Nghiên cứu tổng hợp hoạt chất rhamnetin-3-O-rhamnoside ở vi khuẩn Escherichia coli

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu vnua nghiên cứu sinh tổng hợp hoạt chất rhamnetin 3 0 rhamnoside ở vi khuẩn escherichia coli cải, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện

• Tác giả: Phạm Thị Uyên
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Huy Thuần
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu sinh tổng hợp hoạt chất rhamnetin-3-O-rhamnoside ở vi khuẩn Escherichia coli cải biến di truyền
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 2. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• 3. DANH MỤC BẢNG
• 4. DANH MỤC HÌNH, HIỂU ĐỒ
• 5. TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• 6. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 7. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
• 8. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
• 9. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU
• 9.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài nghiên cứu
• 9.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài nghiên cứu
• 10. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 10.1. KHÁI QUÁT VỀ FLAVONOID
• 10.2. GIỚI THIỆU RHAMNETIN VÀ MỘT SỐ DẪN XUẤT RHAMNETIN GLYCOSIDE THƯỜNG GẶP
• 10.3. CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP RHAMNETIN VÀ DẪN XUẤT RHAMNETIN-3-O-RHAMNOSIDE Ở THỰC VẬT
• 10.4. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP RHAMNETIN VÀ DẪN XUẤT RHAMNETIN GLYCOSIDE

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu tổng hợp rhamnetin 3 O rhamnoside từ E

Nghiên cứu tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside từ vi khuẩn E. coli là một lĩnh vực đang thu hút sự quan tâm lớn trong ngành công nghệ sinh học. Rhamnetin là một flavonoid có nhiều hoạt tính sinh học, bao gồm kháng viêm và kháng khuẩn. Việc tổng hợp hợp chất này từ vi khuẩn E. coli cải biến di truyền không chỉ giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất mà còn mở ra hướng đi mới cho việc phát triển các sản phẩm có giá trị trong y học và mỹ phẩm.

1.1. Rhamnetin và vai trò của nó trong y học

Rhamnetin là một flavonoid thuộc nhóm glycoside, có công thức hóa học C16H12O7. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng rhamnetin có khả năng kháng viêm và kháng khuẩn mạnh mẽ, làm cho nó trở thành một ứng cử viên tiềm năng trong việc phát triển thuốc và sản phẩm chăm sóc sức khỏe.

1.2. Tại sao chọn E. coli cho tổng hợp rhamnetin

Vi khuẩn E. coli được chọn làm hệ thống sản xuất do khả năng sinh trưởng nhanh chóng và dễ dàng cải biến di truyền. Việc sử dụng E. coli cho tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside giúp giảm thiểu thời gian và chi phí sản xuất, đồng thời tăng hiệu suất thu hồi sản phẩm.

II. Thách thức trong việc tổng hợp rhamnetin 3 O rhamnoside

Mặc dù việc tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside từ E. coli có nhiều tiềm năng, nhưng vẫn tồn tại một số thách thức lớn. Các vấn đề như hiệu suất chuyển hóa thấp, điều kiện nuôi cấy không tối ưu và sự cạnh tranh từ các con đường sinh tổng hợp khác cần được giải quyết.

2.1. Hiệu suất chuyển hóa thấp trong nuôi cấy

Một trong những thách thức lớn nhất là hiệu suất chuyển hóa rhamnetin từ E. coli. Nghiên cứu cho thấy rằng các yếu tố như nồng độ IPTG, nhiệt độ và loại môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất này.

2.2. Cạnh tranh từ các con đường sinh tổng hợp khác

E. coli có thể chuyển hóa các hợp chất khác, dẫn đến sự cạnh tranh trong việc sản xuất rhamnetin-3-O-rhamnoside. Việc tối ưu hóa con đường sinh tổng hợp là cần thiết để tăng cường sản xuất hợp chất mục tiêu.

III. Phương pháp nghiên cứu tổng hợp rhamnetin 3 O rhamnoside

Để tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside, nghiên cứu đã áp dụng nhiều phương pháp khác nhau, bao gồm nuôi cấy vi khuẩn, tách chiết và phân tích sản phẩm. Các phương pháp này giúp xác định điều kiện tối ưu cho quá trình tổng hợp.

3.1. Nuôi cấy vi khuẩn E. coli cải biến di truyền

Việc nuôi cấy E. coli cải biến di truyền được thực hiện trong môi trường có bổ sung rhamnetin. Các điều kiện nuôi cấy như nồng độ IPTG và nhiệt độ được điều chỉnh để tối ưu hóa sản xuất rhamnetin-3-O-rhamnoside.

