Nghiên Cứu Ứng Dụng Kỹ Thuật Nuôi Cấy Tế Bào Microcarrier Trong Sản Xuất Vaccine Tai Xanh

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào trên hệ thống microcarrier trong sản xuất vắc xin tai xanh, mở ra hướng đi mới cho y học.

• Tác giả: Trần Thị Vân Anh
• Người hướng dẫn: PGS. Bùi Trần Anh Đào
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên Cứu Ứng Dụng Kỹ Thuật Nuôi Cấy Tế Bào Microcarrier Trong Sản Xuất Vaccine Tai Xanh
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
• 3. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 3.1. TỔNG QUAN NUÔI CẤY TẾ BÀO
• 3.2. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
• 3.3. THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TẾ BÀO
• 3.4. CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TẾ BÀO
• 3.5. ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY TẾ BÀO
• 3.6. SỰ TẠP NHIỄM VÀ CÁCH HẠN CHẾ
• 4. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 4.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
• 4.2. NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NUÔI CẤY TẾ BÀO MARC-145 TRÊN HỆ THỐNG MICRO CARRIER
• 4.2.1. XÁC ĐỊNH TỐC ĐỘ KHUẤY THÍCH HỢP ĐỂ NUÔI TẾ BÀO MARC-145 TRÊN HỆ THỐNG MICRO CARRIER
• 4.2.2. XÁC ĐỊNH GIÁ TRỊ DO THÍCH HỢP ĐỂ NUÔI CẤY TẾ BÀO MARC-145 TRÊN HỆ THỐNG MICRO CARRIER
• 4.2.3. XÁC ĐỊNH LƯU LƯỢNG KHÍ CẤP VÀO THÍCH HỢP ĐỂ NUÔI CẤY TẾ BÀO MARC-145 TRÊN HỆ THỐNG MICRO CARRIER
• 4.2.4. XÁC ĐỊNH MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY THÍCH HỢP CHO TẾ BÀO MARC-145 TRÊN HỆ THỐNG MICRO CARRIER
• 4.2.5. XÁC ĐỊNH LƯỢNG TẾ BÀO MARC-145 CẤY VÀO HẠT CYTODEx TRÊN HỆ THỐNG MICRO CARRIER
• 4.3. NGHIÊN CỨU TÍNH THÍCH ỨNG CỦA VIRUS TAI XANH NUÔI CẤY TRÊN TẾ BÀO MARC-145 BẰNG HỆ THỐNG MICRO CARRIER
• 4.3.1. XÁC ĐỊNH THỜI GIAN HẤP PHỤ VIRUS VÀO TẾ BÀO, XỬ LÍ DỊCH HẤP PHỤ VIRUS
• 4.3.2. XÁC ĐỊNH MÔI TRƯỜNG DUY TRÌ SAU GÂY NHIỄM VIRUS
• 4.3.3. XÁC ĐỊNH LIỀU GÂY NHIỄM, THỜI GIAN THU HOẠCH VIRUS THÍCH HỢP
• 4.4. NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH THU HOẠCH VÀ XỬ LÍ DỊCH VIRUS SAU KHI THU HOẠCH
• 4.5. ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
• 4.5.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
• 4.5.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
• 4.6. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
• 4.7. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
• 4.8. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 4.8.1. PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO
• 4.8.2. PHƯƠNG PHÁP GÂY NHIỄM
• 4.8.3. PHƯƠNG PHÁP THU HOẠCH
• 4.8.4. PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA ĐỘ THUẦN KHIẾT (TCVN8684:2011)
• 4.8.5. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ TCID50
• 4.8.6. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
• 5. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 5.1. NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NUÔI CẤY TẾ BÀO MARC-145 TRÊN HỆ THỐNG MICRO CARRIER
• 5.1.1. XÁC ĐỊNH TỐC ĐỘ KHUẤY THÍCH HỢP ĐỂ NUÔI TẾ BÀO MARC-145 TRÊN HỆ THỐNG MICRO CARRIER
• 5.1.2. XÁC ĐỊNH GIÁ TRỊ DO THÍCH HỢP ĐỂ NUÔI CẤY TẾ BÀO MARC-145 TRÊN HỆ THỐNG MICRO CARRIER
• 5.1.3. XÁC ĐỊNH LƯU LƯỢNG KHÍ CẤP VÀO THÍCH HỢP ĐỂ NUÔI CẤY TẾ BÀO MARC-145 TRÊN HỆ THỐNG MICRO CARRIER
• 5.1.4. XÁC ĐỊNH MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY THÍCH HỢP CHO TẾ BÀO MARC-145 TRÊN HỆ THỐNG MICRO CARRIER
• 5.1.5. XÁC ĐỊNH LƯỢNG TẾ BÀO MARC-145 CẤY VÀO HẠT CYTODEx TRÊN HỆ THỐNG MICRO CARRIER
• 5.2. NGHIÊN CỨU TÍNH THÍCH ỨNG CỦA VIRUS TAI XANH NUÔI CẤY TRÊN TẾ BÀO MARC-145 BẰNG HỆ THỐNG MICRO CARRIER
• 5.2.1. XÁC ĐỊNH THỜI GIAN HẤP PHỤ VIRUS VÀO TẾ BÀO, XỬ LÍ DỊCH HẤP PHỤ VIRUS
• 5.2.2. XÁC ĐỊNH MÔI TRƯỜNG DUY TRÌ SAU GÂY NHIỄM VIRUS
• 5.2.3. XÁC ĐỊNH LIỀU GÂY NHIỄM, THỜI GIAN THU HOẠCH VIRUS THÍCH HỢP
• 5.3. NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH THU HOẠCH-THU DỒN DỊCH VIRUS TAI XANH
• 6. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Ứng Dụng Microcarrier Sản Xuất Vaccine

