Nghiên Cứu Tinh Sạch và Xác Định Tính Chất Catalase Từ Bacillus subtilis PY79

• Tác giả: Phạm Thu Hương
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hồng Loan
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên Cứu Tinh Sạch Và Tính Chất Catalase Từ Bacillus subtilis PY79
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. TỔNG QUAN VỀ CATALASE
• 1.1.1. Giới thiệu và lịch sử phát hiện catalase
• 1.1.2. Cấu trúc và phân loại catalase
• 1.1.3. Cơ chế hoạt động phân tử của catalase
• 1.1.4. Vai trò và ứng dụng của catalase
• 1.1.5. Tình hình nghiên cứu catalase ở trong và ngoài nước
• 1.2. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN Bacillus subtilis
• 1.2.1. Lịch sử phát hiện, đặc điểm và phân loại
• 1.2.2. Đặc điểm hình thái và sự phân bố
• 1.2.3. Đặc điểm sinh hóa và ảnh hưởng của các yếu tố đến sự tổng hợp catalase của B.
• 1.2.4. Tính an toàn và ứng dụng của B.
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. MÁY MÓC VÀ CÁC TRANG THIẾT BỊ
• 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.2.1. Nuôi cấy, thu dịch chiết tổng số của vi khuẩn B.
• 2.2.2. Tinh sạch catalase từ dịch chiết vi khuẩn B. subtilis bằng kết tủa thuận nghịch và sắc kí trao đổi ion
• 2.2.3. Định lượng protein bằng đo quang phổ ở bước sóng A280 nm
• 2.2.4. Kiểm tra độ sạch của protein bằng điện di trên gel polyacrylamide có SDS (SDS-PAGE)
• 2.2.5. Xác định hoạt độ của catalase dựa trên khả năng phân giải H2O2 ở bước sóng A240 nm bằng quang phổ kế
• 2.2.6. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ, pH và một số ion đến hoạt tính của catalase
• 2.2.7. Xác định các hằng số động học của catalase
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU CHO NUÔI CẤY VI KHUẨN B. subtilis PY79 SINH CATALASE
• 3.1.1. Môi trường nuôi cấy thích hợp cho B.
• 3.1.2. Nồng độ H2O2 dùng để cảm ứng B. subtilis PY79 sinh catalase
• 3.1.3. Thời điểm cảm ứng B. subtilis PY79 bằng H2O2
• 3.1.4. Thời điểm thu sinh khối tế bào B.
• 3.2. TINH SẠCH CATALASE TỪ DỊCH CHIẾT VI KHUẨN B.
• 3.2.1. Sắc ký trao đổi anion Q-sepharose
• 3.2.2. Sắc ký trao đổi cation CM-Sepharose
• 3.3. MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA CATALASE TINH SẠCH TỪ B.
• 3.3.1. Nhiệt độ tối thích và độ bền nhiệt độ của catalase
• 3.3.2. pH tối thích và độ bền pH của catalase
• 3.3.3. Thông số động học của catalase tinh sạch từ B.
• 3.3.4. Ảnh hưởng của một số chất lên hoạt độ của catalase tinh sạch từ B.
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Catalase Từ Bacillus Subtilis PY79

Catalase (EC 1.11.1.6) là một enzyme quan trọng có mặt trong hầu hết các vi khuẩn hiếu khí. Enzyme này đóng vai trò trung tâm trong quá trình khử độc, nhanh chóng ngăn chặn sự hình thành các gốc hydroxyl bằng cách xúc tác sự phân giải hydrogen peroxide (H2O2) thành nước và oxy. Catalase điển hình hoạt động tốt nhất trong khoảng pH 5-10, tối ưu ở pH 6-8 và ổn định ở nhiệt độ 10-30°C. Catalase có nhiều ứng dụng trong công nghệ sinh học, bao gồm ức chế sự phân giải tế bào viêm, hỗ trợ dẫn truyền thuốc nội bào và định lượng cholesterol. Nghiên cứu về catalase từ Bacillus subtilis PY79 mở ra tiềm năng ứng dụng lớn trong nhiều lĩnh vực. Theo một số công bố gần đây, sự giảm catalase có thể đóng vai trò trong quá trình bạc tóc sớm ở người. H2O2 tự nhiên được tạo ra bởi các hoạt động trao đổi của cơ thể và catalase có vai trò phân giải chúng rất nhanh.

