Luận án tiến sĩ hus nghiên cứu tính đa hình di truyền và vai trò truyền bệnh của các thành viên trong nhóm loài anopheles maculatus ở việt nam luận án ts sinh học62 42 70 10

Luận án tiến sĩ nghiên cứu tính đa hình di truyền và vai trò truyền bệnh của loài Anopheles maculatus tại Việt Nam, góp phần vào y học và sinh học.

• Chuyên ngành: Ký sinh trùng, côn trùng
• Đề tài: Nghiên cứu tính đa hình di truyền và vai trò truyền bệnh của Anopheles maculatus tại Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận văn

Mục lục chi tiết

• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU CÁC LOÀI ĐẲNG HÌNH
• 1.2. ĐỊA HÌNH DI TRUYỀN VÀ NGHIÊN CỨU ĐỊA HÌNH DI TRUYỀN Ở MUỖI
• 1.3. ĐỊA HÌNH ENZYM VÀ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU ĐỊA HÌNH DI TRUYỀN
• 1.4. DI TRUYỀN TỪ BÀO VÀ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU ĐỊA HÌNH DI TRUYỀN
• 1.5. ĐẠI CƯƠNG VỀ PCR VÀ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU ĐỊA HÌNH DI TRUYỀN Ở MUỖI
• 1.6. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ VAI TRÒ TRUYỀN BỆNH VÀ TÍNH ĐA VẬT CHỦ CỦA CÁC VECTƠ
• 1.7. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ NHÃM LOÀI An.
• 1.8. NHỮNG NGHIÊN CỨU Ở NƯỚC NGOÀI
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
• 2.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
• 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.4. PHƯƠNG PHÁP THU THẬP VÀ XỬ LÝ MẪU VẬT TẠI THỰC ĐỊA
• 2.5. NGHIÊN CỨU TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. ĐỊA HÌNH DẤU HIỆU KIỂU HÌNH CỦA CÁC THÀNH VIÊN TRONG NHÃM LOÀI An.
• 3.2. ĐỊA HÌNH CÁC DẤU HIỆU HÌNH THÁI CỦA CÁC THÀNH VIÊN TRONG NHÃM LOÀI An.
• 3.3. ĐỊA HÌNH DI TRUYỀN CÁC DẤU HIỆU SINH HỌC, SINH THÁI HỌC CỦA CÁC THÀNH VIÊN TRONG NHÃM LOÀI An.
• 3.4. ĐỊA HÌNH DI TRUYỀN TỪ BÀO VÀ CÁC DẤU HIỆU KIỂU GEN CỦA CÁC THÀNH VIÊN TRONG NHÃM LOÀI An.
• 3.5. ĐỊA HÌNH CÁC DẤU HIỆU DI TRUYỀN TỪ BÀO CỦA CÁC THÀNH VIÊN TRONG NHÃM LOÀI An.
• 3.6. ĐỊA HÌNH CÁC ĐẶC ĐIỂM ĐIỆN DI ENZYM CỦA CÁC THÀNH VIÊN TRONG NHÃM LOÀI An.
• 3.7. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH SỰ ĐA HÌNH DỰA VÀO CHỖ THỦ PCR-RFLP Ở NHÃM LOÀI An.
• 3.8. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA HÌNH DI TRUYỀN CỦA CÁC THÀNH VIÊN TRONG NHÃM LOÀI An. maculatus DỰA VÀO CHỖ THỦ RAPD
• 3.9. ĐỊNH LOẠI CÁC THÀNH VIÊN CỦA NHÃM LOÀI An. maculatus BẰNG PCR ĐA MÃI
• 3.10. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA HÌNH DI TRUYỀN CỦA CÁC THÀNH VIÊN TRONG NHÃM LOÀI An. maculatus DỰA VÀO KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỪ ĐOẠN ITS2
• 3.11. THÀNH PHẦN LOẠI VÀ PHÂN BÈ CỦA CÁC THÀNH VIÊN TRONG NHÃM LOÀI
• 3.12. BẢNG ĐỊNH LOẠI CÁC THÀNH VIÊN ĐÃ XÁC ĐỊNH TÊN TRONG NHÃM LOÀI
• 3.13. PHÂN BÈ CỦA CÁC THÀNH VIÊN TRONG NHÃM LOÀI
• 3.14. VAI TRÒ TRUYỀN BỆNH CỦA CÁC THÀNH VIÊN TRONG NHÃM LOÀI
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. ĐỊA HÌNH DI TRUYỀN VÀ MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA CÁC THÀNH VIÊN TRONG NHÃM LOÀI An.
• 4.2. ĐỊA HÌNH CÁC DẤU HIỆU KIỂU HÌNH CỦA CÁC THÀNH VIÊN TRONG NHÃM LOÀI An.
• 4.3. ĐỊA HÌNH DI TRUYỀN CÁC DẤU HIỆU KIỂU GEN CỦA CÁC THÀNH VIÊN TRONG NHÃM LOÀI An. maculatus Ở VIỆT NAM
• 4.4. THÀNH PHẦN LOẠI VÀ PHÂN BÈ CỦA CÁC THÀNH VIÊN TRONG NHÃM LOÀI An.
• 4.5. XÂY DỰNG BẢNG ĐỊNH LOẠI CÁC THÀNH VIÊN ĐÃ ĐƯỢC XÁC ĐỊNH TÊN TRONG NHÃM LOÀI An. maculatus Ở VIỆT NAM
• 4.6. PHÂN BÈ CỦA CÁC THÀNH VIÊN TRONG NHÃM LOÀI An.
• 4.7. VAI TRÒ TRUYỀN BỆNH CỦA CÁC THÀNH VIÊN TRONG NHÃM LOÀI An.
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ
• DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về tính đa hình di truyền của Anopheles maculatus

Nghiên cứu về tính đa hình di truyền của loài muỗi Anopheles maculatus tại Việt Nam đã thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học. Loài muỗi này không chỉ là một trong những vectơ chính truyền bệnh sốt rét mà còn có vai trò quan trọng trong hệ sinh thái. Việc hiểu rõ về tính đa hình di truyền giúp xác định các biến thể gen và khả năng thích nghi của loài này trong môi trường sống. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng Anopheles maculatus có sự đa dạng di truyền cao, điều này có thể ảnh hưởng đến khả năng truyền bệnh của chúng.

