Nghiên cứu ứng dụng enzyme sản xuất chế phẩm isoflavone dạng aglycone

Nghiên cứu ứng dụng enzyme trong sản xuất chế phẩm isoflavone dạng aglycone, mở ra hướng đi mới cho ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm.

• Đề tài: Nghiên Cứu Ứng Dụng Enzyme Trong Công Nghệ Sản Xuất Chế Phẩm Isoflavone Dạng Aglycone

Mục lục chi tiết

• Lời cảm ơn
• KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG BIỂU
• DANH MỤC HÌNH VẼ
• MỞ ĐẦU
• 1. PHẦN I: Giới thiệu về đậu tương
• 1.1. Các thành phần có giá trị dinh dưỡng trong đậu tương
• 1.1.1. Vitamin và khoáng chất
• 1.2. Isoflavone trong đậu tương
• 1.2.1. Cấu trúc isoflavone
• 1.2.2. Hàm lượng isoflavone trong thực phẩm từ đậu tương
• 1.2.3. Lợi ích của isoflavone đối với sức khỏe
• 1.2.4. Tính an toàn của isoflavone trong đậu tương
• 1.3. Sự chuyển hóa isoflavone từ glycoside sang aglycone trong đậu tương bằng enzyme
• 1.4. Một số thực phẩm giàu isoflavone trên thị trường Việt Nam và Thế Giới
• 2. PHẦN II: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Nguyên vật liệu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Phương pháp công nghệ
• 2.2.2. Phương pháp phân tích lý hóa
• 3. PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Lựa chọn nguyên liệu đậu tương có hàm lượng isoflavone cao
• 3.2. Nghiên cứu chuyển hóa isoflavone từ dạng glycoside sang dạng aglycone trong sữa đậu nành bằng enzyme
• 3.2.1. Nghiên cứu lựa chọn enzyme thích hợp để nâng cao hiệu suất chuyển hóa
• 3.2.2. Nghiên cứu nồng độ enzyme tối ưu để nâng cao hiệu suất chuyển hóa
• 3.2.3. Nghiên cứu pH tối ưu để nâng cao hiệu suất chuyển hóa
• 3.2.4. Nghiên cứu nhiệt độ tối ưu để nâng cao hiệu suất chuyển hóa
• 3.2.5. Nghiên cứu thời gian tối ưu cho quá trình thủy phân sữa đậu tương bằng chế phẩm enzyme Lactozym
• 3.3. Nghiên cứu thu nhận chế phẩm sữa bột đậu tương nảy mầm
• 3.3.1. Nghiên cứu nhiệt độ không khí đầu vào
• 3.3.2. Nghiên cứu xác định lưu lượng dòng nhập liệu
• 3.3.3. Nghiên cứu xác định ảnh hưởng của áp suất khí nén
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Isoflavone Aglycone Hé lộ tiềm năng từ tinh chất đậu nành

Isoflavone là hợp chất phenolic tự nhiên có nhiều trong đậu nành, được biết đến với cấu trúc tương tự nội tiết tố nữ estrogen. Hợp chất này tồn tại chủ yếu dưới hai dạng: glycoside (liên kết với phân tử đường) và aglycone (dạng tự do). Trong hạt đậu tương tự nhiên, isoflavone đậu nành chiếm đến hơn 90% ở dạng glycoside, bao gồm các dẫn xuất như daidzin, genistin và glycitin. Tuy nhiên, các nghiên cứu khoa học đã chỉ ra rằng dạng aglycone, mặc dù chỉ chiếm một tỷ lệ rất nhỏ, lại là dạng có hoạt tính sinh học của isoflavone vượt trội. Dạng aglycone có khả năng được cơ thể hấp thu trực tiếp và nhanh chóng qua đường ruột, trong khi dạng glycoside cần phải trải qua quá trình thủy phân isoflavone glycoside phức tạp bởi hệ vi sinh vật đường ruột trước khi có thể được hấp thu. Quá trình chuyển hóa tự nhiên này thường không hiệu quả và phụ thuộc nhiều vào cơ địa mỗi người. Do đó, việc nghiên cứu các phương pháp công nghệ để chuyển hóa isoflavone từ dạng glycoside sang aglycone ngay trong quá trình sản xuất có ý nghĩa vô cùng quan trọng. Mục tiêu là tạo ra các chế phẩm có khả dụng sinh học cao, tối ưu hóa lợi ích sức khỏe cho người tiêu dùng, đặc biệt trong lĩnh vực thực phẩm chức năng isoflavone.

1.1. Phân biệt cấu trúc Isoflavone Glycoside và Aglycone

Về mặt cấu trúc, isoflavone aglycone (ví dụ: genistein và daidzein) có cấu trúc cơ bản gồm hai vòng benzen nối với một dị vòng pyron. Đây là dạng hoạt động, có thể liên kết với các thụ thể estrogen trong cơ thể. Ngược lại, isoflavone glycoside có cấu trúc tương tự nhưng được gắn thêm một hoặc nhiều phân tử đường (glucose) tại các vị trí nhất định. Sự hiện diện của phân tử đường này làm tăng kích thước phân tử, khiến chúng khó được hấp thu qua thành ruột. Chỉ khi liên kết glycoside này bị phá vỡ, phần aglycone mới được giải phóng và phát huy tác dụng.

1.2. Vai trò của hoạt tính sinh học trong các ứng dụng sức khỏe

Chính hoạt tính sinh học của isoflavone dạng aglycone đã mang lại những lợi ích sức khỏe đáng kể, được chứng minh qua nhiều công trình nghiên cứu. Các hợp chất này hoạt động như phytoestrogen, giúp cân bằng nội tiết tố, giảm các triệu chứng tiền mãn kinh, ngăn ngừa loãng xương, và giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch. Hơn nữa, chúng còn thể hiện khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ và góp phần ngăn chặn sự phát triển của một số tế bào ung thư. Việc nâng cao hàm lượng aglycone trong sản phẩm cuối cùng đồng nghĩa với việc gia tăng trực tiếp hiệu quả của các sản phẩm từ tinh chất mầm đậu nành.