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào microcarrier trong sản xuất vaccine tai xanh là một hướng đi đầy tiềm năng. Bệnh tai xanh (PRRS) gây ra những thiệt hại kinh tế to lớn trong ngành chăn nuôi lợn. Việc sản xuất vaccine hiệu quả và kinh tế là vô cùng quan trọng. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào truyền thống gặp nhiều hạn chế về năng suất và quy mô. Microcarrier cung cấp một giải pháp nuôi cấy tế bào 3D hiệu quả hơn, cho phép sản xuất vaccine quy mô lớn. Nghiên cứu này tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình nuôi cấy tế bào trên hệ thống microcarrier để sản xuất vaccine tai xanh chất lượng cao, giảm chi phí và đáp ứng nhu cầu thị trường. Công trình này có ý nghĩa quan trọng trong việc kiểm soát và phòng ngừa bệnh tai xanh ở lợn, góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành chăn nuôi. Theo tài liệu gốc, công ty dược Hanvet đã nghiên cứu và phân lập được chủng virus lưu hành tại Việt Nam và là công ty đầu tiên sản xuất thành công vaccine phòng bệnh tai xanh.

1.1. Giới thiệu về công nghệ Microcarrier trong nuôi cấy tế bào

Microcarrier là những hạt nhỏ, thường có kích thước từ 100-300 micromet, được sử dụng làm giá thể cho tế bào bám dính và phát triển trong môi trường nuôi cấy 3D. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào trên microcarrier cho phép tăng mật độ tế bào và năng suất sản xuất vaccine so với phương pháp nuôi cấy 2D truyền thống. Các loại microcarrier phổ biến bao gồm Cytodex, nhựa polystyrene, và các vật liệu sinh học khác. Việc lựa chọn loại microcarrier phù hợp phụ thuộc vào loại tế bào và mục đích nuôi cấy. Ưu điểm của microcarrier bao gồm khả năng kiểm soát môi trường nuôi cấy tốt hơn, dễ dàng mở rộng quy mô sản xuất, và giảm chi phí nhân công.

1.2. Tổng quan về bệnh Tai Xanh PRRS và nhu cầu vaccine

Bệnh tai xanh (PRRS) là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm ở lợn, gây ra các triệu chứng như sốt cao, bỏ ăn, khó thở, sảy thai, và giảm năng suất sinh sản. Virus tai xanh (PRRSV) có khả năng biến đổi gen cao, dẫn đến sự xuất hiện của nhiều chủng virus khác nhau, gây khó khăn cho việc kiểm soát dịch bệnh. Vaccine tai xanh là một biện pháp phòng ngừa quan trọng, giúp giảm thiểu tác động của bệnh và bảo vệ đàn lợn. Nhu cầu vaccine tai xanh ngày càng tăng do sự lây lan rộng rãi của bệnh và những thiệt hại kinh tế mà nó gây ra. Việc phát triển vaccine hiệu quả và kinh tế là một ưu tiên hàng đầu trong ngành thú y.