3.2. Tách chiết và phân tích sản phẩm

Sau khi nuôi cấy, sản phẩm rhamnetin-3-O-rhamnoside được tách chiết bằng phương pháp chiết pha lỏng-pha lỏng. Sản phẩm sau đó được phân tích bằng các phương pháp như TLC, HPLC và LC-ESI-MS/MS để xác định chất lượng và hàm lượng.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng việc tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside từ E. coli là khả thi và có thể đạt được hiệu suất cao. Các ứng dụng thực tiễn của hợp chất này trong y học và mỹ phẩm đang được khám phá.

4.1. Hiệu suất tổng hợp đạt được

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng với điều kiện nuôi cấy tối ưu, sản lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside có thể đạt tới 12 mg/L. Điều này mở ra cơ hội cho việc sản xuất quy mô lớn trong tương lai.

4.2. Ứng dụng trong y học và mỹ phẩm

Rhamnetin-3-O-rhamnoside có tiềm năng ứng dụng trong các sản phẩm y tế và mỹ phẩm nhờ vào các hoạt tính sinh học của nó. Việc phát triển các sản phẩm này có thể cải thiện sức khỏe và chất lượng cuộc sống cho con người.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside từ E. coli đã mở ra hướng đi mới trong việc sản xuất các hợp chất tự nhiên có giá trị. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều ứng dụng thực tiễn trong các lĩnh vực khác nhau.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu

Nghiên cứu này không chỉ cung cấp kiến thức mới về tổng hợp rhamnetin mà còn góp phần vào việc phát triển các phương pháp sản xuất bền vững cho các hợp chất tự nhiên.

5.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất và khám phá thêm các ứng dụng của rhamnetin-3-O-rhamnoside trong các lĩnh vực khác nhau như thực phẩm và dược phẩm.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Chiết xuất các hợp chất tự nhiên từ thực vật thường gặp rào cản lớn về sản lượng thấp và chi phí tinh chế cao. Điển hình, hàm lượng hoạt chất rhamnetin thu nhận từ dịch chiết vỏ cây keo cao (Acacia catechu) chỉ đạt khoảng 13 mg trên mỗi kilôgam nguyên liệu thô, đồng thời dễ lẫn nhiều tạp chất khó tách. Rhamnetin-3-O-rhamnoside là một flavonol glycoside quý sở hữu nhiều hoạt tính sinh học vượt trội như ức chế tế bào khối u, kháng viêm và chống oxy hóa. Tuy nhiên, tính tan kém trong môi trường nước của aglycone rhamnetin tự nhiên làm suy giảm nghiêm trọng sinh khả dụng. Trong khi đó, các phương pháp tổng hợp hóa hữu cơ truyền thống lại đối mặt với nhược điểm thiếu tính chọn lọc lập thể và sử dụng hóa chất độc hại gây ô nhiễm môi trường.

Luận văn thạc sĩ tập trung giải quyết bài toán trên thông qua mục tiêu thiết lập hoàn chỉnh quy trình sinh tổng hợp hoạt chất rhamnetin-3-O-rhamnoside ở vi khuẩn Escherichia coli cải biến di truyền theo cơ chế chuyển hóa sinh học nguyên tế bào (in vivo whole-cell bioconversion). Đề tài đánh giá toàn diện ảnh hưởng của 3 thông số nuôi cấy then chốt gồm môi trường dinh dưỡng, nồng độ chất cảm ứng IPTG và nhiệt độ nuôi cấy nhằm tối ưu hóa hiệu suất chuyển hóa cơ chất rhamnetin thành sản phẩm glycoside mục tiêu.

Nghiên cứu được triển khai trong phạm vi thời gian từ tháng 02 năm 2017 đến tháng 10 năm 2017 tại phòng thí nghiệm chuyên sâu thuộc Trung tâm Sinh học Phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ cao, phối hợp cùng Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Đề tài mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn sâu sắc khi thiết lập thành công hệ thống sinh tổng hợp xanh, đạt hiệu suất chuyển hóa đỉnh cao lên tới 90% với nồng độ sản phẩm 27,2 µM (tương đương 12,6 mg/L), tạo tiền đề vững chắc cho việc phát triển quy trình lên men quy mô pilot phục vụ ngành dược phẩm và mỹ phẩm.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu vận dụng lý thuyết chuyển hóa sinh học flavonoid, lý thuyết glycosyl hóa xúc tác bởi enzyme và mô hình kỹ thuật chuyển hóa chuyển dịch con đường trao đổi chất (metabolic pathway engineering). Các khái niệm nền tảng bao gồm:

