Nghiên cứu tổng hợp hoạt chất rhamnetin-3-O-rhamnoside ở vi khuẩn Escherichia coli

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu vnua nghiên cứu sinh tổng hợp hoạt chất rhamnetin 3 0 rhamnoside ở vi khuẩn escherichia coli cải, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện

• Tác giả: Phạm Thị Uyên
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Huy Thuần
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu sinh tổng hợp hoạt chất rhamnetin-3-O-rhamnoside ở vi khuẩn Escherichia coli cải biến di truyền
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 2. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• 3. DANH MỤC BẢNG
• 4. DANH MỤC HÌNH, HIỂU ĐỒ
• 5. TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• 6. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 7. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
• 8. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
• 9. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU
• 9.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài nghiên cứu
• 9.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài nghiên cứu
• 10. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 10.1. KHÁI QUÁT VỀ FLAVONOID
• 10.2. GIỚI THIỆU RHAMNETIN VÀ MỘT SỐ DẪN XUẤT RHAMNETIN GLYCOSIDE THƯỜNG GẶP
• 10.3. CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP RHAMNETIN VÀ DẪN XUẤT RHAMNETIN-3-O-RHAMNOSIDE Ở THỰC VẬT
• 10.4. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP RHAMNETIN VÀ DẪN XUẤT RHAMNETIN GLYCOSIDE

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu tổng hợp rhamnetin 3 O rhamnoside từ E

Nghiên cứu tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside từ vi khuẩn E. coli là một lĩnh vực đang thu hút sự quan tâm lớn trong ngành công nghệ sinh học. Rhamnetin là một flavonoid có nhiều hoạt tính sinh học, bao gồm kháng viêm và kháng khuẩn. Việc tổng hợp hợp chất này từ vi khuẩn E. coli cải biến di truyền không chỉ giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất mà còn mở ra hướng đi mới cho việc phát triển các sản phẩm có giá trị trong y học và mỹ phẩm.

1.1. Rhamnetin và vai trò của nó trong y học

Rhamnetin là một flavonoid thuộc nhóm glycoside, có công thức hóa học C16H12O7. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng rhamnetin có khả năng kháng viêm và kháng khuẩn mạnh mẽ, làm cho nó trở thành một ứng cử viên tiềm năng trong việc phát triển thuốc và sản phẩm chăm sóc sức khỏe.

1.2. Tại sao chọn E. coli cho tổng hợp rhamnetin

Vi khuẩn E. coli được chọn làm hệ thống sản xuất do khả năng sinh trưởng nhanh chóng và dễ dàng cải biến di truyền. Việc sử dụng E. coli cho tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside giúp giảm thiểu thời gian và chi phí sản xuất, đồng thời tăng hiệu suất thu hồi sản phẩm.

II. Thách thức trong việc tổng hợp rhamnetin 3 O rhamnoside

Mặc dù việc tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside từ E. coli có nhiều tiềm năng, nhưng vẫn tồn tại một số thách thức lớn. Các vấn đề như hiệu suất chuyển hóa thấp, điều kiện nuôi cấy không tối ưu và sự cạnh tranh từ các con đường sinh tổng hợp khác cần được giải quyết.

2.1. Hiệu suất chuyển hóa thấp trong nuôi cấy

Một trong những thách thức lớn nhất là hiệu suất chuyển hóa rhamnetin từ E. coli. Nghiên cứu cho thấy rằng các yếu tố như nồng độ IPTG, nhiệt độ và loại môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất này.

2.2. Cạnh tranh từ các con đường sinh tổng hợp khác

E. coli có thể chuyển hóa các hợp chất khác, dẫn đến sự cạnh tranh trong việc sản xuất rhamnetin-3-O-rhamnoside. Việc tối ưu hóa con đường sinh tổng hợp là cần thiết để tăng cường sản xuất hợp chất mục tiêu.

III. Phương pháp nghiên cứu tổng hợp rhamnetin 3 O rhamnoside

Để tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside, nghiên cứu đã áp dụng nhiều phương pháp khác nhau, bao gồm nuôi cấy vi khuẩn, tách chiết và phân tích sản phẩm. Các phương pháp này giúp xác định điều kiện tối ưu cho quá trình tổng hợp.

