MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Bệnh bạc lá gây ra bởi Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) là một trong những bệnh nghiêm trọng nhất ở lúa, gây thiệt hại đến năng suất của nhiều giống lúa trên khắp thế giới. Bệnh bạc lá lúa xuất hiện ở tất cả các giai đoạn phát triển của cây lúa.
Mức độ nhiễm bệnh cũng nhƣ những ảnh hƣởng về năng suất tùy thuộc vào giai đoạn phát triển của cây, độ mẫm cảm với mầm bệnh và các yếu tố môi trƣờng. Bệnh bạc lá lúa đƣợc ghi nhận đầu tiên ở Nhật Bản vào năm 1884 và cho đến nay bệnh đã thành dịch hại ở hầu hết các vùng trồng lúa trên thế giới, đặc biệt là các nƣớc trồng lúa ở Châu Á. Bệnh bạc lá lúa có nguy cơ gây hại cả ở vụ xuân và vụ mùa. Hiện nay, việc sử dụng các chất hóa học để kiểm soát bệnh bạc lá vẫn chƣa có hiệu quả, gây ô nhiễm môi trƣờng, sức khỏe con ngƣời và chất lƣợng nông sản.
Ngƣời ta nhận thấy rằng việc tăng cƣờng tính kháng di truyền là phƣơng pháp hiệu quả nhất để kiểm soát bệnh bạc lá lúa. Do đó, việc phát triển các dòng/giống lúa mang gen kháng bệnh thông qua các ứng dụng chọn giống phân tử kết hợp với phƣơng pháp chọn giống truyền thống hiện đang là một trong những chiến lƣợc quan trọng để kiểm soát bệnh bạc lá lúa. Ngày nay, nhờ công cụ giải mã hệ gen thế hệ mới, việc giải mã một hệ gen hoàn chỉnh chỉ trong vài ngày cho phép xây dựng cơ sở dữ liệu hệ gen để khai thác một cách hiệu quả các nguồn gen, đặc biệt các nguồn gen lúa hoang dại và lúa bản địa. Với sự phát triển mạnh mẽ của tin sinh học, việc phân tích hệ gen, sàng lọc, phát hiện các gen/QTL kháng ngày càng nhiều và nhanh chóng.
Tính đến nay, các nhà khoa học đã tìm ra đƣợc 43 gen kháng bệnh bạc lá ở cây lúa trồng và lúa hoang dại, trong đó có 27 gen trội và 16 gen lặn (Yogesh et al, 2017; Suk, 2018). Trong số 43 gen đã đƣợc tìm thấy thì có 15 gen đã đƣợc phân lập, lập bản đồ vật lý và 6 gen kháng đã đƣợc tách dòng, nhân bản và giải trình tự (Basabdatta et al., 2014; Mueen et al., 2015; Ranjith et al., 2016; Yogesh et al. Các gen kháng này hoạt động theo cơ chế gen đối gen và là nguồn gen chính để cải tiến di truyền ở các giống lúa kháng với Xanthomonas. Mức độ biểu hiện tính kháng của các gen rất 2 khác nhau và biểu hiện ở các giai đoạn phát triển khác nhau của cây lúa, những gen chính kháng theo cơ chế hoàn toàn, những gen phụ kháng theo từng phần và đƣợc kiểm soát bởi QTL/gen (Khuất Hữu Trung và cs, 2015).
Tuy nhiên, với sự phát triển của các chủng Xanthomonas mới và sự biến đổi đa dạng quần thể bệnh đã làm phá vỡ tính kháng của nhiều giống lúa (Yogesh et al, 2017). Để kiểm soát sự phá vỡ tính kháng, khuynh hƣớng quy tụ nhiều gen vào một giống đã đƣợc áp dụng và mang lại hiệu quả đáng kể. Mặt khác, mỗi gen chính thƣờng chỉ kháng đƣợc với một chủng gây bệnh hoặc nòi gây hại nào đó, do vậy nếu quy tụ đƣợc vài gen kháng vào một dòng hoặc giống lúa thì sẽ tạo ra đƣợc dòng lúa kháng đƣợc nhiều chủng gây bệnh hoặc nhiều nòi gây hại, cải thiện tính kháng ngang từ tính kháng dọc, tạo ra tính kháng bền vững và ổn định. Việc phát triển nhanh chóng của các chỉ thị phân tử kết hợp với các chỉ thị chức năng cho phép lai qui tụ nhiều gen kháng một cách chính xác đã mở ra cơ hội mới cho các nhà chọn tạo giống trong việc tạo ra các giống kháng bệnh bạc lá phổ rộng, kháng ở mọi giai đoạn phát triển của cây lúa, kháng bền vững với các nòi gây bệnh.