II. Thách thức trong chuyển hóa Isoflavone Glycoside sang Aglycone

Thách thức lớn nhất trong việc sản xuất chế phẩm isoflavone hiệu quả cao nằm ở việc chuyển hóa isoflavone từ dạng glycoside chiếm đa số sang dạng aglycone có hoạt tính sinh học cao. Trong tự nhiên, hạt đậu tương và các sản phẩm không qua lên men như sữa đậu nành, đậu phụ chứa hàm lượng aglycone rất thấp, thường chỉ từ 1-5% tổng lượng isoflavone. Cơ thể con người có thể thực hiện quá trình chuyển hóa này nhờ enzyme do vi khuẩn đường ruột tiết ra, nhưng hiệu suất rất thấp và không ổn định. Điều này dẫn đến sự lãng phí một nguồn dược liệu quý giá, khi phần lớn isoflavone nạp vào không được hấp thu và phát huy tác dụng. Các phương pháp chế biến truyền thống như ngâm, nấu thông thường cũng không đủ khả năng phá vỡ liên kết glycoside một cách hiệu quả. Do đó, ngành công nghệ thực phẩm và dược phẩm phải đối mặt với bài toán làm thế nào để phá vỡ rào cản về khả dụng sinh học này. Việc tìm ra một giải pháp công nghệ có khả năng chuyển hóa triệt để, ổn định và có thể ứng dụng ở quy mô công nghiệp là một yêu cầu cấp thiết để khai thác tối đa tiềm năng của isoflavone đậu nành.

2.1. Hạn chế về khả dụng sinh học của isoflavone dạng glycoside

Khái niệm khả dụng sinh học chỉ tỷ lệ và tốc độ một hoạt chất được hấp thu vào hệ tuần hoàn và đến được nơi tác động. Do có kích thước phân tử lớn và tính chất kém thân dầu hơn, isoflavone glycoside không thể đi qua màng tế bào ruột một cách dễ dàng. Chúng cần được thủy phân isoflavone glycoside để loại bỏ phần đường. Quá trình này phụ thuộc hoàn toàn vào hệ vi sinh vật đường ruột, vốn khác biệt rất lớn giữa các cá thể, dẫn đến hiệu quả hấp thu không đồng đều và khó dự đoán. Đây là trở ngại chính khiến các sản phẩm đậu nành truyền thống chưa phát huy hết tiềm năng sức khỏe.

2.2. Hiệu suất thấp của quá trình chuyển hóa isoflavone tự nhiên

Các sản phẩm lên men đậu nành truyền thống như Miso, Natto (Nhật Bản) hay Tempeh (Indonesia) có hàm lượng aglycone cao hơn đáng kể. Điều này là do các vi sinh vật sử dụng trong quá trình lên men đã sản sinh ra các enzyme có khả năng thủy phân glycoside. Tuy nhiên, phương pháp lên men thường kéo dài, khó kiểm soát chất lượng đồng đều và sản phẩm có mùi vị đặc trưng không phải ai cũng chấp nhận. Do đó, việc tìm kiếm một phương pháp chủ động, có kiểm soát như ứng dụng công nghệ sinh học enzyme được xem là hướng đi đột phá và hiệu quả hơn.

III. Phương pháp ứng dụng enzyme β glucosidase để thủy phân

Giải pháp công nghệ tiên tiến nhất để giải quyết thách thức chuyển hóa isoflavone chính là ứng dụng enzyme trong công nghệ sản xuất. Cụ thể, enzyme β-glucosidase được coi là "chìa khóa vàng" trong quá trình này. Enzyme này hoạt động như một chất xúc tác sinh học, có khả năng nhận biết và cắt đứt một cách đặc hiệu liên kết β-1,4-glucoside giữa phân tử đường và phần aglycone. Phản ứng này diễn ra nhanh chóng, hiệu quả và trong điều kiện ôn hòa, giúp bảo toàn các hoạt chất quý giá khác. Nghiên cứu của Lê Thị Lý (2015) đã tiến hành so sánh hiệu quả của ba loại enzyme thương mại: Lactozym, Sumizyme FP và Novozyme 188. Kết quả cho thấy chế phẩm Sumizyme FP cho hiệu suất chuyển hóa cao nhất (42,5%), theo sau là Lactozym (38,9%). Mặc dù hiệu suất thấp hơn một chút, chế phẩm Lactozym được lựa chọn cho các nghiên cứu sâu hơn nhờ ưu thế về giá thành, phù hợp cho việc triển khai sản xuất ở quy mô lớn. Việc ứng dụng enzyme β-glucosidase không chỉ nâng cao hàm lượng aglycone mà còn mở ra hướng đi mới cho việc sản xuất các thực phẩm chức năng isoflavone chất lượng cao.

3.1. Cơ chế hoạt động của enzyme β glucosidase trên cơ chất glycoside

Enzyme β-glucosidase thuộc nhóm Glycoside Hydrolase (GH), có vai trò xúc tác cho phản ứng thủy phân, phá vỡ liên kết O-glycosidic. Trong trường hợp của isoflavone, enzyme này sẽ tấn công vào cơ chất glycoside (daidzin, genistin), giải phóng phân tử glucose và aglycone tương ứng (daidzein, genistein). Phản ứng này không làm thay đổi cấu trúc của phần aglycone, do đó bảo toàn nguyên vẹn hoạt tính sinh học của isoflavone. Đây là một ưu điểm vượt trội so với các phương pháp sử dụng hóa chất hoặc nhiệt độ cao có thể làm biến tính hoạt chất.

3.2. Lựa chọn nguồn enzyme thương mại cho quá trình thủy phân

Việc lựa chọn enzyme thương mại phù hợp là yếu tố quyết định đến hiệu quả và chi phí sản xuất. Nghiên cứu đã khảo sát các chế phẩm có hoạt tính β-glucosidase hoặc tương tự như β-galactosidase. Chẳng hạn, Lactozym có hoạt tính chính là β-galactosidase nhưng cũng cho thấy khả năng thủy phân isoflavone glycoside hiệu quả. Sự lựa chọn cuối cùng không chỉ dựa trên hoạt độ enzyme mà còn phải cân nhắc đến các yếu tố kinh tế và tính phù hợp với quy trình sản xuất thực phẩm. Kết quả cho thấy Lactozym là một lựa chọn cân bằng giữa hiệu quả và chi phí.

