MỞ ĐẦU Xu hướng chung của thế giới hiện nay trước vấn đề quá tải rác thải nhựa là tập trung đẩy mạnh sản xuất các sản phẩm nhựa có khả năng phân hủy sinh học hoàn toàn nhằm hạn chế tối đa các mảnh nhựa bị phân rã trong môi trường tự nhiên. Nhựa sinh học với đặc tính thân thiện với môi trường, bị phân hủy trong tự nhiên thành CO2 và nước trong thời gian ngắn được xem là cuộc cách mạng quan trọng trong công nghệ chất dẻo, là một giải pháp có tiềm năng ứng dụng và thay thế nhựa truyền thống. Số liệu của European Bioplastics cho thấy tổng năng lực sản xuất các loại nhựa sinh học chiếm 0,9 triệu tấn; dự kiến tăng lên 2,62 triệu tấn vào năm 2023, và đạt 2,87 triệu tấn vào năm 2025, tương đương với mức tăng trưởng trung bình 4,4% một năm trong giai đoạn 2018-2023, cao hơn 1% so với nhựa truyền thống [1]. Điều này cũng đồng nghĩa với nhu cầu về nguyên liệu nhựa sinh học ngày càng tăng, thúc đẩy nhà sản xuất mở rộng quy mô sản xuất, nguồn cung nguyên liệu cũng như hoàn thiện phương pháp sản xuất nhựa sinh học.
Các nhựa sinh học phổ biến hiện nay là các polyeste như polylactic axit (PLA), poly(butyrate adipate terephtalate) (PBAT), polycaprolacton (PCL), polyhydroxyalkanoat (PHA) có thể phân hủy sinh học hoàn toàn bởi vi sinh vật trong khi chúng có đặc tính cơ, lý, hóa ưu việt, có thể so sánh với nhựa nhiệt dẻo thông thường. Đây là các loại nhựa có tiềm năng thay thế nhựa nhiệt dẻo truyền thống, mở rộng phạm vi ứng dụng của nhựa sinh học trong nhiều ứng dụng khác nhau, từ bao bì, đồ gia dụng đến các vật liệu tiên tiến y sinh, hóa dược. Ở Việt Nam, nhựa là một trong các ngành công nghiệp có tốc độ tăng trưởng tương đối nhanh so với tốc độ phát triển của nền kinh tế chung. Tăng trưởng trung bình của ngành nhựa Việt Nam là 11,6%/năm, cao hơn so với mức tăng trưởng 3,4%/năm của ngành nhựa thế giới.
Song song với tốc độ tăng trưởng cao, ngành nhựa cũng gây ra một áp lực rất lớn đối với môi trường do rác thải nhựa gây ra. Việt Nam là một trong 5 nước có lượng rác thải nhựa ra biển lớn nhất trên thế giới với khoảng 1,8 triệu tấn/ năm. Xuất phát từ thực tế trên, các cơ quan quản lý Nhà nước cũng đã và đang đưa ra nhiều biện pháp, chính sách nhằm giảm thiểu ô nhiễm môi trường do rác thải nhựa gây ra. Cho đến nay, các nghiên cứu chế tạo một số vật liệu nhựa có khả năng phân hủy sau khi sử dụng, thay thế nhựa truyền thống đã được thực hiện, tuy vậy các kết quả đạt được còn tương đối rời rạc, ở quy mô nhỏ.
Để có thể chủ động trong quá trình sản xuất, bắt kịp xu hướng phát triển nhựa sinh học trên thế giới chúng ta cần làm chủ được công nghệ sản xuất và tổng hợp các loại nguyên liệu nhựa sinh học từ các nguồn nguyên liệu sẵn có trong nước với giá thành rẻ. Một trong những thế mạnh hiện nay của công nghệ sinh học là có thể tạo ra nguyên liệu nhựa sinh học thông qua khai thác các sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật. n 2 Polyhydroxyalkanoate (PHA) là lớp polyester của các axit hydroxycarboxylic khác nhau, được tổng hợp bởi các loại vi sinh vật dưới dạng năng lượng dự trữ khi điều kiện sinh trưởng bị giới hạn. PHA mang các đặc tính cơ lý tương tự như các loại nhựa có nguồn gốc từ dầu mỏ nhưng ưu việt hơn như không độc hại, không tan trong nước, tương thích sinh học cao và đặc biệt là khả năng phân hủy sinh học, do đó chúng trở thành một trong những loại polymer có tiềm năng lớn để thay thế các loại vật liệu nhựa truyền thống [2].