• Khung cấu trúc Flavonol: Thuộc nhóm flavonoid cấu tạo bởi khung cơ bản C6-C3-C6 với liên kết 3-hydroxyl, trong đó rhamnetin là dẫn xuất methyl hóa đặc trưng tại vị trí carbon số 7 (C-7) với công thức phân tử C16H12O7 và khối lượng phân tử 316,26 g/mol.
• Quá trình glycosyl hóa (Glycosylation): Phản ứng gắn phân tử đường hoạt hóa vào cơ chất nhận aglycone giúp gia tăng độ phân cực, cải thiện độ hòa tan trong nước và tăng cường hoạt tính dược lý.
• Enzyme Glycosyltransferase (GT): Xúc tác chuyển nhóm glycosyl từ phân tử đường hoạt hóa sang cơ chất nhận. Trong đó, enzyme UDP-glycosyltransferase từ thực vật mô hình Arabidopsis thaliana (ArGT3) thuộc họ GT-1, mang trình tự bảo thủ 44 amino acid ở đầu C-terminal (hộp PSPG) đóng vai trò nhận diện và gắn kết phân tử đường.
• Sinh tổng hợp đường hoạt hóa nội bào: Quá trình hình thành thymidine diphosphate (TDP)-α-L-rhamnose từ glucose-1-phosphate thông qua chuỗi 3 enzyme vi khuẩn gồm 4,6-dehydratase, 3,5-epimerase và 4-reductase.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng nguồn dữ liệu thực nghiệm thu nhận trực tiếp qua quá trình nuôi cấy chủng vi khuẩn tái tổ hợp Escherichia coli BL21(DE3) chủng M3G3 đã được bất hoạt hai gen pgi và zwf (Δpgi/Δzwf). Chủng này đồng biểu hiện 3 vector plasmid tái tổ hợp: vector pET28a mang gen mã hóa ArGT3 (kháng kanamycin), vector pCDF-Duet mang hai gen TGS và DH (kháng streptomycin), cùng vector pACYC-Duet mang hai gen EP và KR (kháng chloramphenicol). Cỡ mẫu thực nghiệm được thiết kế với 3 lần lặp lại độc lập (n = 3) cho từng nghiệm thức để thu nhận giá trị trung bình và độ lệch chuẩn chính xác. Phương pháp chọn mẫu đồng nhất dựa trên mật độ quang học OD600 đạt chuẩn 0,6 trước khi bổ sung chất cảm ứng.

Quy trình nuôi cấy thực hiện trong các bình tam giác 250 mL chứa 50 mL môi trường dinh dưỡng ở tốc độ lắc 220 vòng/phút. Sau giai đoạn cảm ứng sinh tổng hợp protein bằng IPTG trong 3-5 giờ, 30 µM cơ chất rhamnetin hòa tan trong hỗn hợp methanol:DMSO (tỷ lệ 9:1 v/v) được bổ sung và nuôi chuyển hóa tiếp tục trong 24 giờ.

Sản phẩm được thu hồi qua phương pháp chiết lỏng - lỏng bằng dung môi ethyl acetate:methanol (tỷ lệ 9:1 v/v), cô quay chân không loại bỏ dung môi và làm khô hoàn toàn bằng máy sấy thăng hoa đông khô ở nhiệt độ âm 70°C. Lý do lựa chọn hệ thống phân tích đa tầng gồm sắc ký bản mỏng TLC (pha động ethyl acetate:methanol:toluene:nước tỷ lệ 8:1:0,5:1 v/v), sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (cột pha đảo C18 Zorbax extend, bước sóng 280 nm) và sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-ESI-MS/MS (chế độ ion âm) là nhằm đảm bảo tính chính xác tuyệt đối từ định tính, định lượng cho đến kiểm chứng cấu trúc phân mảnh ion phân tử.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

