LỜI MỞ ĐẦU Tetragenococcus halophilus là một loài quan trọng của nhóm LAB (Lactic acid bacteria). Chúng có tầm quan trọng rất lớn trong công nghiệp, đặc biệt là trong việc cải thiện các đặc tính cảm quan, hương vị của các sản phẩm lên men….và đã được chứng minh có khả năng cải thiện hương vị của nước mắm. Tetragenococcus halophilus CH6-2 phân lập từ chượp nước mắm Cát Hải, được chứng minh tạo ra nhiều hợp chất bay hơi và có hoạt tính aminopeptidase cao [1]. Vì vậy nó được xem là một chủng tiềm năng bổ sung vào quá trình lên men nước mắm.
Để thuận tiện cho việc sử dụng vi sinh vật cho quá trình lên men nước mắm ở quy mô công nghiệp thì việc tạo ra một lượng lớn vi sinh vật có sẵn, dễ dàng bảo quản, chuyên chở và sử dụng là cần thiết. Chế phẩm vi sinh vật được xem là giải pháp hữu ích đáp ứng các tiêu chí này. Trong quy trình công nghệ sản xuất nước mắm truyền thống thường có thời gian chế biến dài (lớn hơn 12 tháng) dẫn đến hao phí đạm, chi phí nhân công cao do lao động thủ công, khó cơ giới hóa, tự động hóa và ảnh hưởng nhiều đến chất lượng sản phẩm và hiệu quả kinh tế [2]. Công nghệ enzyme tuy có thể rút ngắn thời gian lên men nhưng sản phẩm nước mắm tạo ra không có hương vị nước mắm.
Từ những phân tích trên đề tài hướng đến giải quyết các vấn đề tồn tại trong công nghệ sản xuất nước mắm theo hướng ứng dụng công nghệ enzyme trong công đoạn thủy phân và vi sinh vật trong giai đoạn ủ tạo hương nhằm rút ngắn thời gian lên men và cải thiện hương vị nước mắm. Để tạo được chế phẩm vi sinh vật bổ sung đề tài đã nghiên cứu tối ưu hóa môi trường dinh dưỡng cho sinh trưởng của vi sinh vật với mục đích cải thiện mật độ tế bào làm bước đệm cho tạo chế phẩm vi sinh vật sấy kết hợp vào quá trình lên men nước mắm. Đồng thời đề tài bước đầu nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi sinh vật sấy vào quá trình lên men nước mắm. 1 Nội dung nghiên cứu của đề tài: Tối ưu môi trường sinh trưởng của Tetragenococcus halophilus CH6-2.
Ứng dụng chế phẩm Tetragenococcus halophilus CH6-2 sấy bổ sung vào quá trình lên men nước mắm.1 Đặc tính của Tetragenococcus halophilus 1.1 Phân loại Vi khuẩn lactic (LAB) là một nhóm vi khuẩn đa dạng, gram dương, catalase âm tính, bao gồm cả cầu khuẩn và trực khuẩn, tạo axit lactic như sản phẩm chính trong quá trình lên men carbohydrate. Các chi chính trong nhóm LAB: Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus và Weissella. Việc phân loại vi khuẩn lactic thành các chi khác nhau chủ yếu dựa vào hình thái, phương thức lên men glucose, sinh trưởng ở các nhiệt độ khác nhau, cấu hình của axit lactic được tạo ra, khả năng phát triển ở nồng độ muối cao, và khả năng chịu axit hoặc kiềm. Thuật ngữ LAB có liên quan mật thiết với các vi khuẩn liên quan đến quá trình lên men thực phẩm.
Chúng thường được sử dụng làm chủng khởi động trong quá trình lên men thịt, rau, xúc xích, giăm bông, rượu vang, dưa chua,. và được chứng minh là có thể cái thiện hương vị, kết cấu thực phẩm, ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây hư hỏng [3]. Chi Tetragenococcus hiện bao gồm năm loài khác nhau: T. Tetragenococcus là các vi khuẩn axit lactic kỵ khí gram dương, không di động, thích nghi với môi trường sống nhiều đường hoặc có độ mặn cao.
Năm 1994, chi Tetragenococcus chỉ có một loài duy nhất được công nhận là Tetragenococcus halophilus. Sau đó, Satomi và cộng sự vào năm 1997 đã công bố tìm được một loài mới là Tetragenococcus muriaticus là loại vi khuẩn chịu mặn vừa phải được phân lập từ nước mắm. Năm 2005, Lee đã báo cáo phân lập được chủng mới là Tetragenococcus koreensis sp. từ kim chi.
