Nghiên cứu tính sạch và xác định tính chất của catalase từ Bacillus subtilis PY79

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu tinh sạch và xác định tính chất của catalase từ Bacillus subtilis PY79, góp phần vào lĩnh vực sinh học phân tử.

• Tác giả: Phạm Thu Hƣơng
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hồng Loan
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu tinh sạch và xác định một số tính chất của catalase từ Bacillus subtilis PY79
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. TỔNG QUAN VỀ CATALASE
• 1.1.1. Giới thiệu và lịch sử phát hiện catalase
• 1.1.2. Cấu trúc và phân loại catalase
• 1.1.3. Cơ chế hoạt động phân tử của catalase
• 1.1.4. Vai trò và ứng dụng của catalase
• 1.2. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN Bacillus subtilis
• 1.2.1. Lịch sử phát hiện, đặc điểm và phân loại
• 1.2.2. Đặc điểm hình thái và sự phân bố
• 1.2.3. Đặc điểm sinh hóa và ảnh hưởng của các yếu tố đến sự tổng hợp catalase của B.
• 1.2.4. Tính an toàn và ứng dụng của B.
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. MÁY MÓC VÀ CÁC TRANG THIẾT BỊ
• 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.2.1. Nuôi cấy, thu dịch chiết tổng số của vi khuẩn B.
• 2.2.2. Tinh sạch catalase từ dịch chiết vi khuẩn B. subtilis bằng kết tủa thuận nghịch và sắc kí trao đổi ion
• 2.2.3. Định lượng protein bằng đo quang phổ ở bước sóng A280 nm
• 2.2.4. Kiểm tra độ sạch của protein bằng điện di trên gel polyacrylamide có SDS (SDS-PAGE)
• 2.2.5. Xác định hoạt độ của catalase dựa trên khả năng phân giải H2O2 ở bước sóng A240 nm bằng quang phổ kế
• 2.2.6. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ, pH và một số ion đến hoạt tính của catalase
• 2.2.7. Xác định các hằng số động học của catalase
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU CHO NUÔI CẤY VI KHUẨN B. subtilis PY79 SINH CATALASE
• 3.1.1. Môi trường nuôi cấy thích hợp cho B.
• 3.1.2. Nồng độ H2O2 dùng để cảm ứng B. subtilis PY79 sinh catalase
• 3.1.3. Thời điểm cảm ứng B. subtilis PY79 bằng H2O2
• 3.1.4. Thời điểm thu sinh khối tế bào B.
• 3.2. TINH SẠCH CATALASE TỪ DỊCH CHIẾT VI KHUẨN B.
• 3.2.1. Sắc ký trao đổi anion Q-sepharose
• 3.2.2. Sắc ký trao đổi cation CM-Sepharose
• 3.3. MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA CATALASE TINH SẠCH TỪ B.
• 3.3.1. Nhiệt độ tối thích và độ bền nhiệt độ của catalase
• 3.3.2. pH tối thích và độ bền pH của catalase
• 3.3.3. Thông số động học của catalase tinh sạch từ B.
• 3.3.4. Ảnh hưởng của một số chất lên hoạt độ của catalase tinh sạch từ B.
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu tính sạch của catalase từ Bacillus subtilis PY79

Nghiên cứu về catalase từ Bacillus subtilis PY79 đã thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học. Enzyme này đóng vai trò quan trọng trong việc phân giải hydrogen peroxide (H2O2), một gốc oxy hoạt tính có thể gây hại cho tế bào. Việc hiểu rõ về tính sạch và đặc điểm của catalase không chỉ giúp nâng cao hiệu quả ứng dụng trong công nghệ sinh học mà còn mở ra hướng đi mới trong nghiên cứu các enzyme vi sinh vật. Nghiên cứu này nhằm mục tiêu xác định các tính chất của catalase từ B. subtilis PY79, từ đó phát triển các ứng dụng trong lĩnh vực y dược và công nghệ sinh học.

1.1. Giới thiệu về catalase và vai trò của nó trong sinh học

Catalase là một enzyme quan trọng trong việc phân giải H2O2 thành nước và oxy. Enzyme này có mặt trong hầu hết các sinh vật hiếu khí và giúp bảo vệ tế bào khỏi stress oxy hóa. Nghiên cứu cho thấy catalase có khả năng làm giảm nồng độ H2O2, từ đó ngăn chặn các tổn thương tế bào và mô.

1.2. Tình hình nghiên cứu catalase từ Bacillus subtilis

Bacillus subtilis là một trong những vi khuẩn được nghiên cứu nhiều nhất về khả năng sinh ra catalase. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng B. subtilis có thể sản xuất catalase với hoạt tính cao, tuy nhiên, việc tinh sạch và xác định các tính chất của enzyme này vẫn còn hạn chế. Nghiên cứu này sẽ cung cấp thông tin chi tiết hơn về catalase từ B. subtilis PY79.

II. Thách thức trong việc tinh sạch catalase từ Bacillus subtilis PY79

Việc tinh sạch catalase từ Bacillus subtilis PY79 gặp nhiều thách thức. Một trong những vấn đề chính là sự hiện diện của các protein khác trong dịch chiết, có thể làm giảm hiệu quả của quá trình tinh sạch. Ngoài ra, điều kiện môi trường nuôi cấy cũng ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme. Do đó, việc tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy và quy trình tinh sạch là rất cần thiết để đạt được enzyme có độ tinh sạch cao.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tinh sạch catalase

Nồng độ H2O2, pH và nhiệt độ là những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng sinh catalase của B. subtilis. Nghiên cứu cho thấy, việc điều chỉnh các yếu tố này có thể tối ưu hóa hoạt tính của enzyme, từ đó nâng cao hiệu quả tinh sạch.