IV. Bí quyết tối ưu hóa quá trình thủy phân Isoflavone bằng enzyme

Để đạt được hiệu suất chuyển hóa isoflavone cao nhất, việc tối ưu hóa quá trình thủy phân là bước không thể thiếu. Hiệu quả hoạt động của enzyme phụ thuộc chặt chẽ vào các điều kiện môi trường như nồng độ enzyme, pH, nhiệt độ và thời gian phản ứng. Nghiên cứu đã tiến hành khảo sát một cách hệ thống các yếu tố này để tìm ra bộ thông số tối ưu cho enzyme Lactozym trên cơ chất là sữa đậu nành. Cụ thể, nồng độ enzyme được xác định là 2 ml/l, đây là mức cân bằng giữa hiệu quả và chi phí. Môi trường phản ứng tối ưu có độ pH là 5.0. Nhiệt độ lý tưởng cho hoạt độ enzyme được ghi nhận ở 40°C. Cuối cùng, thời gian thủy phân được lựa chọn là 4 giờ để đảm bảo quá trình chuyển hóa diễn ra gần như hoàn toàn mà không ảnh hưởng đến chất lượng cảm quan của sản phẩm. Việc thiết lập được quy trình tối ưu này là nền tảng quan trọng để có thể sản xuất hàng loạt chế phẩm isoflavone đậu nành dạng aglycone với chất lượng ổn định và hàm lượng hoạt chất cao, đáp ứng tiêu chuẩn của ngành thực phẩm chức năng isoflavone.

4.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme pH và nhiệt độ

Nghiên cứu chỉ ra rằng hàm lượng aglycone tăng tỷ lệ thuận với nồng độ enzyme cho đến một ngưỡng nhất định. Tại nồng độ 2 ml/l, hàm lượng genistein và daidzein đạt mức cao mà không tăng đáng kể khi tiếp tục bổ sung enzyme. Về pH, hoạt độ enzyme đạt đỉnh ở pH 5.0 và giảm dần khi môi trường trở nên quá axit hoặc quá kiềm. Tương tự, nhiệt độ 40°C là điểm hoạt động hiệu quả nhất của enzyme Lactozym, trong khi nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn đều làm giảm hiệu suất thủy phân. Những thông số này là cơ sở khoa học để kiểm soát chất lượng quá trình sản xuất.

4.2. Xác định thời gian tối ưu cho quá trình thủy phân glycoside

Thời gian phản ứng cũng là một yếu tố quan trọng. Kết quả phân tích cho thấy quá trình chuyển hóa isoflavone diễn ra nhanh trong 4 giờ đầu và chậm dần về sau. Mặc dù kéo dài thời gian lên 8-24 giờ có thể tăng thêm một lượng nhỏ aglycone, nhưng điều này không hiệu quả về mặt kinh tế và có thể tạo điều kiện cho vi sinh vật tạp nhiễm phát triển. Do đó, thời gian thủy phân 4 giờ được xem là tối ưu, cân bằng giữa hiệu suất chuyển hóa và chất lượng sản phẩm.

V. Kết quả thu nhận chế phẩm sữa bột giàu Isoflavone Aglycone

Sau khi hoàn tất quá trình thủy phân isoflavone glycoside bằng enzyme, bước tiếp theo là thu nhận chế phẩm ở dạng bột khô để dễ bảo quản và sử dụng. Phương pháp sấy phun được lựa chọn nhờ khả năng tạo ra sản phẩm dạng bột mịn, đồng nhất và phù hợp với quy mô công nghiệp. Các thông số của quá trình sấy phun cũng được tối ưu hóa quá trình thủy phân và sấy, bao gồm nhiệt độ không khí đầu vào (180°C), lưu lượng dòng nhập liệu (6 lít/giờ) và áp suất khí nén (5 bar). Với điều kiện tối ưu này, hiệu suất thu hồi sản phẩm đạt tới 93,5%. Sản phẩm cuối cùng là bột sữa đậu nành nảy mầm có màu vàng sáng, tơi mịn và mùi thơm đặc trưng. Phân tích thành phần cho thấy kết quả vô cùng ấn tượng: tổng hàm lượng isoflavone đạt 492,5 mg/100g, trong đó hàm lượng isoflavone aglycone (chủ yếu là genistein và daidzein) chiếm tới 191,5 mg/100g. Con số này cao hơn rất nhiều so với các sản phẩm đậu nành không qua xử lý enzyme, khẳng định sự thành công của quy trình nghiên cứu.

5.1. Quy trình sấy phun để thu nhận chế phẩm isoflavone

Sấy phun là công nghệ biến đổi dung dịch lỏng thành dạng bột khô thông qua việc phun sương dung dịch vào một buồng chứa dòng khí nóng. Quá trình này diễn ra rất nhanh, giúp hạn chế sự phá hủy các hoạt chất nhạy cảm với nhiệt như isoflavone. Việc kiểm soát nhiệt độ đầu vào, tốc độ nhập liệu và áp suất khí nén là cực kỳ quan trọng để đảm bảo chất lượng bột, độ ẩm và hiệu suất thu hồi. Quy trình này là bước hoàn thiện công nghệ, đưa sản phẩm từ phòng thí nghiệm đến gần hơn với sản xuất thực tế.