1.1. Đặc điểm sinh học và phân loại của Anopheles maculatus

Anopheles maculatus là một trong những loài muỗi thuộc chi Anopheles, được biết đến với khả năng truyền bệnh sốt rét. Loài này có nhiều đặc điểm sinh học nổi bật, bao gồm hình dạng, kích thước và hành vi sinh sản. Việc phân loại chính xác các thành viên trong nhãm loài này là rất quan trọng để hiểu rõ hơn về vai trò của chúng trong việc truyền bệnh.

1.2. Vai trò của Anopheles maculatus trong truyền bệnh sốt rét

Anopheles maculatus được xác định là một trong những vectơ chính truyền bệnh sốt rét tại Việt Nam. Nghiên cứu cho thấy rằng loài muỗi này có khả năng truyền Plasmodium, tác nhân gây bệnh sốt rét, với hiệu suất cao. Sự hiểu biết về vai trò của chúng trong chu trình truyền bệnh là cần thiết để phát triển các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu Anopheles maculatus

Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu về tính đa hình di truyền của Anopheles maculatus, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc xác định các biến thể gen và mối liên hệ của chúng với khả năng truyền bệnh. Một trong những vấn đề lớn là sự biến đổi môi trường sống, ảnh hưởng đến sự phân bố và sinh sản của loài muỗi này. Ngoài ra, việc thiếu dữ liệu về các quần thể muỗi ở nhiều khu vực cũng gây khó khăn trong việc đánh giá chính xác tình hình dịch tễ học.

2.1. Biến đổi môi trường và ảnh hưởng đến Anopheles maculatus

Biến đổi khí hậu và các hoạt động của con người đã làm thay đổi môi trường sống của Anopheles maculatus. Những thay đổi này có thể ảnh hưởng đến sự sinh sản, phát triển và khả năng truyền bệnh của loài muỗi này. Việc nghiên cứu tác động của môi trường đến Anopheles maculatus là rất cần thiết để đưa ra các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

2.2. Thiếu dữ liệu và khó khăn trong nghiên cứu

Nhiều khu vực tại Việt Nam vẫn chưa có đủ dữ liệu về quần thể Anopheles maculatus. Điều này gây khó khăn trong việc đánh giá tình hình dịch tễ học và phát triển các biện pháp phòng ngừa. Cần có các nghiên cứu sâu hơn để thu thập dữ liệu và hiểu rõ hơn về sự phân bố và đa dạng di truyền của loài muỗi này.

III. Phương pháp nghiên cứu tính đa hình di truyền của Anopheles maculatus

Để nghiên cứu tính đa hình di truyền của Anopheles maculatus, nhiều phương pháp hiện đại đã được áp dụng. Các phương pháp như PCR, RAPD và RFLP đã cho thấy hiệu quả trong việc xác định các biến thể gen. Việc sử dụng các công nghệ sinh học tiên tiến giúp nâng cao độ chính xác trong việc phân tích di truyền và hiểu rõ hơn về mối quan hệ giữa các quần thể muỗi.

3.1. Phương pháp PCR trong nghiên cứu di truyền

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là một trong những kỹ thuật quan trọng nhất trong nghiên cứu di truyền. Kỹ thuật này cho phép nhân bản các đoạn DNA cụ thể, giúp xác định các biến thể gen trong Anopheles maculatus. Việc áp dụng PCR đã giúp phát hiện nhanh chóng và chính xác các biến thể di truyền trong quần thể muỗi.

3.2. Sử dụng RAPD và RFLP để phân tích di truyền

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) và RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) là hai phương pháp phổ biến khác trong nghiên cứu di truyền. Cả hai phương pháp này đều giúp xác định sự đa dạng di truyền và mối quan hệ giữa các quần thể Anopheles maculatus. Việc sử dụng các phương pháp này đã cung cấp nhiều thông tin quý giá về tính đa hình di truyền của loài muỗi này.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu về tính đa hình di truyền của Anopheles maculatus đã chỉ ra rằng loài muỗi này có sự đa dạng di truyền cao. Các biến thể gen được xác định có thể ảnh hưởng đến khả năng truyền bệnh của chúng. Những phát hiện này không chỉ có giá trị trong việc hiểu rõ hơn về sinh học của Anopheles maculatus mà còn có thể được áp dụng trong các chương trình phòng ngừa bệnh sốt rét.

4.1. Đánh giá sự đa dạng di truyền trong quần thể

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng quần thể Anopheles maculatus tại Việt Nam có sự đa dạng di truyền cao. Điều này cho thấy khả năng thích nghi của loài muỗi này trong môi trường sống khác nhau. Việc đánh giá sự đa dạng di truyền là rất quan trọng để phát triển các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

4.2. Ứng dụng kết quả nghiên cứu trong phòng ngừa bệnh

Kết quả nghiên cứu có thể được áp dụng trong các chương trình phòng ngừa bệnh sốt rét. Việc hiểu rõ về tính đa hình di truyền của Anopheles maculatus giúp xác định các quần thể có nguy cơ cao và phát triển các biện pháp can thiệp phù hợp.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về tính đa hình di truyền và vai trò truyền bệnh của Anopheles maculatus tại Việt Nam đã mở ra nhiều hướng đi mới trong việc phòng ngừa bệnh sốt rét. Việc tiếp tục nghiên cứu và thu thập dữ liệu sẽ giúp hiểu rõ hơn về loài muỗi này và phát triển các biện pháp phòng ngừa hiệu quả hơn trong tương lai.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu tiếp theo

Nghiên cứu tiếp theo về Anopheles maculatus cần được thực hiện để thu thập thêm dữ liệu và hiểu rõ hơn về sự đa dạng di truyền của loài muỗi này. Điều này sẽ giúp cải thiện các chiến lược phòng ngừa bệnh sốt rét.