1.1. Giới Thiệu Chung Về Enzyme Catalase và Vai Trò

Catalase là một enzyme thuộc lớp oxidoreductase, có mặt trong hầu hết các sinh vật hiếu khí. Vai trò chính của catalase là chống lại các stress oxy hóa bằng cách xúc tác cho phản ứng phân giải H2O2 thành H2O và O2. Enzyme này thường được tìm thấy trong peroxisome của các sinh vật nhân thực và trong tế bào chất của sinh vật nhân sơ. Catalase là một trong những enzyme hoạt động nhanh nhất, có khả năng phân giải hàng triệu phân tử H2O2 mỗi giây. Catalase có khả năng làm giảm H2O2 trong tế bào bằng cách thuỷ phân chúng thành H2O và O2.Ngoài chức năng phân giải và cân bằng lượng H2O2,catalase cũng có khả năng sử dụng H2O2 để oxi hóa các chất độc như methanol, ethanol, formic acid, formaldehydevà nitrate.

1.2. Lịch Sử Phát Hiện và Nghiên Cứu Về Catalase

Catalase là một trong những enzyme được phát hiện sớm nhất, với nhiều nghiên cứu chi tiết về đặc điểm và tính chất. Enzyme này được phát hiện lần đầu bởi nhà bác học Thénard (1818) và được đặt tên là catalase bởi Loew (1900). Warburg (1923) chứng minh rằng trung tâm hoạt động của catalase chứa sắt. Wieland và cộng sự (1927) xác định chức năng của catalase trong tế bào là xúc tác phân giải H2O2 thành H2O và O2. Sumner và Dounce (1937) lần đầu tiên kết tinh được catalase từ gan bò và xác định khối lượng phân tử là 232 kDa. Cho đến nay, đặc điểm cấu trúc, cơ chế hoạt động và tính chất của enzyme đã được làm sáng tỏ.

II. Bacillus Subtilis PY79 Nguồn Tiềm Năng Sản Xuất Catalase

Bacillus subtilis được xem là một chủng vi khuẩn có lợi cho con người và được sử dụng để sản xuất nhiều chế phẩm sinh học như men vi sinh và men Natto. Bacillus subtilis còn được biết đến với khả năng sinh ra nhiều enzyme, trong đó có catalase với hoạt tính cao và an toàn khi thao tác. Nghiên cứu về catalase từ Bacillus subtilis PY79 có ý nghĩa quan trọng trong việc khai thác nguồn enzyme tự nhiên này cho các ứng dụng công nghiệp và y học. Cho đến nay, ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về tinh sạch và xác định các tính chất của catalase từ nguồn gốc tự nhiên. Các nghiên cứu chủ yếu là định tính và định lượng hoạt tính của catalase có trong mẫu dịch chiết.

2.1. Đặc Điểm Sinh Học và Ứng Dụng Của Bacillus Subtilis

Bacillus subtilis là một loại vi khuẩn gram dương, hình que, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý. Vi khuẩn này có khả năng sinh bào tử, giúp chúng tồn tại trong điều kiện khắc nghiệt. Bacillus subtilis được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và nông nghiệp. Một số ứng dụng quan trọng của Bacillus subtilis bao gồm sản xuất enzyme, vitamin, kháng sinh và chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật. Bacillus subtilis còn được sử dụng trong sản xuất men vi sinh, giúp cải thiện hệ tiêu hóa và tăng cường sức khỏe.

2.2. Khả Năng Sản Xuất Enzyme Catalase Của Bacillus Subtilis PY79

Bacillus subtilis PY79 là một chủng vi khuẩn có khả năng sản xuất catalase với hoạt tính cao. Catalase từ Bacillus subtilis PY79 có tiềm năng ứng dụng lớn trong nhiều lĩnh vực, bao gồm công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và môi trường. Enzyme này có thể được sử dụng để loại bỏ H2O2 trong quá trình sản xuất thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm. Catalase cũng có thể được sử dụng trong xử lý nước thải để loại bỏ các chất ô nhiễm. Bacillus subtilis còn được biết đến với khả năng sinh ra nhiều enzyme, trong đó có catalase với hoạt tính cao, an toàn khi thao tác.

