Đặt vấn đề Bacillus thuringiensis là vi khuẩn có khả năng sinh sản ra các protein tinh thể độc có khả năng diệt côn trùng thuộc các bộ khác nhau mà không gây độc hại cho con ngƣời và môi trƣờng sinh thái và sinh vật có ích. Trong nhiều năm qua, thuốc trừ sâu sinh học từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng để diệt trừ côn trùng có hại đối với cây trồng cũng nhƣ bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Càng ngày thuốc trừ sâu sinh học từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis càng đƣợc sử dụng một cách rộng rãi bởi nhu cầu sử dụng các sản phẩm nông nghiệp sạch ngày càng cao. Không những thế thuốc trừ sâu sinh học BT còn có những ƣu điểm rất vƣợt trội từ việc khắc phục đƣợc tính kháng thuốc của côn trùng và chỉ diệt các loài côn trùng có hại, không ảnh hƣởng tới môi trƣờng sinh thái cũng nhƣ sức khỏe con ngƣời.
Côn trùng bộ hai cánh là một trong những bộ lớn trong lớp côn trùng với số lƣợng và thành phần đa dạng. Côn trùng thuộc bộ hai cánh rất đa dạng về mặt sinh thái học và chủ yếu là các tác nhân gây hại trong nông nghiệp (ruồi đục quả) hay cho con ngƣời nhƣ ruồi, muỗi. Chúng là tác nhân trung gian chủ yếu truyền bệnh giữa ngƣời với ngƣời hay giữa động vật và ngƣời. Các bệnh do muỗi truyền có thể gây tử vong cao nhƣ Anopheles gambiae là trung gian truyền bệnh sốt rét cho ngƣời.
Aedes aegypti truyền bệnh sốt xuất huyết. Culex tritaeniorhynchus truyền bệnh viêm não Nhật Bảncòn ruồi là tác nhân truyền khoảng 100 bệnh nhƣng chủ yếu là các bệnh nguy hiểm nhƣ: bại liệt, bệnh đau mắt hột, viêm gan (A, E), sốt hồi qui do Rickettsiae,lỵ, tả, thƣơng hàn, liên cầu khuẩn (Streptococcus) và tụ cầu vàng (Staphyloccocus). Ngày nay, có nhiều phƣơng pháp diệt côn trùng bộ hai cánh khác nhau mà con ngƣời áp dụng. Biện pháp diệt đƣợc sử dụng phổ biến nhất là dùng các loại thuốc diệt ruồi, muỗi.
Tuy nhiên, những loại thuốc này hiện nay thƣờng có giá thành cao, chủ yếu có nguồn gốc từ hóa chất nên dễ gây ô nhiễm môi trƣờng và ảnh hƣởng đến sức khỏe của con ngƣời, động vật, không diệt trừ tận gốc mầm bệnh. Việc nghiên cứu hoạt tính diệt ấu trùng một số côn trùng bộ hai cánh của các 1 chủng Bacillus thuringiensisphân lập ở Việt Nam là rất cần thiết nhằm tìm ra những chủng mang gen tự nhiên có hoạt tính mạnh phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học diệt ấu trùng một số côn trùng bộ hai cánh. Xuất phát từ thực tiễn trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn Bacillusthuringiensis phục vụ tạo chế phẩm diệt côn trùng bộ hai cánh (Diptera)” 2. Mục tiêu nghiên cứu 2.
Mục tiêu chung Tuyển chọn đƣợc chủng Bacillus thuringiensis bản địa có khả năng sinh protein tinh thể độc diệt côn trùng thuộc bộ hai cánh (Diptera) cao. Biểu hiện, tinh sạch đƣợc protein mã hóa tinh thể độc diệt côn trùng bộ hai cánh trong vi khuẩn E.coli phục vụ nghiên cứu chuyên sâu và sản xuất đƣợc chế phẩm sinh học Bacillus thuringiensis có hoạt lực diệt ấu trùng ruồi nhà (Musca domestica) từ bã thải nhà máy bia. Mục tiêu cụ thể - Thu thập và sàng lọc đƣợc chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis từ các mẫu đất, lá tại một số tỉnh của Việt nam có khả năng sinh gen cry2A mã hóa protein tinh thể độc diệt côn trùng bộ hai cánh và xác định đƣợc trình tự nucleotide của gen cry2A này. - Biểu hiện và tinh sạch đƣợc protein tái tổ hợp (rCry2A) trong E.