Cũng vào năm 2005, Ennahar và cộng sự đã chứng minh Enterococcus solitarius Collins thuộc chi Tetragennococcus và đặt tên là Tetragenococcus solitarius comb. Trong đó hai loài T. muriaticus là những loài có vai trò quan trọng và được ứng dụng trong nhiều công nghệ sản xuất thực phẩm lên men hiện nay, được tìm thấy nhiều trong nước tương Indonesia, trứng cá xông khói lên men Nhật Bản, đậu đen lên men và mù tạt lên men. Sự khác biệt giữa hai loại này là 3 T.
halophilus có thể phát triển khi không có NaCl nhưng T. muriaticus đòi hỏi ít nhất 0,5% NaCl để tăng trưởng. Nồng độ NaCl tối ưu của T. muriaticus là 5-10% và 7-10% tương ứng.
Trong nghiên cứu của Udomsil năm 2010, tất cả các LAB được lựa chọn, được xác định là Tetragenococcus đều phát triển ở nồng độ muối 25% trong cả môi trường MRS và FB25[5]. Tetragenococcus halophilus là một loài quan trọng của nhóm LAB. halophilus khá phổ biến trong nhóm vi khuẩn lactic chịu mặn, được tìm thấy trong quá trình lên men nước mắm và có thể chịu được nồng độ muối rất cao (25% NaCl) [5]. halophilus đã phát triển các cơ chế cho phép chúng thích ứng với môi trường có độ mặn cao bằng việc duy trì trạng thái cân bằng thẩm thấu giữa bên trong và bên ngoài tế bào [5].
Ngoài ra vai trò quan trọng của T. halophilus trong nước mắm là thủy phân protein cá ở môi trường có nồng độ muối cao. halophilus có khả năng sinh protease tại môi trường có nồng độ NaCl 25%[5]. Do vậy chúng đóng một vai trò quan trọng trong việc thủy phân protein cá trong quá trình lên men nước mắm.
Trong nghiên cứu của Udomsil, 22 hợp chất dễ bay hơi đã được xác định, trong đó cho thấy hàm lượng 2-methylpropanal và benzadehyde là các aldehyde chính được sản xuất bởi các chủng T. halophilus, ngoài ra còn có 3-methylbutanal, 2-methybutanal và 2- methypropanal là các chất tham gia tạo hương đặc trưng cho nước mắm [5].2 Ảnh hưởng của các thành phần dinh dưỡng đến sinh trưởng của LAB Đối với sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật thì môi trường dinh dưỡng đóng vai trò vô cùng quan trọng. Các thành phần của môi trường dinh dưỡng là những yếu tố cần thiết giúp vi sinh vật sinh trưởng và phát triển. Riêng đối với LAB, chúng là những sinh vật có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp do khả năng tổng hợp hạn chế các nguyên tố cho sự phát triển của chúng.
Chúng không chỉ cần carbohydrate, các nguồn carbon làm năng lượng, chúng còn cần nucleotide, axit amin, vitamin, muối, các nguyên tố khoáng cũng như các nguyên tố vi lượng: Mg, Mn, P… và các chất dinh dưỡng khác cho tăng trưởng và tổng hợp sản phẩm của quá trình chuyển hóa [6]. 4 Tùy đặc tính của mỗi chủng mà điều kiện môi trường khác nhau có thể yêu cầu mức độ dinh dưỡng khác nhau. Do vậy trong thực tế người ta phải tiến thành thử nghiệm các điều kiện môi trường với các thành phần dinh dưỡng khác nhau nhằm mục đích tìm ra điều kiện môi trường về chất dinh dưỡng phù hợp nhất đối với chủng đang khảo sát.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon Nguồn cacbon được sử dụng để tạo ra năng lượng cho sự sinh trưởng và phát triển của chủng. Nguồn cacbon chủ yếu lấy từ các loại carbohydrate khác nhau.