III. Phương Pháp Tinh Sạch Catalase Từ Bacillus Subtilis PY79

Nghiên cứu này tập trung vào việc tinh sạch catalase từ dịch chiết vi khuẩn Bacillus subtilis PY79 bằng các phương pháp kết tủa thuận nghịch và sắc ký trao đổi ion. Các phương pháp này giúp loại bỏ các tạp chất và thu được enzyme catalase có độ tinh sạch cao. Độ tinh sạch của protein được kiểm tra bằng điện di trên gel polyacrylamide có SDS (SDS-PAGE). Hoạt độ của catalase được xác định dựa trên khả năng phân giải H2O2 ở bước sóng A240 nm bằng quang phổ kế. Các điều kiện tối ưu cho nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis PY79 sinh catalase cũng được nghiên cứu để tối ưu hóa quá trình sản xuất enzyme.

3.1. Quy Trình Nuôi Cấy và Thu Dịch Chiết Vi Khuẩn Bacillus Subtilis

Vi khuẩn Bacillus subtilis PY79 được nuôi cấy trong môi trường thích hợp để tối ưu hóa sự sinh trưởng và sản xuất catalase. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và sản xuất catalase của vi khuẩn, bao gồm môi trường nuôi cấy, nồng độ H2O2 dùng để cảm ứng, thời điểm cảm ứng và thời điểm thu sinh khối tế bào, được nghiên cứu và tối ưu hóa. Dịch chiết tổng số của vi khuẩn được thu bằng phương pháp ly tâm hoặc lọc. Môi trường nuôi cấy thích hợp cho B. Nồng độ H2O2 dùng để cảm ứng B. subtilis PY79 sinh catalase. Thời điểm cảm ứng B. subtilis PY79 bằng H2O2. Thời điểm thu sinh khối tế bào B.

3.2. Kỹ Thuật Sắc Ký Trao Đổi Ion Để Tinh Sạch Enzyme Catalase

Sắc ký trao đổi ion là một phương pháp hiệu quả để tinh sạch protein dựa trên sự khác biệt về điện tích. Trong nghiên cứu này, sắc ký trao đổi anion Q-sepharose và sắc ký trao đổi cation CM-Sepharose được sử dụng để tinh sạch catalase từ dịch chiết vi khuẩn Bacillus subtilis PY79. Các phân đoạn chứa catalase được thu thập và kiểm tra độ tinh sạch bằng SDS-PAGE. Sắc ký trao đổi anion Q-sepharose. Sắc ký trao đổi cation CM-Sepharose.

IV. Nghiên Cứu Tính Chất Của Catalase Tinh Sạch Từ B

Sau khi tinh sạch, các tính chất của catalase từ Bacillus subtilis PY79 được nghiên cứu, bao gồm nhiệt độ tối thích, độ bền nhiệt độ, pH tối thích, độ bền pH và các thông số động học. Ảnh hưởng của một số chất lên hoạt độ của catalase cũng được xác định. Các kết quả này cung cấp thông tin quan trọng về đặc điểm và hoạt động của enzyme, giúp định hướng cho các ứng dụng thực tiễn. Nhiệt độ tối thích và độ bền nhiệt độ của catalase. pH tối thích và độ bền pH của catalase. Thông số động học của catalase tinh sạch từ B. Ảnh hưởng của một số chất lên hoạt độ của catalase tinh sạch từ B.

4.1. Ảnh Hưởng Của Nhiệt Độ và pH Đến Hoạt Tính Catalase

Nhiệt độ và pH là hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme. Nghiên cứu này xác định nhiệt độ và pH tối thích cho hoạt động của catalase từ Bacillus subtilis PY79. Độ bền nhiệt độ và độ bền pH của enzyme cũng được đánh giá để xác định điều kiện bảo quản và sử dụng enzyme. Nhiệt độ tối thích và độ bền nhiệt độ của catalase. pH tối thích và độ bền pH của catalase.

4.2. Xác Định Các Thông Số Động Học Của Enzyme Catalase

Các thông số động học, bao gồm hằng số Michaelis-Menten (Km) và tốc độ phản ứng tối đa (Vmax), được xác định để mô tả cơ chế hoạt động của catalase. Các thông số này cung cấp thông tin về ái lực của enzyme với cơ chất và tốc độ phản ứng xúc tác. Thông số động học của catalase tinh sạch từ B.