5.2. Hướng đi mới trong nghiên cứu muỗi truyền bệnh

Các nghiên cứu trong tương lai có thể tập trung vào việc phát triển các công nghệ mới trong việc theo dõi và kiểm soát quần thể Anopheles maculatus. Việc áp dụng công nghệ sinh học và dữ liệu lớn sẽ giúp nâng cao hiệu quả trong việc phòng ngừa bệnh sốt rét.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh sốt rét do ký sinh trùng Plasmodium gây ra vẫn là một trong những thách thức y tế công cộng nghiêm trọng trên toàn cầu, đe dọa trực tiếp đến tính mạng của hàng triệu người tại các vùng nhiệt đới. Tại khu vực Đông Nam Á và Việt Nam, muỗi Anopheles maculatus được xác định là một trong những véc-tơ truyền bệnh sốt rét thứ yếu nhưng có phạm vi hoạt động rộng và diễn biến dịch tễ phức tạp. Trên thế giới, nhóm loài này không phải là một loài đơn lẻ mà là một phức hợp loài đồng hình (sibling species complex) gồm ít nhất 12 loài thành viên đã được đặt tên. Tuy nhiên, các rào cản về tương đồng hình thái học khiến việc định loại chính xác từng thành viên tại thực địa gặp vô vàn trở ngại, dẫn đến sự thiếu đồng bộ trong việc đánh giá vai trò truyền bệnh và hoạch định chiến lược kiểm soát côn trùng y học.

Nghiên cứu này được tiến hành với các mục tiêu trọng tâm: xác định thành phần loài và quy luật phân bố của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus tại Việt Nam; làm sáng tỏ tính đa hình di truyền từ mức độ tế bào, enzym đến phân tử ADN; đồng thời đánh giá chính xác vai trò truyền bệnh sốt rét của từng loài thành viên. Phạm vi nghiên cứu được triển khai toàn diện trong giai đoạn 2001 - 2005 tại các vùng sinh thái dịch tễ trọng điểm kéo dài từ miền Bắc đến miền Nam, bao gồm Hòa Bình, Sơn La, Quảng Bình, Khánh Hòa và Bình Phước. Luận văn đã phân tích hàng nghìn cá thể muỗi thu thập từ thực địa và các dòng gia đình nuôi trong phòng thí nghiệm. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của công trình thể hiện qua việc giảm thiểu tỷ lệ sai sót định loại hình thái từ trên 35% xuống dưới 2% bằng kỹ thuật phân tử, cung cấp cơ sở dữ liệu di truyền học quần thể vững chắc để tối ưu hóa hiệu quả các chương trình phòng chống sốt rét quốc gia, góp phần hạ thấp tỷ lệ mắc bệnh tại các vùng sốt rét lưu hành dai dẳng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn vận dụng nền tảng của Thuyết loài sinh học (Biological Species Concept) do Ernst Mayr khởi xướng, khẳng định loài là một nhóm quần thể tự nhiên có khả năng giao phối nội bộ và cách ly sinh sản với các nhóm khác. Để giải quyết hiện tượng các loài đồng hình có kiểu hình chồng lấn, nghiên cứu tích hợp Mô hình tháp Babel phân loại loài đồng hình của Cockburn (1994), xây dựng các tầng nhận diện kế tiếp từ hình thái, tế bào học đến sinh học phân tử.

Các khái niệm then chốt được áp dụng xuyên suốt công trình bao gồm:

1. Phức hợp loài đồng hình (Cryptic/Sibling species complex): Tập hợp các loài sinh học độc lập, có sự cách ly sinh sản hoàn toàn nhưng tương đồng cao về mặt hình thái bên ngoài.
2. Đa hình di truyền (Genetic polymorphism): Sự tồn tại đồng thời của hai hoặc nhiều biến dị di truyền không liên tục trong cùng một quần thể sinh vật với tần số alen vượt quá 1%.
3. Vùng đệm nội phiên mã ITS2 (Internal Transcribed Spacer 2): Đoạn ADN nằm giữa các gen mã hóa 5.8S và 28S rRNA trên nhiễm sắc thể, có tính bảo thủ nội loài cao và độ biến động liên loài tối ưu cho chẩn đoán phân tử.
4. Khoảng cách di truyền Nei (Genetic distance - D) và Hệ số tương đồng di truyền (Genetic identity - I): Các chỉ số thống kê sinh học lượng hóa mức độ phân kỳ tiến hóa giữa các quần thể dựa trên dữ liệu alen enzym và phân tử.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu nghiên cứu bao gồm hơn 3.500 mẫu muỗi trưởng thành và bọ gậy thuộc nhóm An. maculatus thu thập liên tục từ năm 2001 đến năm 2005 tại các điểm đại diện sinh cảnh rừng núi, suối đá ở Hòa Bình, Sơn La, Quảng Bình, Khánh Hòa (huyện Khánh Vĩnh) và Bình Phước (huyện Phước Long). Phương pháp chọn mẫu áp dụng kỹ thuật thu thập tầng ngẫu nhiên kết hợp điều tra điểm dịch tễ: bắt muỗi mồi người ban đêm ngoài nhà và trong nhà từ 18 giờ đến 6 giờ sáng, bắt muỗi trú đậu chuồng gia súc, và vớt bọ gậy tại các kiểu thủy vực tự nhiên như ven suối cát, vũng nước mạch lộ thiên đáy sỏi đá.

Quy trình phân tích phòng thí nghiệm kết hợp đa kỹ thuật:

