Nghiên Cứu Ứng Dụng Công Nghệ CRISPR/Cas9 Để Nâng Cao Tính Kháng Bệnh Bạc Lá Ở Giống Lúa Bắc Thơm 7

Nghiên cứu ứng dụng công nghệ CRISPR/Cas9 chỉnh sửa promoter OsSweet14 nhằm nâng cao khả năng kháng bệnh bạc lá ở giống lúa Bắc Thơm 7.

• Tác giả: Vũ Hoài Sâm
• Người hướng dẫn: PTS. Phạm Xuân Hội
• Trường học: Viện Khoa Học Nông Nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Ứng Dụng Công Nghệ CRISPR/Cas9 Nâng Cao Tính Kháng Bệnh Bạc Lá Ở Giống Lúa Bắc Thơm 7
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỞ ĐẦU
• 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU VỀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
• 2.1. Giới thiệu về công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9
• 2.1.1. Giới thiệu chung về công nghệ chỉnh sửa gen
• 2.1.2. Cấu trúc và cơ chế chỉnh sửa của công nghệ CRISPR/Cas9
• 2.1.3. Ứng dụng hệ thống CRISPR/Cas9 trong khoa học cây trồng
• 2.2. Giới thiệu về bệnh bạc lá ở lúa và vi khuẩn gây bệnh
• 2.2.1. Vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa
• 2.2.2. Gen OsSWEET14 và mối liên hệ với vi khuẩn Xoo gây bệnh bạc lá lúa
• 2.3. Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá
• 2.3.1. Nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá dựa trên gen kháng
• 2.3.2. Nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bạc lá dựa trên gen “nhiễm”
• 2.4. Giống lúa BT7 và các nghiên cứu cải tiến giống lúa BT7
• 2.4.1. Giới thiệu chung về giống lúa BT7
• 2.4.2. Bệnh bạc lá trên giống lúa BT7
• 2.4.3. Nghiên cứu cải tiến di truyền giống lúa BT7
• 2.5. Chuyển gen vào lúa thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
• 2.5.1. Vai trò của chuyển gen nhờ A. tumefaciens đối với CRISPR/Cas9
• 2.5.2. Hiệu quả chuyển gen lúa nhờ A.
• 2.5.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen vào IE lúa
• 2.5.4. Nghiên cứu chuyển gen vào giống lúa BT7 nhờ A.
• 3. NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 3.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.2. Vật liệu nghiên cứu
• 3.3. Nội dung nghiên cứu
• 3.4. Phương pháp nghiên cứu
• 3.4.1. Các kĩ thuật chung trong nghiên cứu sinh học phân tử
• 3.4.2. Tối ưu quy trình chuyển gen vào giống lúa BT7 sử dụng IE
• 3.4.3. Đánh giá sự tương tác giữa vi khuẩn Xoo và OsSWEET14 trên BT7
• 3.4.4. Thiết kế cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW14-BT
• 3.4.5. Tạo dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT
• 3.4.6. Đánh giá đặc điểm của dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT
• 3.5. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen vào IE giống lúa BT7
• 4.1.1. Tối ưu hệ thống tái sinh in vitro từ IE cho giống lúa BT7
• 4.1.2. Tối ưu quy trình chuyển gen vào IE lúa BT7 qua A.
• 4.1.3. Quy trình chuyển gen vào IE giống lúa BT7 thông qua A.
• 4.2. Thiết kế cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW14-BT
• 4.2.1. Nghiên cứu sự tương tác giữa VXO và OsSWEET14 ở giống lúa BT7
• 4.2.2. Thiết kế cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW14-BT
• 4.2.3. Tạo dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT
• 4.3. Chuyển cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW14-BT vào lúa BT7
• 4.3.1. Sàng lọc kiểu gen và kiểu hình của dòng lúa BT7 tái sinh
• 4.3.2. Sàng lọc kiểu gen và kiểu hình của dòng lúa BT7 chỉnh sửa gen T1
• 4.4. Đánh giá đặc điểm của lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT
• 4.4.1. Đánh giá đặc điểm nông sinh học dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT
• 4.4.2. Nghiên cứu biểu hiện OsSWEET14 trong dòng lúa chỉnh sửa SW14-BT
• 4.4.3. Đánh giá khả năng kháng bạc lá của lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT
• 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Công Nghệ CRISPR Cas9 Chỉnh Sửa Gen Lúa BT7

Công nghệ CRISPR/Cas9 là một cuộc cách mạng trong nghiên cứu di truyền và công nghệ sinh học, cho phép các nhà khoa học chỉnh sửa biến đổi gen một cách chính xác và hiệu quả. Hệ thống này tạo ra các đứt gãy DNA sợi đôi tại các vị trí cụ thể trong hệ gen, từ đó kích hoạt cơ chế sửa chữa DNA tự nhiên của tế bào để tạo ra các đột biến có chủ đích. Ứng dụng CRISPR/Cas9 trong chọn giống cây trồng giúp khắc phục những hạn chế của phương pháp truyền thống, tiết kiệm thời gian, chi phí và giữ lại các đặc tính nông sinh học quý giá của giống gốc. Việc ứng dụng công nghệ này mở ra cơ hội mới cho việc cải thiện phẩm chất giống ở nhiều loại cây trồng, bao gồm cả giống lúa Bắc Thơm 7 ở Việt Nam. Công nghệ này hứa hẹn sẽ đóng góp vào sự phát triển của nông nghiệp công nghệ cao và phát triển nông nghiệp bền vững.

1.1. Giới Thiệu Chi Tiết Về Công Nghệ Chỉnh Sửa Gen

Chỉnh sửa gen, hay còn gọi là chỉnh sửa hệ gen, là tập hợp các công cụ cho phép các nhà khoa học thay đổi DNA của sinh vật. Công nghệ này có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, từ y học đến nông nghiệp. CRISPR/Cas9 là một trong những công cụ chỉnh sửa gen mạnh mẽ và chính xác nhất hiện nay. Công nghệ này có thể được sử dụng để loại bỏ các gen gây bệnh, thêm các gen có lợi, hoặc thay đổi các gen hiện có để cải thiện các đặc tính của sinh vật. Việc ứng dụng công nghệ này đã tạo ra một cuộc cách mạng trong nghiên cứu khoa học sự sống nói chung và khoa học nông nghiệp nói riêng, mang lại cơ hội mới cho lĩnh vực chọn giống chính xác, đang và sẽ góp phần nâng cao phẩm chất giống ở nhiều loại cây trồng ở Việt Nam.

1.2. Cấu Trúc và Cơ Chế Hoạt Động Của CRISPR Cas9

Hệ thống CRISPR/Cas9 bao gồm hai thành phần chính: protein Cas9 và phân tử RNA dẫn đường (gRNA). Protein Cas9 là một enzyme có chức năng cắt DNA. Phân tử gRNA là một đoạn RNA ngắn có trình tự bổ sung với trình tự DNA mục tiêu. Khi gRNA liên kết với trình tự DNA mục tiêu, protein Cas9 sẽ cắt DNA tại vị trí đó. Sau khi DNA bị cắt, tế bào sẽ kích hoạt cơ chế sửa chữa DNA tự nhiên để vá lại chỗ đứt. Các nhà khoa học có thể lợi dụng cơ chế này để tạo ra các đột biến có chủ đích trong hệ gen. CRISPR/Cas9 tạo ra đứt gãy DNA sợi đôi tại vị trí xác định trong hệ gen và thông qua cơ chế tự sửa chữa DNA của tế bào để tạo ra những đột biến có chủ đích trong hệ gen.

II. Bệnh Bạc Lá Lúa Thách Thức và Giải Pháp CRISPR Cas9

Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) gây ra là một trong những bệnh hại nguy hiểm nhất trên lúa, gây thiệt hại lớn đến năng suất lúa và chất lượng lúa. Các biện pháp phòng trừ thông thường thường không hiệu quả. Sử dụng giống lúa kháng bệnh là giải pháp tối ưu. Giống lúa Bắc Thơm 7 (BT7) là giống chủ lực ở miền Bắc, nổi tiếng với chất lượng gạo thơm ngon và năng suất cao. Tuy nhiên, giống này lại rất mẫn cảm với bệnh bạc lá. Nghiên cứu tạo giống BT7 kháng bệnh là rất cần thiết để đảm bảo sản xuất lúa gạo bền vững. Công nghệ CRISPR/Cas9 mở ra hướng đi mới trong việc tạo ra các giống lúa kháng bệnh, giúp giảm thiểu thiệt hại do bệnh bạc lá gây ra.