• Phân lập và kiểm chứng thành công sản phẩm: Tinh sạch thô thu nhận được 25 mg sản phẩm dạng bột đông khô màu vàng nhạt. Phân tích TLC ghi nhận vết sản phẩm rhamnetin-3-O-rhamnoside có hệ số di chuyển Rf = 0,35, phân tách rõ rệt với vết cơ chất rhamnetin ban đầu có Rf = 0,75. Sắc ký đồ HPLC cho thấy pic sản phẩm xuất hiện tại thời gian lưu 13,4 phút, tách biệt hoàn toàn so với pic cơ chất ở thời gian lưu 17,5 phút. Phổ khối LC-ESI-MS/MS xác nhận các phân mảnh ion đặc trưng ở chế độ ion âm gồm m/z 314,10 (phân mảnh mất gốc rhamnose 146,95 Da) và m/z 299,10 (phân mảnh mất tiếp nhóm methyl -CH3 tại vị trí C-7).
• Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy: Môi trường Terrific Broth (TB) mang lại hiệu quả chuyển hóa vượt trội nhất với hàm lượng sản phẩm trung bình đạt 22,3 µM (tương đương 10,3 mg/L), đạt hiệu suất chuyển hóa 74,3%. Năng suất này cao hơn 1,44 lần so với môi trường LB (đạt 15,4 µM, hiệu suất 51,3%) và cao hơn 1,27 lần so với môi trường tối thiểu M9 bổ sung 4 g/L glucose (đạt 17,5 µM, hiệu suất 58,3%).
• Ảnh hưởng của nồng độ IPTG: Nghiên cứu nồng độ IPTG từ 0 đến 1,0 mM cho thấy hàm lượng sản phẩm tăng dần từ mức 7,5 µM (hiệu suất 25% khi không bổ sung IPTG) lên mức cực đại 25,5 µM (tương đương 11,8 mg/L, hiệu suất 85%) tại nồng độ IPTG 0,8 mM. Khi tăng tiếp nồng độ IPTG lên 1,0 mM, năng suất chuyển hóa có xu hướng suy giảm nhẹ về mức 22,5 µM (hiệu suất 75%).
• Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy: Khảo sát 4 mức nhiệt độ từ 25°C đến 37°C chỉ ra rằng 32°C là nhiệt độ tối ưu nhất, tạo ra hàm lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside đạt đỉnh 27,2 µM (12,6 mg/L) với hiệu suất chuyển hóa đạt tới 90%. Ở 25°C hiệu suất chỉ đạt 42% (12,5 µM), ở 27°C đạt 53% (15,8 µM) và ở 37°C đạt 78% (23,5 µM).

Thảo luận kết quả

Môi trường TB vượt trội hơn hẳn LB và M9 nhờ chứa hàm lượng cao dịch chiết nấm men (24 g/L) và tryptone (12 g/L), kết hợp hệ đệm phosphate ổn định pH ở mức 7,5 giúp duy trì sức sống vi khuẩn và cung cấp đủ cofactor cho quá trình tổng hợp đường TDP-rhamnose nội bào. Dữ liệu thực nghiệm được thể hiện trực quan thông qua đồ thị biến thiên nồng độ theo nhiệt độ và nồng độ chất cảm ứng, mô tả rõ quy luật đáp ứng dạng chuông của hệ thống enzyme tái tổ hợp. Tại ngưỡng 0,8 mM IPTG và nhiệt độ 32°C, enzyme ArGT3 biểu hiện ở trạng thái hòa tan tối đa mà không gây độc tế bào hay hình thành thể vùi bất hoạt như ở 37°C.

Khi so sánh với các nghiên cứu tương tự trên cùng hệ thống biểu hiện, sản lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside (12,6 mg/L) tương đương với quá trình tổng hợp afzelin từ kaempferol (12,9 mg/L), nhưng thấp hơn so với astilbin từ taxifolin (22,23 mg/L), quercitrin từ quercetin (24,0 mg/L) và myricitrin từ myricetin (25,8 mg/L). Nguyên nhân chính là do cấu trúc rhamnetin có nhóm methoxy (-OCH3) cồng kềnh tại vị trí C-7 gây cản trở lập thể tại túi gắn cơ chất của enzyme ArGT3, làm giảm ái lực liên kết so với các aglycone mang nhóm hydroxyl tự do.