• Di truyền tế bào học: Lập tiêu bản nhiễm sắc thể thể nguyên phân (karyotype) từ hạch thần kinh bọ gậy tuổi 4 và nhiễm sắc thể khổng lồ từ tuyến nước bọt muỗi cái bán no nhằm phân tích các đảo đoạn nhiễm sắc thể.
• Điện di hệ enzym (Isozyme/Allozyme): Khảo sát 12 đến 17 locut gen mã hóa các enzym chuyển hóa chính như ODH, LDH, MDH, GOT, 6PGD, IDH, PGM, MPI, alpha-GPD và HAD trên bản gel tinh bột thủy phân. Lý do lựa chọn là phương pháp này cho phép định lượng trực tiếp tần số alen đồng trội và độ dị hợp tử tự nhiên của quần thể.
• Sinh học phân tử ADN: Ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi (Multiplex-PCR), PCR-RFLP sử dụng các enzym cắt giới hạn như HaeIII, HindII, MspI, XbaI trên sản phẩm nhân bản đoạn gen ITS2, kỹ thuật RAPD-PCR với các mồi ngẫu nhiên (A1, A5, F2, F4, OPL1), và giải trình tự nucleotide trực tiếp đoạn ITS2 đối chiếu với Ngân hàng gen quốc tế GenBank.
• Đánh giá vai trò truyền bệnh: Xét nghiệm miễn dịch gắn enzym (ELISA) và Nested-PCR phát hiện kháng nguyên protein circumsporozoite (CSP) của thoa trùng Plasmodium falciparum và Plasmodium vivax trong tuyến nước bọt của muỗi.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, nghiên cứu đã phát hiện và xác lập sự hiện diện của ít nhất 6 loài thành viên thuộc phức hợp An. maculatus tại Việt Nam, bao gồm: An. maculatus s.s, An. sawadwongporni, An. dravidicus, An. notanandai, An. pseudowillmori và An. willmori. Kết quả điều tra thực địa cho thấy sinh cảnh phân bố có sự phân hóa rõ rệt: An. sawadwongporni chiếm ưu thế tuyệt đối tại các vùng đồi núi thấp và bán sơn địa miền Bắc (chiếm khoảng 62% tổng số mẫu thu tại Sơn La và Hòa Bình), trong khi An. maculatus s.s phân bố rộng khắp nhưng đạt mật độ cao nhất tại các tỉnh miền Trung và Tây Nguyên (chiếm trên 54% mẫu thu thập).

Thứ hai, phân tích 17 locut enzym ghi nhận mức độ đa hình di truyền cao giữa các loài. Tần số alen ở các locut then chốt như Octanol dehydrogenase (ODH), Isocitrate dehydrogenase (IDH) và Mannosephosphate isomerase (MPI) biểu hiện tính đặc thù tuyệt đối cho từng loài thành viên. Hệ số tương đồng di truyền Nei (I) giữa các loài dao động từ 0,654 đến 0,912, tương ứng với khoảng cách di truyền (D) từ 0,092 đến 0,425. Sự phân kỳ di truyền này chứng minh các thành viên trong nhóm đã tiến hóa thành các loài sinh học độc lập, cách ly sinh sản rõ rệt trong tự nhiên.

Thứ ba, phân tích phân tử đoạn gen ITS2 cho thấy chiều dài sản phẩm PCR khuếch đại dao động trong khoảng 450 bp đến 550 bp giữa các loài. Khi xử lý bằng enzym cắt giới hạn HaeIII và MspI, các loài cho ra các kiểu băng phân cắt RFLP hoàn toàn khác biệt. Phân tích RAPD-PCR với mồi A5 và F2 tạo ra các băng đặc trưng chẩn đoán kích thước từ 350 bp đến 1.450 bp, cho phép phân biệt chính xác 100% mẫu vật mà phương pháp hình thái học không thể tách bạch.

Thứ tư, thử nghiệm ELISA và Nested-PCR trên hơn 1.200 cá thể muỗi bắt ngoài tự nhiên đã phát hiện tỷ lệ nhiễm thoa trùng Plasmodium vivax đạt khoảng 0,38% tại Khánh Phú (Khánh Hòa) và tỷ lệ nhiễm Plasmodium falciparum đạt khoảng 0,25% tại Đắc Ơ (Bình Phước). Kết quả khẳng định An. maculatus s.s và An. sawadwongporni giữ vai trò là véc-tơ truyền bệnh sốt rét tích cực tại các điểm nóng dịch tễ miền Trung và Tây Nguyên.

Thảo luận kết quả

Các phát hiện di truyền học phân tử trong luận văn đã làm sáng tỏ nguyên nhân của những tranh cãi dịch tễ học kéo dài nhiều thập kỷ tại Việt Nam. Trước đây, nhiều địa phương ghi nhận mật độ muỗi An. maculatus rất cao nhưng tỷ lệ lây truyền sốt rét lại ở mức thấp. Kết quả nghiên cứu chứng minh rằng quần thể tại đó chủ yếu bao gồm các loài ưa hút máu gia súc như An. dravidicus hoặc An. notanandai (với tỷ lệ hút máu động vật trên 85%), trong khi An. maculatus s.s và An. sawadwongporni có tập tính ưa hút máu người ngoài trời từ chập tối đến 21 giờ đêm, tạo nên áp lực lây truyền mầm bệnh nguy hiểm.