2.2. Những khó khăn trong việc xác định hoạt tính của catalase

Xác định hoạt tính của catalase là một thách thức lớn. Các phương pháp hiện tại như đo quang phổ có thể bị ảnh hưởng bởi sự hiện diện của các protein khác. Do đó, cần phát triển các phương pháp chính xác hơn để đánh giá hoạt tính của enzyme.

III. Phương pháp tinh sạch catalase từ Bacillus subtilis PY79

Quá trình tinh sạch catalase từ Bacillus subtilis PY79 được thực hiện qua nhiều bước. Đầu tiên, vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường thích hợp để tối ưu hóa sản lượng enzyme. Sau đó, dịch chiết được thu thập và tinh sạch bằng các phương pháp như sắc ký trao đổi ion và kết tủa bằng amoni sulfate. Các bước này giúp loại bỏ các tạp chất và thu được enzyme có độ tinh sạch cao.

3.1. Quy trình nuôi cấy Bacillus subtilis PY79

Quy trình nuôi cấy B. subtilis PY79 được thực hiện trong môi trường lỏng với nồng độ H2O2 thích hợp để kích thích sự sinh tổng hợp catalase. Thời gian nuôi cấy cũng được điều chỉnh để đạt được sinh khối tối ưu.

3.2. Các phương pháp tinh sạch catalase

Các phương pháp như sắc ký trao đổi ion và kết tủa bằng amoni sulfate được sử dụng để tinh sạch catalase. Sắc ký trao đổi ion giúp loại bỏ các protein không mong muốn, trong khi kết tủa bằng amoni sulfate giúp cô đặc enzyme.

IV. Đặc điểm và hoạt tính của catalase tinh sạch từ Bacillus subtilis PY79

Catalase tinh sạch từ Bacillus subtilis PY79 có nhiều đặc điểm nổi bật. Enzyme này hoạt động hiệu quả trong khoảng pH từ 6 đến 8 và có khả năng phân giải H2O2 nhanh chóng. Các nghiên cứu cho thấy, catalase từ B. subtilis có thể phân giải hàng triệu phân tử H2O2 trong một giây, cho thấy tiềm năng ứng dụng lớn trong công nghệ sinh học.

4.1. Đặc điểm động học của catalase

Các thông số động học của catalase tinh sạch từ B. subtilis PY79 được xác định thông qua các thí nghiệm. Kết quả cho thấy enzyme có hằng số Michaelis-Menten thấp, cho thấy hoạt tính cao trong việc phân giải H2O2.

4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt tính của catalase

Nghiên cứu cho thấy, catalase từ B. subtilis hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ từ 25 đến 30 độ C và pH từ 6 đến 8. Những điều kiện này cần được duy trì để đảm bảo hoạt tính của enzyme trong các ứng dụng thực tiễn.

V. Ứng dụng thực tiễn của catalase từ Bacillus subtilis PY79

Catalase từ Bacillus subtilis PY79 có nhiều ứng dụng trong công nghệ sinh học và y dược. Enzyme này có thể được sử dụng trong các quy trình sản xuất thực phẩm, điều trị bệnh và nghiên cứu về stress oxy hóa. Việc phát triển các chế phẩm enzyme từ B. subtilis không chỉ giúp nâng cao hiệu quả sản xuất mà còn mở ra hướng đi mới trong nghiên cứu và ứng dụng enzyme.

5.1. Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm

Catalase có thể được sử dụng trong sản xuất thực phẩm để loại bỏ H2O2, từ đó nâng cao chất lượng sản phẩm. Việc sử dụng enzyme này giúp cải thiện độ an toàn và chất lượng thực phẩm.

5.2. Tiềm năng trong điều trị bệnh

Nghiên cứu cho thấy, catalase có thể đóng vai trò quan trọng trong điều trị các bệnh liên quan đến stress oxy hóa. Việc bổ sung enzyme này có thể giúp cải thiện tình trạng sức khỏe và ngăn ngừa các bệnh lý.

VI. Kết luận và triển vọng nghiên cứu về catalase từ Bacillus subtilis PY79

Nghiên cứu về catalase từ Bacillus subtilis PY79 đã chỉ ra nhiều tiềm năng ứng dụng trong công nghệ sinh học và y dược. Việc tinh sạch và xác định các tính chất của enzyme này không chỉ giúp nâng cao hiệu quả ứng dụng mà còn mở ra hướng đi mới trong nghiên cứu enzyme. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho ngành công nghiệp và sức khỏe con người.

6.1. Hướng đi mới trong nghiên cứu enzyme

Nghiên cứu về catalase từ B. subtilis PY79 mở ra nhiều hướng đi mới trong việc phát triển các chế phẩm enzyme. Việc tối ưu hóa quy trình sản xuất và tinh sạch enzyme sẽ là những bước quan trọng trong tương lai.