2.1. Tác Nhân Gây Bệnh Bạc Lá Lúa Vi Khuẩn Xoo

Vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) là tác nhân chính gây ra bệnh bạc lá lúa. Vi khuẩn này xâm nhập vào cây lúa thông qua các vết thương hoặc lỗ khí khổng, sau đó lan truyền trong hệ thống mạch dẫn của cây. Xoo gây ra các triệu chứng như lá lúa bị úa vàng, khô héo và chết dần. Bệnh có thể lây lan nhanh chóng trong điều kiện thời tiết ẩm ướt và gây thiệt hại nghiêm trọng đến năng suất lúa. Việc kiểm soát Xoo là một thách thức lớn đối với người trồng lúa.

2.2. Gen OsSWEET14 và Vai Trò Trong Quá Trình Gây Bệnh

OsSWEET14 là một gen quan trọng liên quan đến bệnh bạc lá ở lúa. Gen này mã hóa protein vận chuyển đường, giúp vi khuẩn Xoo hấp thụ chất dinh dưỡng từ cây lúa. Khi OsSWEET14 được kích hoạt bởi các protein TAL của Xoo, tế bào thực vật sẽ tăng cường vận chuyển đường đến gian bào, cung cấp dinh dưỡng cho Xoo sinh trưởng và phát triển. Do đó, OsSWEET14 được coi là một gen “nhiễm” quan trọng trong quá trình gây bệnh bạc lá.

III. Phương Pháp CRISPR Cas9 Chỉnh Sửa Gen OsSWEET14 Kháng Bệnh

Việc gây đột biến chính xác trên vùng promoter của gen OsSWEET14 bằng công nghệ CRISPR/Cas9 là một chiến lược đầy hứa hẹn để cải thiện tính kháng bệnh bạc lá cho các giống lúa chủ lực. Các đột biến tại vị trí liên kết (EBE) với protein TAL có thể phá vỡ mối liên kết giữa protein TAL của Xoo và gen “nhiễm”, từ đó tạo ra tính kháng bệnh cho cây lúa. Đây là một hướng nghiên cứu mới và đầy tiềm năng trong lĩnh vực cải thiện giống lúa.

3.1. Thiết Kế Cấu Trúc T DNA Chỉnh Sửa SW14 BT

Cấu trúc T-DNA được thiết kế để mang phức hệ CRISPR/Cas9 và gRNA (RNA dẫn đường) đặc hiệu cho vùng promoter của gen OsSWEET14 (SW14-BT) trong giống lúa Bắc Thơm 7. gRNA sẽ dẫn protein Cas9 đến vị trí mục tiêu trên SW14-BT, nơi Cas9 sẽ cắt DNA. Quá trình sửa chữa DNA sau đó có thể tạo ra các đột biến nhỏ, làm thay đổi khả năng liên kết của protein TAL từ Xoo với promoter, từ đó giảm sự biểu hiện của gen OsSWEET14 và tăng tính kháng bệnh.

3.2. Tạo Dòng Lúa BT7 Chỉnh Sửa SW14 BT Bằng CRISPR Cas9

Sau khi thiết kế cấu trúc T-DNA, nó được đưa vào tế bào lúa thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Các tế bào lúa được biến đổi gen sẽ được nuôi cấy để tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Các cây này sau đó được sàng lọc để xác định những cây mang đột biến trên SW14-BT. Các dòng lúa mang đột biến mong muốn sẽ được chọn lọc và đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá.

IV. Ứng Dụng CRISPR Cas9 Kết Quả Nghiên Cứu và Đánh Giá

Nghiên cứu đã tạo ra các dòng lúa BT7 mang đột biến chính xác trên SW14-BT bằng hệ thống CRISPR/Cas9. Các dòng lúa này được sàng lọc để tìm ra những dòng có khả năng kháng vi khuẩn Xoo Việt Nam. Kết quả cho thấy một số dòng lúa BT7 chỉnh sửa gen thể hiện khả năng kháng bệnh tốt hơn so với giống đối chứng. Đây là một bước tiến quan trọng trong việc cải thiện giống lúa và giảm thiểu thiệt hại do bệnh bạc lá gây ra.

4.1. Đánh Giá Đặc Điểm Nông Sinh Học Của Dòng Lúa BT7 Chỉnh Sửa

Các dòng lúa BT7 chỉnh sửa gen được đánh giá về các đặc điểm nông sinh học quan trọng như chiều cao cây, số bông trên khóm, số hạt trên bông, thời gian sinh trưởng và năng suất. Mục tiêu là đảm bảo rằng việc chỉnh sửa gen không ảnh hưởng tiêu cực đến các đặc tính quan trọng của giống lúa. Các dòng lúa có đặc điểm nông sinh học tương đương hoặc tốt hơn so với giống đối chứng sẽ được ưu tiên lựa chọn.

4.2. Nghiên Cứu Biểu Hiện OsSWEET14 Trong Dòng Lúa Chỉnh Sửa

Mức độ biểu hiện của gen OsSWEET14 trong các dòng lúa BT7 chỉnh sửa gen được nghiên cứu để xác định xem việc chỉnh sửa promoter có thực sự làm giảm sự biểu hiện của gen này hay không. Các phương pháp như RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) được sử dụng để đo lượng mRNA của OsSWEET14 trong các mẫu lá lúa. Kết quả này giúp xác nhận cơ chế kháng bệnh của các dòng lúa chỉnh sửa gen.

4.3. Đánh Giá Khả Năng Kháng Bạc Lá Của Lúa BT7 Chỉnh Sửa

Khả năng kháng bệnh bạc lá của các dòng lúa BT7 chỉnh sửa gen được đánh giá bằng cách lây nhiễm nhân tạo vi khuẩn Xoo. Mức độ bệnh trên các dòng lúa chỉnh sửa gen được so sánh với giống đối chứng để xác định mức độ kháng bệnh. Các dòng lúa thể hiện khả năng kháng bệnh cao sẽ được chọn lọc để tiếp tục nghiên cứu và phát triển.

V. Kết Luận và Triển Vọng CRISPR Cas9 Cải Tạo Giống Lúa

Nghiên cứu đã chứng minh tiềm năng của công nghệ CRISPR/Cas9 trong việc cải thiện giống lúa và tăng cường tính kháng bệnh bạc lá. Các dòng lúa BT7 chỉnh sửa gen thể hiện khả năng kháng bệnh tốt và có các đặc điểm nông sinh học tương đương với giống đối chứng. Đây là một bước tiến quan trọng trong việc phát triển các giống lúa kháng bệnh, giúp giảm thiểu thiệt hại do bệnh bạc lá gây ra và đảm bảo an ninh lương thực. Công nghệ này có thể được áp dụng để cải thiện các đặc tính khác của lúa, như năng suất, chất lượng gạo và khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi.

5.1. Ý Nghĩa Khoa Học và Thực Tiễn Của Nghiên Cứu

Nghiên cứu này cung cấp các dẫn liệu khoa học quan trọng về cơ chế gây bệnh của vi khuẩn Xoo và vai trò của gen OsSWEET14 trong quá trình này. Kết quả nghiên cứu cũng chứng minh tính hiệu quả của công nghệ CRISPR/Cas9 trong việc tạo ra các giống lúa kháng bệnh. Về mặt thực tiễn, nghiên cứu đã tạo ra các dòng lúa BT7 chỉnh sửa gen có tiềm năng được sử dụng để phát triển các giống lúa kháng bệnh bạc lá trong tương lai.

