Tổng quan nghiên cứu

Nhựa sinh học đang trở thành giải pháp quan trọng nhằm giảm thiểu ô nhiễm môi trường do rác thải nhựa truyền thống gây ra. Theo số liệu của European Bioplastics, tổng năng lực sản xuất nhựa sinh học toàn cầu đạt khoảng 0,9 triệu tấn và dự kiến tăng lên 2,62 triệu tấn vào năm 2023, với tốc độ tăng trưởng trung bình 4,4% mỗi năm trong giai đoạn 2018-2023. Việt Nam, với hơn 11.000 km bờ biển và đa dạng sinh học vi sinh vật biển phong phú, có tiềm năng lớn trong việc khai thác các chủng vi khuẩn biển tích lũy nhựa sinh học polyhydroxyalkanoate (PHA) dạng copolymer. PHA là loại polyester sinh học được vi sinh vật tổng hợp dưới dạng năng lượng dự trữ, có khả năng phân hủy sinh học hoàn toàn, thân thiện với môi trường và có đặc tính cơ lý tương tự nhựa truyền thống.

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là tuyển chọn các chủng vi khuẩn biển phân lập ở vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa có khả năng tích lũy PHA dạng copolymer, đồng thời đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố môi trường như pH, nhiệt độ, tỷ lệ giống, độ thoáng khí và nồng độ cơ chất lên quá trình sinh trưởng và tổng hợp PHA. Nghiên cứu được thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 1 đến tháng 9 năm 2022, nhằm góp phần phát triển nguồn nguyên liệu nhựa sinh học trong nước, thúc đẩy sản xuất và ứng dụng PHA trong các ngành công nghiệp thân thiện môi trường.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình nghiên cứu về polyhydroxyalkanoate (PHA), một loại polyester sinh học do vi sinh vật tổng hợp. PHA được phân loại theo độ dài chuỗi carbon thành chuỗi ngắn (3-5 carbon), chuỗi trung bình (6-14 carbon) và chuỗi dài (>15 carbon). Ngoài ra, PHA còn được chia thành homopolymer (chỉ chứa một loại monomer) và copolymer (chứa hai hoặc nhiều loại monomer khác nhau). Copolymer PHA như poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) (PHBV) có tính chất cơ lý ưu việt hơn homopolymer, như giảm độ giòn, tăng độ dẻo dai.

Con đường sinh tổng hợp PHA trong tế bào vi khuẩn được mô tả qua ba con đường chính: con đường tổng hợp từ acetyl-CoA, con đường β-oxy hóa axit béo và con đường tổng hợp từ các nguồn carbon đơn giản như glucose, sucrose. Thành phần monomer của PHA phụ thuộc vào nguồn carbon và đặc điểm enzyme PHA synthase của từng chủng vi khuẩn. Các chủng vi khuẩn ưa mặn có ưu điểm là giảm nguy cơ tạp nhiễm trong quá trình lên men và chi phí thu hồi PHA thấp hơn do tế bào dễ ly giải trong dung dịch đệm pH trung tính.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là các mẫu nước biển và trầm tích biển thu thập tại vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa. Tổng cộng 8 mẫu được lấy, gồm 3 mẫu nước và 5 mẫu trầm tích với các đặc điểm về độ sâu, nhiệt độ, độ mặn và pH được ghi nhận cụ thể. Vi khuẩn được phân lập trên môi trường Salinity LB agar có nồng độ muối 3%, sau đó được sàng lọc khả năng tích lũy PHA bằng phương pháp nhuộm Sudan black B và Nile blue A.

Phương pháp lên men sinh tổng hợp PHA được thực hiện trong bình tam giác chứa môi trường Salinity HT, với các điều kiện pH, nhiệt độ, tỷ lệ giống, tốc độ lắc và nồng độ glycerol được biến đổi để đánh giá ảnh hưởng lên sinh trưởng và tích lũy PHA. Khối lượng tế bào khô (CDW) được xác định bằng cân sau khi sấy khô, hàm lượng PHA được định lượng bằng phương pháp axit crotonic qua đo hấp thụ quang ở bước sóng 235 nm. Thành phần PHA được phân tích bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC).

Phân tích hình thái khuẩn lạc và tế bào được thực hiện bằng kính hiển vi điện tử và nhuộm Gram. DNA tổng số được tách chiết và khuếch đại gene 16S rRNA để xác định phân loại chủng vi khuẩn bằng phương pháp giải trình tự và xây dựng cây phát sinh chủng loại.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Phân lập và sàng lọc vi khuẩn biển tích lũy PHA: Từ 8 mẫu nước và trầm tích biển, đã phân lập được 44 chủng vi khuẩn riêng biệt với mật độ vi khuẩn dao động từ 10^1 đến 6,7 x 10^5 CFU/ml. Qua sàng lọc nhanh bằng nhuộm Sudan black B và Nile blue A, 6 chủng vi khuẩn biển được xác định có khả năng tích lũy PHA cao, thể hiện qua màu cam sáng rõ dưới kính hiển vi huỳnh quang.