3.1. Nuôi cấy vi khuẩn E. coli cải biến di truyền

Việc nuôi cấy E. coli cải biến di truyền được thực hiện trong môi trường có bổ sung rhamnetin. Các điều kiện nuôi cấy như nồng độ IPTG và nhiệt độ được điều chỉnh để tối ưu hóa sản xuất rhamnetin-3-O-rhamnoside.

3.2. Tách chiết và phân tích sản phẩm

Sau khi nuôi cấy, sản phẩm rhamnetin-3-O-rhamnoside được tách chiết bằng phương pháp chiết pha lỏng-pha lỏng. Sản phẩm sau đó được phân tích bằng các phương pháp như TLC, HPLC và LC-ESI-MS/MS để xác định chất lượng và hàm lượng.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng việc tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside từ E. coli là khả thi và có thể đạt được hiệu suất cao. Các ứng dụng thực tiễn của hợp chất này trong y học và mỹ phẩm đang được khám phá.

4.1. Hiệu suất tổng hợp đạt được

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng với điều kiện nuôi cấy tối ưu, sản lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside có thể đạt tới 12 mg/L. Điều này mở ra cơ hội cho việc sản xuất quy mô lớn trong tương lai.

4.2. Ứng dụng trong y học và mỹ phẩm

Rhamnetin-3-O-rhamnoside có tiềm năng ứng dụng trong các sản phẩm y tế và mỹ phẩm nhờ vào các hoạt tính sinh học của nó. Việc phát triển các sản phẩm này có thể cải thiện sức khỏe và chất lượng cuộc sống cho con người.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside từ E. coli đã mở ra hướng đi mới trong việc sản xuất các hợp chất tự nhiên có giá trị. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều ứng dụng thực tiễn trong các lĩnh vực khác nhau.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu

Nghiên cứu này không chỉ cung cấp kiến thức mới về tổng hợp rhamnetin mà còn góp phần vào việc phát triển các phương pháp sản xuất bền vững cho các hợp chất tự nhiên.

5.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất và khám phá thêm các ứng dụng của rhamnetin-3-O-rhamnoside trong các lĩnh vực khác nhau như thực phẩm và dược phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM THỊ UYÊN NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP HOẠT CHẤT RHAMNETIN-3-O-RHAMNOSIDE Ở VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI CẢI BIẾN DI TRUYỀN Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Huy Thuần TS. Nguyễn Xuân Cảnh NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày… tháng… năm… Tác giả luận văn Phạm Thị Uyên i LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý đào tạo, Khoa Công nghệ Sinh học đã quan tâm và tạo điều kiện thuận lợi cho chúng tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Huy Thuần (hướng dẫn khoa học 1) và TS. Nguyễn Xuân Cảnh (hướng dẫn khoa học 2), những người đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, cô và kỹ thuật viên tại Trung tâm sinh học Phân tử - Viện Nghiên cứu và Phát triển công nghệ cao, Đại Học Duy Tân bao gồm TS. Nguyễn Minh Hùng, TS. Nguyễn Thành Trung, TS. Nguyễn Thị Hà, TS.

Lê Thành Đô, TS. Hồ Viết Hiếu, TS. Trần Thị Thanh Thỏa và cử nhân Đặng Thị Kim Mai đã tạo điều kiện cho tôi được sử dụng các trang thiết bị để tiến hành thí nghiệm. Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới bạn Võ Trần Khánh Huyền - học viên cao học tại Trung tâm Sinh học Phân tử, em Nguyễn Hồng Phong, sinh viên K19 khoa Dược – Đại học Duy Tân, đã tham gia trao đổi với tôi về các vấn đề thực hành thí nghiệm.

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện của Ban lãnh đạo trường Đại học Duy Tân, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, cùng tập thể cán bộ, công nhân viên, đã tạo mọi điều kiện tốt nhất và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu. Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân, bạn bè, những người luôn tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu cũng như hoàn thành luận văn này. Hà Nội, ngày… tháng… năm… Tác giả luận văn Phạm Thị Uyên ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Mục lục.

iii Danh mục chữ viết tắt. v Danh mục bảng. vi Danh mục hình, hiểu đồ. vii Thesis abstract.

Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu nghiên cứu. Phạm vi nghiên cứu. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu.

Ý nghĩa khoa học của đề tài nghiên cứu. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài nghiên cứu .Tổng quan tài liệu. Khái quát về flavonoid. Giới thiệu rhamnetin và một số dẫn xuất rhamnetin glycoside thường gặp.

Con đường sinh tổng hợp rhamnetin và dẫn xuất rhamnetin-3-o-rhamnoside ở thực vật. Một số phương pháp nghiên cứu tổng hợp rhamnetin và dẫn xuất rhamnetin glycoside. Vai trò của các enzyme. Một số phương pháp tổng hợp rhamnetin.

Các hoạt tính sinh học của rhamnetin. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu.

Nội dung nghiên cứu. Nguyên vật liệu. Phương pháp nghiên cứu. 20 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside. Ảnh hưởng của môi trường tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside. Ảnh hưởng của nồng độ iptg tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside.

Kết quả và thảo luận. Kết quả thí nghiệm tổng hợp và phát hiện rhamnetin-3-o-rhamnoside. Kết quả nghiên cứu bổ sung cơ chất rhamnetin và tách chiết thu sản phẩm. Phân tích kết quả chuyển hóa bằng sắc ký bản mỏng.

Phân tích kết quả chuyển hóa bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (hplc). Phân tích kết quả chuyển hóa bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ. Đánh giá và bàn luận ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy tới hiệu suất sinh tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside. Ảnh hưởng của môi trường tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside.

Ảnh hưởng của nồng độ iptg tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside. Kết luận và kiến nghị. 41 Tài liệu tham khảo.

42 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ 4CC 4-coumaroyl-CoA 4CL 4-coumaroyl-CoA ligase C4H Cinnamic 4-hydroxylase CHI Chalcone isomerase CHS Chalcone synthase CPR cytochrome P450 reductase DMSO Dimethyl sulfoxide F3H Flavone 3β-hydroxylase F3GT Flavonol 3-O-glycosyltransferase FLS Flavonol synthase GT Glycosyltransferase HPLC High-performance liquid chromatography IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside KLPT Khối lượng phân tử LB Lysogeny broth LC-ESI-MS/MS Liquid Chromatography Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometric NDP nucleotide diphosphate OD Optical density OMT O-methyltransferase PAL phenylalanine amoniac lyase TAL Tyrosine amoniac lyase TB Terrific Broth TDP Thymidine diphosphate TLC Thin layer chromatography UDP Uridine diphosphate UGT Uridine diphosphate glycosyltransferase v LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Phân loại một số lớp flavonoid thường gặp ở thực vật. Một số hoạt tính sinh học của rhamnetin. Thành phần môi trường TB.

Thành phần môi trường LB. Thành phần các dung dịch gốc dùng để pha môi trường M9. Thành phần môi trường M9. Kết quả đo thử nghiệm hàm lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside ở các môi trường nuôi cấy khác nhau.

Kết quả đo hàm lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside tại các nồng độ IPTG khác nhau. Kết quả đo hàm lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside tại các mức nhiệt độ khác nhau. So sánh hiệu quả chuyển hóa một số loại cơ chất với rhamnetin. 40 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC HÌNH, HIỂU ĐỒ Hình 2.

Phân loại flavonoid dựa vào gốc aryl (vòng B). Các cấu trúc khung cơ bản của một số nhóm flavonoid thường gặp. Phân bố của rhamnetin ở một số loài thực vật. Rhamnetin và một số dẫn xuất của chúng.

Tổng hợp rhamnetin glycoside ở thực vật. Cơ chế phản ứng của enzyme glycosyltransferases, (A). Sản xuất rhamnetin từ quercetin thông qua enzyme POMT7. coli tái tổ hợp.

Sơ đồ chuyển hóa tạo sản phẩm rhamnetin-3-O-rhamnoside. Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của môi trường tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside. Sản phẩm sau khi tinh sạch và đông khô. Sắc ký đồ phân tích vị trí của cơ chất rhamnetin và rhamnetin glycoside.