5.2. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo và Ứng Dụng Rộng Rãi

Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc đánh giá hiệu quả kháng bệnh của các dòng lúa BT7 chỉnh sửa gen trong điều kiện đồng ruộng, cũng như nghiên cứu cơ chế kháng bệnh ở mức độ phân tử chi tiết hơn. Công nghệ CRISPR/Cas9 cũng có thể được áp dụng để cải thiện các đặc tính khác của lúa, như năng suất, chất lượng gạo và khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi. Ngoài ra, công nghệ này có thể được sử dụng để cải thiện các loại cây trồng khác, góp phần vào sự phát triển của nông nghiệp bền vững.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Bệnh bạc lá lúa (Bacterial Leaf Blight - BLB) do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) gây ra là một trong những dịch bệnh gây thiệt hại nặng nề nhất đối với sản xuất lúa gạo tại Việt Nam và trên thế giới, làm giảm năng suất từ 20% đến 50%, thậm chí lên đến 100% trong điều kiện dịch bùng phát. Các biện pháp phòng trừ hóa học và canh tác thông thường ít mang lại hiệu quả; do đó, chọn tạo giống lúa mang tính kháng bền vững là giải pháp kinh tế và an toàn sinh học hàng đầu.

Giống lúa Bắc thơm 7 (BT7) là giống lúa thuần nhập nội thuộc loài phụ indica, được công nhận và gieo trồng rộng rãi tại các tỉnh phía Bắc Việt Nam nhờ năng suất khá (50–55 tạ/ha) và chất lượng gạo ngon, dẻo, thơm, hàm lượng amylose đạt từ 13% đến 19%. Tại một số địa phương như Nam Định, diện tích gieo trồng BT7 từng chiếm tới 63,03% (năm 2021). Tuy nhiên, giống BT7 có nhược điểm lớn là rất mẫn cảm với bệnh bạc lá (mức nhiễm điểm 5 đến điểm 9 trong các đánh giá lây nhiễm nhân tạo và đồng ruộng), gây suy giảm năng suất nghiêm trọng trong vụ Mùa.

Vi khuẩn Xoo xâm nhiễm vào mô mạch lá lúa thông qua hệ thống tiết loại III (Type III secretion system - T3SS) và giải phóng các protein hoạt hóa phiên mã (Transcription activator-like effectors - TALE hay protein TAL). Các protein TAL này liên kết đặc hiệu vào các yếu tố liên kết thụ thể (Effector binding elements - EBE) nằm trên vùng khởi động (promoter) của các gen "nhiễm" (Susceptibility gene - gen S) thuộc họ vận chuyển đường SWEET (đặc biệt là OsSWEET14), hoạt hóa quá trình phiên mã gen nhằm kích thích vận chuyển đường ra gian bào, cung cấp dinh dưỡng cho vi khuẩn phát triển. Việc chọn giống truyền thống hoặc lai quy tụ gen kháng (Xa) gặp nhiều hạn chế do tốn thời gian, nguy cơ kéo theo các tính trạng xấu và vi khuẩn có thể biến chủng để bẻ gãy tính kháng. Khoảng trống nghiên cứu được luận án giải quyết là ứng dụng công nghệ chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas9 nhằm gây đột biến chính xác tại vùng EBE trên promoter OsSWEET14 của giống lúa BT7 (ký hiệu: SW14-BT), phá vỡ liên kết với protein TAL của Xoo, từ đó tạo ra dòng lúa BT7 kháng bệnh bạc lá nhưng vẫn giữ nguyên vẹn nền di truyền và các đặc tính nông sinh học quý của giống gốc.

Mục tiêu chung của luận án là ứng dụng công nghệ CRISPR/Cas9 để tăng cường tính kháng bệnh bạc lá cho giống lúa BT7 thông qua chỉnh sửa promoter OsSWEET14.

Các mục tiêu cụ thể gồm:

1. Tối ưu quy trình chuyển gen vào phôi non (Immature embryos - IE) giống lúa BT7 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
2. Thiết kế cấu trúc T-DNA biểu hiện phức hệ CRISPR/Cas9 chỉnh sửa promoter OsSWEET14 của giống lúa BT7 (SW14-BT).
3. Tạo dòng lúa BT7 mang đột biến chính xác trên SW14-BT bằng hệ thống CRISPR/Cas9.
4. Sàng lọc dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT tăng cường tính kháng với vi khuẩn Xoo Việt Nam.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Giống lúa Bắc thơm 7 (BT7); các chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae thu thập tại Việt Nam (ký hiệu VXO, bao gồm VXO_11, VXO_60, VXO_96); đoạn promoter gen OsSWEET14; hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9; chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
• Phạm vi không gian: Thí nghiệm vi sinh vật, nuôi cấy mô in vitro và sinh học phân tử được thực hiện tại Bộ môn Bệnh học Phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp. Thí nghiệm nông học, gieo trồng và đánh giá tính kháng bệnh nhân tạo được thực hiện tại nhà lưới an toàn sinh học của Viện Di truyền Nông nghiệp (số 1 đường Phạm Văn Đồng, Bắc Từ Liêm, Hà Nội).
• Phạm vi thời gian: Từ tháng 08/2017 đến tháng 12/2021.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã tổng quan hệ thống các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến công nghệ chỉnh sửa gen, bệnh bạc lá lúa, cơ chế phân tử tương tác giữa vi khuẩn Xoo và cây lúa, cũng như kỹ thuật chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens.

Về công nghệ chỉnh sửa gen, lịch sử phát triển trải qua bốn thế hệ công cụ nuclease định hướng: Meganuclease, ZFN (Zinc-Finger Nuclease), TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nuclease) và CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas protein). Kể từ công bố nền tảng của Jinek và cộng sự (2012), hệ thống CRISPR/Cas9 từ Streptococcus pyogenes đã trở thành công cụ chỉnh sửa gen phổ biến nhờ cấu trúc gồm protein nuclease Cas9 và phân tử RNA dẫn đường đơn (sgRNA), nhận biết trình tự bảo thủ liền kề protospacer (PAM 5'-NGG-3') và tạo vết cắt đứt gãy sợi đôi (DSB) cách PAM 3 nucleotide. Tế bào thực vật tự sửa chữa DSB theo hai con đường chính: ghép nối tận cùng không tương đồng (NHEJ - con đường dễ phát sinh đột biến mất hoặc chèn nucleotide) hoặc sửa chữa định hướng tương đồng (HDR - yêu cầu trình tự khuôn).

Đặc điểm	Meganuclease	ZFN	TALEN	CRISPR/Cas9
Nguồn gốc	Sinh vật nhân sơ	Sinh vật nhân sơ và nhân thực	Vi khuẩn Xanthomonas	Streptococcus pyogenes
Mô-đun liên kết	DNA – Protein	DNA – Protein	DNA – Protein	DNA – RNA
Mô-đun cắt	Cặp Protein	Cặp Protein (FokI)	Cặp Protein (FokI)	Protein đơn Cas9 + gRNA
Chiều dài trình tự đích	12 – 40 bp	18 – 24 bp	24 – 59 bp	20 bp
Tần suất điểm cắt	1/1.000 bp	1/140 bp	1 tiểu đơn vị/1 bp	1/13 bp (PAM)
Độ đặc hiệu	Trung bình	Trung bình	Trung bình	Cao
Tính khả thi thí nghiệm	Đắt đỏ, tốn thời gian	Phức tạp, đắt đỏ	Nhanh, đơn giản, chi phí thấp	Nhanh, đơn giản, giá rẻ

Về cơ chế phân tử của bệnh bạc lá và gen SWEET, các nghiên cứu của Chen và cộng sự (2010), Antony và cộng sự (2010) đã xác định 5 trong số 22 gen thuộc họ SWEET ở lúa là gen "nhiễm" bị vi khuẩn Xoo lợi dụng: OsSWEET11 (Os8N3/Xa13), OsSWEET12, OsSWEET13 (Xa25), OsSWEET14 (Os11N3/xa41), và OsSWEET15. Trong đó, promoter của OsSWEET14 chứa 4 vị trí EBE chồng lấn hoặc gần kề được nhận biết bởi các protein TAL độc từ các chủng Xoo khác nhau: EBE AvrXa7 (từ chủng PXO86), EBE PthXo3 (từ chủng PXO61), EBE Tal5/TalF (từ chủng MAL1) và EBE TalC (từ chủng BAI3). Nghiên cứu của Hutin và cộng sự (2015) trên 169 giống lúa châu Phi đã phát hiện alen tự nhiên xa41(t) mang đột biến mất 18 bp trên promoter OsSWEET14, giúp cây kháng phổ rộng nhiều chủng Xoo. Nghiên cứu của Blanvillain-Baufumé và cộng sự (2017) sử dụng công nghệ dTALEN chứng minh việc đột biến mất đoạn nhỏ (indel) tại EBE AvrXa7 và Tal5 đủ để tạo tính kháng bệnh bạc lá. Các nghiên cứu quốc tế sau đó của Li và cộng sự (2012), Oliva và cộng sự (2019), Xu và cộng sự (2019), Zafar và cộng sự (2020) đã ứng dụng TALEN hoặc CRISPR/Cas9 để chỉnh sửa promoter SWEET trên các giống lúa Kitaake, IR64, Ciherang-Sub1 và Basmati.

