodex 3g/lít, liều nhiễm 0,01 MOI) để áp dụng trực tiếp vào việc thiết kế, vận hành và tối ưu hóa hệ thống bioreactor nuôi cấy tế bào động vật.
• Ban lãnh đạo và quản lý sản xuất tại các doanh nghiệp vacxin: Có được cơ sở dữ liệu kinh tế - kỹ thuật rõ ràng để chuyển đổi mô hình từ nuôi cấy tĩnh sang nuôi cấy động, giúp thay thế hàng trăm chai T-flask bằng một bình nuôi kín 10 lít, tiết kiệm 60% diện tích mặt bằng phòng sạch và giảm thiểu chi phí nhân công.
• Học viên cao học, nghiên cứu sinh ngành Thú y và Vi sinh vật học: Sử dụng tài liệu như một cẩm nang phương pháp luận chuẩn mực về quy trình phân lập virus theo TCVN 8400-21:2014, phương pháp chuẩn độ TCID50 theo Spearman - Karber và các kỹ thuật kiểm tra độ thuần khiết theo TCVN 8684:2011.
• Chuyên gia kiểm định và đảm bảo chất lượng (QA/QC): Tham khảo quy trình kiểm soát chất lượng nguyên dịch vacxin bán thành phẩm, xây dựng hồ sơ thẩm định quy trình sản xuất đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn thực hành tốt sản xuất thuốc của Tổ chức Y tế Thế giới (GMP-WHO).

Câu hỏi thường gặp

Hệ thống Microcarrier mang lại ưu thế vượt trội gì so với nuôi cấy tĩnh truyền thống? Hệ thống Microcarrier sử dụng hạt vi mang Cytodex-1 với diện tích bề mặt lên tới 4.400 cm2/g, cho phép một bình nuôi kín dung tích 10 lít thay thế hoàn toàn 200 chai T225cm2. Nhờ hệ thống tự động kiểm soát DO, pH và cấp khí kín, rủi ro tạp nhiễm vi sinh vật giảm triệt để, đồng thời nâng cao hiệu giá virus thêm 0,5 - 0,7 log TCID50/ml so với phương pháp thủ công.

Vì sao tốc độ khuấy 60 vòng/phút và DO 50% là thông số vận hành lý tưởng? Tại 60 vòng/phút, dòng thủy lực vừa đủ để giữ hạt vi mang lơ lửng mà không tạo bọt hay gây lực cắt cơ học làm rách màng tế bào. Mức DO 50% cung cấp đầy đủ dưỡng khí cho quá trình hô hấp tế bào, giúp mật độ tế bào Marc-145 tăng trưởng mạnh gấp 22,2 lần sau 72 giờ nuôi, cao gần gấp đôi so với mức DO 20%.

Môi trường nuôi cấy nào mang lại hiệu quả tăng sinh tế bào Marc-145 cao nhất? Môi trường MEM bổ sung 5% FBS đem lại tỷ suất nhân tế bào cao nhất, đạt 30-31 lần sau 72-96 giờ nuôi cấy. Kết quả này vượt trội hơn hẳn so với môi trường M199 (20-22 lần) cũng như môi trường DMEM và LH (chỉ đạt 17-18 lần), đáp ứng hoàn hảo yêu cầu tạo thảm tế bào đơn lớp kín trên bề mặt hạt mang.

Điều kiện cảm nhiễm và thu hoạch nào cho hiệu giá virus PRRS tối ưu? Hiệu giá virus đạt mức cao nhất từ 10^7,2 đến 10^7,5 TCID50/ml khi sử dụng liều gây nhiễm 0,01 MOI trong môi trường MEM 1% FBS, thời gian hấp phụ 60 phút (không hút bỏ dịch hấp phụ). Thời điểm thu hoạch chuẩn xác là 72 giờ sau nhiễm khi tỷ lệ hủy hoại tế bào đạt trên 95%, kết hợp kỹ thuật đông tan 1 lần.

Quy trình kiểm soát độ thuần khiết của dịch vacxin được thực hiện ra sao? Nguyên dịch virus sau thu hoạch được kiểm tra vô trùng nghiêm ngặt theo tiêu chuẩn TCVN 8684:2011. Mẫu dịch được cấy trên môi trường thioglycollate, trypticase đậu tương và thạch máu để phát hiện vi khuẩn (7-10 ngày), thạch Sabouraud để kiểm tra nấm mốc (14 ngày), cùng môi trường thạch và canh thang PPLO để loại trừ Mycoplasma (14-28 ngày).