6.2. Tương lai của ứng dụng catalase trong y dược

Catalase có tiềm năng lớn trong việc điều trị các bệnh liên quan đến stress oxy hóa. Nghiên cứu tiếp theo sẽ tập trung vào việc phát triển các phương pháp điều trị mới dựa trên enzyme này.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Gốc oxy hóa hoạt tính (ROS), đặc biệt là hydrogen peroxide ($H_2O_2$), là sản phẩm phụ tất yếu sinh ra từ chuỗi truyền điện tử trong hô hấp hiếu khí, có khả năng phá hủy cấu trúc DNA, màng lipid kép và protein tế bào. Nhằm ngăn chặn độc tính này, sinh vật hiếu khí sử dụng enzyme catalase (E.C 1.11.1.6) – một trong những xúc tác sinh học có tốc độ phản ứng nhanh nhất tự nhiên với khả năng phân giải hàng triệu phân tử $H_2O_2$ thành nước và oxy trong mỗi giây. Nghiên cứu tinh sạch và xác định đặc tính enzyme này đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển các giải pháp chống oxy hóa sinh học phục vụ y dược, công nghiệp chế biến sữa, dệt may và xử lý môi trường.

Vấn đề cốt lõi của nghiên cứu là thiết lập quy trình nuôi cấy tối ưu và tinh sạch triệt để catalase tự nhiên từ chủng vi khuẩn Gram dương Bacillus subtilis PY79 – một chủng vi sinh vật an toàn sinh học theo chuẩn của FDA. Mục tiêu cụ thể của luận văn bao gồm: xác định môi trường dinh dưỡng và các thông số cảm ứng $H_2O_2$ tối ưu; xây dựng quy trình tinh sạch enzyme qua hệ thống sắc ký trao đổi ion đa bước; đồng thời xác định các đặc tính hóa sinh quan trọng như khối lượng phân tử, nhiệt độ tối thích, pH hoạt động, độ bền nhiệt và các thông số động học.

Nghiên cứu được triển khai thực nghiệm tại Phòng Protein tái tổ hợp thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội vào năm 2017. Kết quả nghiên cứu mang ý nghĩa thực tiễn to lớn khi tạo ra chế phẩm catalase có độ tinh sạch tăng 144 lần so với dịch chiết thô ban đầu, đạt hoạt độ riêng lên tới 30.717,2 U/mg từ 50 ml dịch chiết tế bào, đóng góp dữ liệu thực nghiệm quan trọng cho công nghệ sinh học enzyme tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên lý thuyết phản ứng oxy hóa khử sinh học và cơ chế xúc tác enzyme của nhóm oxidoreductase. Phản ứng phân giải $H_2O_2$ của catalase diễn ra qua hai giai đoạn liên tiếp: nguyên tử Fe ở trung tâm nhân protoporphyrin trong nhóm heme bị oxy hóa bởi một phân tử $H_2O_2$ đầu tiên để tạo thành phức hệ trung gian (phức hệ A) kèm một phân tử $H_2O$; sau đó, phân tử $H_2O_2$ thứ hai đóng vai trò chất khử phức hệ A, giải phóng thêm một phân tử $H_2O$ và một phân tử oxy tự do ($O_2$).

Về phân loại học phân tử, catalase trong tự nhiên được chia thành ba nhóm chính: catalase đơn chức chứa nhân heme (monofunctional catalase) phổ biến nhất với cấu trúc tetramer có khối lượng phân tử 200 - 340 kDa; catalase-peroxidase hai chức (bifunctional catalase-peroxidase) có cấu trúc dimer khoảng 120 - 340 kDa; và nhóm mangan catalase (pseudocatalase) không chứa nhân heme, có khối lượng phân tử 170 - 210 kDa. Chủng vi khuẩn mô hình Bacillus subtilis sở hữu hệ gen kích thước 4,2 Mb gồm khoảng 4.100 gen mã hóa protein, có khả năng tiết lượng enzyme ngoại bào và nội bào lớn đạt hiệu suất 20 - 25 g/lít môi trường, hoàn toàn không gây độc tính cho người và động vật.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thực nghiệm được thu thập từ quá trình nuôi cấy chuẩn hóa 1 lít dịch vi khuẩn Bacillus subtilis PY79 (được cung cấp từ Đại học Hoàng Gia Holloway London). Cỡ mẫu khảo sát bao gồm 5 hệ môi trường nuôi cấy đối chứng (LB, DSM, PYS, TBS, MT5) và 8 dải nồng độ chất cảm ứng $H_2O_2$ từ 0 đến 2 mM được thực hiện lặp lại để thu được các giá trị trung bình tin cậy. Phương pháp chọn mẫu tập trung vào việc thu thập dịch chiết tế bào tại các mốc mật độ quang học $OD_{600}$ từ 0,3 đến 1,0 trên đường cong sinh trưởng logarit.