Tại Việt Nam, các nghiên cứu dịch tễ của Lưu Văn Quyết (2012), Nguyễn Huy Mạnh và cộng sự (2013), Nguyễn Thị Thơ và cộng sự (2022) chỉ ra rằng quần thể vi khuẩn Xoo tại các tỉnh miền Bắc có tính đa dạng di truyền rất cao, nhiều chủng có khả năng bẻ gãy tính kháng của các đơn gen Xa (như Xa21). Các nghiên cứu cải tiến giống lúa BT7 trước đây chủ yếu sử dụng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS) kết hợp lai trở lại để chuyển gen kháng Xa21, xa5 (Phạm Thiên Thành; Nguyễn Huy Mạnh) hoặc tích hợp locus chịu ngập Sub1 và chịu mặn Saltol (Chu Đức Hà và cộng sự, 2019).

Khoảng trống nghiên cứu: Chưa có công trình nào tại Việt Nam nghiên cứu cải tạo tính kháng bệnh bạc lá cho giống lúa thuần chủ lực dựa trên tương tác giữa protein TAL và gen "nhiễm" bằng công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9. Luận án này là công trình đầu tiên tại Việt Nam tiếp cận theo hướng tạo đột biến điểm chính xác trên vùng promoter OsSWEET14 của giống lúa BT7 nhằm thu nhận dòng lúa mang tính kháng ổn định và không chứa DNA chuyển gen ngoại lai (T-DNA free).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết về sinh học phân tử thực vật, di truyền học và bệnh học phân tử:

• Khung lý thuyết tương tác mầm bệnh - cây chủ: Vi khuẩn Xoo tiết protein TAL qua hệ thống T3SS, gắn đặc hiệu vào vùng EBE trên promoter của gen OsSWEET14 ở cây lúa, hoạt hóa sự biểu hiện của gen này dẫn đến vận chuyển đường saccharose ra gian bào cung cấp thức ăn cho vi khuẩn. Việc làm biến đổi trình tự EBE sẽ làm mất ái lực liên kết của protein TAL, ngăn cản sự hoạt hóa phiên mã của OsSWEET14, dẫn đến phản ứng kháng bệnh.
• Cơ chế cắt và tự sửa chữa DNA của hệ thống CRISPR/Cas9: Phức hệ Cas9:sgRNA nhận biết vị trí mục tiêu dài 20 nucleotide liền kề motif PAM (5'-NGG) trên promoter OsSWEET14, tạo đứt gãy sợi đôi (DSB). Tế bào tự sửa chữa theo con đường NHEJ tạo ra các đột biến mất/chèn nucleotide nhỏ (indels). Ở các thế hệ phân ly tiếp theo, các cá thể mang đột biến đồng hợp tử tại vùng đích và phân ly loại bỏ cấu trúc T-DNA ngoại lai được chọn lọc.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm bao gồm:

1. Phương pháp nuôi cấy mô và chuyển gen:

• Sử dụng phôi non (IE) thu thập từ hạt non sau thụ phấn 12–15 ngày của giống lúa BT7 làm vật liệu khởi đầu.
• Khử trùng hạt non bằng dung dịch NaOCl 1,0% với thời gian tối ưu.
• Nuôi cấy mô sẹo và tái sinh chồi in vitro trên môi trường dinh dưỡng bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng (PGRs: BAP, NAA, 2,4-D, kinetin) và nước dừa, khảo sát trong điều kiện chiếu sáng khác nhau.
• Chuyển gen vào mô sẹo phát sinh từ IE nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chủng EHA105 mang vector chuyển gen nhị phân; tối ưu hóa mật độ tế bào vi khuẩn (OD600), thời gian đồng nuôi cấy, tuổi phôi non và nồng độ Acetosyringone (AS).

2. Phương pháp sinh học phân tử:

• Tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp CTAB cải tiến; tách chiết tổng số RNA và tổng hợp cDNA phục vụ phân tích phiên mã.
• Phân lập, nhân dòng đoạn promoter OsSWEET14 của giống lúa BT7 (SW14-BT) bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu, tách dòng vào vector pGEM-T Easy và xác định trình tự bằng phương pháp giải trình tự Sanger.
• Thiết kế các đoạn crRNA ứng viên dựa trên phần mềm tin sinh học nhằm nhận biết đặc hiệu vùng EBE AvrXa7/PthXo3/Tal5 trên promoter SW14-BT, loại bỏ các vị trí bắt cặp ngoài mục tiêu (off-target).
• Lắp ráp cassette biểu hiện sgRNA dưới sự điều khiển của promoter U3/U6 và Cas9 vào vector nhị phân mang gen chọn lọc kháng kháng sinh hygromycin phosphotransferase (HPT).
• Sàng lọc thể đột biến ở các thế hệ T0 và T1 bằng phản ứng cắt enzyme T7 Endonuclease I (T7E1), giải trình tự chuỗi DNA và kiểm tra sự hiện diện của T-DNA bằng mồi đặc hiệu cho gen Cas9 và HPT.

3. Phương pháp bệnh học phân tử và đánh giá kiểu hình:

• Phân tích mức độ biểu hiện gen OsSWEET14 trước và sau khi lây nhiễm vi khuẩn Xoo bằng kỹ thuật bán định lượng RT-PCR.
• Lây nhiễm nhân tạo các chủng vi khuẩn Xoo phân lập tại Việt Nam (VXO_11, VXO_60, VXO_96) vào lá lúa ở giai đoạn làm đòng/trỗ bằng phương pháp cắt mép lá (leaf-clipping).
• Đo chiều dài vết bệnh sau lây nhiễm 14–21 ngày, phân cấp tính kháng theo thang điểm đánh giá tiêu chuẩn của Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế (IRRI): Cấp 1 (chiều dài vết bệnh < 3 cm: Kháng cao), Cấp 3 (3–5 cm: Kháng), Cấp 5 (5–10 cm: Nhiễm vừa), Cấp 7 (10–15 cm: Nhiễm nặng), Cấp 9 (> 15 cm: Nhiễm rất nặng).
• Đánh giá các chỉ tiêu nông sinh học chính trong điều kiện nhà lưới: Chiều cao cây, số nhánh/bông, tỷ lệ hạt chắc, khối lượng 1000 hạt.

4. Phương pháp xử lý số liệu:

• Số liệu thực nghiệm được xử lý và phân tích thống kê bằng phần mềm SPSS và Microsoft Excel, biểu diễn qua giá trị trung bình và độ lệch chuẩn (Mean ± SD), kiểm định sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức xác suất p < 0,05.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu về nội dung nghiên cứu

Chương 1 hệ thống hóa toàn diện cơ sở lý thuyết và các nghiên cứu liên quan đến đề tài. Tác giả phân tích chi tiết cơ chế hoạt động của hệ thống CRISPR/Cas9, cấu trúc của Cas9 nuclease và sgRNA, phân tích ưu thế của công nghệ chỉnh sửa gen so với chuyển gen truyền thống (không tích hợp gen ngoại lai bền vững trong sản phẩm cuối cùng, tạo đột biến định hướng chính xác). Luận án tổng hợp dịch tễ bệnh bạc lá lúa trên thế giới và tại Việt Nam, đặc điểm sinh học của vi khuẩn Xoo (vi khuẩn Gram âm, hình que, đơn mao, sinh sắc tố vàng, tiết EPS tạo màng sinh học làm tắc mạch dẫn).