II. Thách Thức Sản Xuất Vaccine Tai Xanh Giải Pháp Microcarrier

Việc sản xuất vaccine tai xanh đối mặt với nhiều thách thức, bao gồm sự biến đổi gen nhanh chóng của virus, khó khăn trong việc nuôi cấy virus trên quy mô lớn, và chi phí sản xuất cao. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào truyền thống thường cho năng suất thấp và đòi hỏi nhiều công sức. Microcarrier hứa hẹn giải quyết những thách thức này bằng cách cung cấp một nền tảng nuôi cấy tế bào hiệu quả hơn, cho phép sản xuất vaccine với quy mô lớn hơn và chi phí thấp hơn. Tuy nhiên, việc ứng dụng microcarrier trong sản xuất vaccine tai xanh đòi hỏi sự tối ưu hóa quy trình nuôi cấy, lựa chọn loại microcarrier phù hợp, và kiểm soát chất lượng vaccine nghiêm ngặt. Theo tài liệu, quá trình sản xuất vaccine virus tế bào vẫn trên quy mô nhỏ lẻ, phương pháp nuôi cấy cổ điển trên hệ thống nuôi cấy tĩnh trên bình Tfask, Roller.nên năng xuất và hiệu quả không cao.

2.1. Các hạn chế của phương pháp nuôi cấy tế bào truyền thống

Phương pháp nuôi cấy tế bào 2D truyền thống có nhiều hạn chế, bao gồm diện tích bề mặt nuôi cấy hạn chế, khó kiểm soát môi trường nuôi cấy, và tốn nhiều công sức. Việc mở rộng quy mô sản xuất vaccine bằng phương pháp này gặp nhiều khó khăn và tốn kém. Ngoài ra, tế bào nuôi cấy trong môi trường 2D có thể không thể hiện đầy đủ các đặc tính sinh học của tế bào trong cơ thể sống, ảnh hưởng đến hiệu quả vaccine.

2.2. Yêu cầu về tối ưu hóa quy trình nuôi cấy tế bào Microcarrier

Để ứng dụng microcarrier thành công trong sản xuất vaccine tai xanh, cần tối ưu hóa quy trình nuôi cấy tế bào, bao gồm lựa chọn loại microcarrier phù hợp, xác định mật độ tế bào ban đầu tối ưu, điều chỉnh tốc độ khuấy, kiểm soát pH và oxy hòa tan, và lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp. Việc tối ưu hóa quy trình này đòi hỏi sự nghiên cứu kỹ lưỡng và thử nghiệm thực tế để đạt được năng suất và chất lượng vaccine cao nhất.

III. Phương Pháp Nuôi Cấy Tế Bào Marc 145 Trên Microcarrier

Nghiên cứu này tập trung vào việc nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống microcarrier để sản xuất vaccine tai xanh. Tế bào Marc-145 là một dòng tế bào thường được sử dụng để nuôi cấy virus tai xanh. Quy trình nuôi cấy bao gồm các bước chuẩn bị microcarrier, cấy tế bào, theo dõi sự phát triển của tế bào, và thu hoạch tế bào. Các yếu tố quan trọng cần kiểm soát trong quá trình nuôi cấy bao gồm tốc độ khuấy, pH, oxy hòa tan, và nhiệt độ. Việc tối ưu hóa các yếu tố này sẽ giúp tăng năng suất và chất lượng vaccine. Theo tài liệu, tốc độ khuấy 60 vòng/phút, tế bào bám hạt sau 24h, phát triển 90-100% sau 72-96h, môi trường nuôi không tạo bọt; giá trị DO=50% tế bào phát triển tốt nhất.