- Tìm ra đƣợc phƣơng pháp xử lý bã malt bia làm môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn B. thuringiensis và nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng và sinh tổng hợp protein tinh thể của vi khuẩn B. thuringiensis khi sử dụng bã malt bia làm môi trƣờng nuôi cấy ở quy mô phòng thí nghiệm. Đồng thời đánh giá đƣợc sơ bộ hiệu quả diệt côn trùng bộ hai cánh của chế phẩm BT từ vi khuẩn B.
Nội dung nghiên cứu - Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng Bacillus thuringiensis (B. thuringiensis) có hoạt tính diệt côn trùng bộ hai cánh. - Nghiên cứu tách dòng và đọc trình tự đƣợc gen cry2 của các chủng Bt phân lập từ đất, lá có hoạt tính diệt côn trùng bộ hai cánhcủa chủng vi khuẩn B. thuringiensis tuyển chọn.
- Nghiên biểu hiện gen mã hóa protein Cry2 diệt côn trùng bộ hai cánh của chủng vi khuẩn B. thuringiensis tuyển chọn. - Nghiên cứu các phƣơng pháp xử lý bã malt bia làm môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn B. Hoàn thiện môi trƣờng lên men vi khuẩn B.
thuringiensis từ bã malt bia. - Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng và sinh tổng hợp protein tinh thể của vi khuẩn B. thuringiensis tuyển chọn khi sử dụng bã malt bia làm môi trƣờng nuôi cấy ở quy mô phòng thí nghiệm. - Lên men sản xuất chế phẩm sinh học diệt côn trùng bộ hai cánh từ vi khuẩn B.
thuringiensis tuyển chọn và đánh giá sơ bộ hiệu quả diệt côn trùng bộ hai cánh của chế phẩm trong phòng thí nghiệm và ngoài thực địa. Những đóng góp mới của luận án - Phân lập và tuyển chọn đƣợc 7 chủng vi khuẩn B. thuringiensis mang gen cry2A có hoạt tính diệt côn trùng bộ hai cánh cao. - Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ thống về gen cry2A từ chủng vi khuẩn B.
Thuringiensis serovar kurstaki MSS 8.4 của Việt Nam có khả năng diệt côn trùng bộ hai cánh phục vụ cho việc phát triển thuốc trừ sâu sinh học. - Bổ sung cơ sở dữ liệu nguồn gen cry2A của các chủng B. thuringiensis Việt Nam phục vụ cho các nghiên cứu và ứng dụng về sau. 3 - Sử dụng bã malt bia là một chất thải của ngành sản xuất đồ uống làm nguồn nguyên liệu cung cấp các chất dinh dƣỡng (các bon, nitơ, chất khoáng…) cho sự sinh trƣởng của vi khuẩn B.
thuringiensis và đƣợc sử dụng nhƣ một nguyên liệu thay thế cho các hợp chất hữu cơ tổng hợp đắt tiền để sản xuất thuốc trừ sâu sinh học BT. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 5. Ý nghĩa khoa học Nghiên cứu một cách hệ thống và đầy đủ về gen cry2A là cơ sở khoa học đáng tin cậy cho những nghiên cứu tiếp theo về vi khuẩn Bacillus thuringiensis nói chung và gen cryA nói riêng. Trên cơ sở đánh giá đƣợc tác động của gen cryA mã hóa protein tinh thể có khả năng diệt đƣợc một số côn trùng bộ hai cánh nhƣ ruồi nhà là một bƣớc đi mới để mở ra khả năng tạo ra đƣợc các chế phẩm sinh học diệt các côn trùng này.
Kết quả của luận án còn góp phần phát triển công nghệ lên men chế phẩm BT từ nguồn nguyên liệu thay thế rẻ tiền là phế thải của ngành sản xuất bia. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của luận án góp phần khai thác có hiệu quả nguồn gen của vi sinh vật nói chung và gen cry2A của vi khuẩn B. thuringiensis nói riêng để góp phần tạo ra các chế phẩm sinh học diệt một số côn trùng bộ hai cánh.Mặt khác sử dụng bã malt bia - một loại chất thải của ngành sản xuất công nghiệp đƣợc xử lý thành nguồn nguyên liệu cho quá trình sản xuất khác chế phẩm BT là rất cần thiết. Đây là một hƣớng nghiên cứu nhằm nâng cao giá trị của bã malt bia, tạo ra sản phẩm thân thiện môi trƣờng phục vụ sản xuất nông nghiệp bền vững.