Quy trình phân tích hóa sinh áp dụng các kỹ thuật tiêu chuẩn quốc tế:

• Hoạt độ catalase được định lượng theo phương pháp đo quang phổ của Beer và Sizer (1952) tại bước sóng cực đại 240 nm, dựa trên hệ số hấp thụ phân tử của $H_2O_2$ là 43,6 $M^{-1} cm^{-1}$, xác định lượng cơ chất phân giải trong 1 phút ở 25°C và pH 7,0.
• Hàm lượng protein được định lượng bằng phương pháp đo độ hấp thụ tử ngoại tại bước sóng 280 nm, sử dụng albumin huyết thanh bò (BSA) làm đường chuẩn với hệ số hấp thụ $A_{280} = 0,66$ tương ứng 1 mg/ml.
• Kiểm tra độ sạch và xác định khối lượng phân tử protein được thực hiện qua điện di biến tính SDS-PAGE trên gel polyacrylamide 12% theo phương pháp Laemmli (1970) với điện thế 150 V trong 70 phút.
• Các hằng số động học ($K_m, V_{max}$) được xác định thông qua việc khảo sát dải nồng độ cơ chất $H_2O_2$ từ 6 đến 30 mM với lượng enzyme 20 - 30 ng, xử lý số liệu hồi quy tuyến tính bằng phương trình Lineweaver-Burk. Toàn bộ timeline nghiên cứu và thực nghiệm phân tích được chuẩn hóa trong giai đoạn 2016 - 2017.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình khảo sát điều kiện sinh tổng hợp catalase đã xác định các thông số nuôi cấy tối ưu cho Bacillus subtilis PY79:

• Môi trường nuôi cấy: Môi trường Luria Bertani (LB) lỏng cho hoạt độ riêng catalase cao nhất đạt 124 U/mg, vượt trội so với các môi trường MT5, DSM và TBS.
• Nồng độ chất cảm ứng: Bổ sung $H_2O_2$ ở nồng độ 0,1 mM giúp hoạt độ riêng đạt đỉnh 203,52 U/mg, cao hơn 25% đến 50% so với các nồng độ thử nghiệm khác (0,01 - 2 mM).
• Thời điểm cảm ứng và thu hoạch: Cảm ứng $H_2O_2$ tại thời điểm giữa pha log ($OD_{600} = 0,6 - 0,7$) cho hoạt độ riêng cao nhất lên tới 388 U/mg. Thời điểm thu sinh khối tối ưu được xác định là sau 120 phút cảm ứng, đạt hoạt độ 155,5 U/mg. Từ 1 lít môi trường nuôi cấy tối ưu, thu được 50 ml dịch chiết chứa 418,2 mg protein tổng số với tổng hoạt độ 89.250 U (hoạt độ riêng 213,4 U/mg).

Quy trình tinh sạch 3 bước liên hoàn đã mang lại hiệu quả phân tách vượt bậc:

• Bước 1 (Kết tủa muối): Kết tủa chọn lọc bằng $(NH_4)_2SO_4$ 50% thu được 275,8 mg protein, nâng hoạt độ riêng lên 272 U/mg, độ tinh sạch tăng 1,3 lần với hiệu suất thu hồi 84%.
• Bước 2 (Sắc ký trao đổi anion Q-Sepharose): Rửa chiết protein bám cột bằng gradient NaCl 0 - 0,7 M, thu hồi các phân đoạn hoạt tính ở nồng độ muối 0,3 - 0,5 M, thu được 12,7 mg protein với hoạt độ riêng 3.475 U/mg, độ tinh sạch tăng 16,3 lần, hiệu suất đạt 50%.
• Bước 3 (Sắc ký trao đổi cation CM-Sepharose): Rửa chiết bằng đệm natri acetate 10 mM (pH 4,8) chứa 0,3 M NaCl, thu được 0,26 mg catalase tinh khiết cao với hoạt độ riêng đạt 30.717,2 U/mg, tổng hoạt độ đạt 7.912 U. Độ tinh sạch cuối cùng tăng gấp 144 lần so với dịch chiết ban đầu, hiệu suất thu hồi đạt 8,9%. Điện di SDS-PAGE 12% cho thấy một băng đơn nhất có khối lượng phân tử khoảng 65 kDa.

Khảo sát đặc tính lý hóa của enzyme tinh sạch:

• Nhiệt độ hoạt động: Tối thích tại 37°C, duy trì độ bền nhiệt ổn định trong khoảng 4°C - 37°C sau 30 phút ủ, hoạt tính giảm dần từ trên 37°C và mất hoàn toàn ở 70°C - 80°C.
• Dải pH hoạt động: Tối thích tại pH 7,0 trong đệm kali phosphate 50 mM, hoạt động ổn định trong vùng trung tính pH 6,0 - 8,0, giữ độ bền tốt từ pH 6,0 đến 9,0 nhưng mất hoạt tính hoàn toàn tại các vùng pH khắc nghiệt dưới 4,0 hoặc trên 12,0.

Thảo luận kết quả

Hiệu quả cảm ứng sinh tổng hợp catalase bằng $H_2O_2$ ở nồng độ thấp (0,1 mM) được giải thích bởi cơ chế kích hoạt các yếu tố điều hòa phiên mã chống stress oxy hóa trong tế bào vi khuẩn. Khi nồng độ $H_2O_2$ vượt quá 0,25 mM, sự tích tụ chất oxy hóa mạnh làm tổn thương cấu trúc màng và ức chế bộ máy dịch mã, dẫn đến suy giảm hoạt độ enzyme thu nhận.

So sánh với các công bố quốc tế, quy trình tinh sạch 3 bước trong nghiên cứu này thể hiện sự tối ưu rõ rệt:

• Độ tinh khiết tăng 144 lần, vượt trội hơn nhiều so với nghiên cứu trên chủng Bacillus subtilis WSHDZ-01 (chỉ tăng 6,8 lần, hoạt độ riêng 13.568 U/mg) và nghiên cứu trên chủng kiềm Bacillus sp. (chỉ tăng 6,2 lần, hoạt độ riêng 566,6 U/mg).
• Quy trình kết hợp sắc ký trao đổi anion Q-Sepharose và cation CM-Sepharose đã loại bỏ triệt để các protein tạp mà không cần qua 5 bước phức tạp như các phương pháp tinh sạch truyền thống trên nấm men hay vi khuẩn biển.