5.2. Phân tích thành phần dinh dưỡng và isoflavone trong sản phẩm

Sản phẩm bột thu được không chỉ giàu isoflavone aglycone mà còn có giá trị dinh dưỡng cao với hàm lượng protein lên tới 52,5% và lipid là 23,4%. Đặc biệt, hàm lượng aglycone (191,5 mg/100g) cho thấy hiệu quả vượt trội của phương pháp chiết xuất isoflavone từ đậu nành kết hợp với xử lý enzyme. Đây là một nguyên liệu tiềm năng cho ngành công nghiệp thực phẩm, đặc biệt là trong việc phát triển các sản phẩm hỗ trợ sức khỏe phụ nữ, giúp cân bằng nội tiết tố nữ estrogen một cách tự nhiên và an toàn.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây công nghiệp và cây thực phẩm có nguồn gốc từ châu Á, hiện được canh tác và tiêu thụ rộng rãi trên thế giới nhờ giá trị dinh dưỡng vượt trội cùng các hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe con người. Các nghiên cứu dịch tễ học và y sinh học đã chứng minh các sản phẩm từ đậu tương có tác dụng hỗ trợ hạ cholesterol huyết thanh, giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch, ngăn ngừa loãng xương ở phụ nữ tiền mãn kinh và giảm nguy cơ mắc một số bệnh ung thư (ung thư tuyến tiền liệt, ung thư vú, ung thư đường tiêu hóa). Tác dụng này chủ yếu bắt nguồn từ nhóm hợp chất isoflavone – các polyphenol tự nhiên hoạt động như phytoestrogen có tính chọn lọc trên các thụ thể estrogen ($\alpha$ và $\beta$).

Trong hạt đậu tương tự nhiên, isoflavone tồn tại ở hai nhóm cấu trúc chính: dạng tự do (aglycone gồm daidzein, genistein, glycitein) và dạng liên kết (glycoside gồm daidzin, genistin, glycitin cùng các dẫn xuất 6"-O-acetyl glycoside và 6"-O-malonyl glycoside). Hơn 90% (từ 95,97% đến 98,35%) tổng lượng isoflavone trong hạt đậu tương tồn tại ở dạng glycoside liên kết với phân tử đường glucose qua liên kết $\beta$-1,4-glucoside. Mặc dù chiếm tỷ lệ lớn, dạng glycoside có khối lượng phân tử cao, độ phân cực lớn nên cơ thể người khó hấp thu trực tiếp qua thành ruột non. Ngược lại, isoflavone dạng aglycone có hoạt tính sinh học cao hơn, tốc độ và tỷ lệ hấp thu qua đường tiêu hóa vượt trội hơn nhiều so với dạng glycoside. Dù hệ vi sinh đường ruột và enzyme tiêu hóa có thể thủy phân một phần glycoside thành aglycone, hiệu suất chuyển hóa nội sinh trong cơ thể người là tương đối thấp và phụ thuộc vào hệ vi sinh của từng cá nhân.

Các sản phẩm đậu tương lên men truyền thống (natto, miso, tempeh, chongkukjang) có hàm lượng aglycone cao nhờ enzyme nội sinh từ vi sinh vật, nhưng mùi vị đặc trưng của sản phẩm lên men thường kén người tiêu dùng và quy trình khó kiểm soát nồng độ hoạt chất chính xác. Xuất phát từ thực tiễn trên, khóa luận tập trung giải quyết vấn đề ứng dụng enzyme thương mại để thủy phân liên kết glycoside, nâng cao hiệu suất chuyển hóa isoflavone sang dạng aglycone và tối ưu hóa công nghệ sấy phun thu hồi bột sữa đậu tương giàu hoạt tính sinh học.

Khóa luận xác định 2 nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

1. Nghiên cứu nâng cao hiệu suất chuyển hóa isoflavone đậu tương từ dạng glycoside sang dạng aglycone bằng chế phẩm enzyme thương mại trong dịch sữa đậu tương nảy mầm.
2. Nghiên cứu xác định các thông số công nghệ tối ưu của quá trình sấy phun để thu nhận chế phẩm sữa bột đậu tương nảy mầm giàu isoflavone dạng aglycone.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: 9 giống đậu tương trồng tại Việt Nam (DT 12, DT 22, DT 26, DT 98, DT 2001, DT 2008, DT 2101, DT 9804, VX 93); 3 chế phẩm enzyme thương mại gồm Lactozym ($\beta$-galactosidase, Novo Nordisk - Đan Mạch), Sumizyme FP ($\beta$-glucosidase, Shin-nihon Kagaku Kogyo - Nhật Bản), Novozyme 188 ($\beta$-glucosidase, Novozymes - Đan Mạch); sản phẩm sữa bột đậu tương nảy mầm.
• Phạm vi nghiên cứu: Thực nghiệm công nghệ sinh học và phân tích hóa lý thực hiện tại Khoa Công nghệ Sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội phối hợp với Bộ môn Thực phẩm và Dinh dưỡng - Viện Công nghiệp Thực phẩm, hoàn thành vào tháng 5 năm 2015.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận xây dựng trên nền tảng lý thuyết về hóa sinh học các hợp chất isoflavone, cơ chế xúc tác enzyme thủy phân liên kết glycoside hydrolase (GH) và kỹ thuật sấy phun sấy khô dịch huyền phù thực phẩm.

Khung lý thuyết và cơ chế chuyển hóa

Cấu trúc cơ bản của isoflavone gồm 2 vòng benzen A và B liên kết với một dị vòng pyron C. Khi chịu tác dụng của enzyme $\beta$-glucosidase hoặc $\beta$-galactosidase, liên kết $\beta$-1,4-glucoside giữa aglycone và phân tử đường glucose bị cắt đứt, giải phóng glucose tự do cùng các phân tử aglycone tương ứng:

• Daidzin $\rightarrow$ Daidzein ($C_{15}H_{10}O_4$)
• Genistin $\rightarrow$ Genistein (4',5,7-trihydroxyisoflavone, $C_{15}H_{10}O_5$)
• Glycitin $\rightarrow$ Glycitein ($C_{16}H_{12}O_5$)