3.1. Lựa chọn và chuẩn bị Microcarrier cho nuôi cấy tế bào

Việc lựa chọn loại microcarrier phù hợp là rất quan trọng. Cytodex là một loại microcarrier phổ biến được sử dụng trong nuôi cấy tế bào động vật. Trước khi sử dụng, microcarrier cần được chuẩn bị bằng cách rửa sạch, khử trùng, và hydrat hóa. Quá trình chuẩn bị này đảm bảo rằng microcarrier sạch sẽ và có khả năng hỗ trợ sự bám dính và phát triển của tế bào.

3.2. Tối ưu hóa các thông số nuôi cấy Tốc độ khuấy pH DO

Tốc độ khuấy, pH, và oxy hòa tan (DO) là những thông số quan trọng cần kiểm soát trong quá trình nuôi cấy tế bào trên microcarrier. Tốc độ khuấy ảnh hưởng đến sự phân bố của tế bào và chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy. pH và DO ảnh hưởng đến sự trao đổi chất và sinh trưởng của tế bào. Việc tối ưu hóa các thông số này sẽ giúp tạo ra một môi trường nuôi cấy lý tưởng cho tế bào phát triển.

3.3. Môi trường nuôi cấy và bổ sung dinh dưỡng cho tế bào Marc 145

Môi trường nuôi cấy cần cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của tế bào Marc-145, bao gồm amino acid, vitamin, muối khoáng, và glucose. Huyết thanh thai bò (FBS) thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để cung cấp các yếu tố tăng trưởng và protein cần thiết. Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy phù hợp và bổ sung dinh dưỡng đầy đủ sẽ giúp tế bào phát triển khỏe mạnh và đạt năng suất cao.

IV. Ứng Dụng Microcarrier Sản Xuất Vaccine Tai Xanh Hiệu Quả

Sau khi nuôi cấy tế bào Marc-145 thành công trên microcarrier, bước tiếp theo là gây nhiễm virus tai xanh và thu hoạch vaccine. Quy trình gây nhiễm virus cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo hiệu quả gây nhiễm cao và giảm thiểu nguy cơ tạp nhiễm. Quá trình thu hoạch vaccine cần được thực hiện nhanh chóng và hiệu quả để bảo toàn hiệu giá virus. Vaccine thu được cần được kiểm tra chất lượng nghiêm ngặt trước khi đưa vào sử dụng. Theo tài liệu, liều gây nhiễm 0,01MOI; môi trường nhiễm là MEM 1% FBS ; hấp phụ virut 60 phút, dịch hấp phụ không hút bỏ, thu hoạch virus sau 72 giờ cho hiệu giá virut 107,2- 107,5TCID50/ml.

4.1. Quy trình gây nhiễm virus Tai Xanh vào tế bào Marc 145

Quy trình gây nhiễm virus tai xanh vào tế bào Marc-145 bao gồm các bước chuẩn bị virus, pha loãng virus, và gây nhiễm vào tế bào. Liều lượng virus gây nhiễm (MOI) cần được tối ưu hóa để đạt được hiệu quả gây nhiễm cao nhất. Thời gian hấp phụ virus cũng cần được điều chỉnh để đảm bảo virus xâm nhập vào tế bào một cách hiệu quả.

4.2. Thu hoạch và xử lý dịch virus sau gây nhiễm trên Microcarrier

Sau khi virus nhân lên trong tế bào, dịch virus cần được thu hoạch và xử lý để loại bỏ các tạp chất và tế bào chết. Quá trình thu hoạch có thể được thực hiện bằng cách ly tâm hoặc lọc. Dịch virus thu được cần được kiểm tra hiệu giá và độ tinh khiết trước khi sử dụng để sản xuất vaccine.

4.3. Kiểm tra chất lượng và đánh giá hiệu quả vaccine Tai Xanh

Vaccine tai xanh thu được cần được kiểm tra chất lượng nghiêm ngặt để đảm bảo an toàn và hiệu quả. Các chỉ tiêu kiểm tra chất lượng bao gồm hiệu giá virus, độ tinh khiết, và khả năng tạo miễn dịch. Vaccine cần được thử nghiệm trên động vật để đánh giá hiệu quả bảo vệ chống lại bệnh tai xanh.