Các kết quả thực nghiệm được biểu diễn trực quan và chặt chẽ qua hệ thống bảng tóm tắt 4 giai đoạn tinh sạch, kết hợp sắc ký đồ hấp thụ quang phổ $A_{280}$ và ảnh chụp bản gel điện di SDS-PAGE đa giếng. Sự tương thích giữa đỉnh rửa chiết hoạt tính tại nồng độ muối 0,3 M NaCl và độ đậm nét của băng protein 65 kDa trên bản gel điện di khẳng định tính chính xác của phương pháp phân tách.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết quả đạt được, luận văn đưa ra 4 khuyến nghị và định hướng nghiên cứu ứng dụng cụ thể:

1. Tối ưu hóa kỹ thuật cô đặc mẫu và màng siêu lọc thẩm tích nhằm hạn chế thất thoát protein enzyme, đặt mục tiêu nâng hiệu suất thu hồi chế phẩm tinh khiết từ 8,9% lên trên 25% trong thời gian 6 tháng tới (Chủ thể thực hiện: Nhóm nghiên cứu công nghệ protein tại các phòng thí nghiệm chuyên ngành).
2. Nâng cấp quy mô nuôi cấy từ hệ thống bình lắc 1 lít lên hệ thống bioreactor lên men tự động 10 - 50 lít, kiểm soát chính xác các thông số oxy hòa tan (DO) và tốc độ bổ sung cơ chất cảm ứng liên tục nhằm tăng sinh khối vi khuẩn trong vòng 12 tháng (Chủ thể thực hiện: Các đơn vị nghiên cứu vi sinh vật thực nghiệm).
3. Ứng dụng chế phẩm catalase tinh sạch vào xử lý dư lượng $H_2O_2$ trong quy trình tẩy trắng vải sợi của ngành công nghiệp dệt nhuộm và loại bỏ peroxide sau khử trùng lạnh trong chế biến sữa, nhằm cắt giảm 100% hóa chất trung hòa độc hại và tiết kiệm 30% lượng nước thải sinh thái (Chủ thể thực hiện: Các doanh nghiệp sản xuất thực phẩm và dệt may công nghiệp).
4. Phát triển công nghệ cố định enzyme (enzyme immobilization) trên các chất mang polyme sinh học hoặc hạt nano từ tính để cải thiện độ bền nhiệt trên 50°C và cho phép tái sử dụng enzyme ít nhất 10 chu kỳ phản ứng trong thời hạn 18 tháng (Chủ thể thực hiện: Các viện nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học và vật liệu mới).

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Tài liệu luận văn là nguồn tham khảo khoa học hữu ích cho 4 nhóm đối tượng chính:

1. Học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Hóa sinh, Sinh học thực nghiệm và Công nghệ sinh học: Cung cấp tài liệu tham khảo chuẩn mực về phương pháp lập quy trình tinh sạch protein đa bước, kỹ thuật điện di SDS-PAGE và phân tích động học enzyme.
2. Giảng viên và cán bộ nghiên cứu tại các trường đại học, viện nghiên cứu chuyên ngành: Ứng dụng làm bài giảng chuyên đề về kỹ thuật sắc ký protein, chuyển hóa sinh hóa và các cơ chế phòng vệ chống oxy hóa ở vi sinh vật nhân sơ.
3. Kỹ sư R&D trong ngành công nghệ thực phẩm và đồ uống: Tham khảo quy trình sản xuất và ứng dụng enzyme catalase an toàn để loại bỏ $H_2O_2$ trong quy trình chế biến sữa tươi thanh trùng và bảo quản thực phẩm.
4. Chuyên gia công nghệ môi trường và công nghiệp dệt may: Tìm kiếm giải pháp xử lý nước thải công nghiệp thân thiện với môi trường, sử dụng enzyme sinh học thay thế các hợp chất khử hóa học truyền thống.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao chủng vi khuẩn Bacillus subtilis PY79 lại được chọn làm nguồn sinh tổng hợp catalase? Bacillus subtilis PY79 là chủng vi khuẩn mô hình Gram dương đã được giải mã hoàn toàn hệ gen 4,2 Mb, có khả năng sinh tổng hợp lượng enzyme lớn và được FDA công nhận an toàn sinh học. Việc sử dụng chủng vi khuẩn này giúp quá trình nuôi cấy diễn ra thuận lợi, hạn chế nguy cơ lây nhiễm độc tố và đảm bảo độ tinh sạch cao cho sản phẩm enzyme cuối cùng.

2. Nồng độ và thời điểm cảm ứng $H_2O_2$ nào mang lại hiệu quả sinh tổng hợp catalase cao nhất? Thực nghiệm chứng minh nồng độ cảm ứng $H_2O_2$ tối ưu là 0,1 mM, thực hiện 4 lần ngắt quãng tại thời điểm giữa pha log ($OD_{600} = 0,6 - 0,7$). Nồng độ này kích thích tối đa các operon phòng vệ oxy hóa của vi khuẩn, giúp hoạt độ riêng catalase đạt 388 U/mg mà không gây ức chế sinh trưởng tế bào.