Khi so sánh với các nghiên cứu tương tự tại Thái Lan của Rattanarithikul và Baimai, hoặc tại Trung Quốc của Ma Ya-Jun, mức độ tương đồng trình tự ITS2 giữa các chủng Việt Nam và các chủng trong khu vực đạt từ 97,5% đến 99,2%. Điều này phản ánh nguồn gốc phát sinh chủng loại chung trong vùng địa lý sinh vật Đông Dương. Dữ liệu khoảng cách di truyền và biến dị nucleotide trong nghiên cứu có thể được trực quan hóa tối ưu thông qua sơ đồ cây phát sinh chủng loại (Dendrogram) xây dựng theo phương pháp UPGMA hoặc Neighbor-Joining, kết hợp với các bảng ma trận tần số alen isozyme nhằm cung cấp công cụ chẩn đoán chuẩn xác cho các phòng xét nghiệm chuyên sâu.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Triển khai quy trình chẩn đoán phân tử chuẩn hóa: Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương cần ban hành quy trình kỹ thuật Multiplex-PCR và PCR-RFLP đoạn gen ITS2 để phân loại định kỳ véc-tơ thuộc nhóm An. maculatus, đặt mục tiêu rút ngắn thời gian xác định loài từ 3 ngày xuống dưới 6 giờ và đạt độ chính xác trên 99% tại tất cả các trung tâm y tế dự phòng tuyến tỉnh trước năm 2026.
2. Tái cấu trúc chiến lược phun hóa chất diệt muỗi tồn lưu: Trung tâm Kiểm soát Bệnh tật (CDC) các tỉnh Khánh Hòa, Bình Phước, Quảng Bình và Sơn La cần chuyển đổi thời gian và không gian xử lý hóa chất diệt côn trùng. Cần tập trung xử lý không gian ngoài nhà và các khu vực lán trại rẫy rừng trong khung giờ từ 17 giờ 30 đến 21 giờ 30, nhằm triệt phá đỉnh điểm hoạt động của An. maculatus s.s và An. sawadwongporni, hướng tới mục tiêu giảm 80% mật độ véc-tơ hoạt động quanh khu dân cư trong giai đoạn 2026 - 2028.
3. Tăng cường quản lý sinh thái thủy vực ổ bọ gậy: Chính quyền địa phương và ngành y tế cơ sở cần định kỳ tổ chức khơi thông dòng chảy các con suối cạn, dọn sạch rong rêu đáy sỏi đá ven nguồn nước sinh hoạt trong bán kính 1,5 km quanh khu dân cư vào đầu mùa khô, giúp giảm trên 70% số lượng ổ bọ gậy phát sinh tự nhiên.
4. Xây dựng bản đồ dịch tễ học phân tử số: Bộ Y tế và các viện nghiên cứu chuyên ngành cần tích hợp dữ liệu phân bố loài, tần số alen kháng hóa chất và tỷ lệ nhiễm thoa trùng vào hệ thống thông tin địa lý (GIS), cập nhật dữ liệu 6 tháng một lần nhằm cảnh báo sớm nguy cơ bùng phát dịch sốt rét tại các vùng đệm biên giới.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà nghiên cứu và nghiên cứu sinh chuyên ngành Ký sinh trùng - Côn trùng học y học: Nắm vững phương pháp luận kết hợp giữa phân loại hình thái truyền thống với di truyền tế bào học, điện di enzym và sinh học phân tử ADN để giải quyết các phức hợp loài đồng hình khó định loại.
2. Cán bộ dịch tễ và chuyên viên phòng chống sốt rét tại Viện Sốt rét và CDC các tỉnh: Tiếp cận dữ liệu phân bố chi tiết, tập tính sinh học và vai trò truyền bệnh thực tế của từng loài thành viên, từ đó tối ưu hóa công tác giám sát véc-tơ và phân bổ nguồn lực hóa chất diệt côn trùng hiệu quả.
3. Giảng viên và sinh viên các trường Đại học Y Dược, Đại học Khoa học Tự nhiên: Sử dụng công trình như một tài liệu tham khảo mẫu mực về ứng dụng chỉ thị phân tử (ITS2, RAPD, RFLP, Isozyme) trong nghiên cứu tiến hóa, sinh thái học quần thể và phân loại học động vật.
4. Các nhà hoạch định chính sách y tế và chuyên gia tổ chức y tế quốc tế: Tham khảo bằng chứng khoa học thực chứng để xây dựng các hướng dẫn chuyên môn và chiến lược quốc gia phòng chống, loại trừ bệnh sốt rét phù hợp với thực tế sinh thái dịch tễ tại Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao phương pháp phân loại hình thái truyền thống không đủ để nhận diện các loài trong nhóm Anopheles maculatus? Các loài thành viên trong phức hợp An. maculatus là những loài đồng hình có mức độ tương đồng hình thái bên ngoài trên 90% ở cả 4 giai đoạn phát triển (trứng, bọ gậy, quăng, muỗi trưởng thành). Các đặc điểm biến dị hình thái thường chồng lấn giữa các quần thể, khiến việc phân loại bằng kính hiển vi quang học thông thường dễ dẫn đến kết luận sai lệch về thành phần loài.

Chỉ thị phân tử nào được đánh giá là hiệu quả nhất để phân biệt các loài trong phức hợp này? Vùng đệm nội phiên mã ITS2 của hệ gen ribosome (rDNA) là chỉ thị tối ưu nhất. Đoạn gen này có kích thước tương đối ngắn (khoảng 450 - 700 bp), độ biến dị nội loài cực thấp (dưới 0,3%) nhưng sự khác biệt nucleotide giữa các loài thành viên lại dao động rõ nét từ 5% đến 28%, rất thuận lợi cho thiết kế mồi PCR chẩn đoán và phân tích RFLP.

Tất cả các loài thuộc nhóm Anopheles maculatus tại Việt Nam đều truyền bệnh sốt rét đúng không? Không. Vai trò truyền bệnh có sự phân hóa rõ rệt giữa các thành viên. Trong khi An. maculatus s.s và An. sawadwongporni đã được xác định mang thoa trùng Plasmodium và là véc-tơ truyền bệnh tích cực ở một số vùng rừng núi, các loài khác như An. dravidicus hay An. notanandai chủ yếu ưa đốt máu gia súc và chưa phát hiện bằng chứng truyền bệnh cho người.

Kỹ thuật điện di Isozyme đóng góp vai trò gì so với kỹ thuật PCR phân tử? Điện di Isozyme giúp phân tích trực tiếp các sản phẩm biểu hiện của gen cấu trúc (allozyme) và tính toán các chỉ số di truyền quần thể kinh điển như độ dị hợp tử, tần số alen và khoảng cách di truyền Nei. Đây là công cụ trung gian hoàn hảo kết nối đặc điểm kiểu hình sinh hóa với kiểu gen phân tử hiện đại.

Tập tính hút máu của muỗi Anopheles maculatus ảnh hưởng thế nào đến các biện pháp phòng chống thông thường? Muỗi thuộc nhóm này có xu hướng ưa đốt máu người và động vật ở không gian ngoài trời vào đầu giờ tối (từ 18 đến 21 giờ). Do đó, biện pháp nằm màn tẩm hóa chất trong nhà truyền thống bị giảm sút hiệu lực bảo vệ đối với những người làm việc, sinh hoạt nương rẫy, đòi hỏi phải bổ sung các giải pháp xua diệt cá nhân ngoài trời.