Kết luận

• Đã xây dựng thành công quy trình nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier 10 lít với các thông số chuẩn: tốc độ khuấy 60 rpm, DO 50%, lưu lượng khí cấp 0,25 - 0,5 lít/phút và môi trường MEM bổ sung 5% FBS.
• Xác định mật độ cấy giống tối ưu là 300x10^6 tế bào trên 30 gam hạt Cytodex-1 cho bình 10 lít, giúp tỷ suất nhân tế bào đạt mức kỷ lục 42 lần sau 72-96 giờ nuôi, tạo thảm tế bào bao phủ 100% bề mặt hạt.
• Thiết lập hoàn chỉnh quy trình sản xuất virus PRRS nhược độc với liều cảm nhiễm 0,01 MOI trong môi trường MEM 1% FBS, thời gian hấp phụ 60 phút và thu hoạch sau 72 giờ.
• Hiệu giá nguyên dịch kháng nguyên đạt mức cao vượt trội từ 10^7,2 đến 10^7,5 TCID50/ml, đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn kiểm tra độ thuần khiết và vô trùng theo TCVN 8684:2011.
• Khẳng định tính khả thi của việc ứng dụng công nghệ vi mang quy mô công nghiệp trong sản xuất vacxin thú y tại Việt Nam, mở ra hướng đi tự chủ nguồn sinh phẩm chất lượng cao với giá thành cạnh tranh.

Trong giai đoạn tiếp theo (2020-2022), nhóm nghiên cứu dự kiến mở rộng thử nghiệm trên các hệ thống bioreactor công suất 50 - 100 lít và hoàn thiện hồ sơ đăng ký lưu hành vacxin PRRS công nghệ vi mang. Các đơn vị sản xuất, nhà nghiên cứu và doanh nghiệp quan tâm có thể liên hệ hợp tác chuyển giao công nghệ để cùng thúc đẩy ngành sinh phẩm thú y nước nhà phát triển bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN THỊ VÂN ANH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO TRÊN HỆ THỐNG MICROCARRIER TRONG SẢN XUẤT VACXIN TAI XANH Ngành: Thú y Mã số: 8640101 Người hướng dẫn khoa học: PGS.Bùi Trần Anh Đào TS. Bùi Thị Tố Nga NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày tháng Năm 2019 Tác giả luận văn Trần Thị Vân Anh i LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CẢM ƠN Cho đến nay tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Nhân dịp này tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc tới các thầy, cô giáo. Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất của mình đến thầy cô hướng dẫn: PSG. Bùi Trần Anh Đào và TS.

Bùi Thị Tố Nga bộ môn Bệnh lý - Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, người đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị em bạn bè đồng nghiệp công ty TNHH Dược Hanvet đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Cuối cùng xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, các anh, chị em những người luôn động viên, giúp đỡ tôi để tôi hoàn thành tốt luận văn này. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng Năm 2019 Tác giả luận văn Trần Thị Vân Anh ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] MỤC LỤC Lời cam đoan.

ii Mục lục. iii Danh mục chữ viết tắt. vi Danh mục bảng. vii Danh mục hình.

viii Trich yêu luân văn. ix Thesis abstract. Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu nghiên cứu.

Tổng quan tài liệu. Tổng quan nuôi cấy tế bào. Một số đặc điểm của tế bào động vật. Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy tế bào.

Các loại môi trường nuôi cấy tế bào. Điều kiện nuôi cấy tế bào. Sự tạp nhiễm và cách hạn chế. Sự sinh trưởng của tế bào động vật trong nuôi cấy.

Virus tai xanh. Hình thái và cấu trúc của virus PRRS. Đặc tính nuôi cấy virus Tai Xanh. Nuôi cấy virus tai xanh trên môi trường tế bào.

Các dòng tế bào nuôi cấy thích hợp virus Tai Xanh. Nuôi cấy virus Tai Xanh trên môi trường tế bào Marc-145. Các yếu tố ảnh hưởng trong nuôi cấy tế bào và virus tai xanh. Bề mặt nuôi cấy.

