MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài CRISPR-Cas9 là một công nghệ chỉnh sửa gen tiên tiến, cho phép cải biến DNA hệ gen trong tế bào một cách chính xác và hiệu quả. Hệ thống này tạo ra đứt gãy DNA sợi đôi tại vị trí xác định trong hệ gen và thông qua cơ chế tự sửa chữa DNA của tế bào để tạo ra những đột biến có chủ đích trong hệ gen. Chọn giống chính xác bằng công nghệ CRISPR/Cas9 có thể khắc phục được những hạn chế vốn có của các phương pháp chọn giống truyền thống như tiết kiệm thời gian và chi phí, giữ được toàn bộ nền di truyền với các đặc tính nông sinh học quý của giống gốc.
Việc ứng dụng công nghệ này đã tạo ra một cuộc cách mạng trong nghiên cứu khoa học sự sống nói chung và khoa học nông nghiệp nói riêng, mang lại cơ hội mới cho lĩnh vực chọn giống chính xác, đang và sẽ góp phần nâng cao phẩm chất giống ở nhiều loại cây trồng ở Việt Nam. Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (gọi tắt là Xoo) là một trong những bệnh hại nguy hiểm nhất trên lúa hiện nay, gây ra những thiệt hại nặng nề trong sản xuất lúa gạo ở Việt Nam và nhiều nơi trên thế giới. Cho đến nay, các biện pháp phòng trừ thông thường hầu như không mang lại hiệu quả đối với bệnh bạc lá lúa; sử dụng giống lúa kháng vẫn là cách tốt nhất để đối phó với bệnh bạc lá do vi khuẩn Xoo gây ra.
Giống lúa Bắc thơm 7 (BT7) là một trong những giống chủ lực ở miền Bắc với rất nhiều ưu điểm như chất lượng gạo thơm, ngon, năng suất cao và được nhiều người ưa chuộng. Tuy nhiên, giống lúa này rất mẫn cảm với bệnh bạc lá, dẫn đến sản lượng thu hoạch bị ảnh hưởng nghiêm trọng, đặc biệt ở vụ Mùa. Vì vậy, nghiên cứu chọn tạo giống lúa BT7 kháng bệnh bạc lá là yêu cầu tất yếu, giúp đảm bảo tính bền vững và hiệu quả trong sản xuất lúa gạo ở khu vực phía Bắc. Xoo xâm nhiễm vào tế bào lúa và gây bệnh thông qua hệ thống tiết loại III (Type III secretion system - T3SS).
Các protein TAL (Transcription activator-like effector) thuộc T3SS liên kết với vùng promoter và hoạt hóa sự biểu hiện của các gen “nhiễm” (susceptibility gene – S gene), gây bệnh bạc lá cho cây lúa. OsSWEET14 thuộc họ gen mã hóa protein vận chuyển đường SWEET (Sugar will eventually be 2 exported transporter) đã được biết là gen “nhiễm” quan trọng có liên quan tới bệnh bạc lá ở lúa. Khi gen này được hoạt hóa bởi các protein TAL, tế bào thực vật sẽ tăng cường vận chuyển đường đến gian bào, cung cấp dinh dưỡng cho Xoo sinh trưởng và phát triển. Các đột biến xảy ra trên vùng promoter của gen “nhiễm” tại vị trí liên kết (Effector binding element – EBE) với protein TAL có thể phá vỡ mối liên kết giữa protein TAL của Xoo và gen “nhiễm”, tạo ra tính kháng bạc lá cho cây lúa.
Điều này đã mở ra một hướng nghiên cứu đầy tiềm năng nhằm cải tiến tính kháng bệnh bạc lá cho các giống lúa chủ lực bằng công nghệ chỉnh sửa gen. Ý tưởng gây đột biến chính xác gen “nhiễm” bằng công nghệ CRSIPR/Cas9 để cải tiến tính kháng bạc lá cho giống lúa BT7 là chiến lược chọn giống hoàn toàn mới ở Việt Nam, đáp ứng được đồng thời nhu cầu cấp thiết của sản xuất cũng như nền khoa học nông nghiệp Việt Nam. Vì vậy, tôi đã thực hiện luận án “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ CRISPR/Cas9 chỉnh sửa promoter OsSWEET14 nhằm nâng cao tính kháng bệnh bạc lá ở giống lúa BT7”. Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu chung: Ứng dụng công nghệ CRISPR/Cas9 để tăng cường tính kháng bệnh bạc lá cho giống lúa BT7 thông qua chỉnh sửa promoter OsSWEET14.