V. Ứng Dụng Tiềm Năng Của Catalase Từ Bacillus Subtilis PY79

Catalase có nhiều ứng dụng tiềm năng trong các ngành công nghiệp khác nhau. Trong công nghiệp thực phẩm, catalase có thể được sử dụng để loại bỏ H2O2 trong quá trình sản xuất sữa, phô mai và các sản phẩm thực phẩm khác. Trong công nghiệp dược phẩm, catalase có thể được sử dụng để sản xuất thuốc và mỹ phẩm. Trong công nghiệp môi trường, catalase có thể được sử dụng để xử lý nước thải và loại bỏ các chất ô nhiễm. Catalase trong thực phẩm. Catalase trong dược phẩm. Catalase trong mỹ phẩm.

5.1. Ứng Dụng Catalase Trong Công Nghiệp Thực Phẩm và Dược Phẩm

Trong công nghiệp thực phẩm, catalase được sử dụng để loại bỏ H2O2 trong quá trình sản xuất sữa, phô mai và các sản phẩm thực phẩm khác. H2O2 có thể được sử dụng để khử trùng thực phẩm, nhưng cần phải loại bỏ sau đó để đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng. Trong công nghiệp dược phẩm, catalase được sử dụng để sản xuất thuốc và mỹ phẩm. Catalase có thể được sử dụng để điều trị các bệnh liên quan đến stress oxy hóa và để cải thiện sức khỏe làn da.

5.2. Vai Trò Của Catalase Trong Xử Lý Nước Thải và Bảo Vệ Môi Trường

Catalase có thể được sử dụng để xử lý nước thải và loại bỏ các chất ô nhiễm. H2O2 được sử dụng trong quá trình xử lý nước thải để oxy hóa các chất ô nhiễm, nhưng cần phải loại bỏ sau đó để đảm bảo an toàn cho môi trường. Catalase có thể được sử dụng để phân hủy H2O2 thành nước và oxy, giúp làm sạch nước thải và bảo vệ môi trường.

VI. Kết Luận và Hướng Phát Triển Nghiên Cứu Về Catalase

Nghiên cứu về tinh sạch và xác định tính chất của catalase từ Bacillus subtilis PY79 đã cung cấp thông tin quan trọng về enzyme này. Các kết quả nghiên cứu có thể được sử dụng để phát triển các ứng dụng thực tiễn của catalase trong các ngành công nghiệp khác nhau. Hướng phát triển tiếp theo của nghiên cứu có thể tập trung vào việc tối ưu hóa quá trình sản xuất catalase và nghiên cứu các ứng dụng mới của enzyme. Tối ưu hóa quá trình tinh sạch. Nghiên cứu ứng dụng mới.

6.1. Tóm Tắt Kết Quả Nghiên Cứu và Đánh Giá Tiềm Năng

Nghiên cứu đã thành công trong việc tinh sạch catalase từ Bacillus subtilis PY79 và xác định các tính chất quan trọng của enzyme. Các kết quả nghiên cứu cho thấy catalase từ Bacillus subtilis PY79 có tiềm năng ứng dụng lớn trong nhiều lĩnh vực. Cần có thêm các nghiên cứu để tối ưu hóa quá trình sản xuất và ứng dụng enzyme.

6.2. Đề Xuất Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về Enzyme Catalase

Hướng nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc tối ưu hóa quá trình sản xuất catalase từ Bacillus subtilis PY79 bằng các phương pháp công nghệ sinh học. Nghiên cứu cũng có thể tập trung vào việc khám phá các ứng dụng mới của catalase trong các lĩnh vực khác nhau, bao gồm y học, nông nghiệp và môi trường.

Tổng quan nghiên cứu

Catalase là enzyme quan trọng có mặt trong hầu hết các sinh vật hiếu khí, đóng vai trò trung tâm trong quá trình khử độc tế bào bằng cách xúc tác phân giải hydrogen peroxide (H₂O₂) thành nước và oxy. H₂O₂ là một gốc oxy hoạt tính (ROS) phổ biến, có thể gây tổn thương DNA, protein và màng lipid, dẫn đến các bệnh lý và quá trình lão hóa. Hoạt tính catalase được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp, y học và môi trường. Tuy nhiên, ở Việt Nam, các nghiên cứu về tinh sạch và đặc tính catalase từ nguồn tự nhiên còn hạn chế, chủ yếu tập trung vào định tính và định lượng enzyme trong dịch chiết thô.