Việc chọn tạo các giống lúa mang đa gen với sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử (MAS) giúp chọn lọc các cá thể mang các tính trạng mong muốn với độ tin cậy cao, có thể chọn lọc ở giai đoạn phát triển đầu của cá thể, phân biệt đƣợc kiểu gen dị hợp tử, chọn lọc đƣợc các alen lặn và giúp quy tụ đƣợc nhiều gen vào cùng một giống, giúp đẩy nhanh sự phát triển các dòng trong chƣơng trình chọn tạo giống (Guvvala et al, 2013; Pradhan et al, 2015). Xuất phát từ những lý do nêu trên chúng tôi đã thực hiện nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu tích hợp gen kháng bệnh bạc lá vào một số dòng/giống lúa phục vụ chọn tạo giống” nhằm sử dụng chỉ thị phân tử kết hợp với lai trở lại để nhanh chóng đƣa các gen/gen ứng viên kháng bệnh bạc lá vào các giống lúa ƣu tú, phục vụ cho các chƣơng trình nghiên cứu chọn tạo giống lúa và trực tiếp cho sản xuất. Mục tiêu nghiên cứu - Ứng dụng chỉ thị phân tử trong lai trở lại nhằm tích hợp các gen/gen ứng viên kháng bệnh bạc lá (Xa4, xa5, Xa7, xa13 và Xa21) vào một số dòng/giống lúa 3 ƣu tú, tạo đƣợc các nguồn vật liệu mang 2-3 gen kháng bệnh bạc lá phục vụ công tác chọn tạo giống lúa; - Tạo ra dòng triển vọng có năng suất cao, chất lƣợng tốt, có khả năng kháng bền vững với các chủng gây bệnh bạc lá của Việt Nam để phát triển thành giống, đáp ứng đƣợc nhu cầu của sản xuất. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài * Ý nghĩa khoa học: - Cung cấp thêm nhiều dữ liệu, thông tin về phân tích hệ gen lúa bản địa và ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá; - Kết quả của đề tài góp phần quan trọng trong việc tạo nguồn vật liệu là các dòng/giống mang đa gen/gen ứng viên kháng bệnh bạc lá phục vụ cho công tác nghiên cứu tính kháng và chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá.
* Ý nghĩa thực tiễn: - Tạo đƣợc 2-3 nguồn vật liệu có khả năng bệnh kháng bệnh bạc lá có nền di truyền là các giống lúa ƣu tú; - Tạo ra đƣợc 1-2 dòng triển vọng trong khảo nghiệm có năng suất cao, chất lƣợng tốt, kháng bệnh bạc lá, có khả năng phát triển trong sản xuất. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu * Đối tượng nghiên cứu - Các dòng/giống lúa ƣu tú đang đƣợc trồng phổ biến ở phía Bắc Việt Nam, các giống lúa bản địa, các dòng NIL mang gen kháng bệnh bạc lá nhập nội từ IRRI; - Cơ sở dữ liệu hệ gen của 36 giống lúa bản địa của Việt Nam và các chỉ thị phân tử có liên quan ứng dụng trong nghiên cứu chọn tạo giống. * Phạm vi nghiên cứu - Đề tài ứng dụng công cụ tin sinh học để khai thác trình tự hệ gen đầy đủ của các giống lúa bản địa của Việt Nam, xác định đƣợc các gen ứng viên kháng bệnh bạc lá, từ đó thiết kế chỉ thị chức năng để nhận biết các gen mục tiêu, phục vụ cho nghiên cứu tính kháng và công tác chọn tạo giống lúa; 4 - Đề tài tập trung nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử và lai trở lại để tích hợp nhiều gen kháng bệnh bạc lá vào cùng một giống lúa, nhằm tạo ra nguồn vật liệu kháng bệnh bạc lá, phục vụ cho công tác chọn tạo giống. * Địa điểm và thời gian nghiên cứu - Thí nghiệm đƣợc triển khai tại: Bộ môn Kĩ thuật Di truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp; Viện Bảo vệ Thực vật; Trạm Khảo kiểm nghiệm giống, sản phẩm cây trồng Văn Lâm, Hƣng Yên và Trung tâm Nghiên cứu ứng dụng khoa học kĩ thuật giống cây trồng nông nghiệp Thanh Hóa thuộc Trung tâm Khảo kiểm nghiệm Giống, sản phẩm Cây trồng Quốc gia; khu đồng ruộng thí nghiệm thuộc xã Tây Tựu, Bắc Từ Liêm, Hà Nội; xã Đại Đồng, Thạc Thất, Hà Nội.
- Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2014 đến năm 2017. Những đóng góp mới của đề tài - Lần đầu tiên ứng dụng công cụ tin sinh học để khai thác trình tự hệ gen đầy đủ của các giống lúa bản địa của Việt Nam, xác định đƣợc các gen ứng viên xa5 và xa13, từ đó thiết kế các chỉ thị chức năng và ứng dụng chỉ thị phân tử nhằm tích hợp nhiều gen kháng vào các dòng/giống lúa ƣu tú, phục vụ lai tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá và công tác nghiên cứu tính kháng; - Tạo ra 10 nguồn vật liệu mang 2-3 gen/gen ứng viên (Xa4+xa5/ Xa4+Xa7/ xa5+Xa7/xa5+xa13/xa5+Xa7+xa13 - có nguồn gốc từ dòng NIL của IRRI) hoặc 2-3 gen ứng viên (Xa4+Xa7/Xa4+Xa21/Xa7+Xa21/Xa4+Xa7+Xa21 - có nguồn gốc từ các giống lúa bản địa) có khả năng kháng bệnh bạc lá, phục vụ cho công tác chọn tạo giống lúa năng suất cao, chất lƣợng tốt, kháng bệnh bạc lá; - Tạo ra 01 dòng triển vọng (KTDT18) có năng suất, chất lƣợng, mang 2 gen ứng viên Xa4+xa5 (có nguồn gốc từ giống lúa bản địa), có khả năng kháng bệnh bạc lá, để phát triển phục vụ cho sản xuất. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về bệnh bạc lá ở lúa 1.
Lịch sử phát hiện bệnh Bệnh bạc lá lúa đƣợc phát hiện đầu tiên ở Fukuoka - Nhật Bản vào năm 1884. Ban đầu ngƣời ta lầm tƣởng nguyên nhân gây nên triệu chứng bệnh là do acid đất. Nhƣng không lâu sau đó, ngƣời ta đã công nhận nguyên nhân của nó là do vi khuẩn gây nên. Năm 1911, Bokura đã phân lập một loại vi khuẩn và sau khi nghiên cứu về hình thái và sinh lý đã đặt tên là Bacillus oryzae.
Năm 1922, Ishiyama đã nghiên cứu sâu hơn về bệnh bạc lá và đã đặt tên lại là Pseudomonas oryzae theo hệ thống Migula. Sau nhiều nghiên cứu tiếp theo, ngƣời ta đặt tên nó là Bacterium oryzae và sau này là Xanthomonas oryzae. Theo sửa đổi của Bộ luật quốc tế về danh mục vi khuẩn (ICNB), ủy ban phân loại vi khuẩn của Hiệp hội Thực vật Quốc tế đã thông qua tên Xanthomonas campestris pv. Năm 1990, tác nhân gây bệnh bạc lá đã đƣợc phân loại là loài và đƣợc đặt tên là Xanthomonas oryzae pv.
oryzae (Trích theo Pranamika Sharma et al. Xanthomonas oryzae pv. oryzae tồn tại chủ yếu trong cây lúa và trên vật chủ là cỏ dại, đáng chú ý là Leersia oryzoides, Zizania latifolia Leptocholoa chinensis, L. panicea và Cyperus rotundis.
Ở Úc, vi khuẩn đƣợc biết là tồn tại trong các loài Oryza hoang dã (O. Xoo cũng có thể tồn tại thời gian ngắn trên hạt bị nhiễm bệnh và trong đất, nhƣng chúng chƣa đƣợc chứng minh là nguồn quan trọng trong việc lây nhiễm mầm bệnh. Ở những vùng nhiệt đới, vi khuẩn cũng có thể tồn tại trong nƣớc tƣới (Trích theo Pranamika Sharma et al.