  2. Ảnh hưởng của pH: Các chủng vi khuẩn sinh trưởng và tích lũy PHA tối ưu ở pH từ 6 đến 8. Ở pH 8, chủng 6.6 đạt khối lượng sinh khối khô 4,21 mg/ml và hàm lượng PHA tích lũy 44,1%. Ở pH thấp (4-5) hoặc cao (9), sinh trưởng và tích lũy PHA giảm đáng kể, với hàm lượng PHA chỉ từ 5,6% đến 11,7%.

  3. Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng và tích lũy PHA của các chủng là 37°C, với khối lượng sinh khối khô từ 16,3 đến 38,8 mg/ml và hàm lượng PHA từ 25,7% đến 44,2%. Ở nhiệt độ 25°C và 45°C, sinh trưởng và tích lũy PHA gần như không xảy ra.

  4. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống: Tỷ lệ giống 7,5% cho kết quả sinh trưởng và tích lũy PHA cao nhất, tuy nhiên sự khác biệt so với tỷ lệ 5% không đáng kể (chênh lệch 1-5%). Tỷ lệ giống 5% được chọn làm điều kiện tối ưu cho các thí nghiệm tiếp theo.

  5. Ảnh hưởng của tốc độ lắc: Tốc độ lắc 250 rpm thúc đẩy sinh trưởng và tích lũy PHA cao nhất ở hầu hết các chủng, đặc biệt với các chủng có nhu cầu oxy cao. Chủng 6.6 đạt khối lượng sinh khối khô 4,19 mg/ml và hàm lượng PHA 44,1% ở tốc độ lắc 200-250 rpm.

  6. Ảnh hưởng của nồng độ glycerol: Nồng độ glycerol từ 20 đến 30 g/l là điều kiện tối ưu để tăng hiệu suất tích lũy PHA lên gấp 2-3 lần so với 10 g/l, với hàm lượng PHA đạt 15,5% đến 22%. Nồng độ glycerol 40 g/l không làm tăng thêm sinh trưởng hay tích lũy PHA đáng kể.

  7. Thành phần PHA: 5 trong 6 chủng tổng hợp homopolymer PHB, chỉ có chủng 6.6 tổng hợp copolymer PHBV với 5,2 mol% 3-hydroxyvalerate (3HV). Đây là kết quả bước đầu quan trọng trong việc tìm kiếm chủng vi khuẩn biển có khả năng tích lũy PHA dạng copolymer tại Việt Nam.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu phù hợp với các công bố quốc tế về điều kiện sinh trưởng và tích lũy PHA của vi khuẩn biển ưa mặn. pH và nhiệt độ là hai yếu tố vật lý quan trọng ảnh hưởng đến hoạt động enzyme tổng hợp PHA và sự hấp thụ cơ chất. Tỷ lệ giống và tốc độ lắc ảnh hưởng đến mật độ tế bào và cung cấp oxy, từ đó tác động đến hiệu suất sản xuất PHA. Nồng độ glycerol là nguồn carbon chính, ảnh hưởng đến cân bằng dinh dưỡng và quá trình chuyển hóa nội bào.

Việc phát hiện chủng 6.6 có khả năng tổng hợp copolymer PHBV với tỷ lệ 3HV 5,2 mol% trên nguồn glycerol là bước tiến quan trọng, mở ra hướng nghiên cứu nâng cao hàm lượng copolymer và tối ưu hóa quy trình lên men. So với các nghiên cứu trong nước và quốc tế, hàm lượng PHA và tỷ lệ 3HV của chủng này còn thấp nhưng phù hợp với điều kiện nghiên cứu sơ khởi và nguồn nguyên liệu glycerol. Các biểu đồ sinh trưởng, hàm lượng PHA theo pH, nhiệt độ, tỷ lệ giống, tốc độ lắc và nồng độ glycerol minh họa rõ mối quan hệ giữa các yếu tố môi trường và hiệu suất sản xuất PHA, giúp định hướng các nghiên cứu tiếp theo.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Tối ưu hóa quy trình lên men: Áp dụng quy trình lên men gián đoạn hai pha với tỷ lệ giống 5-7,5%, pH duy trì ở 7-8, nhiệt độ 37°C và tốc độ lắc 200-250 rpm để đạt hiệu suất sinh trưởng và tích lũy PHA cao nhất trong vòng 48 giờ.

  2. Nâng cao hàm lượng copolymer 3HV: Bổ sung các tiền chất như axit propionic hoặc axit valeric vào môi trường lên men để tăng tỷ lệ monomer 3HV trong copolymer PHBV, hướng tới cải thiện tính chất cơ lý của vật liệu.