Luận văn này tập trung nghiên cứu tinh sạch và xác định một số tính chất của catalase từ vi khuẩn Bacillus subtilis PY79, một chủng vi khuẩn có lợi, được sử dụng rộng rãi trong sản xuất enzyme và chế phẩm sinh học. Mục tiêu chính là thiết lập quy trình tinh sạch hiệu quả, đồng thời khảo sát các tính chất sinh học của catalase nhằm tạo ra chế phẩm enzyme có độ tinh sạch, độ bền và hoạt tính cao phục vụ cho các nghiên cứu và ứng dụng tiếp theo.

Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, trong năm 2017. Kết quả nghiên cứu góp phần làm rõ đặc điểm sinh học của catalase từ B. subtilis PY79, đồng thời mở ra hướng phát triển các ứng dụng enzyme trong công nghiệp và y học tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Catalase là enzyme thuộc lớp oxidoreductase, xúc tác phản ứng phân giải H₂O₂ thành H₂O và O₂, giúp bảo vệ tế bào khỏi stress oxy hóa. Cấu trúc catalase thường là tetramer hoặc dimer, mỗi monomer chứa khoảng 500-700 amino acid và một nhóm heme với nguyên tử Fe ở trung tâm. Catalase được phân loại thành ba nhóm chính: catalase đơn chức năng (monofunctional catalase), catalase hai chức năng (bifunctional catalase-peroxidase) và pseudocatalase (manganese catalase). Mỗi nhóm có đặc điểm cấu trúc và cơ chế hoạt động khác nhau.

Các khái niệm chính trong nghiên cứu bao gồm:

• Hoạt độ riêng của enzyme (U/mg): lượng enzyme phân giải 1 μmol H₂O₂ trong 1 phút trên 1 mg protein.
• Độ tinh sạch: tỷ lệ tăng hoạt độ riêng so với dịch chiết ban đầu.
• Hằng số động học Km và Vmax: phản ánh ái lực enzyme với cơ chất và tốc độ phản ứng tối đa.
• Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và ion kim loại: các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến hoạt tính và độ bền enzyme.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn nguyên liệu chính là chủng vi khuẩn Bacillus subtilis PY79 được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng, cảm ứng sinh catalase bằng H₂O₂ 0,1 mM tại pha giữa đường cong sinh trưởng (OD600 = 0,6-0,7). Sau 2 giờ cảm ứng, tế bào được thu bằng ly tâm, phá vỡ bằng siêu âm để thu dịch chiết protein tổng số.

Quy trình tinh sạch catalase gồm ba bước chính:

1. Kết tủa thuận nghịch với (NH₄)₂SO₄ 50% để loại bỏ protein không mong muốn và cô đặc mẫu.
2. Sắc ký trao đổi anion Q-Sepharose: gắn protein lên cột, rửa giải bằng gradient NaCl 0-0,7 M, thu phân đoạn có hoạt tính catalase.
3. Sắc ký trao đổi cation CM-Sepharose: tinh sạch thêm bằng cách gắn và rửa giải protein với NaCl 0,15-0,5 M, thu phân đoạn catalase tinh sạch.

Protein được định lượng bằng đo hấp thụ quang phổ tại bước sóng 280 nm, kiểm tra độ tinh sạch và khối lượng phân tử bằng SDS-PAGE. Hoạt độ catalase được xác định dựa trên khả năng phân giải H₂O₂ đo quang phổ tại bước sóng 240 nm. Các yếu tố ảnh hưởng như nhiệt độ, pH và ion kim loại được khảo sát bằng cách xử lý enzyme trong các điều kiện khác nhau và đo hoạt tính còn lại. Hằng số động học Km và Vmax được tính theo phương trình Lineweaver-Burk dựa trên dải nồng độ H₂O₂ từ 6 đến 30 mM.

Cỡ mẫu nghiên cứu bao gồm 1 lít dịch nuôi cấy vi khuẩn, thu được 418,2 mg protein tổng số trong dịch chiết ban đầu. Phân tích số liệu được thực hiện bằng phần mềm Excel và các phương pháp thống kê phù hợp.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Điều kiện nuôi cấy tối ưu:

   • Môi trường LB cho hoạt độ riêng catalase cao nhất đạt 124 U/mg, với băng protein 65 kDa rõ nét trên SDS-PAGE.
   • Nồng độ H₂O₂ cảm ứng tối ưu là 0,1 mM, hoạt độ riêng catalase đạt 203,5 U/mg, tăng 25-50% so với các nồng độ khác.
   • Thời điểm cảm ứng H₂O₂ tại pha giữa đường cong sinh trưởng (OD600 = 0,6-0,7) cho hoạt độ riêng catalase cao nhất 388 U/mg.
   • Thời điểm thu sinh khối sau 120 phút cảm ứng cho hoạt độ catalase cao nhất 155,5 U/mg.