V. Kết Luận Tiềm Năng Ứng Dụng Microcarrier Sản Xuất Vaccine

Nghiên cứu này đã chứng minh tiềm năng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào microcarrier trong sản xuất vaccine tai xanh. Việc tối ưu hóa quy trình nuôi cấy và gây nhiễm virus đã giúp tăng năng suất và chất lượng vaccine. Microcarrier hứa hẹn là một giải pháp hiệu quả để sản xuất vaccine với quy mô lớn và chi phí thấp, đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của thị trường. Tuy nhiên, cần có thêm nhiều nghiên cứu để hoàn thiện quy trình sản xuất vaccine và đánh giá hiệu quả của vaccine trên thực địa. Theo tài liệu, quá trình thu hoạch virus đông tan 1 lần cho hiệu giá virus cao nhất.

5.1. Ưu điểm và nhược điểm của kỹ thuật Microcarrier trong sản xuất vaccine

Ưu điểm của microcarrier bao gồm khả năng tăng năng suất sản xuất vaccine, giảm chi phí, và dễ dàng mở rộng quy mô. Nhược điểm của microcarrier bao gồm yêu cầu kỹ thuật cao, cần tối ưu hóa quy trình nuôi cấy, và có thể gây ra một số vấn đề về kiểm soát chất lượng.

5.2. Hướng phát triển và nghiên cứu tiếp theo về vaccine Tai Xanh

Hướng phát triển tiếp theo của vaccine tai xanh bao gồm phát triển vaccine thế hệ mới có hiệu quả bảo vệ cao hơn, vaccine đa giá có khả năng bảo vệ chống lại nhiều chủng virus khác nhau, và vaccine có khả năng kích thích miễn dịch tế bào. Cần có thêm nhiều nghiên cứu để hiểu rõ hơn về cơ chế miễn dịch của vaccine tai xanh và phát triển vaccine hiệu quả hơn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN THỊ VÂN ANH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO TRÊN HỆ THỐNG MICROCARRIER TRONG SẢN XUẤT VACXIN TAI XANH Ngành: Thú y Mã số: 8640101 Người hướng dẫn khoa học: PGS.Bùi Trần Anh Đào TS. Bùi Thị Tố Nga NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019 c LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày tháng Năm 2019 Tác giả luận văn Trần Thị Vân Anh i c LỜI CẢM ƠN Cho đến nay tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Nhân dịp này tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc tới các thầy, cô giáo. Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất của mình đến thầy cô hướng dẫn: PSG. Bùi Trần Anh Đào và TS.

Bùi Thị Tố Nga bộ môn Bệnh lý - Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, người đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị em bạn bè đồng nghiệp công ty TNHH Dược Hanvet đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Cuối cùng xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, các anh, chị em những người luôn động viên, giúp đỡ tôi để tôi hoàn thành tốt luận văn này. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng Năm 2019 Tác giả luận văn Trần Thị Vân Anh ii c MỤC LỤC Lời cam đoan.

ii Mục lục. iii Danh mục chữ viết tắt. vi Danh mục bảng. vii Danh mục hình.

viii Trich yêu luân văn. ix Thesis abstract. Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu nghiên cứu.

Tổng quan tài liệu. Tổng quan nuôi cấy tế bào. Một số đặc điểm của tế bào động vật. Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy tế bào.

Các loại môi trường nuôi cấy tế bào. Điều kiện nuôi cấy tế bào. Sự tạp nhiễm và cách hạn chế. Sự sinh trưởng của tế bào động vật trong nuôi cấy.

Virus tai xanh. Hình thái và cấu trúc của virus PRRS. Đặc tính nuôi cấy virus Tai Xanh. Nuôi cấy virus tai xanh trên môi trường tế bào.

Các dòng tế bào nuôi cấy thích hợp virus Tai Xanh. Nuôi cấy virus Tai Xanh trên môi trường tế bào Marc-145. Các yếu tố ảnh hưởng trong nuôi cấy tế bào và virus tai xanh. Bề mặt nuôi cấy.

Yếu tố không khí môi trường xung quanh. Các hệ thống nuôi cấy tế bào. Hệ thống nuôi cấy tế bào hiện nay. Hệ thống Microcarrier.

Bình nuôi cấy. Các loại hạt Cytodex. Vật liệu- phƣơng pháp nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu.

Nghiên cứu quy trình nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier. Nghiên cứu tính thích ứng của virus Tai Xanh nuôi cấy trên tế bào Marc-145 bằng hệ thống Microcarrier. Nghiên cứu quy trình thu hoạch và xử lí dịch virus sau khi thu hoạch. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu.