Đề xuất và khuyến nghị

• Tối ưu hóa cấu trúc enzyme bằng kỹ thuật đột biến protein: Tiến hành gây đột biến điểm định hướng hoặc tiến hóa phân tử (directed evolution) trên các amino acid quan trọng thuộc túi liên kết cơ chất của enzyme ArGT3, nhằm nâng cao ái lực xúc tác với cơ chất methyl hóa và tăng hiệu suất chuyển hóa lên 150% (đạt sản lượng trên 35 mg/L), thực hiện bởi các nhóm nghiên cứu sinh học phân tử trong lộ trình 12 tháng.
• Cải biến con đường chuyển hóa tiền chất nội bào: Thiết kế tái tổ hợp chủng vi khuẩn mang thêm các cụm gen tăng cường tổng hợp nucleotide đường TDP-L-rhamnose dưới sự điều khiển của promoter mạnh, hướng tới mục tiêu tăng nồng độ đường hoạt hóa nội bào thêm 40% trong thời gian 9 tháng do các viện nghiên cứu chuyên ngành đảm trách.
• Mở rộng quy mô sản xuất lên hệ thống bioreactor pilot: Nâng cấp quy mô nuôi cấy từ bình tam giác 250 mL lên hệ thống nồi lên men tự động dung tích 5 lít đến 50 lít, kiểm soát liên tục nồng độ oxy hòa tan (DO trên 30%), giữ ổn định pH 7,2 và áp dụng kỹ thuật lên men bổ sung cơ chất theo mẻ nạp (fed-batch), nhằm đạt tỷ lệ chuyển hóa trên 95% cơ chất trong thời gian 18 tháng do các trung tâm công nghệ sinh học ứng dụng triển khai.
• Hoàn thiện quy trình tinh sạch và tiêu chuẩn hóa sản phẩm: Chuẩn hóa hệ thống chiết tách bằng sắc ký cột hấp phụ pha đảo kết hợp kết tinh phân đoạn thay thế dung môi hữu cơ bay hơi, đạt mục tiêu nâng độ tinh sạch của rhamnetin-3-O-rhamnoside lên trên 98,5% và giảm 30% chi phí dung môi trong vòng 6 tháng thực hiện bởi các phòng kiểm nghiệm dược phẩm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

• Các nhà khoa học và giảng viên chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Hóa sinh học: Tiếp cận tài liệu tham khảo giá trị về phương pháp thiết kế vi sinh vật chuyển gen đa plasmid và kỹ thuật chuyển hóa sinh học in vivo để phát triển các hướng nghiên cứu biến dưỡng chuyên sâu.
• Chuyên viên R&D tại các doanh nghiệp Dược phẩm và Thực phẩm bảo vệ sức khỏe: Ứng dụng công nghệ đường hóa vi sinh nhằm gia tăng độ hòa tan và hoạt tính dược lý của các nhóm hoạt chất polyphenol tự nhiên, phục vụ phát triển các dòng sản phẩm hỗ trợ điều trị ung thư và chống viêm.
• Kỹ sư công nghệ lên men và vi sinh công nghiệp: Sử dụng bộ thông số thực nghiệm tối ưu về môi trường TB, nồng độ IPTG và nhiệt độ để xây dựng quy trình công nghệ chuẩn hóa, hỗ trợ quá trình scale-up sản xuất quy mô bán công nghiệp.
• Học viên cao học và sinh viên đại học khối ngành Khoa học Sự sống: Sử dụng làm tài liệu học tập chuẩn mực về phương pháp phân tích kiểm nghiệm đa tầng từ sắc ký TLC, HPLC đến khối phổ LC-MS/MS trong nghiên cứu hóa học các hợp chất thiên nhiên.

Câu hỏi thường gặp

• Ý nghĩa của việc gắn gốc đường rhamnose vào phân tử rhamnetin là gì? Phân tử rhamnetin aglycone tự nhiên rất khó tan trong nước nên khả năng hấp thu qua màng sinh học bị hạn chế. Khi gắn thêm phân tử đường rhamnose tại vị trí C-3 tạo thành rhamnetin-3-O-rhamnoside, độ phân cực của hợp chất tăng lên rõ rệt, cải thiện độ tan và độ bền cấu trúc, từ đó nâng cao sinh khả dụng cùng các hoạt tính dược lý như kháng u và chống viêm.

• Chuyển hóa sinh học nguyên tế bào in vivo có ưu điểm gì so với phản ứng in vitro bằng enzyme tinh sạch? Phương pháp chuyển hóa in vivo tận dụng trực tiếp bộ máy sinh học của tế bào sống để tự tái sinh nguồn phân tử đường hoạt hóa đắt đỏ (TDP-rhamnose), không cần trải qua bước tinh sạch enzyme tốn kém, cho phép sử dụng cơ chất đầu vào có độ tinh khiết trung bình và vận hành liên tục với hiệu suất chuyển hóa đạt tới 90%.

• Vì sao chủng vi khuẩn chủ E. coli cần phải loại bỏ hai gen pgi và zwf? Hai gen pgi và zwf chịu trách nhiệm chuyển hóa glucose-6-phosphate vào chu trình đường phân và pentose phosphate. Việc xóa bỏ hai gen này giúp dòng carbon nội bào tập trung tích lũy thành glucose-1-phosphate, tạo nguồn tiền chất dồi dào để vi khuẩn tổng hợp hàm lượng cao đường hoạt hóa TDP-α-L-rhamnose phục vụ phản ứng gắn đường.