2. Quy trình tinh sạch catalase:

   • Sau bước kết tủa (NH₄)₂SO₄ 50%, thu được 275,8 mg protein với hoạt độ riêng 272 U/mg, tăng 1,3 lần so với dịch chiết ban đầu.
   • Qua sắc ký trao đổi anion Q-Sepharose, hoạt độ riêng tăng lên 3475 U/mg với hiệu suất thu hồi 50%.
   • Bước sắc ký trao đổi cation CM-Sepharose thu được catalase tinh sạch với hoạt độ riêng 30.717 U/mg, hiệu suất 8,9%, độ tinh sạch tăng 144 lần so với dịch chiết ban đầu.
   • SDS-PAGE cho thấy băng protein duy nhất rõ nét ở khoảng 65 kDa, phù hợp với khối lượng phân tử lý thuyết của catalase từ B. subtilis.

3. Tính chất sinh học của catalase tinh sạch:

   • Nhiệt độ tối ưu hoạt động là 37°C, enzyme ổn định từ 4°C đến 37°C, mất hoạt tính hoàn toàn ở 70°C sau 30 phút.
   • pH tối ưu là 7, enzyme hoạt động tốt trong khoảng pH 6-8, giảm hoạt tính ở pH axit và kiềm, không hoạt động ở pH 4 và 12.
   • Hằng số Km và Vmax được xác định qua phương trình Lineweaver-Burk, phản ánh ái lực cao và hiệu quả xúc tác tốt của enzyme với cơ chất H₂O₂.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu phù hợp với các công bố trước đây về catalase từ các chủng B. subtilis khác, tuy nhiên quy trình tinh sạch trong nghiên cứu này đơn giản hơn, giảm số bước và vẫn đạt độ tinh sạch cao. Hoạt độ riêng catalase thu được tuy chưa đạt mức cao nhất trong các nghiên cứu quốc tế, nhưng đã cải thiện đáng kể so với dịch chiết ban đầu, cho thấy hiệu quả của quy trình tinh sạch.

Điều kiện nuôi cấy và cảm ứng H₂O₂ được tối ưu kỹ lưỡng, giúp tăng đáng kể hoạt tính enzyme, phù hợp với đặc điểm sinh trưởng và biểu hiện enzyme của B. subtilis PY79. Nhiệt độ và pH tối ưu của catalase tương đồng với các catalase điển hình, cho thấy enzyme có thể ứng dụng trong các quy trình công nghiệp sinh học ở điều kiện trung tính và nhiệt độ vừa phải.

Biểu đồ sắc ký và SDS-PAGE minh họa rõ ràng sự loại bỏ các protein không mong muốn và thu nhận enzyme tinh sạch, giúp đánh giá trực quan hiệu quả quy trình. Các hạn chế về hiệu suất thu hồi enzyme có thể do mất hoạt tính trong quá trình kết tủa và thẩm tích, cần được tối ưu trong nghiên cứu tiếp theo.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tối ưu quy trình tinh sạch:

   • Áp dụng các bước kết tủa và sắc ký bổ sung hoặc thay thế để tăng hiệu suất thu hồi và duy trì hoạt tính enzyme.
   • Sử dụng các phương pháp bảo vệ enzyme trong quá trình thẩm tích và cô đặc để giảm mất hoạt tính.

2. Mở rộng nghiên cứu đặc tính enzyme:

   • Khảo sát ảnh hưởng của các ion kim loại và chất ức chế khác nhau đến hoạt tính và độ bền của catalase.
   • Nghiên cứu tính ổn định enzyme trong các điều kiện công nghiệp thực tế như pH biến đổi, nhiệt độ cao hoặc môi trường chứa các chất oxy hóa.

3. Phát triển ứng dụng catalase:

   • Ứng dụng enzyme trong xử lý nước thải công nghiệp, loại bỏ H₂O₂ trong ngành dệt may và chế biến thực phẩm.
   • Nghiên cứu phối hợp catalase với các enzyme khác để phát triển các chế phẩm sinh học đa chức năng.