Chương này đi sâu vào cơ chế phân tử của hệ thống tiết T3SS và họ protein TAL, chỉ rõ cách thức các protein TAL nhận biết các motif EBE trên promoter của các gen vận chuyển đường họ OsSWEET. Trong số các gen SWEET, OsSWEET14 được xác định là gen "nhiễm" then chốt do promoter của nó là điểm hội tụ của ít nhất 4 protein TAL quan trọng (AvrXa7, PthXo3, Tal5/TalF, TalC). Tác giả cũng tổng kết lịch sử cải tiến di truyền giống lúa BT7 tại Việt Nam và nhấn mạnh sự cần thiết của việc xây dựng quy trình chuyển gen qua A. tumefaciens sử dụng phôi non (IE) nhằm khắc phục tính khó tái sinh của phân loài indica.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn vật liệu, hóa chất, chủng vi sinh vật, thiết bị và các quy trình kỹ thuật được áp dụng trong toàn bộ nghiên cứu. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát được thiết kế gồm 4 khối nội dung logic: (1) Tối ưu hóa quy trình nuôi cấy mô và chuyển gen vào IE của giống lúa BT7; (2) Nghiên cứu tương tác giữa các chủng vi khuẩn VXO và promoter OsSWEET14, thiết kế cấu trúc vector pCas9/gRNA-SW14; (3) Biến nạp gen, sàng lọc dòng lúa T0 và T1 mang đột biến đồng hợp tử, không mang T-DNA; (4) Đánh giá đặc tính nông sinh học và khả năng kháng bệnh bạc lá của các dòng chỉnh sửa gen.

Chương này trình bày rõ các công thức môi trường nuôi cấy (môi trường tạo sẹo, môi trường đồng nuôi cấy, môi trường chọn lọc hygromycin, môi trường tái sinh chồi và ra rễ), trình tự các cặp mồi PCR sử dụng cho nhân dòng, giải trình tự, sàng lọc đột biến T7E1 và kiểm tra biểu hiện gen RT-PCR.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được theo 4 nội dung chính:

1. Xây dựng quy trình chuyển gen vào IE giống lúa BT7

Tác giả đã xác định các thông số kỹ thuật tối ưu cho hệ thống nuôi cấy in vitro và biến nạp gen vào IE của giống lúa BT7:

• Khử trùng hạt non: Sử dụng dung dịch NaOCl 1,0% trong thời gian 15 phút cho tỷ lệ mẫu sạch và tỷ lệ phôi nảy mầm đạt tối ưu (Bảng 3.1).
• Tác động của ánh sáng và chất điều hòa sinh trưởng: Nuôi cấy trong điều kiện tối hoàn toàn ở giai đoạn cảm ứng mô sẹo cho tỷ lệ tạo sẹo đạt cao nhất và chất lượng sẹo loại 1 (sẹo rắn, màu vàng sáng, có khả năng tái sinh) vượt trội so với điều kiện chiếu sáng (Bảng 3.2, 3.3). Môi trường tái sinh bổ sung BAP kết hợp NAA và nước dừa cho hiệu quả tái sinh chồi đạt cao nhất (Bảng 3.4).
• Tối ưu hóa điều kiện biến nạp A. tumefaciens: Mật độ vi khuẩn thích hợp là OD600 = 0,6–0,8; thời gian đồng nuôi cấy là 3 ngày (Bảng 3.5); tuổi phôi non thích hợp nhất là 12–15 ngày sau thụ phấn (DAP) (Bảng 3.6); nồng độ Acetosyringone (AS) bổ sung vào môi trường đồng nuôi cấy tối ưu là 100–150 µM (Bảng 3.7). Quy trình chuyển gen tối ưu đạt hiệu suất 20,68%.

Thông số thí nghiệm	Điều kiện tối ưu	Kết quả ghi nhận
Nồng độ và thời gian NaOCl	NaOCl 1,0% trong 15 phút	Tỷ lệ hạt sạch cao, phôi không bị tổn thương
Chế độ chiếu sáng tạo sẹo	Tối hoàn toàn (25 ± 2°C)	Mô sẹo loại 1 phát triển tốt, tỷ lệ tạo sẹo cao
Tuổi phôi non (IE)	12 – 15 ngày sau thụ phấn (DAP)	Hiệu quả cảm ứng mô sẹo và chuyển gen cao nhất
Mật độ A. tumefaciens (OD600)	OD600 = 0,6 – 0,8	Vi khuẩn bám tốt, không gây hoại tử mô
Thời gian đồng nuôi cấy	3 ngày	Hiệu quả lây nhiễm cao, dễ ức chế vi khuẩn sau đó
Nồng độ Acetosyringone (AS)	100 – 150 µM	Tăng cường hoạt hóa gen vir của vi khuẩn
Hiệu suất chuyển gen tổng thể	Quy trình hoàn chỉnh	Đạt 20,68%

2. Thiết kế cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW14-BT

• Phân tích tương tác giữa các chủng Xoo Việt Nam và OsSWEET14: Khi lây nhiễm nhân tạo các chủng vi khuẩn VXO_11, VXO_60, VXO_96 lên giống lúa BT7, kết quả RT-PCR cho thấy chủng VXO_11 làm tăng mạnh mức độ biểu hiện phiên mã của gen OsSWEET14, chứng minh OsSWEET14 đóng vai trò là gen "nhiễm" chính đối với chủng VXO_11.
• Phân lập và phân tích trình tự SW14-BT: Phân đoạn promoter SW14-BT dài khoảng 1,1 kb của giống lúa BT7 đã được nhân bản và giải trình tự, xác định vùng EBE AvrXa7/PthXo3/Tal5 nằm ở vị trí từ -281 đến -309 bp phía trước mã mở đầu phiên mã.
• Thiết kế crRNA và vector: Tác giả đã thiết kế và đánh giá các crRNA ứng viên (Bảng 3.8, 3.9, 3.10), chọn lọc được crRNA-8 đặc hiệu với vùng EBE AvrXa7/PthXo3/Tal5. Vector nhị phân pCas9/gRNA-SW14 được lắp ráp hoàn chỉnh và biến nạp thành công vào chủng vi khuẩn A. tumefaciens EHA105.

3. Tạo dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT

• Biến nạp và tái sinh cây T0: Biến nạp cấu trúc pCas9/gRNA-SW14 vào mô sẹo IE lúa BT7 thu được các dòng cây tái sinh T0 kháng hygromycin (Bảng 3.11).
• Sàng lọc kiểu gen T0: Phân tích bằng enzyme T7E1 và giải trình tự Sanger xác định được các dạng đột biến mất đoạn (từ 1 đến nhiều nucleotide) hoặc đột biến dịch khung tại vị trí cắt mục tiêu (Bảng 3.12, 3.13). Các dòng T0 có khả năng sinh trưởng và tạo hạt bình thường trong nhà lưới (Bảng 3.14).
• Phân tích thế hệ T1: Đánh giá sự phân ly di truyền của cấu trúc T-DNA và đột biến SW14-BT ở thế hệ T1 (Bảng 3.15, 3.16). Kết quả đã chọn lọc được 8 dòng lúa BT7 T1 mang đột biến SW14-BT ở trạng thái đồng hợp tử và hoàn toàn sạch gen chuyển ngoại lai (không chứa T-DNA) (Bảng 3.17).