Tetragenococcus halophilus có thể lên men được D-lactose và D-raffinose theo kết quả nghiên cứu của Uchida, 1982; Roling và van Verseveld, 1996; Kobayashi và cộng sự, 2000; Juste và cộng sự, 2008. Kobayashi, Kimura và Fuji (2000) đã phân lập được Tetragenococcus halophilus từ giống tôm Indonesia nó có thể lên men L-arabinose, D-mannitơl, maltose, D-melizitose, glycerol và sucrose…[7]. Các gen trao đổi chất cũng như hệ thống vận chuyển các loại cacborhydrate khác nhau bao gồm: D-glucose, D-ribose, D-fructose, D-mannose, maltose, trehalose, cellobiose, lactose, melibiose, raffinose, stachyose, galactitol, D-sorbitol, D-mannitol, L-arabinose và D-xylose, được tìm thấy trong bộ gen của các chủng T. Khi đánh giá sự ảnh hưởng của các nguồn cacbon khác nhau đến tăng trưởng của các chi khác nhau trong LAB, Stefana Petrut và các cộng sự (2019) đã sử dụng môi trường MRS làm môi trường tham chiếu và 2% các nguồn carbon khác nhau (glucose, lactose, fructose, galactose, sucrose, ribose, maltose, mannose và arabinose) đã được thêm vào.
Kết quả cho thấy, L. rhamnosus ATCC ® 9595 ™ ưu tiên sử dụng galactose cho sự sinh trưởng (giá trị tăng trưởng cao nhất (OD 600 là 0,465) đã thu được trên galactose sau 15h lên men), việc sử dụng nguồn carbon này cho sinh khối cao hơn được cho là do hoạt động galactokinase cao. Sau đó là glucose, lactose và mannose. Đối với tăng trưởng của L.
lactis 28, kết quả khảo sát cho thấy fructose và maltose là nguồn carbon được chuyển hóa tốt hơn so với glucose trong môi trường kiểm chứng. Tốc độ 5 phát triển của P. acidilactici ATCC ® 8042 ™ tăng lên khi có mặt của sucrose và maltose. Kết quả nghiên cứu còn nhấn mạnh rằng maltose là nguồn carbon năng lượng chính được ưu tiên chuyển hóa bởi S.
Các nguồn cacbon khác nhau như glucose, lactose, sucrose, galactose, maltose và tinh bột đã được sử dụng trong nghiên cứu của Fangfang Cheng (2019) về ảnh hưởng của chúng đến sinh trưởng của chủng L. Kết quả cho thấy trong môi trường nuôi cấy với glucose và maltose cho sinh khối cao hơn các nguồn carbon khác. Bên cạnh đó, thì nồng độ glucose 2% được xem là tối ưu cho sự phát triển của chủng này [9].2 Ảnh hưởng của nguồn Nitơ LAB cần có nhiều axit amin và peptit để đáp ứng nhu cầu nitơ phức tạp của chúng, đồng thời do khả năng tổng hợp hạn chế nitơ vô cơ. Nhu cầu axit amin của LAB phụ thuộc vào từng chủng [10].
Môi trường nuôi cấy LAB thường chứa nhiều nguồn nitơ khác nhau (chẳng hạn như peptone, chiết xuất nấm men, chiết xuất thịt bò, hoặc whey protein). Các nguồn nitơ này cung cấp axit amin, peptit, dẫn xuất nucleic acid, khoáng chất và vitamin. Thay thế chiết xuất men bằng chiết xuất thịt, casitone hoặc gluten như nguồn nitơ không làm tăng tốc độ tăng trưởng so với chỉ sử dụng chiết xuất nấm men [11]. Thay thế một nửa chiết xuất nấm men hoặc chiết xuất mạch nha được phát hiện là làm giảm sinh khối của chủng L.
Nồng độ chiết xuất nấm men (YE> 12 mg/mL) cũng có thể làm giảm sự phát triển của LAB. Việc sử dụng peptone trong sự tăng trưởng LAB tốt hơn sử dụng tryptone. Việc sử dụng chiết xuất nấm men và peptone ở nồng độ cao dẫn đến giảm sự phát triển của các chủng LAB. Nồng độ tryptone cao (>35 mg/mL) làm giảm sự phát triển.
Tăng tryptone từ 0,25 mg/mL đến 5 mg/mL tryptone, không cho thấy tăng trưởng [13]. Thay thế 22 mg/mL nguồn nitơ trong MRS (chiết xuất nấm men, chiết xuất thịt, peptone) bằng 5 mg/mL peptone cá chỉ làm giảm sinh khối L. Trong khi hỗn hợp 2,5 mg/mL peptone và 2,5 mg/mL chiết xuất nấm men làm tăng sinh khối lên 10% [14].