Đối tượng nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu. Địa điểm nghiên cứu. Thời gian nghiên cứu.

Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp nuôi cấy tế bào. Phương pháp gây nhiễm. Phương pháp thu hoạch.

Phương pháp kiểm tra độ thuần khiết (TCVN8684:2011). Phương pháp xác định chỉ số TCID50. Phương pháp xử lý số liệu. Kết quả và thảo luận.

Nghiên cứu quy trình nuôi cấy tế bào marc-145 trên hệ thống microcarrier. Xác định tốc độ khuấy thích hợp để nuôi tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier. Xác định giá trị DO thích hợp để nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier. Xác định lưu lượng khí cấp vào thích hợp để nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier.

Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp cho tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier. Xác định lượng tế bào Marc-145 cấy vào hạt Cytodex trên hệ thống Microcarrier. Nghiên cứu tính thích ứng của virus tai xanh nuôi cấy trên tế bào marc-145 bằng hệ thống microcarrier. Xác định thời gian hấp phụ virus vào tế bào, xử lí dịch hấp phụ virus.

Xác định môi trường duy trì sau gây nhiễm virus. Xác định liều gây nhiễm, thời gian thu hoạch virus thích hợp. Nghiên cứu quy trình thu hoạch-thu dồn dịch virus tai xanh. Kết luận và kiến nghị.

51 Tài liệu tham khảo. 55 v c DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt CPE Cyto Pathogenic Effect DMEM Dulbecco’s Modified MEM Medium DO Dissolved Oxygen EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid FBS Fetal Bovine Serum LH Lactalbumin Hydrolysate M199 Medium 199 MEM Minimum essential medium MOI Multiplicity of infection PBS Phosphate Buffered Saline pH Hydrogen power PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus TCID50 50% Tisue culture infective dose TE Trypsin – EDTA vi c DANH MỤC BẢNG Bảng 2. Protein cấu trúc của PRRSV. Kết quả theo dõi điều chỉnh tốc độ khuấy.

Mức độ bám tế bào Marc-145 vào hạt Cytodex ở các giá trị DO khác nhau. Tỉ suất sinh sản tế bào Marc-145 sau 72 giờ nuôi. Kết quả điều chỉnh lưu lượng khí cấp vào môi trường nuôi. Khả năng bám và phát triển tế bào Marc-145 trên các loại môi trường.

Số lượng tế bào Marc-145 nuôi sau 72 giờ và 96 giờ nuôi. Khả năng gây bệnh tích tế bào trong thời gian hấp phụ virus. Kết quả hiệu giá xác định thời gian hấp phụ virus vào tế bào. Khả năng gây bệnh tích tế bào trên các môi trường.

Hiệu giá virus tìm môi trường sau gây nhiễm. Kết quả theo dõi mức độ thể hiện CPE ở các liều gây nhiễm. Kết quả xác định hiệu giá virus của các liều gây nhiễm (MOI). Kết quả xác định hiệu giá virus thu dồn kháng nguyên Tai Xanh (log10TCID50/ml).14: Kết quả kiểm tra vô trùng nguyên dịch Tai Xanh.

49 vii c DANH MỤC HÌNH Hình 2. Hình thái virus PRRS. Cấu trúc bộ gen của PRRSV. Hình thái tế bào Marc-145 sau 72 giờ nuôi trên hệ thống Tflask.

Bệnh tích tế bào sau 54-72 giờ nhiễm virus Tai Xanh. Chai nuôi tế bào Tfask. Hệ thống nuôi chai lăn. Hệ thống nuôi cấy Microcarrier.

Tế bào Marc-145 bám trên hạt Cytodex. Mô hình nhân số lượng tế bào cho nuôi cấy trên hệ thống Microcarrier. Buồng đếm tế bào. Cân chỉnh điện cực pH.

Cân chỉnh điện cứu DO. (1) Bình nuôi có bọt, (2) bình nuôi cấy không có bọt. Lấy mẫu theo dõi năng suất nhân tế bào Marc-145. Hệ thống khí đi vào hệ thống Microcarrier.