Phương pháp công nghệ

1. Chuẩn bị sữa đậu tương nảy mầm: Đậu tương được phân loại, rửa sạch, ngâm nước 3 giờ ở nhiệt độ 25–35°C; ủ nảy mầm trong thùng có lỗ thoát nước đáy, phủ vải xô ở 25–30°C trong 48 giờ (tưới nước 4 giờ/lần); rửa và đãi tách vỏ nhẹ tay tránh gãy mầm; nấu với nước theo tỷ lệ 1/3 (đun sôi 1 giờ, vớt bã và vỏ sót); nghiền lọc bằng máy xay hai đầu ra (bã nghiền lại 4 lần), lọc qua vải thô thu dịch sữa đậu tương.
2. Thực nghiệm thủy phân bằng enzyme: Khảo sát lựa chọn chế phẩm enzyme thích hợp (Lactozym, Sumizyme FP, Novozyme 188); tối ưu hóa nồng độ enzyme (0,5–2,5 ml/l), giá trị pH môi trường (3,0–8,0), nhiệt độ phản ứng (30–60°C) và thời gian phản ứng (1–24 giờ).
3. Thực nghiệm sấy phun thu hồi bột sữa: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ không khí sấy đầu vào (140, 160, 180, 200°C), lưu lượng dòng nhập liệu (5, 6, 7, 8 lít/h) và áp suất khí nén cấp cho đĩa quay (3, 4, 5, 6 bar).

Phương pháp phân tích lý hóa

• Đo pH: Sử dụng máy đo pH/mV/2A 10-1012 315i (Đức).
• Hàm lượng chất khô: Xác định bằng khúc xạ kế Milwauke (Phần Lan).
• Hàm lượng protein thô: Định lượng theo phương pháp Kjeldahl (vô cơ hóa mẫu bằng $H_2SO_4$ đậm đặc với xúc tác $K_2SO_4$ và $CuSO_4$; cất đạm giải phóng $NH_3$ bằng $NaOH$ 40% vào dung dịch $H_3BO_3$; chuẩn độ bằng $H_2SO_4$ 0,1N; tính hàm lượng protein với hệ số chuyển đổi 6,25).
• Hàm lượng lipid: Định lượng theo phương pháp Soxhlet sử dụng dung môi ete dầu hỏa hồi lưu liên tục trong 8–12 giờ.
• Hàm lượng gluxit: Xác định theo phương pháp Bertrand dựa trên phản ứng khử $Cu(OH)_2$ thành kết tủa đỏ gạch $Cu_2O$ trong môi trường kiềm, hòa tan kết tủa bằng $Fe_2(SO_4)_3$ trong axit và chuẩn độ $Fe^{2+}$ tạo thành bằng dung dịch $KMnO_4$ 0,1N tiêu chuẩn.
• Định lượng isoflavone: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trên hệ thống Waters Empower (Mỹ) trang bị bơm dung môi 2690, bộ tiêm mẫu tự động, đầu dò DAD ở bước sóng 260 nm, cột sắc ký pha đảo Luna (2) C18 ($250 \times 3,9\text{ mm}, 5\ \mu\text{m}$). Pha động gồm dung dịch A ($CH_3COOH$ 0,1%) và dung dịch B (Acetonitril 80% trong $CH_3COOH$ 0,1%) chạy theo chương trình rửa giải gradient 45 phút.
• Xác định hoạt tính enzyme $\beta$-glucosidase: Đo mức độ thủy phân cơ chất p-nitrophenyl-$\beta$-D-glucopyranoside (p-NPG) giải phóng p-nitrophenol đo quang ở bước sóng 405 nm; 1 đơn vị hoạt tính (U) là lượng enzyme giải phóng $1\ \mu\text{mol}$ p-nitrophenol/phút ở điều kiện chuẩn.
• Công thức tính hiệu suất chuyển hóa: $$H\ (%) = \frac{m_1 - m_2}{m_1} \times 100$$ (Trong đó: $m_1$ là hàm lượng isoflavone glycoside trước khi xử lý enzyme; $m_2$ là hàm lượng isoflavone glycoside sau khi xử lý).

---

Nội dung chính theo từng chương

Phần I. Giới thiệu về đậu tương và isoflavone

Chương tổng quan hệ thống hóa kiến thức về nguồn gốc thực vật học của đậu tương (Glycine max), tình hình canh tác tại Việt Nam và trên thế giới. Tác giả phân tích chi tiết các thành phần dinh dưỡng đa lượng và vi lượng trong hạt đậu tương nguyên liệu:

Thành phần dinh dưỡng	Hàm lượng trung bình (%)
Độ ẩm	8,0
Protein	40,0 (dao động 31,0 – 41,7%)
Lipid	20,0 (dao động 15,0 – 25,0%)
Gluxit	30,0 – 35,0 (hòa tan ~10%, không tan ~90%)
Tro (khoáng chất)	4,6 (Ca, P, Mn, Zn, Fe)
Pentosan	4,4
Chất xơ	3,5

Chương này cũng phân loại 12 dạng đồng phân isoflavone, đối chiếu cấu trúc hóa học giữa nhóm aglycone tự do (daidzein, genistein, glycitein) và glycoside liên kết. Tác giả tổng hợp các bằng chứng y sinh về tác dụng của isoflavone trong giảm hội chứng bốc hỏa thời kỳ tiền mãn kinh (giảm đến 40% số lần bốc hỏa sau 12 tuần bổ sung bột đậu tương), tăng mật độ khoáng chất xương quanh thắt lưng thêm 2,2%, hỗ trợ giãn mạch hạ huyết áp và làm giảm chỉ số kháng nguyên đặc hiệu tuyến tiền liệt (PSA). Đồng thời, tác giả nêu rõ ngưỡng dung nạp an toàn của isoflavone ở người trưởng thành là 70–75 mg/ngày và tổng hợp hàm lượng isoflavone có trong một số chế phẩm thương mại trong nước và quốc tế.

Phần II. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương II mô tả xuất xứ của 9 giống đậu tương cung cấp bởi Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, đặc tính hoạt lực của 3 chế phẩm enzyme thương mại (Lactozym 2600 U/ml, Sumizyme FP 172 U/g, Novozyme 188 250 U/g). Tác giả thiết lập sơ đồ quy trình công nghệ điều chế dịch sữa đậu nành nảy mầm kết hợp phân tích chi tiết từng bước chuẩn bị mẫu, quy trình chiết tách isoflavone bằng acetonitril – HCl, làm khô bằng khí nitơ và hòa tan lại trong methanol trước khi tiêm vào hệ thống sắc ký HPLC. Toàn bộ các công thức định lượng hóa học chuẩn độ protein, lipid, đường khử và xác định hoạt độ enzyme được trình bày với đầy đủ thông số hóa chất.