4. Đánh giá đặc điểm nông sinh học và tính kháng bạc lá của dòng lúa chỉnh sửa

• Đặc điểm nông học: 8 dòng lúa BT7 chỉnh sửa gen T1 sạch T-DNA được theo dõi kiểu hình trong điều kiện nhà lưới. Kết quả so sánh với giống đối chứng BT7 không chỉnh sửa cho thấy các chỉ tiêu về chiều cao cây, số bông hữu hiệu/khóm, chiều dài bông, tỷ lệ hạt chắc và khối lượng 1000 hạt không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (Bảng 3.18, 3.19).
• Biểu hiện gen OsSWEET14: Phân tích RT-PCR khi lây nhiễm nhân tạo chủng vi khuẩn VXO_11 cho thấy mức độ phiên mã của OsSWEET14 ở các dòng chỉnh sửa mang đột biến EBE giảm rõ rệt so với giống BT7 đối chứng.
• Đánh giá tính kháng bệnh: Lây nhiễm nhân tạo các chủng vi khuẩn Xoo Việt Nam cho thấy 2 dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT biểu hiện tính kháng hoàn toàn với chủng VXO_11 (chiều dài vết bệnh < 3 cm, tương ứng Cấp 1 trên thang điểm IRRI). Đối với các chủng VXO_60 và VXO_96, các dòng chỉnh sửa giảm nhẹ mức độ nhiễm bệnh so với đối chứng nhưng chưa kháng hoàn toàn, do các chủng này có thể sử dụng thêm các protein TAL khác để hoạt hóa các gen SWEET bổ sung.

Kết quả và những đóng góp mới

Các đóng góp mới về lý luận và thực tiễn của luận án gồm:

1. Xây dựng và tối ưu hóa thành công quy trình chuyển gen vào phôi non (IE) của giống lúa Bắc thơm 7 (indica) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, đạt hiệu suất chuyển gen 20,68%, bổ sung cơ sở khoa học cho công tác thao tác di truyền trên các giống lúa indica khó nuôi cấy tái sinh in vitro.
2. Xác định OsSWEET14 hoạt động như một gen "nhiễm" quan trọng trong tương tác giữa giống lúa BT7 và quần thể vi khuẩn Xoo tại Việt Nam; chỉ rõ chủng vi khuẩn VXO_11 gây bệnh thông qua protein TAL tương tác trực tiếp với vị trí EBE AvrXa7/PthXo3/TalF trên promoter OsSWEET14.
3. Thiết kế thành công hệ thống vector chuyển gen mang cấu trúc biểu hiện phức hệ CRISPR/Cas9 (pCas9/gRNA-SW14) chỉnh sửa định hướng vùng EBE trên promoter SW14-BT.
4. Tạo ra được 8 dòng lúa BT7 chỉnh sửa gen thế hệ T1 mang đột biến trên promoter OsSWEET14 ở trạng thái đồng hợp tử, không mang cấu trúc T-DNA ngoại lai trong hệ gen (T-DNA free) và duy trì các đặc tính nông sinh học chính tương đương giống BT7 gốc.
5. Tạo được 2 dòng lúa BT7 chỉnh sửa promoter OsSWEET14 có khả năng kháng hoàn toàn đối với chủng vi khuẩn bạc lá VXO_11.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất từ luận án:

• Sử dụng các dòng lúa BT7 chỉnh sửa gen mang đột biến đồng hợp sạch T-DNA làm nguồn vật liệu khởi đầu phục vụ công tác chọn tạo và phát triển các giống lúa BT7 kháng bệnh bạc lá thương mại.
• Áp dụng hệ thống vector và quy trình chỉnh sửa promoter OsSWEET14 đã thiết lập để cải tiến tính kháng bạc lá trên các giống lúa thuần chất lượng cao khác của Việt Nam.
• Tiếp tục nghiên cứu kết hợp chỉnh sửa đồng thời nhiều vị trí EBE hoặc chỉnh sửa đồng thời nhiều gen SWEET (OsSWEET11, OsSWEET13, OsSWEET14) để tạo ra các dòng lúa kháng phổ rộng đối với các chủng vi khuẩn Xoo phức tạp (như VXO_60, VXO_96).

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

• Tính kháng bệnh bạc lá thu được trên dòng lúa BT7 chỉnh sửa mới chỉ thể hiện tính kháng hoàn toàn đối với chủng VXO_11; đối với các chủng VXO_60 và VXO_96, mức độ kháng chưa triệt để do tính đa dạng của hệ protein TAL trong quần thể Xoo tại Việt Nam.
• Các thí nghiệm đánh giá đặc tính nông sinh học và khả năng kháng bệnh mới được tiến hành trong phạm vi nhà lưới an toàn sinh học của Viện Di truyền Nông nghiệp, chưa thực hiện khảo nghiệm diện rộng ngoài đồng ruộng ở các vùng sinh thái khác nhau.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Đánh giá tính ổn định di truyền của các đột biến SW14-BT và các đặc tính nông học của các dòng lúa chỉnh sửa gen ở các thế hệ tiếp theo (T2, T3) trên đồng ruộng.
• Nghiên cứu giải trình tự và phân tích chức năng hệ protein TAL của các chủng vi khuẩn Xoo bản địa khác tại Việt Nam nhằm xác định thêm các gen "nhiễm" mục tiêu.
• Mở rộng ứng dụng công nghệ CRISPR/Cas9 để chỉnh sửa đa gen (multiplex editing) trên cả ba gen OsSWEET11, OsSWEET13 và OsSWEET14 nhằm tạo tính kháng bệnh bạc lá phổ rộng và bền vững.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo hữu ích cho các nhóm đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Công nghệ sinh học, Di truyền học thực vật, Bệnh học phân tử và Khoa học cây trồng trong việc tiếp cận phương pháp thiết kế sgRNA, lắp ráp vector CRISPR/Cas9 và kỹ thuật phân tích đột biến chính xác trên thực vật.
• Giảng viên và cán bộ nghiên cứu tại các trường đại học, viện nghiên cứu nông nghiệp quan tâm đến quy trình chuyển gen vào phôi non của các giống lúa indica khó tái sinh và phương pháp sàng lọc cá thể đồng hợp tử sạch T-DNA ở thế hệ phân ly T1.
• Các nhà chọn tạo giống cây trồng và cơ quan quản lý nông nghiệp trong việc định hướng phát triển giống cây trồng chỉnh sửa gen không chứa DNA ngoại lai, phục vụ sản xuất nông nghiệp bền vững.

Nội dung có giá trị tham khảo cao nhất gồm: Bảng tổng hợp các thông số tối ưu quy trình nuôi cấy và chuyển gen IE qua A. tumefaciens; quy trình thiết kế crRNA nhận biết vùng EBE trên promoter OsSWEET14; và phương pháp sàng lọc kép bằng enzyme T7E1 kết hợp giải trình tự Sanger để xác định đột biến indels.

Câu hỏi thường gặp

1. Gen OsSWEET14 đóng vai trò gì trong cơ chế gây bệnh bạc lá của vi khuẩn Xoo trên giống lúa BT7?

OsSWEET14 là một gen "nhiễm" (Susceptibility gene - gen S) mã hóa protein vận chuyển đường qua màng. Khi vi khuẩn Xoo xâm nhiễm vào lá lúa, protein TAL (như AvrXa7, PthXo3, Tal5/TalF) do vi khuẩn tiết ra sẽ bám đặc hiệu vào vị trí EBE trên promoter của OsSWEET14, kích hoạt sự biểu hiện quá mức của gen này. Hậu quả là đường saccharose từ tế bào lúa bị bơm ra gian bào, cung cấp nguồn dinh dưỡng thiết yếu cho vi khuẩn nhân lên và gây bệnh cháy bìa lá.

2. Vì sao tác giả lựa chọn phôi non (IE) làm vật liệu chuyển gen thay vì phôi trưởng thành và hiệu suất chuyển gen tối ưu đạt bao nhiêu?

Phôi non (thu thập 12–15 ngày sau thụ phấn) có khả năng sinh mô sẹo có tính phôi cao, tốc độ tăng sinh nhanh và khả năng tái sinh chồi vượt trội so với phôi trưởng thành ở các giống lúa thuộc loài phụ indica (vốn nổi tiếng là khó nuôi cấy mô và khó tái sinh in vitro). Quy trình chuyển gen tối ưu sử dụng IE của giống lúa BT7 qua vi khuẩn A. tumefaciens trong luận án đã đạt hiệu suất chuyển gen 20,68%.