3. Quy trình tinh sạch catalase trong luận văn gồm những bước nào và đạt độ sạch bao nhiêu? Quy trình tinh sạch bao gồm 3 bước liên hoàn: kết tủa phân đoạn bằng $(NH_4)_2SO_4$ 50%, sắc ký trao đổi anion Q-Sepharose và sắc ký trao đổi cation CM-Sepharose. Quy trình giúp độ tinh sạch của enzyme tăng gấp 144 lần so với dịch chiết thô, đạt hoạt độ riêng 30.717,2 U/mg.

4. Khối lượng phân tử và các điều kiện hoạt động tối ưu của catalase tinh sạch là gì? Catalase tinh sạch từ Bacillus subtilis PY79 có khối lượng phân tử monomer khoảng 65 kDa trên điện di SDS-PAGE. Enzyme đạt hoạt tính xúc tác cao nhất tại nhiệt độ 37°C và pH 7,0 trong dung dịch đệm kali phosphate 50 mM, giữ độ bền tốt trong khoảng nhiệt độ 4°C - 37°C và pH 6,0 - 9,0.

5. Chế phẩm catalase tinh khiết từ Bacillus subtilis PY79 có tiềm năng ứng dụng gì trong công nghiệp? Chế phẩm có thể ứng dụng trực tiếp để phân giải triệt để dư lượng $H_2O_2$ trong dây chuyền chế biến sữa thanh trùng, xử lý nước thải tẩy trắng của ngành dệt may, sản xuất thiết bị cảm biến sinh học (biosensor) định lượng peroxide và phát triển các sản phẩm chăm sóc sức khỏe chống lão hóa.

Kết luận

• Xác định thành công môi trường dinh dưỡng LB lỏng và điều kiện cảm ứng $H_2O_2$ 0,1 mM tại pha giữa log ($OD_{600} = 0,6 - 0,7$) là tối ưu nhất cho sinh tổng hợp catalase từ Bacillus subtilis PY79.
• Thiết lập quy trình tinh sạch 3 bước hiệu quả gồm kết tủa muối $(NH_4)_2SO_4$ 50%, sắc ký trao đổi anion Q-Sepharose và sắc ký trao đổi cation CM-Sepharose.
• Thu nhận chế phẩm catalase có độ tinh sạch tăng 144 lần, hoạt độ riêng đạt 30.717,2 U/mg, cho một băng đồng nhất trên bản gel SDS-PAGE với khối lượng phân tử khoảng 65 kDa.
• Xác định rõ các đặc tính hóa sinh quan trọng với nhiệt độ tối thích 37°C, pH tối thích 7,0 và độ bền cao trong dải pH 6,0 - 9,0.
• Cung cấp cơ sở khoa học và quy trình thực nghiệm tin cậy cho việc phát triển các chế phẩm enzyme chống oxy hóa an toàn, phục vụ công nghệ sinh học và sản xuất công nghiệp.

Đóng góp chính của luận văn là đã hoàn thiện một quy trình tinh sạch catalase tự nhiên có độ sạch cao tại Việt Nam, mở ra tiềm năng sản xuất chế phẩm sinh học quy mô lớn. Để tiếp tục hoàn thiện, các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung mở rộng quy mô lên hệ thống lên men công nghiệp và nghiên cứu công nghệ cố định enzyme trên chất mang rắn. Các đơn vị nghiên cứu và doanh nghiệp quan tâm có thể ứng dụng ngay quy trình này vào hoạt động R&D để nâng cao giá trị gia tăng cho các sản phẩm công nghệ sinh học.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Catalase (E.6) là enzyme có ở hầu hết các vi khuẩn hiếu khí và là một trong những thành phần trung tâm của các quá trình khử độc, ngăn chặn cực nhanh sự hình thành phản ứng hydroxyl bằng cách xúc tác sự phân giảihydrogen peroxide (H2O2) thành nước và oxy [43, 52]. Catalase điển hình hoạt động trong khoảng pH 5 - 10, tối ưu tại pH 6 - 8 và ổn định ở nhiệt độ 10 - 30oC [5]. Catalase đã được ứng dụng trong nhiều quy trình công nghệ sinh học khác nhau. Do có hoạt tính phân giải nhanh H2O2 nên catalase có khả năng ức chế sự phân giải của tế bào viêm, một loạt các khối u, apoptosis, tế bào thần kinh và lão hóa [12, 18, 33, 57, 58].

Enzyme cũng được chứng minh là tác nhân có thể hỗ trợ dẫn truyền thuốc nội bào [53] và sử dụng trong định lượng cholesterol [42]. Theo một số công bố gần đây, sự giảm của catalase có thể đóng vai trò trong quá trình bạc tóc sớm ở người. H2O2 tự nhiên được tạo ra bởi các hoạt động trao đổi của cơ thể và catalase có vai trò phân giải chúng rất nhanh. Do vậy, nếu hàm lượng catalase giảm đi, nó sẽ không thể phân giải hết H2O2, dẫn đến tóc bị tẩy trắng từ bên trong.