  3. Phát triển chủng vi khuẩn biển: Tiếp tục tuyển chọn và cải biến gen các chủng vi khuẩn biển có khả năng tích lũy PHA copolymer cao hơn, đặc biệt tập trung vào chủng 6.6 và các chủng có tiềm năng tương tự.

  4. Ứng dụng glycerol phế phẩm: Khai thác glycerol từ các ngành công nghiệp sinh học làm nguồn carbon giá rẻ, thân thiện môi trường để sản xuất PHA, giảm chi phí nguyên liệu và tăng tính bền vững của quy trình.

  5. Mở rộng nghiên cứu quy mô lớn: Thử nghiệm quy trình lên men trong hệ thống lên men công nghiệp để đánh giá khả năng ứng dụng thực tế, đồng thời nghiên cứu xử lý nước thải mặn và thiết bị lên men chịu muối nhằm khắc phục các thách thức kỹ thuật.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành công nghệ sinh học: Luận văn cung cấp dữ liệu thực nghiệm chi tiết về tuyển chọn vi khuẩn biển tích lũy PHA, phương pháp phân lập, sàng lọc và phân tích thành phần PHA, hỗ trợ nghiên cứu phát triển vật liệu sinh học.

  2. Doanh nghiệp sản xuất nhựa sinh học: Thông tin về điều kiện lên men tối ưu, nguồn nguyên liệu glycerol và tiềm năng vi khuẩn biển giúp doanh nghiệp phát triển quy trình sản xuất PHA hiệu quả, thân thiện môi trường.

  3. Cơ quan quản lý môi trường và chính sách: Nghiên cứu góp phần thúc đẩy phát triển công nghệ nhựa phân hủy sinh học, giảm thiểu ô nhiễm nhựa truyền thống, hỗ trợ xây dựng chính sách phát triển bền vững.

  4. Ngành công nghiệp chế biến thủy sản và nông nghiệp: Khai thác phế phẩm glycerol và các nguồn nguyên liệu sẵn có trong nước để sản xuất vật liệu sinh học, tạo giá trị gia tăng và giảm thiểu chất thải.

Câu hỏi thường gặp

  1. PHA là gì và tại sao nó quan trọng?
    PHA là polymer sinh học do vi sinh vật tổng hợp, có khả năng phân hủy sinh học hoàn toàn, thân thiện môi trường và có thể thay thế nhựa truyền thống trong nhiều ứng dụng.

  2. Tại sao chọn vi khuẩn biển để sản xuất PHA?
    Vi khuẩn biển ưa mặn giảm nguy cơ tạp nhiễm trong quá trình lên men, dễ ly giải tế bào để thu hồi PHA và có khả năng sử dụng nguồn nguyên liệu rẻ tiền, phù hợp với điều kiện môi trường biển Việt Nam.

  3. Các yếu tố nào ảnh hưởng đến sản xuất PHA?
    pH, nhiệt độ, tỷ lệ giống, tốc độ lắc và nồng độ cơ chất là các yếu tố vật lý và hóa học quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng vi khuẩn và hiệu suất tích lũy PHA.

  4. Làm thế nào để tăng tỷ lệ monomer 3HV trong copolymer PHBV?
    Bổ sung các tiền chất như axit propionic hoặc axit valeric vào môi trường lên men giúp tăng tỷ lệ 3HV, cải thiện tính chất cơ lý của vật liệu.

  5. Glycerol có vai trò gì trong quá trình lên men?
    Glycerol là nguồn carbon giá rẻ, dồi dào từ phế phẩm công nghiệp, giúp vi khuẩn sinh trưởng và tổng hợp PHA hiệu quả, góp phần giảm chi phí sản xuất.

Kết luận

  • Đã phân lập và tuyển chọn thành công 6 chủng vi khuẩn biển có khả năng tích lũy PHA, trong đó chủng 6.6 tổng hợp copolymer PHBV với 5,2 mol% 3HV.
  • Điều kiện pH 7-8, nhiệt độ 37°C, tỷ lệ giống 5-7,5%, tốc độ lắc 200-250 rpm và nồng độ glycerol 20-30 g/l là tối ưu cho sinh trưởng và tích lũy PHA.
  • Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) hiệu quả trong việc xác định thành phần monomer PHA.
  • Nghiên cứu góp phần làm phong phú nguồn gen vi khuẩn biển sản xuất nhựa sinh học tại Việt Nam, mở hướng phát triển công nghệ sản xuất PHA thân thiện môi trường.
  • Các bước tiếp theo bao gồm tối ưu hóa quy trình lên men, nâng cao hàm lượng copolymer và thử nghiệm quy mô công nghiệp nhằm ứng dụng rộng rãi trong sản xuất nhựa sinh học.

Hành động ngay: Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp nên phối hợp triển khai nghiên cứu tiếp theo để phát triển công nghệ sản xuất PHA từ vi khuẩn biển, góp phần bảo vệ môi trường và phát triển kinh tế bền vững.