3. Cấu trúc vector chuyển gen CRISPR/Cas9 trong luận án được thiết kế tác động vào vị trí cụ thể nào trên promoter OsSWEET14?

Cấu trúc vector pCas9/gRNA-SW14 sử dụng crRNA-8 được thiết kế để dẫn đường nuclease Cas9 cắt chính xác vào vùng EBE AvrXa7/PthXo3/Tal5 trên promoter OsSWEET14 của giống lúa BT7 (nằm ở vị trí từ -281 đến -309 bp phía trước mã mở đầu phiên mã), tạo ra các đột biến mất/chèn nucleotide nhỏ (indels) nhằm phá vỡ ái lực liên kết của các protein TAL tương ứng.

4. Các dòng lúa BT7 chỉnh sửa gen ở thế hệ T1 có giữ được đặc tính nông học của giống gốc không và khả năng kháng bệnh với các chủng VXO như thế nào?

8 dòng lúa BT7 T1 mang đột biến đồng hợp tử sạch T-DNA đều sinh trưởng bình thường trong nhà lưới, có các chỉ tiêu nông học chính (chiều cao cây, số bông/khóm, tỷ lệ hạt chắc, khối lượng 1000 hạt) tương đương với giống BT7 không chỉnh sửa. Trong đó, 2 dòng được đánh giá kháng hoàn toàn với chủng vi khuẩn VXO_11 (chiều dài vết bệnh < 3 cm, Cấp 1 thang điểm IRRI), đồng thời mức độ biểu hiện gen OsSWEET14 giảm rõ rệt sau khi lây nhiễm nhân tạo.

5. Tại sao các dòng lúa BT7 chỉnh sửa chỉ kháng hoàn toàn chủng VXO_11 mà chưa kháng triệt để chủng VXO_60 và VXO_96?

Chủng VXO_11 gây bệnh trên giống BT7 chủ yếu dựa vào một protein TAL đơn lẻ liên kết vào vị trí EBE AvrXa7/PthXo3/TalF trên promoter OsSWEET14, do đó khi vị trí này bị đột biến, vi khuẩn mất khả năng hoạt hóa gen và không thể gây bệnh. Ngược lại, hai chủng VXO_60 và VXO_96 mang nhiều protein TAL khác nhau, có khả năng kích hoạt các vị trí EBE khác trên promoter OsSWEET14 hoặc hoạt hóa các gen "nhiễm" bổ sung khác trong họ SWEET (như OsSWEET11, OsSWEET13).

Kết luận

Luận án của tác giả Vũ Hoài Sâm đã ứng dụng thành công công nghệ CRISPR/Cas9 để gây đột biến chính xác vùng EBE trên promoter của gen "nhiễm" OsSWEET14 ở giống lúa Bắc thơm 7. Nghiên cứu đã tối ưu hóa quy trình chuyển gen qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens sử dụng phôi non với hiệu suất đạt 20,68% và tạo ra được 8 dòng lúa BT7 thế hệ T1 mang đột biến đồng hợp tử, không mang T-DNA ngoại lai trong hệ gen. Hai dòng lúa chỉnh sửa gen thu nhận được thể hiện tính kháng hoàn toàn với chủng vi khuẩn bạc lá Xanthomonas oryzae pv. oryzae VXO_11 và duy trì các đặc tính nông sinh học tương đương giống BT7 ban đầu. Công trình là nguồn dẫn liệu khoa học giá trị và cung cấp nguồn vật liệu khởi đầu triển vọng cho nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài CRISPR-Cas9 là một công nghệ chỉnh sửa gen tiên tiến, cho phép cải biến DNA hệ gen trong tế bào một cách chính xác và hiệu quả. Hệ thống này tạo ra đứt gãy DNA sợi đôi tại vị trí xác định trong hệ gen và thông qua cơ chế tự sửa chữa DNA của tế bào để tạo ra những đột biến có chủ đích trong hệ gen. Chọn giống chính xác bằng công nghệ CRISPR/Cas9 có thể khắc phục được những hạn chế vốn có của các phương pháp chọn giống truyền thống như tiết kiệm thời gian và chi phí, giữ được toàn bộ nền di truyền với các đặc tính nông sinh học quý của giống gốc.

Việc ứng dụng công nghệ này đã tạo ra một cuộc cách mạng trong nghiên cứu khoa học sự sống nói chung và khoa học nông nghiệp nói riêng, mang lại cơ hội mới cho lĩnh vực chọn giống chính xác, đang và sẽ góp phần nâng cao phẩm chất giống ở nhiều loại cây trồng ở Việt Nam. Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (gọi tắt là Xoo) là một trong những bệnh hại nguy hiểm nhất trên lúa hiện nay, gây ra những thiệt hại nặng nề trong sản xuất lúa gạo ở Việt Nam và nhiều nơi trên thế giới. Cho đến nay, các biện pháp phòng trừ thông thường hầu như không mang lại hiệu quả đối với bệnh bạc lá lúa; sử dụng giống lúa kháng vẫn là cách tốt nhất để đối phó với bệnh bạc lá do vi khuẩn Xoo gây ra.

Giống lúa Bắc thơm 7 (BT7) là một trong những giống chủ lực ở miền Bắc với rất nhiều ưu điểm như chất lượng gạo thơm, ngon, năng suất cao và được nhiều người ưa chuộng. Tuy nhiên, giống lúa này rất mẫn cảm với bệnh bạc lá, dẫn đến sản lượng thu hoạch bị ảnh hưởng nghiêm trọng, đặc biệt ở vụ Mùa. Vì vậy, nghiên cứu chọn tạo giống lúa BT7 kháng bệnh bạc lá là yêu cầu tất yếu, giúp đảm bảo tính bền vững và hiệu quả trong sản xuất lúa gạo ở khu vực phía Bắc. Xoo xâm nhiễm vào tế bào lúa và gây bệnh thông qua hệ thống tiết loại III (Type III secretion system - T3SS).

Các protein TAL (Transcription activator-like effector) thuộc T3SS liên kết với vùng promoter và hoạt hóa sự biểu hiện của các gen “nhiễm” (susceptibility gene – S gene), gây bệnh bạc lá cho cây lúa. OsSWEET14 thuộc họ gen mã hóa protein vận chuyển đường SWEET (Sugar will eventually be 2 exported transporter) đã được biết là gen “nhiễm” quan trọng có liên quan tới bệnh bạc lá ở lúa. Khi gen này được hoạt hóa bởi các protein TAL, tế bào thực vật sẽ tăng cường vận chuyển đường đến gian bào, cung cấp dinh dưỡng cho Xoo sinh trưởng và phát triển. Các đột biến xảy ra trên vùng promoter của gen “nhiễm” tại vị trí liên kết (Effector binding element – EBE) với protein TAL có thể phá vỡ mối liên kết giữa protein TAL của Xoo và gen “nhiễm”, tạo ra tính kháng bạc lá cho cây lúa.

Điều này đã mở ra một hướng nghiên cứu đầy tiềm năng nhằm cải tiến tính kháng bệnh bạc lá cho các giống lúa chủ lực bằng công nghệ chỉnh sửa gen. Ý tưởng gây đột biến chính xác gen “nhiễm” bằng công nghệ CRSIPR/Cas9 để cải tiến tính kháng bạc lá cho giống lúa BT7 là chiến lược chọn giống hoàn toàn mới ở Việt Nam, đáp ứng được đồng thời nhu cầu cấp thiết của sản xuất cũng như nền khoa học nông nghiệp Việt Nam. Vì vậy, tôi đã thực hiện luận án “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ CRISPR/Cas9 chỉnh sửa promoter OsSWEET14 nhằm nâng cao tính kháng bệnh bạc lá ở giống lúa BT7”. Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu chung: Ứng dụng công nghệ CRISPR/Cas9 để tăng cường tính kháng bệnh bạc lá cho giống lúa BT7 thông qua chỉnh sửa promoter OsSWEET14.