Mục tiêu cụ thể: - Tối ưu quy trình chuyển gen vào phôi non (immature embryo – IE) giống lúa BT7 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. - Thiết kế cấu trúc T-DNA biểu hiện phức hệ CRISPR/Cas9 chỉnh sửa promoter OsSWEET14 của giống lúa BT7 (gọi tắt là SW14-BT). - Tạo dòng lúa BT7 mang đột biến chính xác trên SW14-BT bằng hệ thống CRISPR/Cas9. - Sàng lọc dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT tăng cường tính kháng với vi khuẩn Xoo Việt Nam.
Những đóng góp mới của luận án - Tối ưu các điều kiện để chuyển gen vào IE giống lúa BT7 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens; quy trình chuyển gen tối ưu đạt hiệu suất 20,68%. - Xác định được OsSWEET14 hoạt động như một gen “nhiễm” quan trọng đối với bệnh bạc lá ở giống lúa BT7. - Thiết kế thành công hệ thống vector chuyển gen mang cấu trúc biểu hiện phức hệ CRISPR/Cas9 chỉnh sửa SW14-BT.
- Ứng dụng thành công hệ thống CRISPR/Cas9, tạo ra tám dòng lúa BT7 chỉnh sửa gen mang đột biến SW14-BT ở dạng đồng hợp, không chứa cấu trúc T-DNA trong hệ gen và có một số đặc điểm nông sinh học chính tương tự giống lúa đối chứng không chỉnh sửa gen. - Tạo được hai dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT thể hiện tính kháng hoàn toàn với chủng vi khuẩn VXO_11. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án 4. Ý nghĩa khoa học Việc xác định được các yếu tố môi trường nuôi cấy và yếu tố vật lý tác động đến chuyển gen vào IE giống lúa BT7 thông qua vi khuẩn A.
tumefaciens đã bổ sung các dẫn liệu khoa học cho nghiên cứu chuyển gen vào các giống lúa indica. Trên cơ sở phân tích mức độ biểu hiện OsSWEET14 khi lây nhiễm các chủng vi khuẩn VXO và đánh giá tính kháng bệnh bạc lá của các dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT biểu hiện OsSWEET14, luận án đã bước đầu xác định được cơ chế gây bệnh ở mức độ phân tử của một số chủng VXO trên giống lúa BT7. Kết quả luận án đã cho thấy sự đa dạng của quần thể Xoo ở Việt Nam, ít nhất là về hệ protein tiết loại III TAL liên quan tới độc tính của vi khuẩn trên cây lúa. Chủng VXO_11 gây bệnh trên BT7 thông qua một protein TAL độc duy nhất liên kết với vị trí EBE AvrXa7/PthXo3/TalF; trong khi độc tính của hai chủng VXO_60 và VXO_96 phụ thuộc vào ít nhất 2 protein TAL khác nhau.
Luận án đã thành công trong việc sử dụng hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 để tạo đột biến chính xác trên giống lúa chủ lực trong sản xuất (BT7) 4 của Việt Nam. Đây là nguồn dẫn liệu tham khảo tốt cho công tác nghiên cứu liên quan đến chỉnh sửa gen bằng công nghệ CRISPR/Cas9. Ý nghĩa thực tiễn Luận án đã tạo được dòng lúa BT7 chỉnh sửa gen có khả năng kháng chủng vi khuẩn VXO_11, mang các đặc tính nông sinh học chính không khác biệt so với với giống gốc ban đầu khi trồng ở điều kiện nhà lưới. Đây là nguồn nguyên liệu cho nghiên cứu chọn tạo và phát triển dòng/giống lúa BT7 kháng bệnh bạc lá sau này.