Phần III. Kết quả và thảo luận

Chương III trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được qua 3 nhóm nội dung chính:

1. Đánh giá và tuyển chọn giống đậu tương nguyên liệu

Phân tích hàm lượng isoflavone tổng số và tỷ lệ giữa hai dạng glycoside/aglycone trên 9 giống đậu tương thu hoạch tại Việt Nam:

STT	Giống đậu tương	Tổng isoflavone (mg/100g CK)	Tỷ lệ Glycoside (%)	Tỷ lệ Aglycone (%)
1	DT 12	152,0	98,35	1,65
2	DT 22	68,0	97,79	2,21
3	DT 26	134,2	97,76	2,24
4	DT 98	178,5	97,46	2,54
5	DT 2001	185,0	96,80	3,20
6	DT 2008	213,6	95,97	4,03
7	DT 2101	162,3	97,10	2,90
8	DT 9804	145,8	97,80	2,20
9	VX 93	174,0	96,84	3,16

Giống DT 2008 cho hàm lượng isoflavone tổng số cao nhất (213,6 mg/100g chất khô) và hàm lượng aglycone ban đầu đạt 4,03%, thích nghi tốt ở cả vụ Đông và Hè Thu trên cả hai miền Nam - Bắc nên được chọn làm nguyên liệu cho các công đoạn tiếp theo.

2. Tối ưu hóa quá trình thủy phân dịch sữa đậu tương bằng enzyme

• Lựa chọn chế phẩm enzyme: Khảo sát khả năng chuyển hóa của 3 loại enzyme cho thấy Sumizyme FP đạt hiệu suất 42,5%, Lactozym đạt 38,9% và Novozyme 188 đạt 35,6%. Do Sumizyme FP chứa phức hệ protease phụ trợ cắt mạch protein giúp enzyme tiếp cận cơ chất tốt hơn, nhưng Lactozym có giá thành thấp hơn đáng kể nên được lựa chọn để tối ưu hóa quy trình.
• Nồng độ enzyme: Khi tăng nồng độ Lactozym từ 0,5 đến 2,5 ml/l, hàm lượng daidzein tăng từ 4,10 lên 7,21 mg/100g và genistein tăng từ 7,25 lên 11,87 mg/100g. Mức 2,0 ml/l cho hàm lượng daidzein 6,95 mg/100g và genistein 11,46 mg/100g, chênh lệch không đáng kể so với mức 2,5 ml/l nên được chọn để tiết kiệm chi phí.
• Giá trị pH: pH 5,0 là điểm tối ưu giúp tạo ra hàm lượng aglycone cao nhất (daidzein: 5,04 mg/100g; genistein: 9,12 mg/100g). Ở pH thấp (<4,0) hoặc cao (>6,0), hoạt tính enzyme bị suy giảm rõ rệt.
• Nhiệt độ phản ứng: Nhiệt độ 40°C cho hoạt lực xúc tác tốt nhất (daidzein đạt 5,64 mg/100g; genistein đạt 9,61 mg/100g), vượt trội hơn so với các mức 30°C, 50°C và 60°C.
• Thời gian phản ứng: Quá trình chuyển hóa diễn ra mạnh nhất trong 4 giờ đầu. Mặc dù kéo dài đến 16–24 giờ hàm lượng aglycone tiếp tục tăng nhẹ (daidzein đạt 9,15–9,34 mg/100g; genistein đạt 13,51–13,62 mg/100g), nhưng thời gian dài ở 40°C gây biến đổi chất lượng cảm quan và dinh dưỡng của dịch sữa. Do đó, thời gian 4 giờ được lựa chọn là điểm dừng công nghệ thích hợp.

3. Tối ưu hóa chế độ sấy phun thu hồi bột sữa đậu tương nảy mầm

• Nhiệt độ không khí đầu vào: Ở 140°C, vòi phun bị tắc; ở 160°C bột bám thành buồng sấy nhiều (thu hồi 80,5%); ở 200°C sản phẩm bị sẫm màu và suy giảm isoflavone (còn 421,7 mg/100g). Nhiệt độ 180°C đạt hiệu suất thu hồi 87,4%, hàm lượng isoflavone 478,9 mg/100g, bột vàng sáng, tơi mịn.
• Lưu lượng nhập liệu: Mức 5 lít/h cho hiệu suất thu hồi 91,2% nhưng kéo dài thời gian sấy; các mức 7–8 lít/h làm giảm hiệu suất xuống 80,6% và 72,5%. Mức 6 lít/h là tối ưu với hiệu suất thu hồi đạt 89,4% và isoflavone đạt 480,2 mg/100g.
• Áp suất khí nén: Áp suất 5 bar (tương đương tốc độ đĩa quay khoảng 14.000 vòng/phút) cho hiệu suất thu hồi cao nhất đạt 93,5%, isoflavone tổng số đạt 492,5 mg/100g. Mức 3–4 bar bột kém tơi (thu hồi 80,2–85,4%), trong khi 6 bar làm hệ thống vận hành không ổn định (thu hồi giảm về 80,6%).