Mục tiêu cụ thể: - Tối ưu quy trình chuyển gen vào phôi non (immature embryo – IE) giống lúa BT7 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. - Thiết kế cấu trúc T-DNA biểu hiện phức hệ CRISPR/Cas9 chỉnh sửa promoter OsSWEET14 của giống lúa BT7 (gọi tắt là SW14-BT). - Tạo dòng lúa BT7 mang đột biến chính xác trên SW14-BT bằng hệ thống CRISPR/Cas9. - Sàng lọc dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT tăng cường tính kháng với vi khuẩn Xoo Việt Nam.

Những đóng góp mới của luận án - Tối ưu các điều kiện để chuyển gen vào IE giống lúa BT7 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens; quy trình chuyển gen tối ưu đạt hiệu suất 20,68%. - Xác định được OsSWEET14 hoạt động như một gen “nhiễm” quan trọng đối với bệnh bạc lá ở giống lúa BT7. - Thiết kế thành công hệ thống vector chuyển gen mang cấu trúc biểu hiện phức hệ CRISPR/Cas9 chỉnh sửa SW14-BT.

- Ứng dụng thành công hệ thống CRISPR/Cas9, tạo ra tám dòng lúa BT7 chỉnh sửa gen mang đột biến SW14-BT ở dạng đồng hợp, không chứa cấu trúc T-DNA trong hệ gen và có một số đặc điểm nông sinh học chính tương tự giống lúa đối chứng không chỉnh sửa gen. - Tạo được hai dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT thể hiện tính kháng hoàn toàn với chủng vi khuẩn VXO_11. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án 4. Ý nghĩa khoa học Việc xác định được các yếu tố môi trường nuôi cấy và yếu tố vật lý tác động đến chuyển gen vào IE giống lúa BT7 thông qua vi khuẩn A.

tumefaciens đã bổ sung các dẫn liệu khoa học cho nghiên cứu chuyển gen vào các giống lúa indica. Trên cơ sở phân tích mức độ biểu hiện OsSWEET14 khi lây nhiễm các chủng vi khuẩn VXO và đánh giá tính kháng bệnh bạc lá của các dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT biểu hiện OsSWEET14, luận án đã bước đầu xác định được cơ chế gây bệnh ở mức độ phân tử của một số chủng VXO trên giống lúa BT7. Kết quả luận án đã cho thấy sự đa dạng của quần thể Xoo ở Việt Nam, ít nhất là về hệ protein tiết loại III TAL liên quan tới độc tính của vi khuẩn trên cây lúa. Chủng VXO_11 gây bệnh trên BT7 thông qua một protein TAL độc duy nhất liên kết với vị trí EBE AvrXa7/PthXo3/TalF; trong khi độc tính của hai chủng VXO_60 và VXO_96 phụ thuộc vào ít nhất 2 protein TAL khác nhau.

Luận án đã thành công trong việc sử dụng hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 để tạo đột biến chính xác trên giống lúa chủ lực trong sản xuất (BT7) 4 của Việt Nam. Đây là nguồn dẫn liệu tham khảo tốt cho công tác nghiên cứu liên quan đến chỉnh sửa gen bằng công nghệ CRISPR/Cas9. Ý nghĩa thực tiễn Luận án đã tạo được dòng lúa BT7 chỉnh sửa gen có khả năng kháng chủng vi khuẩn VXO_11, mang các đặc tính nông sinh học chính không khác biệt so với với giống gốc ban đầu khi trồng ở điều kiện nhà lưới. Đây là nguồn nguyên liệu cho nghiên cứu chọn tạo và phát triển dòng/giống lúa BT7 kháng bệnh bạc lá sau này.

Các cấu trúc vector chỉnh sửa promoter OsSWEET14 là sản phẩm trung gian trong quá trình thực hiện đề tài này có thể được sử dụng cho các nghiên cứu tương tự nhằm cải tạo tính kháng bệnh bạc lá cho các giống lúa chủ lực khác ở Việt Nam. Đây là nghiên cứu đầu tiên áp dụng công nghệ chỉnh sửa gen (CRISPR/Cas9) vào cải tạo giống lúa ở Việt Nam. Thành công của luận án đã mở ra triển vọng về hướng nghiên cứu chỉnh sửa gen nhằm nâng cao năng suất, tính chống chịu và chất lượng của các giống cây trồng khác ở Việt Nam. Phạm vi nghiên cứu: Địa điểm nghiên cứu: Các thí nghiệm về vi khuẩn, nuôi cấy mô và sinh học phân tử được thực hiện tại Bộ môn Bệnh học Phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp.

Các thí nghiệm nông học, gieo trồng, đánh giá tính kháng bệnh được thực hiện tại nhà lưới an toàn sinh học của Viện Di truyền Nông nghiệp, tại số 1 đường Phạm Văn Đồng, quận Bắc Từ Liêm, Hà Nội. Thời gian thực hiện: Từ 08/2017 – 12/2021. TỔNG QUAN TÀI LIỆU VỀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu về công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 1.1 Giới thiệu chung về công nghệ chỉnh sửa gen Chỉnh sửa gen (hay còn được gọi là chỉnh sửa hệ gen) là một tập hợp các công cụ giúp các nhà khoa học thay đổi DNA của sinh vật. Phương pháp này lợi dụng hệ thống sửa chữa DNA của tế bào để tạo ra những thay đổi nhỏ trong trình tự DNA đích, thông qua việc sử dụng các nuclease tổng hợp để tạo ra đột biến đứt gãy sợi đôi (double-stranded breaks - DSB) tại vị trí xác định trong hệ gen.

Đột biến xảy ra trên phân tử DNA thường là: (1) ghép nối trực tiếp và (2) mất/chèn đoạn hoặc trao đổi chéo hoặc chuyển đoạn (Hình 1.1: Cơ chế chỉnh sửa gen Ghi chú: Các mức độ khác nhau của tái tổ hợp, có sự tương đồng và không tương đồng. Tái tổ hợp không tương đồng: Con đường tạo ra cNHEJ sửa chữa bảo 6 tồn theo nguyên tắc bổ sung; con đường cắt bỏ sai hỏng tạo ra đột biến mới altNHEJ/MMEJ (mất hoặc chèn dưới 3 nucleotide) và ghép sợi đơn (SSA) xảy ra khi có đoạn trình tự tương đồng tồn tại ở đâu đó trong hệ gen. Cả 3 loại sửa chữa này đều khác với tái tổ hợp tương đồng (HDR), ở đó, sau khi cắt bỏ đoạn sai hỏng, phần nhô ra của sợi đơn này sẽ trao đổi chéo với phần tương đồng không bị hư hại (một phần) của sợi đơn phân tử khác và ghép sợi đôi (liên kết bổ sung - SDSA), gây ra sự đảo ngược hoặc hoán vị gen alen. Ngoài ra, các cấu trúc tái tổ hợp (đường nối Holiday) trung gian có thể được hình thành bởi sự trao đổi đoạn sợi đôi giữa phân tử khuôn và phân tử lỗi hỏng.

Dựa vào phân tử khuôn, sự trao đổi đoạn sợi đôi tạo ra nhiễm sắc tử chị em (SCE), trao đổi chéo trong giảm phân hoặc các dạng sắp xếp lại khác [118]. Đặc điểm chính của các công nghệ chỉnh sửa gen Đặc điểm Meganuclease ZFN TALEN CRISPR/Cas9 SV nhân sơ SV nhân sơ và SV Sinh vật nhân Vi khuẩn Nguồn gốc (Streptococus nhân thực thực Xanthomonas pyogenes) Mô-đun liên kết DNA – Protein DNA - Protein DNA - Protein DNA – RNA Cặp Protein Cặp Protein Mô-đun cắt Protein đơn Cas9 + gRNA (FokI) (FokI) Chiều dài trình tự 12 – 40 bp 18 – 24 bp 24 – 59 bp 20 bp đích Tần suất điểm cắt 1/1.