• Những điều kiện nuôi cấy nào mang lại hiệu suất sinh tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside cao nhất? Thực nghiệm chứng minh điều kiện nuôi cấy tối ưu nhất bao gồm sử dụng môi trường Terrific Broth (TB), bổ sung chất cảm ứng IPTG ở nồng độ 0,8 mM khi vi khuẩn đạt OD600 bằng 0,6, và duy trì nhiệt độ nuôi cấy ở 32°C trong 24 giờ sau khi nạp 30 µM cơ chất rhamnetin, giúp đạt hiệu suất chuyển hóa đỉnh cao 90%.

• Cấu trúc của sản phẩm rhamnetin-3-O-rhamnoside được khẳng định bằng những bằng chứng phân tích nào? Cấu trúc sản phẩm được xác định vững chắc qua 3 phương pháp: sắc ký TLC cho thấy vết sản phẩm có Rf = 0,35; sắc ký HPLC ghi nhận pic đơn sắc nét tại thời gian lưu 13,4 phút; và khối phổ phân mảnh LC-ESI-MS/MS ghi nhận hai ion phân mảnh đặc trưng tại m/z 314,10 (mất phân tử đường rhamnose) và m/z 299,10 (mất tiếp nhóm methyl tại C-7).

Kết luận

• Thiết lập thành công quy trình sinh tổng hợp hoạt chất rhamnetin-3-O-rhamnoside ở vi khuẩn Escherichia coli tái tổ hợp mang phức hệ gen ngoại lai từ Arabidopsis thaliana.
• Tách chiết thu nhận 25 mg sản phẩm thô và xác định chính xác cấu trúc hóa học qua hệ thống phân tích đa tầng TLC (Rf = 0,35), HPLC (13,4 phút) và LC-ESI-MS/MS.
• Xác lập chuẩn xác bộ điều kiện nuôi cấy tối ưu gồm môi trường TB, nồng độ IPTG 0,8 mM và nhiệt độ 32°C, mang lại hiệu suất chuyển hóa vượt bậc đạt 90% (nồng độ 27,2 µM).
• Làm sáng tỏ ảnh hưởng cản trở lập thể của nhóm 7-methoxy lên hoạt tính xúc tác của enzyme glycosyltransferase, cung cấp dữ liệu nền tảng cho việc thiết kế tái cấu trúc enzyme.
• Hoàn thiện công nghệ biến dưỡng vi sinh vật xanh, mở ra giải pháp thay thế hoàn hảo cho phương pháp chiết xuất thực vật và tổng hợp hóa học truyền thống.

Lộ trình phát triển giai đoạn tiếp theo sẽ tập trung vào cải biến protein enzyme và mở rộng thử nghiệm lên men quy mô 50 lít. Các viện nghiên cứu, trường đại học và doanh nghiệp dược phẩm hãy liên kết ứng dụng ngay quy trình công nghệ sinh tổng hợp tiên tiến này nhằm thương mại hóa nguồn nguyên liệu hoạt chất sinh học tự nhiên chất lượng cao.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM THỊ UYÊN NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP HOẠT CHẤT RHAMNETIN-3-O-RHAMNOSIDE Ở VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI CẢI BIẾN DI TRUYỀN Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Huy Thuần TS. Nguyễn Xuân Cảnh NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày… tháng… năm… Tác giả luận văn Phạm Thị Uyên i LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý đào tạo, Khoa Công nghệ Sinh học đã quan tâm và tạo điều kiện thuận lợi cho chúng tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Huy Thuần (hướng dẫn khoa học 1) và TS. Nguyễn Xuân Cảnh (hướng dẫn khoa học 2), những người đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, cô và kỹ thuật viên tại Trung tâm sinh học Phân tử - Viện Nghiên cứu và Phát triển công nghệ cao, Đại Học Duy Tân bao gồm TS. Nguyễn Minh Hùng, TS. Nguyễn Thành Trung, TS. Nguyễn Thị Hà, TS.

Lê Thành Đô, TS. Hồ Viết Hiếu, TS. Trần Thị Thanh Thỏa và cử nhân Đặng Thị Kim Mai đã tạo điều kiện cho tôi được sử dụng các trang thiết bị để tiến hành thí nghiệm. Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới bạn Võ Trần Khánh Huyền - học viên cao học tại Trung tâm Sinh học Phân tử, em Nguyễn Hồng Phong, sinh viên K19 khoa Dược – Đại học Duy Tân, đã tham gia trao đổi với tôi về các vấn đề thực hành thí nghiệm.