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả định lượng chính của đề tài

1. Đã sàng lọc được giống đậu tương DT 2008 có hàm lượng isoflavone tổng số cao nhất (213,6 mg/100g chất khô) trong số 9 giống khảo sát tại Việt Nam.
2. Xác lập được bộ thông số công nghệ tối ưu cho quá trình thủy phân chuyển hóa isoflavone từ dạng glycoside sang aglycone bằng enzyme Lactozym:
   • Chế phẩm enzyme: Lactozym (Novo Nordisk).
   • Nồng độ enzyme: 2,0 ml/l dịch sữa.
   • Độ pH môi trường: 5,0.
   • Nhiệt độ thủy phân: 40°C.
   • Thời gian thủy phân: 4 giờ.
3. Xác lập được chế độ vận hành tối ưu cho hệ thống thiết bị sấy phun:
   • Nhiệt độ không khí sấy đầu vào: 180°C.
   • Lưu lượng dòng nhập liệu: 6 lít/h.
   • Áp suất khí nén cấp đĩa quay: 5 bar.
   • Hiệu suất thu hồi sản phẩm: 93,5%.
4. Thành phẩm bột sữa đậu tương nảy mầm thu được có các chỉ tiêu chất lượng và cảm quan cụ thể:

STT	Chỉ tiêu chất lượng	Đơn vị tính	Kết quả phân tích
1	Độ ẩm	%	3,7
2	Isoflavone tổng số	mg/100g	492,5
3	Isoflavone dạng aglycone	mg/100g	191,5
4	Protein thô	%	52,5
5	Lipid	%	23,4
6	Gluxit	%	19,4
7	Màu sắc cảm quan	–	Màu vàng sáng
8	Mùi vị	–	Mùi thơm đặc trưng của đậu tương nảy mầm
9	Trạng thái vật lý	–	Dạng bột tơi, mịn, đồng nhất

Đóng góp thực tiễn của khóa luận

Khóa luận đã xây dựng thành công quy trình công nghệ hoàn chỉnh từ khâu xử lý nguyên liệu hạt nảy mầm, đường phân enzyme đến công đoạn sấy phun tạo sản phẩm bột giàu isoflavone dạng aglycone (191,5 mg/100g). Nghiên cứu mở ra khả năng tận dụng nguồn enzyme thương mại giá thành hợp lý (Lactozym) để thay thế quy trình lên men vi sinh truyền thống phức tạp, rút ngắn thời gian sản xuất và tạo ra dạng bột dinh dưỡng tiện dụng, dễ tiêu hóa và kiểm soát được liều lượng hoạt chất sinh học.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Dựa trên phạm vi thực nghiệm của khóa luận tốt nghiệp:

• Hạn chế: Quy trình thực nghiệm mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm và pilot nhỏ với các mẻ sấy dung tích giới hạn; chưa khảo sát sự biến đổi hoạt tính chống oxy hóa in vitro/in vivo của chế phẩm sau khi sấy phun; chưa theo dõi độ ổn định và thời hạn bảo quản của bột sữa trong các điều kiện bao bì khác nhau.
• Hướng mở rộng:
  1. Thử nghiệm mở rộng quy mô sản xuất bán công nghiệp để đánh giá đầy đủ các chỉ số tiêu hao năng lượng và khấu hao thiết bị.
  2. Nghiên cứu bổ sung chất mang (như maltodextrin, gum arabic) nhằm đánh giá khả năng bảo vệ hoạt chất isoflavone dưới tác động nhiệt của buồng sấy phun.
  3. Khảo sát thời hạn sử dụng và đánh giá hoạt tính sinh học của chế phẩm bột trên mô hình động vật thực nghiệm.

---

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo thiết thực cho:

• Sinh viên và học viên ngành Công nghệ Sinh học, Công nghệ Thực phẩm, Dinh dưỡng học: Tham khảo quy trình phân tích định tính và định lượng 12 dạng đồng phân isoflavone bằng phương pháp HPLC; các phương pháp hóa lý tiêu chuẩn (Kjeldahl, Soxhlet, Bertrand) và phương pháp xác định hoạt độ enzyme $\beta$-glucosidase bằng cơ chất p-NPG.
• Kỹ sư công nghệ và nhà phát triển sản phẩm thực phẩm chức năng: Tham khảo thông số công nghệ sấy phun dịch sữa thực vật nảy mầm và phương pháp ứng dụng enzyme $\beta$-galactosidase thương mại trong thủy phân hoạt chất thực vật.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Vì sao đề tài chọn giống đậu tương DT 2008 làm nguyên liệu nghiên cứu chính?

Trong 9 giống đậu tương khảo sát (DT 12, DT 22, DT 26, DT 98, DT 2001, DT 2008, DT 2101, DT 9804, VX 93), giống DT 2008 có hàm lượng isoflavone tổng số cao nhất (213,6 mg/100g chất khô) và hàm lượng isoflavone dạng aglycone ban đầu đạt 4,03%. Đồng thời, DT 2008 là giống đậu tương phổ biến, được gieo trồng rộng rãi ở cả miền Bắc và miền Nam tại 2 vụ chính (Đông và Hè Thu), đảm bảo nguồn cung nguyên liệu ổn định cho sản xuất.

2. Tại sao chế phẩm enzyme Lactozym được chọn dù Sumizyme FP cho hiệu suất chuyển hóa cao hơn?

Sumizyme FP cho hiệu suất chuyển hóa isoflavone đạt 42,5% (nhờ chứa thêm hoạt tính protease phân cắt liên kết protein - isoflavone), cao hơn so với Lactozym (38,9%). Tuy nhiên, chế phẩm Lactozym có giá thành phẩm thương mại rẻ hơn nhiều và vẫn đảm bảo hiệu suất chuyển hóa xấp xỉ, giúp nâng cao tính khả thi về mặt kinh tế khi ứng dụng sản xuất quy mô công nghiệp.

3. Điều kiện tối ưu của quá trình thủy phân sữa đậu tương bằng enzyme Lactozym là gì?

Quá trình thủy phân đạt hiệu quả cao nhất ở nồng độ enzyme Lactozym 2,0 ml/l, độ pH môi trường bằng 5,0, nhiệt độ phản ứng duy trì ở 40°C trong thời gian 4 giờ.

4. Vì sao tác giả chọn thời gian thủy phân là 4 giờ dù kéo dài đến 24 giờ hàm lượng aglycone vẫn tăng?

Trong 4 giờ đầu, phản ứng thủy phân diễn ra nhanh nhất và đạt tỷ lệ chuyển hóa lớn. Kéo dài thời gian thủy phân lên 16–24 giờ ở nhiệt độ 40°C tuy làm hàm lượng aglycone tăng nhẹ nhưng có nguy cơ làm chua dịch sữa, biến tính protein và ảnh hưởng xấu đến chất lượng dinh dưỡng cũng như cảm quan của sản phẩm sau này.