4 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Vi khuẩn Bacillus thuringiensis 1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bacillus thuringiensis Năm 1870, Louis Pasteur phát hiện một loài vi khuẩn có khả năng gây bệnh cho tằm và ông đặt tên loại vi khuẩn này là Bacillus bombyces. Năm 1901, Bacillus soto đƣợc nhà khoa học Nhật Bản Sigetane Ishiwata phát hiện và đặt tên khi ông nghiên cứu về bệnh ở tằm dâu.
Đến mƣời năm sau (1911), loài vi khuẩn này đƣợc nhà khoa học ngƣời Đức là Berliner phân lập đƣợc từ xác ấu trùng bƣớm Địa Trung Hải (Anagasta kuhniella) và ông đã có những mô tả đầu tiên về loài vi khuẩn đất này, đó là vi khuẩn đất có tế bào hình que, có khả năng sinh bào tử. Đến năm 1915, vi khuẩn này chính thức mang tên Bacillus thuringiensisdo phân lập từ nhà máy bột vùng Thuringen của Đức. Từ đó, chế phẩm sử dụng B. thuringiensis để diệt sâu đục thân có hại Angasta kuhniella ở châu Âu đƣợc ra đời năm 1930 tên là chế phẩm BT.
Chế phẩm thƣơng mại đầu tiên đƣợc sản xuất để diệt sâu hại lúa mỳ tại Pháp năm 1938. Năm 1953, Hannay và Fitzjame đã phát hiện ra thể vùi và công bố tinh thể có bản chất protein. Năm 1956, Angus đã chứng minh đƣợc hoạt tính diệt sâu của B. thuringiensislà do tinh thể độc này đƣợc sinh ra từ tế bào và bào tử vi khuẩn.
Trong suốt những năm 1960, nhiều chế phẩm thƣơng mại của B. thuringiensis đã đƣợc sản xuất ở nhiều quy mô khác nhau tại Mỹ, Pháp, Đức. Sau đó, Howard Dulmage và Clayton Beesle của viện nghiên cứu Nông Nghiệp USDA đã thu thập đƣợc bộ sƣu tầm đầu tiên về các chủng B. Năm 1962, De Barjac và Bonnefoi đã đƣa ra phƣơng pháp phân loại mới cho các chủng B.
sphaericus (Bs) bằng phƣơng pháp huyết thanh. Năm 1970, Dulmage đã phân lập đƣợc chủng HD-1 và cho đến nay nó vẫn đƣợc sử dụng cho nhiều nghiên cứu và trong chế phẩm B. Trong những năm 1970 và 1980, rất nhiều nghiên cứu về B. Thuringiensis 5 đƣợc thực hiện nhằm tìm ra phổ côn trùng đích của B.
Năm 1977, Goldberg và Margarit đã phát hiện ra B. isralensis diệt đƣợc cả ấu trùng muỗi và ruồi thuộc bộ hai cánh. Đặc biệt, gen mã hóa protein tinh thể diệt sâu đầu tiên đƣợc tách dòng và đọc trình tự năm 1981. Từ đó trở đi, rất nhiều gen của vi khuẩn B.
thuringiensis đã đƣợc tách dòng và nghiên cứu đặc tính diệt côn trùng. Năm 1983, Krieg và cộng sự đã phát hiện dƣới loài Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis diệt bọ cánh cứng hại lá khoai tây vùng Colorado, Hoa Kỳ từ sâu Tenebrio molitar. Sau đó không lâu thì công ty Mycogen phát hiện chủng tƣơng tự B.
morrisoni đặt tên là B. sandiego và đã tổng hợp đƣợc chuỗi gen độc tố của chúng. Đặc biệt, vi khuẩn này còn đƣợc phát hiện ra hoạt tính đối với giun tròn thực vật, diệt ve bét, mạt thuộc bộ Trematoda và diệt kiến thuộc bộ Hymenoptera. Đáng chú ý, đây cũng là giai đoạn diễn ra những nghiên cứu đầu tiên về chuyển gen B.
thuringiensis vào cây trồng (1985).