Nhận định này vẫn đang được làm sáng tỏ với hy vọng phát triển các phương pháp chữa bạc tóc dựa trên việc bổ sung catalase [20, 62]. Catalase từ các sinh vật khác nhau cũng đã được tinh sạch và nghiên cứu tính chất như: B. Hầu hết các nghiên cứu thường tinh sạch enzyme bằng cách sử dụng muối amoni sulfate kết tủa chọn lọc protein và các loại sắc ký như lọc gel [23, 30], trao đổi ion (DEAE Sephadex hoặc DEAE cellulose[23, 30], Q Sepharose FF [59]). subtilis được xem như là một chủng vi khuẩn có lợi cho con người và đã được sử dụng để sản xuất nhiều chế phẩm sinh học như: men vi sinh; men Natto – một thực phẩm chức năng rất bổ dưỡng cho sức khỏeở Nhật Bản [61].

subtilis còn được biết đến với khả năng sinh ra nhiều enzyme, trong đó có catalase với hoạt tính cao, an toàn khi thao tác [46]. Cho đến nay, ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về tinh sạch và xác định 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] các tính chất của catalase từ nguồn gốc tự nhiên. Các nghiên cứu chủ yếu là định tính và định lượng hoạt tính của catalase có trong mẫu dịch chiết [1]. Từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tinh sạch và xác định một số tính chất của catalase từ Bacilus subtilisPY79” với mục tiêu tạo được chế phẩm enzyme có độ tinh sạch, độ bền và hoạt tính tốt để phục vụ cho các nghiên cứu sau này.

2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. TỔNG QUAN VỀ CATALASE 1. Giới thiệu và lịch sử phát hiện catalase Hydrogen peroxide (H2O2) là một trong những gốc oxy hoạt tính (ROS) phổ biến nhất trong khí quyển.

H2O2 xuất hiện do có trong môi trường, là sản phẩm phụ của chuỗi vận chuyển điện tử trong quá trình hô hấp hiếu khí, quang hợp hoặc sản phẩm của sự hoạt động enzyme (chủ yếu là oxidase) [63]. Trong tế bào, các gốc oxi hóa tự do tấn công hầu hết các hợp chất quan trọng như DNA, protein, màng lipid kép và thậm chí phá hủy cả tế bào. Do đó, các sinh vật đã tiến hóa để có một hệ thống enzyme phức tạp và hiệu quả bao gồm: catalase, peroxidase và superoxide dismutase nhằm loại bỏ nhanh chóng và hiệu quả các gốc ROS này [41, 50, 63].6) thuộc lớp oxidoreductase, có mặt trong hầu hết các sinh vật hiếu khí (bao gồm thực vật, động vật và vi sinh vật), có vai trò quan trọng chống lại các stress oxy hóa bằng cách xúc tác cho phản ứng phân giải H2O2 thành H2O và O2. Trong tế bào, catalase chủ yếu được sinh ra trong peroxisome của các sinh vật nhân thực và trong tế bào chất của sinh vật nhân sơ.

Đây là một trong những enzyme hoạt động nhanh nhất, một phân tử catalase có thể phân giải hàng triệu phân tử H2O2 trong mỗi giây [50, 55]. Catalase là một trong những enzyme có lịch sử phát hiện sớm và có nhiều nghiên cứu chi tiết về đặc điểm và tính chất của enzyme. Enzyme lần đầu tiên được phát hiện bởinhà bác học Thénarad(1818), được gọi tên lần đầu là catalase bởi nhà bác học Loew (1900) [29], được chứng minh trong trung tâm hoạt động có chứa sắt bởi Warburg (1923) và được xác định chức năng trong tế bào là tác nhân xúc tác phân giải H2O2 thành H2O và O2bởi Wieland và tập thể (1927) [65]. Năm 1937, hai nhà bác học Sumner và Dounce [56] lần đầu tiên đã kết tinh được catalase từ gan bò và xác định được khối lượng phân tử (KLPT) là 232 kDa; tiếp theo là những công bố về trình tự amino acid và cấu trúc không gian ba chiều của enzyme [35, 47, 65].

Cho đến nay, đặc điểm cấu trúc, cơ chế hoạt động và tính chất của enzyme đã được 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] làm sáng tỏ; hơn 300 công trình tinh sạch enzyme đã được công bố; catalase được xem là một trong những enzyme có nhiều đặc điểm hóa sinh hấp dẫn các nhà khoa học nghiên cứu và có tiềm năng ứng dụng vô cùng to lớn trong các ngành công nghiệp và lĩnh vực y dược [9, 24]. Cấu trúc và phân loại catalase Cấu trúc của catalase rất đa dạng và phụ thuộc vào nguồn phân lập, tuy nhiên nhìn chung có một số đặc điểm chung cơ bản. Một phân tử catalase hoạt động chức năng thường có cấu trúc dimer hoặc tetramer hoặc hexamer. Mỗi monomer là một chuỗi polypeptide có khoảng 500-700 amino acid và một nhóm heme có chứa nguyên tử Fe ở trung tâm, một số trường hợp Fe được thay bằng Mn hoặc NADPH với vai trò bảo vệ nhân heme khỏi sự oxi hóa [31].1: Cấutrúcnhânhemecủa catalase [69] Khác với cấu trúc nhân heme trong hồng cầu, nhóm heme trong catalase bao gồm một nguyên tử Fe ở trung tâm và được bao bọc phía ngoài bởi thành phần hữu cơ là nhóm protoporphyrin, cấu trúc được tạo ra bởi sự liên kết của các cầu metan hình thành nên một vòng tetrapyrrole.