Phân tích định tính sự tạo thành rhamnetin-3-O-rhamnoside. Phân tích LC-ESI-MS/MS ở chế độ negative mode. Sơ đồ phân mảnh MS/MS của rhamnetin rhamnoside. Đánh giá ảnh hưởng của môi trường tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3- O-rhamnoside.

Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ IPTG tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin- 3-O-rhamnoside. Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-O- rhamnoside. 37 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Phạm Thị Uyên Tên luận văn: “Nghiên cứu sinh tổng hợp hoạt chất rhamnetin-3-O-rhamnoside ở vi khuẩn Escherichia coli cải biến di truyền”. Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60 42 02 01 Cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: Thiết lập quy trình sinh tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside ở vi khuẩn E.

coli cải biến di truyền và đánh giá ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy để tối ưu hóa sản xuất hợp chất này. Phương pháp nghiên cứu Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh nuôi cấy vi khuẩn E. coli trên đĩa thạch và trong ống nghiệm có sử dụng kháng sinh với nồng độ phù hợp Tách chiết hoạt chất rhamnetin glycoside bằng phương pháp chiết pha lỏng-pha lỏng sử dụng ethylacetate làm dung môi. Đông khô mẫu trên máy sấy thăng hoa.

Định tính và định lượng bằng phương pháp TLC, HPLC, LC-ESI-MS/MS. Kết quả chính và kết luận Việc tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside dựa trên E. coli tái tổ hợp có tính khả thi và sản phẩm tạo thành được kiểm tra bằng các phương pháp như TLC, HPLC, LC-ESI-MS/MS. Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng trực tiếp tới nuôi cấy và chuyển hóa cơ chất như chủng loại môi trường, nồng độ IPTG và nhiệt độ đã thu được sản lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside cao nhất đạt 12.

Tìm hiểu, đánh giá tầm quan trọng của các sản phẩm flavonoid glycoside nói chung và rhamnetin nói riêng trong các lĩnh vực y dược, mỹ phẩm, v. xây dựng cơ sở cho các nghiên cứu phục vụ nhu cầu thực tiễn tạo các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên và có giá trị cao trong đời sống. viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] THESIS ABSTRACT Master candidate: Pham Thi Uyen Thesis title: “Study on the biosynthesis of the bioactive rhamnetin-3-O-rhamnoside in genetically modified Escherichia coli” Major: Biotechnology Code: 60 42 0201 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives: Investigation the biosynthesis of rhamnnetin-3-O-rhamnoside using genetically engineered E. coli by supplementation of methylated flavonol, rhamnetin, and evaluating the effect of culture conditions (medium, IPTG concentration and temperature) to improve the production of target compounds.

Materials and Methods: Recombinant E. coli was cultured in broth medium using antibiotics (streptomycin, kanamycin and chloramphenicol) at appropriate concentrations. Rhamnetin was supplemented into culture broth as substrate and the culture was mainted to proceed whole cell bioconversion to produce rhamnetin-3-O-rhamnoside. Extraction of rhamnetin glycoside was carried out by liquid-liquid extraction using ethylacetate as solvent.

Crude extract was obtained by the vacuum rotary drier. The formation of product was confirmed by chromatographical methods such as TLC, HPLC, LC-ESI-MS / MS. Culture conditions such as type of medium, IPTG concentration and temperature those effect to bacterial growth were screened to improve yield of rhamnetin-3-O-rhamnoside. Main findings and conclusions The recombinant E.

coli was proved to produce rhamnetin-3-O-rhamnoside by TLC, HPLC and LC-ESI-MS/MS data. Effect of culture medium, IPTG and temperature was investigated and resulted in TB, 0.8 mM IPTG and 32ºC are the best parameters to enhance the production. The highest yield of rhamnetin-3-O-rhamnoside was 12. Understanding and evaluating the importance of flavonoid glycoside as well as and rhamnetin in particular in the fields of medicine, cosmetics, etc.

ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Rhamnetin là một flavonoid thuộc nhóm flavonol, có vị trí methyl hóa ở carbon số 7 (C7). Rhamnetin và dẫn xuất rhamnetin glycoside đã được chứng minh có một số hoạt tính sinh học mạnh như kháng viêm, kháng khuẩn, ức chế khối u rất mạnh.