Cùng với một số loại nhựa sinh học khác như PLA, PBAT, PHA hiện nay đã được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, y tế, dược phẩm, nông nghiệp v. Các PHA có bản chất homopolymer (3HB) thường có tính kết tinh cao do đó vật liệu tương đối giòn, cứng, với tỷ lệ kéo dài thấp. Trong khi đó các vật liệu copolymer đã khắc phục được những hạn chế của homopolymer, vì vậy việc tìm kiếm các chủng vi sinh vật sinh tổng hợp các copolymer có chứa các monomer khác với 3-hydroxybutyrate (3HB) là một điều cần thiết. Việt Nam với lợi thế hơn 11.000 km đường biển, là một trong những đất nước có mức độ đa dạng vi sinh vật biển cao, do đó việc khai thác và bảo tồn nguồn vi sinh vật ở hệ sinh thái này mang lại nhiều tiềm năng phát triển, đặc biệt là các chủng vi sinh vật có khả năng tích lũy PHA.
Một số nghiên cứu trong nước cũng như quốc tế cũng đã tập trung vào nhóm các chủng vi sinh vật chịu mặn tổng hợp PHA với các đặc tính vật liệu hữu ích. Chính từ những cơ sở đã phân tích ở trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Tuyển chọn các chủng vi khuẩn tích lũy nhựa sinh học Polyhydroxyalkanoate (PHA) dạng copolymer phân lập ở Việt Nam” trong đó tập trung vào nhóm vi khuẩn biển, với mục tiêu: Thu nhận được các chủng sinh tổng hợp PHA dạng polymer. Thu nhận được nhựa PHA từ các chủng tuyển chọn. Để đạt được mục tiêu nghiên cứu này, chúng tôi đã thực hiện các nội dung nghiên cứu sau: - Phân lập các chủng vi khuẩn từ vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa.
- Sàng lọc các chủng vi khuẩn biển sinh tổng hợp PHA. - Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố như pH, nhiệt độ lên mức độ sinh trưởng và sinh tổng hợp PHA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn. - Thu nhận PHA từ các chủng tuyển chọn và phân tích thành phần PHA. - Phân loại các chủng vi khuẩn sinh PHA tuyển chọn.
TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1. Polyhydroxyalkanoate Polyhydroxyalkanoate (PHA) là lớp polyeste của các axit hydroxycarboxylic khác nhau, được tổng hợp bởi các loại vi sinh vật dưới dạng năng lượng dự trữ. Khi điều kiện sinh trưởng bị hạn chế do dư thừa carbon nhưng lại thiếu nguồn nitơ, phốtpho, lưu huỳnh, oxy v.v thì vi sinh vật điều khiển các hoạt động trao đổi chất của chúng theo cách mà thay vì tuân theo chu trình axit tricarboxylic thông thường, acetyl-CoA được chuyển hướng sang tổng hợp PHA. PHA không hòa tan trong nước, được tích lũy bởi vi khuẩn dưới dạng các hạt nội bào trong bào tương, tạo thành các thể vùi.
Do PHA mang các đặc tính cơ lý tương tự như các loại nhựa có nguồn gốc từ dầu mỏ nên chúng trở thành một trong những loại polymer có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành sản xuất. Hơn thế nữa PHA có thể phân hủy sinh học trong các môi trường khác nhau, do đó chúng là lựa chọn hấp dẫn để thay thế nhựa sử dụng một lần. Với đặc tính phân hủy sinh học của chúng, PHA hình thành một chu trình sản xuất vòng khép kín giảm thiểu tác động đến môi trường. Có hơn 150 loại axit polyhydroxyalkanoic khác nhau tạo nên họ PHA [4].
Dựa vào sự liên kết của các đơn phân monomer đã tạo ra số lượng khổng lồ các chuỗi PHA có khối lượng, thành phần monomer và chiều dài chuỗi khác nhau. Phân loại PHA PHA có thể được phân loại dựa trên số lượng nguyên tử carbon của chuỗi polymer hoặc dựa trên bản chất của các monomer trong chuỗi. Dựa vào độ dài chuỗi, PHA được chia thành 3 loại: (i) chuỗi ngắn từ 3–5 carbon (SCL-PHA); (ii) chuỗi trung bình từ 6–14 carbon (MCL-PHA); và (iii) chuỗi dài gồm hơn 15 nguyên tử carbon (LCL-PHA). PHA chuỗi ngắn và chuỗi trung bình là các loại polymer có liên kết, khi được tạo ra từ các axit béo không bão hòa [5.