Các cấu trúc vector chỉnh sửa promoter OsSWEET14 là sản phẩm trung gian trong quá trình thực hiện đề tài này có thể được sử dụng cho các nghiên cứu tương tự nhằm cải tạo tính kháng bệnh bạc lá cho các giống lúa chủ lực khác ở Việt Nam. Đây là nghiên cứu đầu tiên áp dụng công nghệ chỉnh sửa gen (CRISPR/Cas9) vào cải tạo giống lúa ở Việt Nam. Thành công của luận án đã mở ra triển vọng về hướng nghiên cứu chỉnh sửa gen nhằm nâng cao năng suất, tính chống chịu và chất lượng của các giống cây trồng khác ở Việt Nam. Phạm vi nghiên cứu: Địa điểm nghiên cứu: Các thí nghiệm về vi khuẩn, nuôi cấy mô và sinh học phân tử được thực hiện tại Bộ môn Bệnh học Phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp.
Các thí nghiệm nông học, gieo trồng, đánh giá tính kháng bệnh được thực hiện tại nhà lưới an toàn sinh học của Viện Di truyền Nông nghiệp, tại số 1 đường Phạm Văn Đồng, quận Bắc Từ Liêm, Hà Nội. Thời gian thực hiện: Từ 08/2017 – 12/2021. TỔNG QUAN TÀI LIỆU VỀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu về công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 1.1 Giới thiệu chung về công nghệ chỉnh sửa gen Chỉnh sửa gen (hay còn được gọi là chỉnh sửa hệ gen) là một tập hợp các công cụ giúp các nhà khoa học thay đổi DNA của sinh vật. Phương pháp này lợi dụng hệ thống sửa chữa DNA của tế bào để tạo ra những thay đổi nhỏ trong trình tự DNA đích, thông qua việc sử dụng các nuclease tổng hợp để tạo ra đột biến đứt gãy sợi đôi (double-stranded breaks - DSB) tại vị trí xác định trong hệ gen.
Đột biến xảy ra trên phân tử DNA thường là: (1) ghép nối trực tiếp và (2) mất/chèn đoạn hoặc trao đổi chéo hoặc chuyển đoạn (Hình 1.1: Cơ chế chỉnh sửa gen Ghi chú: Các mức độ khác nhau của tái tổ hợp, có sự tương đồng và không tương đồng. Tái tổ hợp không tương đồng: Con đường tạo ra cNHEJ sửa chữa bảo 6 tồn theo nguyên tắc bổ sung; con đường cắt bỏ sai hỏng tạo ra đột biến mới altNHEJ/MMEJ (mất hoặc chèn dưới 3 nucleotide) và ghép sợi đơn (SSA) xảy ra khi có đoạn trình tự tương đồng tồn tại ở đâu đó trong hệ gen. Cả 3 loại sửa chữa này đều khác với tái tổ hợp tương đồng (HDR), ở đó, sau khi cắt bỏ đoạn sai hỏng, phần nhô ra của sợi đơn này sẽ trao đổi chéo với phần tương đồng không bị hư hại (một phần) của sợi đơn phân tử khác và ghép sợi đôi (liên kết bổ sung - SDSA), gây ra sự đảo ngược hoặc hoán vị gen alen. Ngoài ra, các cấu trúc tái tổ hợp (đường nối Holiday) trung gian có thể được hình thành bởi sự trao đổi đoạn sợi đôi giữa phân tử khuôn và phân tử lỗi hỏng.
Dựa vào phân tử khuôn, sự trao đổi đoạn sợi đôi tạo ra nhiễm sắc tử chị em (SCE), trao đổi chéo trong giảm phân hoặc các dạng sắp xếp lại khác [118]. Đặc điểm chính của các công nghệ chỉnh sửa gen Đặc điểm Meganuclease ZFN TALEN CRISPR/Cas9 SV nhân sơ SV nhân sơ và SV Sinh vật nhân Vi khuẩn Nguồn gốc (Streptococus nhân thực thực Xanthomonas pyogenes) Mô-đun liên kết DNA – Protein DNA - Protein DNA - Protein DNA – RNA Cặp Protein Cặp Protein Mô-đun cắt Protein đơn Cas9 + gRNA (FokI) (FokI) Chiều dài trình tự 12 – 40 bp 18 – 24 bp 24 – 59 bp 20 bp đích Tần suất điểm cắt 1/1.