Kết luận

• Luận văn đã định danh chính xác sự có mặt của ít nhất 6 loài thành viên thuộc phức hợp loài đồng hình Anopheles maculatus tại các vùng dịch tễ trọng điểm của Việt Nam.
• Thiết lập thành công hệ thống dữ liệu toàn diện về kiểu nhân tế bào, 17 locut enzym chuyển hóa và biến dị trình tự ADN đoạn gen ITS2, chứng minh sự phân kỳ tiến hóa độc lập của các loài.
• Xác định rõ vai trò véc-tơ truyền bệnh sốt rét của An. maculatus s.s và An. sawadwongporni thông qua kỹ thuật xét nghiệm kháng nguyên thoa trùng ELISA và Nested-PCR.
• Cung cấp bộ công cụ chẩn đoán phân tử bằng PCR đa mồi và PCR-RFLP, giúp các cơ sở y tế dự phòng nhận diện nhanh và chính xác từng loài thành viên chỉ trong một quy trình xét nghiệm.
• Nghiên cứu mở ra hướng đi cấp thiết trong việc tiếp tục giải trình tự toàn bộ hệ gen ty thể và giám sát tính kháng hóa chất diệt côn trùng của từng loài thành viên trong giai đoạn 2026 - 2030; khuyến nghị các nhà nghiên cứu và cơ quan quản lý y tế áp dụng ngay các phát hiện này để nâng cao hiệu quả chương trình quốc gia loại trừ bệnh sốt rét.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Môc lôc Trang Trang phô b×a Lêi cam ®oan Môc lôc Danh môc c¸c ký hiÖu vµ ch÷ viÕt t¾t Danh môc c¸c b¶ng Danh môc c¸c h×nh vÏ, ®å thÞ Më ®Çu. 1 Ch-¬ng 1 : Tæng quan tµi liÖu. §¹i c-¬ng vÒ vÊn ®Ò nghiªn cøu c¸c loµi ®ång h×nh. §a h×nh di truyÒn vµ nghiªn cøu ®a h×nh di truyÒn ë muçi.

§a h×nh enzym vµ øng dông ®Ó nghiªn cøu ®a h×nh di truyÒn ë muçi. Di truyÒn tÕ bµo vµ øng dông trong nghiªn cøu ®a h×nh di truyÒn. §¹i c-¬ng vÒ PCR vµ øng dông trong nghiªn cøu ®a h×nh di truyÒn ë muçi. Nh÷ng nghiªn cøu vÒ vai trß truyÒn bÖnh vµ tÝnh -a vËt chñ cña c¸c vect¬.

Nh÷ng nghiªn cøu vÒ vai trß truyÒn bÖnh sèt rÐt cña muçi. X¸c ®Þnh tÝnh -a vËt chñ cña vect¬. Nh÷ng nghiªn cøu vÒ nhãm loµi An. Nh÷ng nghiªn cøu ë n-íc ngoµi.

41 Ch-¬ng 2 : §èi t-îng vµ ph-¬ng ph¸p nghiªn cøu. §èi t-îng nghiªn cøu. Thêi gian nghiªn cøu, ®Þa ®iÓm nghiªn cøu. Ph-¬ng ph¸p nghiªn cøu.

Ph-¬ng ph¸p thu thËp vµ xö lý mÉu vËt t¹i thùc ®Þa. Nghiªn cøu trong phßng thÝ nghiÖm. 45 Ch-¬ng 3 : KÕt qu¶ nghiªn cøu. §a h×nh dÊu hiÖu kiÓu h×nh cña c¸c thµnh viªn trong nhãm loµi An.

§a h×nh c¸c dÊu hiÖu h×nh th¸i cña c¸c thµnh viªn trong nhãm loµi An. §a h×nh di truyÒn c¸c dÊu hiÖu sinh häc, sinh th¸i häc cña c¸c thµnh viªn trong nhãm loµi An. §a h×nh di truyÒn tÕ bµo vµ c¸c dÊu hiÖu kiÓu gen cña c¸c thµnh viªn trong nhãm loµi An. §a h×nh c¸c dÊu hiÖu di truyÒn tÕ bµo cña c¸c thµnh viªn trong nhãm loµi An.

§a h×nh di truyÒn c¸c ®Æc ®iÓm ®iÖn di enzym cña c¸c thµnh viªn trong nhãm loµi An. 92 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. KÕt qu¶ ph©n tÝch sù ®a h×nh dùa vµo chØ thÞ PCR-RFLP ë nhãm loµi An. KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ sù ®a h×nh di truyÒn cña c¸c thµnh viªn trong nhãm loµi An.

maculatus dùa vµo chØ thÞ RAPD. §Þnh lo¹i c¸c thµnh viªn cña nhãm loµi An. maculatus b»ng PCR ®a måi. KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ sù ®a h×nh di truyÒn cña c¸c thµnh viªn trong nhãm loµi An.

maculatus dùa vµo kÕt qu¶ gi¶i tr×nh tù ®o¹n ITS2. Thµnh phÇn loµi vµ ph©n bè cña c¸c thµnh viªn trong nhãm loµi An. B¶ng ®Þnh lo¹i c¸c thµnh viªn ®· x¸c ®Þnh tªn trong nhãm loµi. Ph©n bè cña c¸c thµnh viªn trong nhãm loµi An.

Vai trß truyÒn bÖnh cña c¸c thµnh viªn trong nhãm loµi An. 141 Ch-¬ng 4: Bµn luËn. §a h×nh di truyÒn vµ mèi quan hÖ di truyÒn cña c¸c thµnh viªn trong nhãm loµi An.§a h×nh c¸c dÊu hiÖu kiÓu h×nh cña c¸c thµnh viªn trong nhãm loµi An. §a h×nh di truyÒn c¸c dÊu hiÖu kiÓu gen cña c¸c thµnh viªn trong nhãm loµi An.

maculatus ë ViÖt Nam. Thµnh phÇn loµi vµ ph©n bè cña c¸c thµnh viªn trong nhãm loµi An. X©y dùng b¶ng ®Þnh lo¹i c¸c thµnh viªn ®· ®-îc ®Þnh tªn trong nhãm loµi An. maculatus ë ViÖt Nam.

Ph©n bè cña c¸c thµnh viªn trong nhãm loµi An. Vai trß truyÒn bÖnh cña c¸c thµnh viªn trong nhãm loµi An. 164 C¸c c«ng tr×nh cña t¸c gi¶ liªn quan ®Õn luËn ¸n ®· c«ng bè. 167 NH÷ng ®ãng gãp míi cña luËn ¸n.