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện của Ban lãnh đạo trường Đại học Duy Tân, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, cùng tập thể cán bộ, công nhân viên, đã tạo mọi điều kiện tốt nhất và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu. Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân, bạn bè, những người luôn tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu cũng như hoàn thành luận văn này. Hà Nội, ngày… tháng… năm… Tác giả luận văn Phạm Thị Uyên ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Mục lục.

iii Danh mục chữ viết tắt. v Danh mục bảng. vi Danh mục hình, hiểu đồ. vii Thesis abstract.

Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu nghiên cứu. Phạm vi nghiên cứu. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu.

Ý nghĩa khoa học của đề tài nghiên cứu. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài nghiên cứu .Tổng quan tài liệu. Khái quát về flavonoid. Giới thiệu rhamnetin và một số dẫn xuất rhamnetin glycoside thường gặp.

Con đường sinh tổng hợp rhamnetin và dẫn xuất rhamnetin-3-o-rhamnoside ở thực vật. Một số phương pháp nghiên cứu tổng hợp rhamnetin và dẫn xuất rhamnetin glycoside. Vai trò của các enzyme. Một số phương pháp tổng hợp rhamnetin.

Các hoạt tính sinh học của rhamnetin. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu.

Nội dung nghiên cứu. Nguyên vật liệu. Phương pháp nghiên cứu. 20 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside. Ảnh hưởng của môi trường tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside. Ảnh hưởng của nồng độ iptg tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside.

Kết quả và thảo luận. Kết quả thí nghiệm tổng hợp và phát hiện rhamnetin-3-o-rhamnoside. Kết quả nghiên cứu bổ sung cơ chất rhamnetin và tách chiết thu sản phẩm. Phân tích kết quả chuyển hóa bằng sắc ký bản mỏng.

Phân tích kết quả chuyển hóa bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (hplc). Phân tích kết quả chuyển hóa bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ. Đánh giá và bàn luận ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy tới hiệu suất sinh tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside. Ảnh hưởng của môi trường tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside.

Ảnh hưởng của nồng độ iptg tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside. Kết luận và kiến nghị. 41 Tài liệu tham khảo.

42 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ 4CC 4-coumaroyl-CoA 4CL 4-coumaroyl-CoA ligase C4H Cinnamic 4-hydroxylase CHI Chalcone isomerase CHS Chalcone synthase CPR cytochrome P450 reductase DMSO Dimethyl sulfoxide F3H Flavone 3β-hydroxylase F3GT Flavonol 3-O-glycosyltransferase FLS Flavonol synthase GT Glycosyltransferase HPLC High-performance liquid chromatography IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside KLPT Khối lượng phân tử LB Lysogeny broth LC-ESI-MS/MS Liquid Chromatography Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometric NDP nucleotide diphosphate OD Optical density OMT O-methyltransferase PAL phenylalanine amoniac lyase TAL Tyrosine amoniac lyase TB Terrific Broth TDP Thymidine diphosphate TLC Thin layer chromatography UDP Uridine diphosphate UGT Uridine diphosphate glycosyltransferase v LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Phân loại một số lớp flavonoid thường gặp ở thực vật. Một số hoạt tính sinh học của rhamnetin. Thành phần môi trường TB.

Thành phần môi trường LB. Thành phần các dung dịch gốc dùng để pha môi trường M9. Thành phần môi trường M9. Kết quả đo thử nghiệm hàm lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside ở các môi trường nuôi cấy khác nhau.

Kết quả đo hàm lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside tại các nồng độ IPTG khác nhau. Kết quả đo hàm lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside tại các mức nhiệt độ khác nhau. So sánh hiệu quả chuyển hóa một số loại cơ chất với rhamnetin. 40 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC HÌNH, HIỂU ĐỒ Hình 2.

Phân loại flavonoid dựa vào gốc aryl (vòng B). Các cấu trúc khung cơ bản của một số nhóm flavonoid thường gặp. Phân bố của rhamnetin ở một số loài thực vật. Rhamnetin và một số dẫn xuất của chúng.

Tổng hợp rhamnetin glycoside ở thực vật. Cơ chế phản ứng của enzyme glycosyltransferases, (A). Sản xuất rhamnetin từ quercetin thông qua enzyme POMT7. coli tái tổ hợp.