Yếu tố không khí môi trường xung quanh. 13 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Các hệ thống nuôi cấy tế bào. Hệ thống nuôi cấy tế bào hiện nay.

Hệ thống Microcarrier. Bình nuôi cấy. Các loại hạt Cytodex. Vật liệu- phƣơng pháp nghiên cứu.

Nội dung nghiên cứu. Nghiên cứu quy trình nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier. Nghiên cứu tính thích ứng của virus Tai Xanh nuôi cấy trên tế bào Marc-145 bằng hệ thống Microcarrier. Nghiên cứu quy trình thu hoạch và xử lí dịch virus sau khi thu hoạch.

Đối tượng và vật liệu nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu. Địa điểm nghiên cứu.

Thời gian nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp nuôi cấy tế bào. Phương pháp gây nhiễm.

Phương pháp thu hoạch. Phương pháp kiểm tra độ thuần khiết (TCVN8684:2011). Phương pháp xác định chỉ số TCID50. Phương pháp xử lý số liệu.

Kết quả và thảo luận. Nghiên cứu quy trình nuôi cấy tế bào marc-145 trên hệ thống microcarrier. Xác định tốc độ khuấy thích hợp để nuôi tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier. Xác định giá trị DO thích hợp để nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier.

Xác định lưu lượng khí cấp vào thích hợp để nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier. 34 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp cho tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier. Xác định lượng tế bào Marc-145 cấy vào hạt Cytodex trên hệ thống Microcarrier.

Nghiên cứu tính thích ứng của virus tai xanh nuôi cấy trên tế bào marc-145 bằng hệ thống microcarrier. Xác định thời gian hấp phụ virus vào tế bào, xử lí dịch hấp phụ virus. Xác định môi trường duy trì sau gây nhiễm virus. Xác định liều gây nhiễm, thời gian thu hoạch virus thích hợp.

Nghiên cứu quy trình thu hoạch-thu dồn dịch virus tai xanh. Kết luận và kiến nghị. 51 Tài liệu tham khảo. 55 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt CPE Cyto Pathogenic Effect DMEM Dulbecco’s Modified MEM Medium DO Dissolved Oxygen EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid FBS Fetal Bovine Serum LH Lactalbumin Hydrolysate M199 Medium 199 MEM Minimum essential medium MOI Multiplicity of infection PBS Phosphate Buffered Saline pH Hydrogen power PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus TCID50 50% Tisue culture infective dose TE Trypsin – EDTA vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC BẢNG Bảng 2.

Protein cấu trúc của PRRSV. Kết quả theo dõi điều chỉnh tốc độ khuấy. Mức độ bám tế bào Marc-145 vào hạt Cytodex ở các giá trị DO khác nhau. Tỉ suất sinh sản tế bào Marc-145 sau 72 giờ nuôi.

Kết quả điều chỉnh lưu lượng khí cấp vào môi trường nuôi. Khả năng bám và phát triển tế bào Marc-145 trên các loại môi trường. Số lượng tế bào Marc-145 nuôi sau 72 giờ và 96 giờ nuôi. Khả năng gây bệnh tích tế bào trong thời gian hấp phụ virus.

Kết quả hiệu giá xác định thời gian hấp phụ virus vào tế bào. Khả năng gây bệnh tích tế bào trên các môi trường. Hiệu giá virus tìm môi trường sau gây nhiễm. Kết quả theo dõi mức độ thể hiện CPE ở các liều gây nhiễm.

Kết quả xác định hiệu giá virus của các liều gây nhiễm (MOI). Kết quả xác định hiệu giá virus thu dồn kháng nguyên Tai Xanh (log10TCID50/ml).14: Kết quả kiểm tra vô trùng nguyên dịch Tai Xanh. 49 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC HÌNH Hình 2. Hình thái virus PRRS.

Cấu trúc bộ gen của PRRSV. Hình thái tế bào Marc-145 sau 72 giờ nuôi trên hệ thống Tflask. Bệnh tích tế bào sau 54-72 giờ nhiễm virus Tai Xanh. Chai nuôi tế bào Tfask.

Hệ thống nuôi chai lăn. Hệ thống nuôi cấy Microcarrier. Tế bào Marc-145 bám trên hạt Cytodex. Mô hình nhân số lượng tế bào cho nuôi cấy trên hệ thống Microcarrier.