Tỉ suất sinh sản tế bào Marc-145 ở các môi trường nuôi. Tỉ xuất nhân tế bào Marc-145 khi đầu vào tế bào khác nhau. Mức độ bám tế bào Marc-145 trên hạt Cytodex. Bệnh tích tế bào 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ sau gây nhiễm virus Tai xanh.

Đồ thị sinh trưởng và phát triển virus Tai Xanh. Hạt Cytodex sau quá trình thu hoạch virus Tai Xanh. 49 viii c TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Trần Thị Vân Anh Tên luâ ̣n văn: “Nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy tế bào trên hệ thống Microcarrier trong sản xuất vacxin Tai Xanh” Ngành: Thú y Mã số: 8640101 Tên cơ sở đào ta ̣o: Học Viê ̣n Nông Nghiê ̣p Viê ̣t Nam Mục tiêu nghiên cứu - Xây dựng quy trình nuôi tế bào Marc-145 và quy trình sản xuất nguyên dịch Tai Xanh trên hệ thống Microcarrier theo quy mô công nghiệp, - Tiền đề để áp dụng các quy trình sản xuất nguyên dịch khác trong sản xuất vacxin động vật trên tế bào. Phƣơng pháp nghiên cứu Phương pháp nuôi cấy tế bào Marc-145 và phân lập virus Tai Xanh theo TCVN 8400-21:2014.

Lấy mẫu và đếm số tế bào theo TCVN 4884-2:2015 Phương pháp kiểm tra độ thuần khiết theo TCVN 8684:2011 Phương pháp xác định chỉ số TCID50 theo phương pháp Spearman và Karber. Số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm Excel 2010 và Minitap 16. Kết quả chính và kết luận 1.Xây dựng được quy trình nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier. Tốc độ khuấy 60 vòng/phút, tế bào bám hạt sau 24h, phát triển 90-100% sau 72-96h, môi trường nuôi không tạo bọt; giá trị DO=50% tế bào phát triển tốt nhất; Lưu lượng khí 0,25-0,5 lít/phút sau 3 giờ 50 phút ổn định được giá trị DO và pH môi trường; môi trường MEM 5% FBS và tế bào đầu vào 300x106/30gram hạt Cytodex nuôi 10 lít môi trường là tốt nhất.Xây dựng được quy trình sản xuất virus Tai Xanh trên hệ thống Microcarrier sử dụng liều gây nhiễm 0,01MOI; môi trường nhiễm là MEM 1% FBS ; hấp phụ virut 60 phút, dịch hấp phụ không hút bỏ, thu hoạch virus sau 72 giờ cho hiệu giá virut 107,2- 107,5TCID50/ml.Quá trình thu hoạch virus đông tan 1 lần cho hiệu giá virus cao nhất.

ix c THESIS ABSTRACT Master candidate: Tran Thi Van Anh Thesis title: “Study on the application of cell culture techniques on Microcarrier system in the production of porcine reproductive and respiratory syndrome vaccines”. Major: Veterinary Medicine Code: 8640101 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives - Building the Marc-145 cell culture process and the production process of PRRSV fluid on Microcarrier system by industrial scale. -The premise to apply other original production processes in the production of animal vaccines on cells. Materials and Methods - Marc-145 cell-cultured and PRRSV isolated by TCVN 8400-21:2014.

- Sampled and cell counted by TCVN 4884-2:2015 - Purity tested by TCVN 8684:2011 - Determined index TCID50 by Spearman and Karber. - Data analyzed by Excel 2010 software and Minitab 16. Main findings and conclusions 1.Constructed the procedure of Marc-145 cell culture on Microcarrier system. Stirred speed 60 rpm, cells grow after 24 hours, grow 90-100% after 72-96 hours, the culture medium was not foam; DO = 50% indicates the best cell growth, The DO and pH were stable with an airflow of 0.5 liters/minute after 3 hours 50 minutes.; The suitable culture medium was MEM 5%FBS and 300x106 cell/30gram Cytodex.Constructed the PRRS virus production process on Microcarrier system using 0,01MOI; The infected medium was MEM 1%FBS.

The virus absorbed for 60 minutes, the adsorbent was not withdrawn, harvested the virus after 72 hours for viral titration 7,2-7,5 log10 TCID50 / ml.The virus freezing once obtained the highest viral titration.