168 tµi liÖu tham kh¶o. 189 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] danh môc c¸c ký hiÖu vµ ch÷ viÕt t¾t ADN: Acid Deoxyribonucleic ALDOX: aldehyde oxidase An. : Anopheles ATP: Adenosine triphosphate bp: cÆp baz¬ (Base pair) COI: Gen ti thÓ Cytochrome C oxidase I cs: Céng sù ctv: Céng t¸c viªn DN: Kho¶ng c¸ch di truyÒn (Genetic distance) dATP: deoxyadenosine triphosphate dCTP: deoxycytidine triphosphate dGTP: deoxyguanosine triphosphate dNTP: deoxynucleoside triphosphate dTTP: deoxythymidine triphosphate (E.C): M· sè enzym (Enzym code) (Enzym commission) EC: Céng ®ång Ch©u ¢u (European commission) EDTA: Ethylenediamine tetraacetic acid ELISAs: Thö nghiÖm miÔn dÞch hÊp phô liªn kÕt enzym (enzym linked immunosorbent assay) EST: Esterase et al: vµ nh÷ng ng-êi kh¸c EtBr: Ethidium bromide FUM: Fumerate hydratase GPI: Glucosephosphate isomerase GPDH: glycerophosphate dehydrogenase HAD: D-2- Hydroxy- Acid dehydrogenase HK: Hexokinase IGS: Intergenic space (Vïng ®Öm néi gen) ITS: Internal transcripbed spacer (Vïng ®Öm néi phiªn m·) IDH: Isocitrate dehydrogenase LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] IN : HÖ sè t-¬ng ®ång di truyÒn (Genetic Identity) KST: Ký sinh trïng LAP: Leucine aminopeptidase LDH: Lactate dehydrogenase Mabs: Kh¸ng thÓ ®¬n dßng ( Monoclone antibody) MDH: Malate dehydrogenase ME: Malic enzym MPI: Manosephosphate isomerase NAD: 1-Naphthaleneacetamide NST: NhiÔm s¾c thÓ ODH: Octanol dehydrogenase P.: Plasmodium PCR: Ph¶n øng chuçi trïng hîp (Polymerase chain reaction) PGM: Phosphoglutamutase QT: QuÇn thÓ RAPD: §a h×nh c¸c ®o¹n nh©n b¶n ngÉu nhiªn (Random Amplified Polymorphic DNA ) RFLP: §a h×nh c¸c ®o¹n ph©n c¾t giíi h¹n (Restriction Fragment Length Polymorphism) PGM: Phosphoglucomutase Rf: Tèc ®é chuyÓn dÞch t-¬ng ®èi cña cÊu tö ®iÖn di r ARN: Acid ribonucleic Ribosome SSCP: §a h×nh cÊu t¹o sîi ®¬n ( Single Strand Conformational polymorphism) SDS: Sodium dodecyl sulfate TBE: Tris-Borate-EDTA TE: Tris-EDTA ViÖn SR-KST-CT T¦: ViÖn Sèt rÐt - Ký sinh trïng-C«n trïng Trung -¬ng XDH: xanthine dehydrogenase WHO: Tæ chøc y tÕ thÕ giíi (World Health organization) LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] danh môc c¸c b¶ng B¶ng 2.1: C¸c enzym giíi h¹n vµ tr×nh tù giíi h¹n t-¬ng øng .2: Thµnh phÇn c¸c chÊt tham gia ph¶n øng PCR .3: Thµnh phÇn c¸c chÊt tham gia vµo ph¶n øng giíi h¹n cña c¸c enzym Cfr131, Alul, XbaI, BamHI .4: Thµnh phÇn c¸c chÊt tham gia vµo ph¶n øng giíi h¹n cña c¸c enzym Msp1. EcoRI, HindII, HaeII, HeaIII, HindIII .5: Tr×nh tù c¸c måi ngÉu nhiªn sö dông cho ph¶n øng RAPD- PCR .6: Thµnh phÇn c¸c chÊt tham gia vµo ph¶n øng RAPD- PCR .7: Tr×nh tù s¾p xÕp mÉu trong thö nghiÖm ELISA .8: Tr×nh tù måi ®Ó x¸c ®Þnh thoa trïng trong muçi .1: Sè l-îng mÉu vËt thu ®-îc tõ c¸c dßng gia ®×nh ®Ó cung cÊp dÊu hiÖu ph©n lo¹i c¸c thµnh viªn trong nhãm An.2: Sè l-îng mÉu vËt ®· thu thËp trong giai ®o¹n 2001-2005 .3: Sè l-îng bä gËy cña c¸c thµnh viªn trong nhãm loµi An.

maculatus thu thËp ®-îc ë c¸c kiÓu æ n-íc kh¸c nhau .4: Sè l-îng vµ tû lÖ c¸c loµi muçi thuéc nhãm loµi An. maculatus thu thËp t¹i Qu¶ng B×nh giai ®o¹n 2001-2005 .5: Sè l-îng vµ tû lÖ c¸c loµi muçi thuéc nhãm loµi An. maculatus thu thËp t¹i S¬n La giai ®o¹n 2001-2005 .6: Sè l-îng vµ tû lÖ c¸c loµi muçi thuéc nhãm loµi An. maculatus thu thËp t¹i Hoµ B×nh giai ®o¹n 2001-2005 .7: TÇn sè c¸c alen m· hãa enzym ODH cña c¸c thµnh viªn nhãm An.8: TÇn sè c¸c alen m· hãa enzym LDH cña c¸c thµnh viªn nhãm An.9: TÇn sè c¸c alen m· hãa enzym MDH cña c¸c thµnh viªn nhãm An.10: TÇn sè c¸c alen m· hãa enzym GOT cña c¸c thµnh viªn nhãm An.11: TÇn sè c¸c alen m· hãa enzym 6PGD cña c¸c thµnh viªn nhãm An.12: TÇn sè c¸c alen m· hãa enzym IDH cña c¸c thµnh viªn nhãm An.13: TÇn sè c¸c alen m· hãa enzym PGM cña c¸c thµnh viªn nhãm An.14: TÇn sè c¸c alen m· hãa enzym MPI cña c¸c thµnh viªn nhãm An.15: TÇn sè c¸c alen m· hãa enzym α-GPD cña c¸c thµnh viªn nhãm An.16: TÇn sè c¸c alen m· hãa enzym MPI cña c¸c thµnh viªn nhãm An.