5. Thông số công nghệ sấy phun tối ưu và chất lượng sản phẩm cuối cùng đạt được như thế nào?

Chế độ sấy phun tối ưu gồm: nhiệt độ không khí đầu vào 180°C, lưu lượng nhập liệu 6 lít/h, áp suất khí nén 5 bar. Sản phẩm bột sữa thu được đạt hiệu suất thu hồi 93,5%, độ ẩm 3,7%, hàm lượng isoflavone tổng số đạt 492,5 mg/100g (trong đó isoflavone aglycone đạt 191,5 mg/100g), protein thô 52,5%, lipid 23,4%, gluxit 19,4%, bột có màu vàng sáng, tơi mịn và mùi thơm đặc trưng.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Lê Thị Lý đã nghiên cứu thành công quy trình ứng dụng enzyme Lactozym nhằm nâng cao hàm lượng isoflavone dạng aglycone từ dịch sữa đậu tương nảy mầm giống DT 2008. Bằng việc tối ưu hóa đồng bộ các điều kiện thủy phân enzyme (nồng độ 2 ml/l, pH 5,0, nhiệt độ 40°C, thời gian 4 giờ) và chế độ vận hành sấy phun (nhiệt độ đầu vào 180°C, lưu lượng 6 lít/h, áp suất khí nén 5 bar), đề tài đã tạo ra sản phẩm bột sữa đậu tương nảy mầm có hàm lượng isoflavone aglycone đạt 191,5 mg/100g cùng giá trị dinh dưỡng và cảm quan tốt. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm hoàn chỉnh, có giá trị ứng dụng cao cho lĩnh vực chế biến thực phẩm chức năng và công nghệ sinh học sau thu hoạch.

Trích đoạn nội dung tài liệu

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ------ --------------- KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU ÚNG DỤNG ENZYME TRONG CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHÉ PHẨM ISOFLAVONE DẠNG AGLYCONE Ngưòi hướng dẫn : TS. TRUONG HƯƠNG LAN Sinh viên thực hiện : LÊ THỊ LÝ Lớp : TP CNSH 11.03 Khóa luận tất nghiệp Lời cảm on Sau quá trình học tập, nghiên cứu và tiến hành thí nghiệm đế hoàn thành khóa luận này, trước tiên tôi xin cám on sâu sắc tới TS. Trương Hương Lan, chủ nhiệm bộ môn Thực phẩm và dinh dưỡng - Viện Công Nghiệp Thực Phấm đã tận tình hướng dẫn, cung cấp những thông tin quý giá và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Tôi cũng xin câm ơn các cán bộ của Bộ môn Thực phẩm và dinh dường - Viện Công Nghiệp Thực Pham đã giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đe tài.

Qua đây tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo cùng tập the cán bộ, nhân viên khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mờ Hà Nội đã dạy dồ, chi bảo tận tình trong quãng thời gian 4 năm học tại trường. Cuối cùng tôi xin cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ, động viên cùa gia đình và bạn bè đã dành cho tôi trong suốt quãng thời gian qua. Thư viẹn Viện Đại học Mở Hà Nội Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2015 Sinh Viên Lê Thị Lý Lê Thị Lý Lớp: 1103 Khóa luận tất nghiệp MỤC LỤC Lời cảm on MỤC LỤC KÍ HIỆU VÀ VIẾT TAT DANH MỤC BẢNG BIÊU DANH MỤC HÌNH VẼ MỞDÀU. Giới thiệu về đậu tương.

Các thành phầncó giátrị dinh dưỡng trong đậu tương. 5 ,, „, Tlur viện Viện Đại học Mở Hà Nội 1. Vitamin và khoángchất. Isoflavone trong đậu tương.

Cấu trúc isoflavone. Hàm lượng isoflavone trong thực plĩâm từ đậu tương. Lợi ích cùa isoflavone đoi với sức khỏe. Tính an toàn của isoflavone trong đậu tương.

Sự chuyển hóa isoflavone từ glycoside sang aglycone trong đậu tương bằng enzyme. Một số thực phẩm giàu isoflavone trên thị trường Việt Nam và Thế Giới. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP. Nguyên vật liệu.

20 Lê Thị Lý Lớp: lltrì Khóa luận tất nghiệp 2. Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp công nghệ. Phương pháp phân tích lý hỏa.

KÉT QUẢ VÃ THẢO LUẬN. Lựa chọn nguyên liệu đậu tương có hàm lượng isollavone cao. Nghiên cứu chuyến hóa isoflavone từ dạng glycoside sang dạng aglycone trong sữa đậu nành bằng enzyme. Nghiên cứu lựa chọn enzyme thích hợp đế nâng cao hiệu suất chuyên hóa32 3.

Nghiên cứu nồng độ enzyme tối ưu đế nâng cao hiệu suất chuyến hóa. Nghiên cứu pH tối ưu đê nâng cao hiệu suất chuyên hóa. Nghiên cứu nhiệt độ toi ưu đe năng cao hiệu suất chuyến hóa. Nghiên cứu thời gian tối ưu cho quá trình thúy phân sữa đậu tương bang chê phẩm enzyme Lactozym.

Nghiên cứu thu nhận che phâm sữa bột đậu tương nảy mầm. Nghiên nhiẹt độẽỉầu btòt. Nghiên cứu xác định lưu lượng dòng nhập liệu. Nghiên cứu xác định ảnh hưởng của áp suất khí nén.

45 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 46 Lê Thị Lý Lớp: lioẳ Khóa luận tất nghiệp DANH MỤC CÁC KÝ KIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đií DAD Diode Array Detection ER Estrogen receptor - Thụ thê estrogen FDA Food and Frug Administratio - Cục Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ GH Glycoside hydrolase HPLC High Performance Liquid Chromatography - Sac ký lóng hiệu năng cao LDL-cholesterol Low density lipoprotein cholesterol - Cholestero Hiên ket Lipoprotein .