Buồng đếm tế bào. Cân chỉnh điện cực pH. Cân chỉnh điện cứu DO. (1) Bình nuôi có bọt, (2) bình nuôi cấy không có bọt.

Lấy mẫu theo dõi năng suất nhân tế bào Marc-145. Hệ thống khí đi vào hệ thống Microcarrier. Tỉ suất sinh sản tế bào Marc-145 ở các môi trường nuôi. Tỉ xuất nhân tế bào Marc-145 khi đầu vào tế bào khác nhau.

Mức độ bám tế bào Marc-145 trên hạt Cytodex. Bệnh tích tế bào 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ sau gây nhiễm virus Tai xanh. Đồ thị sinh trưởng và phát triển virus Tai Xanh. Hạt Cytodex sau quá trình thu hoạch virus Tai Xanh.

49 viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Trần Thị Vân Anh Tên luâ ̣n văn: “Nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy tế bào trên hệ thống Microcarrier trong sản xuất vacxin Tai Xanh” Ngành: Thú y Mã số: 8640101 Tên cơ sở đào ta ̣o: Học Viê ̣n Nông Nghiê ̣p Viê ̣t Nam Mục tiêu nghiên cứu - Xây dựng quy trình nuôi tế bào Marc-145 và quy trình sản xuất nguyên dịch Tai Xanh trên hệ thống Microcarrier theo quy mô công nghiệp, - Tiền đề để áp dụng các quy trình sản xuất nguyên dịch khác trong sản xuất vacxin động vật trên tế bào. Phƣơng pháp nghiên cứu Phương pháp nuôi cấy tế bào Marc-145 và phân lập virus Tai Xanh theo TCVN 8400-21:2014. Lấy mẫu và đếm số tế bào theo TCVN 4884-2:2015 Phương pháp kiểm tra độ thuần khiết theo TCVN 8684:2011 Phương pháp xác định chỉ số TCID50 theo phương pháp Spearman và Karber. Số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm Excel 2010 và Minitap 16.

Kết quả chính và kết luận 1.Xây dựng được quy trình nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier. Tốc độ khuấy 60 vòng/phút, tế bào bám hạt sau 24h, phát triển 90-100% sau 72-96h, môi trường nuôi không tạo bọt; giá trị DO=50% tế bào phát triển tốt nhất; Lưu lượng khí 0,25-0,5 lít/phút sau 3 giờ 50 phút ổn định được giá trị DO và pH môi trường; môi trường MEM 5% FBS và tế bào đầu vào 300x106/30gram hạt Cytodex nuôi 10 lít môi trường là tốt nhất.Xây dựng được quy trình sản xuất virus Tai Xanh trên hệ thống Microcarrier sử dụng liều gây nhiễm 0,01MOI; môi trường nhiễm là MEM 1% FBS ; hấp phụ virut 60 phút, dịch hấp phụ không hút bỏ, thu hoạch virus sau 72 giờ cho hiệu giá virut 107,2- 107,5TCID50/ml.Quá trình thu hoạch virus đông tan 1 lần cho hiệu giá virus cao nhất. ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] THESIS ABSTRACT Master candidate: Tran Thi Van Anh Thesis title: “Study on the application of cell culture techniques on Microcarrier system in the production of porcine reproductive and respiratory syndrome vaccines”. Major: Veterinary Medicine Code: 8640101 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives - Building the Marc-145 cell culture process and the production process of PRRSV fluid on Microcarrier system by industrial scale.

-The premise to apply other original production processes in the production of animal vaccines on cells. Materials and Methods - Marc-145 cell-cultured and PRRSV isolated by TCVN 8400-21:2014. - Sampled and cell counted by TCVN 4884-2:2015 - Purity tested by TCVN 8684:2011 - Determined index TCID50 by Spearman and Karber. - Data analyzed by Excel 2010 software and Minitab 16.

Main findings and conclusions 1.Constructed the procedure of Marc-145 cell culture on Microcarrier system. Stirred speed 60 rpm, cells grow after 24 hours, grow 90-100% after 72-96 hours, the culture medium was not foam; DO = 50% indicates the best cell growth, The DO and pH were stable with an airflow of 0.5 liters/minute after 3 hours 50 minutes.; The suitable culture medium was MEM 5%FBS and 300x106 cell/30gram Cytodex.