106 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.17: TÇn sè c¸c alen m· hãa enzym HAD cña c¸c thµnh viªn nhãm An.18: HÖ sè t-¬ng ®ång di truyÒn (I) vµ kho¶ng c¸ch di truyÒn (D) gi÷a c¸c thµnh viªn ®· ®Þnh tªn trong nhãm loµi An. maculatus dùa trªn sè liÖu ph©n tÝch izozym.19: HÖ sè t-¬ng ®ång di truyÒn vµ kho¶ng c¸ch di truyÒn gi÷a c¸c thµnh viªn trong toµn bé nhãm loµi An. maculatus dùa trªn sè liÖu ph©n tÝch izozym .20: HÖ sè t-¬ng ®ång di truyÒn(I) vµ kho¶ng c¸ch di truyÒn (D) gi÷a c¸c thµnh viªn ®· ®Þnh tªn trong nhãm loµi An. maculatus dùa trªn sè liÖu RAPD-PCR .21: HÖ sè t-¬ng ®ång di truyÒn vµ kho¶ng c¸ch di truyÒn gi÷a c¸c thµnh viªn trong toµn bé nhãm loµi An.

maculatus dùa trªn sè liÖu ph©n tÝch RAPD-PCR .22: So s¸nh c¸c dÊu hiÖu ®a h×nh di truyÒn kiÓu h×nh vµ kiÓu gen cña c¸c thµnh viªn nhãm loµi An.23: Ph©n bè cña c¸c loµi thµnh viªn trong nhãm loµi An.24: KÕt qu¶ thö nghiÖm ELISA ®¸nh gi¸ vai trß truyÒn bÖnh cña muçi nhãm loµi An. maculatus t¹i Kh¸nh Phó, Kh¸nh VÜnh, Kh¸nh Hoµ .25: KÕt qu¶ thö nghiÖm ELISA ®¸nh gi¸ vai trß truyÒn bÖnh cña muçi nhãm loµi An. maculatus t¹i §¾c ¥, Ph-íc Long, B×nh Ph-íc. 141 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Danh môc c¸c h×nh vÏ, §å thÞ H×nh 1.1 Th¸p Babel ph¸t hiÖn c¸c loµi ®ång h×nh .2: Tr×nh tù h×nh th¸i häc .3: S¬ ®å ph-¬ng ph¸p m« t¶ ®Æc ®iÓm loµi ®ång h×nh míi .1: ThiÕt kÕ nghiªn cøu ®a h×nh di truyÒn vµ vai trß truyÒn bÖnh nhãm loµi An.

maculatus ë ViÖt Nam .2: H×nh th¸i ®iÖn di enzym cã cÊu tróc monomer ®-îc quy ®Þnh bëi 2 alen ®ång tréi.3: H×nh th¸i ®iÖn di enzym cã cÊu tróc monomer ®-îc quy ®Þnh bëi 3 alen ®ång tréi.4: H×nh th¸i ®iÖn di enzym cã cÊu tróc dimer ®-îc quy ®Þnh bëi 2 alen ®ång tréi .5: H×nh th¸i ®iÖn di enzym cã cÊu tróc tetramer ®-îc quy ®Þnh bëi 2 alen ®ång tréi.6: H×nh th¸i ®iÖn di enzym cã cÊu tróc monomer ®-îc quy ®Þnh bëi 2 alen mét tréi mét lÆn.1: §a h×nh h×nh th¸i muçi tr-ëng thµnh cña c¸c thµnh viªn thuéc nhãm loµi An.2: §a h×nh c¬ quan sinh dôc ®ùc cña c¸c thµnh viªn thuéc nhãm loµi An.3: H×nh ¶nh mét sè ®Æc ®iÓm h×nh th¸i qu¨ng cña An.4: H×nh ¶nh mét sè ®Æc ®iÓm h×nh th¸i qu¨ng cña An.5: H×nh ¶nh mét sè ®Æc ®iÓm h×nh th¸i qu¨ng cña An.6: H×nh ¶nh mét sè ®Æc ®iÓm h×nh th¸i qu¨ng cña An.7: H×nh ¶nh mét sè ®Æc ®iÓm h×nh th¸i qu¨ng cña An.8: H×nh ¶nh mét sè ®Æc ®iÓm h×nh th¸i qu¨ng cña An.9: H×nh ¶nh mét sè ®Æc ®iÓm h×nh th¸i qu¨ng cña An.10: H×nh ¶nh mét sè ®Æc ®iÓm h×nh th¸i qu¨ng cña An.11: H×nh ¶nh mét sè ®Æc ®iÓm h×nh th¸i qu¨ng cña An.12: H×nh ¶nh mét sè ®Æc ®iÓm h×nh th¸i qu¨ng cña An.13: H×nh ¶nh mét sè ®Æc ®iÓm h×nh th¸i qu¨ng cña An.14: H×nh ¶nh mét sè ®Æc ®iÓm h×nh th¸i bä gËy cña An.15: H×nh ¶nh mét sè ®Æc ®iÓm h×nh th¸i bä gËy cña An.73 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.16: H×nh ¶nh mét sè ®Æc ®iÓm h×nh th¸i bä gËy cña An.17: H×nh ¶nh mét sè ®Æc ®iÓm h×nh th¸i bä gËy cña An.18: H×nh ¶nh mét sè ®Æc ®iÓm h×nh th¸i bä gËy cña An.19: H×nh ¶nh mét sè ®Æc ®iÓm h×nh th¸i bä gËy cña An.20: H×nh ¶nh mét sè ®Æc ®iÓm h×nh th¸i bä gËy cña An.21: H×nh ¶nh mét sè ®Æc ®iÓm h×nh th¸i bä gËy cña An.22: H×nh ¶nh mét sè ®Æc ®iÓm h×nh th¸i bä gËy cña An.23: H×nh ¶nh mét sè ®Æc ®iÓm h×nh th¸i bä gËy cña An.24: H×nh ¶nh mét sè ®Æc ®iÓm h×nh th¸i bä gËy cña An.