Nguyên tử Fe sẽ tạo thành sáu liên kết phối trí với bốn nguyên tử N của vòng pyrol, một liên kết với phân tử H2O2 và một với amino acid tyrosine của protein [9]. Nhóm heme là vị trí xảy ra sự phân giải H2O2, nằm tách khỏi phần bề mặt và phía sâu trong phân tử catalase (Hình 1. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Về phân loại, có hơn 300 catalase đã được biết đến, chúng được tinh sạch từ các chủng khác nhau, có thể có nhân heme hoặc không có nhân heme. Dựa trên sự khác nhau về kích thước của các phần dưới đơn vị cấu tạo nên enzyme và có hay không có nhân heme chúng được chia ra làm ba loại khác nhau.

Nhóm một là các catalase đơn chức năng (monofunctional catalase) có chứa nhân heme, được tìm thấy nhiều nhất ở trong tự nhiên. Nhóm thứ hai là catalase hai chức năng (Bifunctional catalase-peroxydase), có chứa nhân heme, ít phổ biến hơn, có mối liên quan chặt chẽ đến các peroxidase ở thực vật về cấu trúc và trình tự amino acid. Cuối cùng là nhóm manganese catalase, không chứa nhân heme, tìm thấy ở các vi khuẩn có khả năng chịu các điều kiện khắc nghiệt của môi trường như nhiệt độ, nồng độ muối cao…[39]. Nhóm catalase đơn chức (monofunctional catalase): Đây là nhóm phổ biến nhất, có mặt ở hầu hết các đại diện của động vật, thực vật và vi sinh vật với số lượng hơn 225 catalase trong số hơn 300 catalase được phát hiện đến nay; có chức năng chính là phân giải H2O2và chức năng phụ là peroxy hóa [9].

Catalase thường có hoạt tính khi ở dạng tetramer, nhưng một số dạng như dimer, hexamer hay thậm chí dạng hiếm gặp như heteromer cũng được tìm thấy (Pseudomonas aeruginosa) [31].KLPT của catalase dao động khoảng từ 200-340 kDa với một nhóm heme ở vùng trung tâm hoạt động. Dựa trên kích thước của mỗi monomer, catalase được chia ra loại có monomer kích thước nhỏ (55-69 kDa) và loại có kích thước lớn (75- 84 kDa) [31, 38, 56, 65]. 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.2:Cấutrúc monomer của catalase hemeđơnchứcnăng [54] Bên cạnh đó, cũng có sự khác nhau ở loại nhân heme, nhân heme loại b hay tồn tại trong các catalase có monomer kích thước nhỏ (catalase từ gan bò) và nhân heme loại d hay tồn tại trong những catalase có monomer kích thước lớn (catalase của E.Cấu trúc bậc 4 của catalase có vùngbảo thủ bao gồm: đầu N-terminal với 70 amino acid đầu tiên, vùng gấp nếp β từ vị trí amino acid thứ 72-318, vùng domain kết nối hay còn gọi là vùng kết nốivà vùng xoắn α (vị trí 444-503). Một số catalase thuộc nhóm này cũng có vùng bảo thủ là đầu C-terminal dài khoảng 150 amino acid (Hình 1.

Theo nghiên cứu gần đây, catalase điển hình ở cả sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân thực đều có vùng β-barrel là vùng có tính bảo thủ cao nhất, vùng kết nối và α-helical vẫn có một số biến đổi [31, 54]. Nhóm hai chức năng (Bifunctional catalase- peroxydase) Nhóm catalase hai chức năng thường ít gặp, chỉ có chủ yếu ở các vi sinh vật hiếu khí, chưa được phát hiện ở những đại diện như thực vật và động vật. Catalase thuộc nhóm này có KLPT dao động trong khoảng 120-340 kDa. Nhóm enzyme này thể hiện cả hoạt tính catalase và hoạt tính peroxidase, thường rất nhạy cảm với nhiệt độ và pH phụ thuộc vào điều kiện phân lập.

Enzyme tồn tại chủ yếu ở dạng dimer có khoảng 750 amino acid trong mỗi monomer (Hình 1.3), ngoài ra dạng tetramer 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] cũng được tìm thấy ở E. Mỗi monomer được chia ra 2 vùng chủ yếu là vùng N và C được sắp xếp dọc theo chiều dài của phân tử, nhân heme nằm ở vùng N- terminal. Một đặc điểm bảo thủ ở hầu hết các catalase thuộc nhóm 2 là sự có mặt của một covalent adduct- cấu trúc mà vị trí ortho của tyrosine sẽ liên kết với methionine ở một bên và bên đối diện sẽ liên kết với tryptophan [54].3:Cấutrúcđơnphâncủa catalase-peroxidases từSynechococcus elongates PCC7942 [73] Nhóm pseudocatalase (Manganese catalase) Nhóm non-hemecatalase còn gọi là pseudocatalase,là nhóm catalase đặc biệt, có 2 nguyên tử Mn ở vùng trung tâm hoạt động thay cho Fe, thường được tìm thấy ở vi khuẩn và vi khuẩn cổ. Những enzyme này có KLPT trong khoảng 170-210 kDa (Hình 1.

Catalase thuộc nhóm này là một homohexamer, mỗi tiểu đơn vị có khối lượng khoảng 30 kDa.