Các PHA điển hình có thể kể đến là poly (3-hydroxybutyrate) (PHB) và poly (3-hydroxybutyrate-co-3- hydroxyvalerate (PHBV), cả hai đều là PHA chuỗi ngắn và đại diện cho các dạng cơ bản nhất có sẵn trên thị trường. Các loại PHA hiện có khác được sử dụng trong các nghiên cứu phân hủy sinh học là poly (3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) (PH4B), poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) (PHBHx) và poly (3- hydroxybutyrate-co-3-hydroxyoctanoate) (PHBO).1: Cấu trúc hóa học của (a) 3-Hydroxypropionate (HP), (b) 3- hydroxybutyrate (HB), (c) 3-hydroxyvalerate (HV), (d) 4-hydroxybutyrate (4HB), (e) 3-hydroxyhexanoate (Hx), and (f) 3-hydroxyoctonaote (HO) [6] Dựa vào bản chất monomer, PHAs được chia thành hai loại homopolymer và heteropolymer. Trong khi homopolymer chỉ chứa một loại monomer axit béo 3-hydroxy duy nhất thì heteropolymer có thể chứa hai hoặc nhiều loại monomer khác nhau, do đó chúng còn có tên là copolymer. Ví dụ điển hình của homopolymer là poly-3-hydroxybutyrate (P(3HB) chỉ có một dạng monomer là 3HB.
P3HB (PHB) có tính kết tinh cao (> 50%), do đó tương đối giòn và cứng, với tỷ lệ kéo dài và đứt gãy thấp. Vì vậy, các nỗ lực tạo phức PHB chủ yếu tập trung vào việc tìm kiếm chất hóa dẻo và chất hạt nhân làm giảm quá trình kết tinh và cải thiện tính linh hoạt. PHA dạng copolymer có chứa hỗn hợp gồm các tiểu đơn vị có chiều dài 4-5 carbon và chứa các monomer 3-hydroxyvalerate (3HV) hoặc 4-hydroxybutyrate (4HB) khi nuôi cấy các chủng vi khuẩn với axit valeric. Việc kết hợp HV vào polymer PHB tạo ra poly (3-hydroxybutyrate-co- 3-hydroxyvalerate) (P(3HB/3HV), ít cứng và giòn hơn P(3HB) nguyên chất [7].
Đặc tính hóa lý của một số loại PHA Một số đặc tính hóa lý của PHA như tính kỵ nước của polymer, điểm nóng chảy, nhiệt độ chuyển thủy tinh và mức độ kết tinh hoàn toàn thay đổi đáng kể phụ thuộc vào thành phần của monomer cấu thành. Họ PHA thể hiện nhiều tính chất cơ học khác nhau, từ dạng tinh thể cứng đến dạng đàn hồi. Các PHA dạng chuỗi ngắn và vừa: Các polymer sinh học có độ dài chuỗi ngắn thường có đặc tính cứng, giòn, có mức độ kết tinh cao (khoảng 60 – 80%) trong khi n 5 PHA có độ dài chuỗi trung bình dễ uốn dẻo và đàn hồi hơn, có độ kết tinh thấp (25%), độ bền kéo thấp, độ giãn dài cao, nhiệt độ nóng chảy thấp và Tg thấp hơn nhiệt độ phòng [8]. P(3HB): PHB là polymer thuộc họ PHA được nghiên cứu rộng rãi nhất nên hầu hết các đặc tính của PHA thường được giải thích từ tích chất của PHB.
P(3HB) có tính kết tinh cao do tính ổn định trong cấu trúc không gian của nó. P(3HB) không tan trong nước và tương đối bền với phản ứng thủy phân. Nó có tính thấm O2 thấp, là loại nhựa nhiệt dẻo tốt nhưng các tính chất cơ học và độ bền kéo kém hơn so với các polymer có nguồn gốc từ dầu mỏ, ví dụ như polypropylene [9]. Mật độ của PHB tinh thể và vô định hình lần lượt là 1,26 và 1,18 g/ cm3.
Khối lượng phân tử của P(3HB) thu nhận từ vi khuẩn phân lập trong tự nhiên thường nằm trong khoảng 10.000 Da với độ phân tán khoảng 2.