4. Đào tạo và chuyển giao công nghệ:

   • Tổ chức các khóa đào tạo kỹ thuật tinh sạch enzyme cho các phòng thí nghiệm và doanh nghiệp.
   • Hợp tác với các đơn vị công nghiệp để thử nghiệm và ứng dụng catalase tinh sạch trong quy mô sản xuất.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu enzyme và sinh học phân tử:

   • Hưởng lợi từ quy trình tinh sạch và đặc tính enzyme được xác định chi tiết, phục vụ cho các nghiên cứu phát triển enzyme mới hoặc cải tiến enzyme hiện có.

2. Doanh nghiệp công nghiệp sinh học và dược phẩm:

   • Áp dụng quy trình tinh sạch và điều kiện nuôi cấy để sản xuất catalase phục vụ các ứng dụng công nghiệp như xử lý nước thải, chế biến thực phẩm, hoặc sản xuất dược phẩm.

3. Giảng viên và sinh viên ngành sinh học, công nghệ sinh học:

   • Sử dụng luận văn làm tài liệu tham khảo về kỹ thuật tinh sạch protein, phân tích enzyme và ứng dụng enzyme trong thực tế.

4. Cơ quan quản lý và phát triển công nghệ:

   • Tham khảo để xây dựng các chính sách hỗ trợ nghiên cứu và ứng dụng enzyme trong công nghiệp, thúc đẩy phát triển công nghệ sinh học tại Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

1. Catalase là gì và vai trò chính của nó trong tế bào?
   Catalase là enzyme xúc tác phân giải hydrogen peroxide thành nước và oxy, giúp bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do các gốc oxy hoạt tính. Ví dụ, trong tế bào gan và hồng cầu, catalase ngăn ngừa sự oxy hóa protein và lipid.

2. Tại sao chọn Bacillus subtilis PY79 làm nguồn enzyme?
   B. subtilis PY79 là chủng vi khuẩn an toàn, có khả năng sinh catalase với hoạt tính cao, được nghiên cứu rộng rãi và dễ nuôi cấy trong phòng thí nghiệm, phù hợp cho sản xuất enzyme quy mô lớn.

3. Quy trình tinh sạch catalase gồm những bước nào?
   Quy trình gồm kết tủa thuận nghịch bằng (NH₄)₂SO₄, sắc ký trao đổi anion Q-Sepharose và sắc ký trao đổi cation CM-Sepharose, giúp loại bỏ protein không mong muốn và thu được enzyme tinh sạch với độ tinh sạch tăng 144 lần.

4. Nhiệt độ và pH tối ưu hoạt động của catalase là bao nhiêu?
   Catalase hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 37°C và pH 7, enzyme ổn định trong khoảng pH 6-8 và nhiệt độ từ 4°C đến 37°C, phù hợp với điều kiện sinh học và công nghiệp thông thường.

5. Ứng dụng thực tiễn của catalase tinh sạch từ B. subtilis PY79?
   Catalase có thể được ứng dụng trong xử lý nước thải, loại bỏ H₂O₂ trong công nghiệp dệt may, chế biến thực phẩm, y học và dược phẩm, cũng như phát triển các chế phẩm enzyme đa chức năng.

Kết luận

• Đã thiết lập thành công quy trình tinh sạch catalase từ Bacillus subtilis PY79 gồm ba bước chính, đạt độ tinh sạch tăng 144 lần với hoạt độ riêng 30.717 U/mg.
• Xác định được điều kiện nuôi cấy tối ưu gồm môi trường LB, cảm ứng H₂O₂ 0,1 mM tại pha giữa sinh trưởng và thu sinh khối sau 120 phút.
• Catalase tinh sạch có nhiệt độ tối ưu 37°C, pH tối ưu 7, ổn định trong khoảng pH 6-8 và nhiệt độ 4-37°C.
• Kết quả nghiên cứu góp phần làm rõ đặc tính sinh học của catalase từ B. subtilis PY79, mở rộng tiềm năng ứng dụng enzyme trong công nghiệp và y học.
• Đề xuất tiếp tục tối ưu quy trình tinh sạch và mở rộng nghiên cứu ứng dụng enzyme trong các lĩnh vực công nghiệp sinh học.

Khuyến khích các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp quan tâm phối hợp phát triển các sản phẩm enzyme chất lượng cao, góp phần nâng cao giá trị khoa học và kinh tế trong lĩnh vực công nghệ sinh học tại Việt Nam.