Sơ đồ chuyển hóa tạo sản phẩm rhamnetin-3-O-rhamnoside. Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của môi trường tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside. Sản phẩm sau khi tinh sạch và đông khô. Sắc ký đồ phân tích vị trí của cơ chất rhamnetin và rhamnetin glycoside.

Phân tích định tính sự tạo thành rhamnetin-3-O-rhamnoside. Phân tích LC-ESI-MS/MS ở chế độ negative mode. Sơ đồ phân mảnh MS/MS của rhamnetin rhamnoside. Đánh giá ảnh hưởng của môi trường tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3- O-rhamnoside.

Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ IPTG tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin- 3-O-rhamnoside. Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-O- rhamnoside. 37 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Phạm Thị Uyên Tên luận văn: “Nghiên cứu sinh tổng hợp hoạt chất rhamnetin-3-O-rhamnoside ở vi khuẩn Escherichia coli cải biến di truyền”. Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60 42 02 01 Cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: Thiết lập quy trình sinh tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside ở vi khuẩn E.

coli cải biến di truyền và đánh giá ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy để tối ưu hóa sản xuất hợp chất này. Phương pháp nghiên cứu Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh nuôi cấy vi khuẩn E. coli trên đĩa thạch và trong ống nghiệm có sử dụng kháng sinh với nồng độ phù hợp Tách chiết hoạt chất rhamnetin glycoside bằng phương pháp chiết pha lỏng-pha lỏng sử dụng ethylacetate làm dung môi. Đông khô mẫu trên máy sấy thăng hoa.

Định tính và định lượng bằng phương pháp TLC, HPLC, LC-ESI-MS/MS. Kết quả chính và kết luận Việc tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside dựa trên E. coli tái tổ hợp có tính khả thi và sản phẩm tạo thành được kiểm tra bằng các phương pháp như TLC, HPLC, LC-ESI-MS/MS. Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng trực tiếp tới nuôi cấy và chuyển hóa cơ chất như chủng loại môi trường, nồng độ IPTG và nhiệt độ đã thu được sản lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside cao nhất đạt 12.

Tìm hiểu, đánh giá tầm quan trọng của các sản phẩm flavonoid glycoside nói chung và rhamnetin nói riêng trong các lĩnh vực y dược, mỹ phẩm, v. xây dựng cơ sở cho các nghiên cứu phục vụ nhu cầu thực tiễn tạo các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên và có giá trị cao trong đời sống. viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] THESIS ABSTRACT Master candidate: Pham Thi Uyen Thesis title: “Study on the biosynthesis of the bioactive rhamnetin-3-O-rhamnoside in genetically modified Escherichia coli” Major: Biotechnology Code: 60 42 0201 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives: Investigation the biosynthesis of rhamnnetin-3-O-rhamnoside using genetically engineered E. coli by supplementation of methylated flavonol, rhamnetin, and evaluating the effect of culture conditions (medium, IPTG concentration and temperature) to improve the production of target compounds.

Materials and Methods: Recombinant E. coli was cultured in broth medium using antibiotics (streptomycin, kanamycin and chloramphenicol) at appropriate concentrations. Rhamnetin was supplemented into culture broth as substrate and the culture was mainted to proceed whole cell bioconversion to produce rhamnetin-3-O-rhamnoside. Extraction of rhamnetin glycoside was carried out by liquid-liquid extraction using ethylacetate as solvent.

Crude extract was obtained by the vacuum rotary drier. The formation of product was confirmed by chromatographical methods such as TLC, HPLC, LC-ESI-MS / MS. Culture conditions such as type of medium, IPTG concentration and temperature those effect to bacterial growth were screened to improve yield of rhamnetin-3-O-rhamnoside. Main findings and conclusions The recombinant E.

coli was proved to produce rhamnetin-3-O-rhamnoside by TLC, HPLC and LC-ESI-MS/MS data. Effect of culture medium, IPTG and temperature was investigated and resulted in TB, 0.8 mM IPTG and 32ºC are the best parameters to enhance the production. The highest yield of rhamnetin-3-O-rhamnoside was 12. Understanding and evaluating the importance of flavonoid glycoside as well as and rhamnetin in particular in the fields of medicine, cosmetics, etc.

ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Rhamnetin là một flavonoid thuộc nhóm flavonol, có vị trí methyl hóa ở carbon số 7 (C7). Rhamnetin và dẫn xuất rhamnetin glycoside đã được chứng minh có một số hoạt tính sinh học mạnh như kháng viêm, kháng khuẩn, ức chế khối u rất mạnh.