Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ nông nghiệp với đề tài "Nghiên cứu tích hợp gen kháng bệnh bạc lá vào một số dòng/giống lúa phục vụ chọn tạo giống" được thực hiện bởi nghiên cứu sinh Nguyễn Thúy Điệp, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Khuất Hữu Trung và TS. Hoàng Hoa Long, tại Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam (chuyên ngành Công nghệ sinh học, mã số: 9420201, bảo vệ năm 2019).

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) gây ra là một trong những bệnh hại nghiêm trọng nhất đối với sản xuất lúa gạo, làm giảm sút năng suất ở nhiều vùng trồng lúa trên thế giới và tại Việt Nam trong cả vụ Xuân lẫn vụ Mùa. Biện pháp sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật hiện nay không mang lại hiệu quả cao, đồng thời gây ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Do đó, việc cải tiến và nâng cao tính kháng di truyền của cây lúa được xác định là giải pháp kiểm soát bệnh bạc lá hiệu quả và bền vững.

Mặc dù các nhà khoa học đã xác định được 43 gen kháng bệnh bạc lá (Xa1 đến Xa42, xa44(t)), việc sử dụng đơn gen kháng thường nhanh chóng bị bẻ gãy do sự biến đổi đa dạng và áp lực chọn lọc của các chủng nòi vi khuẩn Xoo mới. Đồng thời, việc sử dụng các dòng cận đẳng gen (NILs) nhập nội từ Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế (IRRI) làm nguồn cho gen kháng tại Việt Nam còn gặp hạn chế do tính tương thích thấp với các chủng nòi sinh thái bản địa phong phú. Khoảng trống nghiên cứu đặt ra là cần khai thác dữ liệu giải trình tự hệ gen của tập đoàn lúa bản địa Việt Nam để phát hiện các gen ứng viên, thiết kế các chỉ thị chức năng đặc thù và áp dụng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS) kết hợp lai hồi giao (MABC) nhằm quy tụ đồng thời 2–3 gen kháng vào các giống lúa ưu tú, kết hợp duy trì các tính trạng chất lượng hạt gạo (Waxy, BADH2).

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định 2 mục tiêu nghiên cứu cụ thể được đánh số trong văn bản:

  1. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong lai trở lại nhằm tích hợp các gen/gen ứng viên kháng bệnh bạc lá (Xa4, xa5, Xa7, xa13 và Xa21) vào một số dòng/giống lúa ưu tú, tạo được các nguồn vật liệu mang 2–3 gen kháng bệnh bạc lá phục vụ công tác chọn tạo giống lúa.
  2. Tạo ra dòng triển vọng có năng suất cao, chất lượng tốt, có khả năng kháng bền vững với các chủng gây bệnh bạc lá của Việt Nam để phát triển thành giống, đáp ứng được nhu cầu của sản xuất.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu:
    • Các dòng/giống lúa ưu tú đang được trồng phổ biến tại miền Bắc Việt Nam (An Dân 11, DT39, Thủ Đô 1, Bắc thơm số 7).
    • Các giống lúa bản địa (Chấn thơm, Hom râu,...).
    • Các dòng NIL mang gen kháng bệnh bạc lá nhập nội từ IRRI (IRBB62,...).
    • Cơ sở dữ liệu hệ gen của 36 giống lúa bản địa Việt Nam và các chỉ thị phân tử liên quan.
  • Phạm vi nghiên cứu:
    • Khai thác trình tự hệ gen đầy đủ của 36 giống lúa bản địa bằng công cụ tin sinh học, xác định các gen ứng viên kháng bệnh bạc lá (xa5, xa13), thiết kế chỉ thị phân tử chức năng (SSLP).
    • Ứng dụng chỉ thị phân tử và lai trở lại để tích hợp 2–3 gen kháng (Xa4, xa5, Xa7, xa13, Xa21) vào giống nền ưu tú, kết hợp sàng lọc gen phẩm chất (BADH2, Waxy).
    • Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Kỹ thuật Di truyền, Bộ môn Bệnh học Phân tử (Viện Di truyền Nông nghiệp); Viện Bảo vệ Thực vật; Trạm Khảo kiểm nghiệm giống, sản phẩm cây trồng Văn Lâm (Hưng Yên); Trung tâm Nghiên cứu ứng dụng KHKT giống cây trồng nông nghiệp Thanh Hóa; ruộng thí nghiệm tại Tây Tựu (Bắc Từ Liêm, Hà Nội) và Đại Đồng (Thạch Thất, Hà Nội).
    • Thời gian thực hiện: Từ năm 2014 đến năm 2017.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước được tác giả tổng thuật

Luận án đã hệ thống hóa các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước về vi khuẩn gây bệnh, nguồn gen kháng và công nghệ chọn giống:

  1. Lịch sử và phân loại vi khuẩn gây bệnh bạc lá (Xanthomonas oryzae pv. oryzae): Bệnh được phát hiện lần đầu năm 1884 tại Fukuoka (Nhật Bản). Tác nhân vi khuẩn lần lượt được Bokura (1911) định danh là Bacillus oryzae, Ishiyama (1922) định danh là Pseudomonas oryzae, sau đó đổi thành Bacterium oryzae, Xanthomonas campestris pv. oryzae và chính thức là Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) vào năm 1990 (Pranamika Sharma et al.). Hệ gen Xoo có kích thước xấp xỉ 5 triệu bp, hàm lượng G+C chiếm 63,72%, mang các nhóm gen độc lực chính gồm hrp (27 gen), họ gen avr (17 bản copy avrBs3/pth) và HrpX chứa 37 bản copy đoạn PIP box (Ochiai et al., 2005).
  2. Nghiên cứu về chủng nòi sinh lý của Xoo:
    • Trên thế giới: Nhật Bản xác định 5 nhóm nòi; Philippines xác định 6 nhóm nòi; Indonesia có 9 nhóm nòi; tổng số hơn 30 nòi Xoo đã được ghi nhận toàn cầu (NIAS, 2010; Pranamika Sharma et al.).
    • Tại Việt Nam: Tạ Minh Sơn (1987) xác định 4 nhóm nòi chính; Lưu Văn Quyết (1999) phân lập 7 nhóm nòi ở Đồng bằng sông Hồng; Bùi Trọng Thủy và Phan Hữu Tôn (2003, 2004, 2007) phân lập 64 isolate thành 10–12 chủng sinh lý tại miền Bắc và ghi nhận các gen Xa7, Xa21, xa5 kháng với cả 10 chủng; Dinh D. và cs (2006–2007) phân chia 41 isolate ở Đồng bằng sông Cửu Long thành 6 nhóm nòi; Nguyễn Văn Viết và cs (2008) xác định 13 nhóm chủng sinh lý miền Bắc; Furuya et al. (2012) phân loại 84 chủng miền Bắc thành 4 nhóm (G1–G4); Lưu Văn Quyết và cs (2016) xác định 3 nhóm nòi I, II, III; Thanh T. và cs (2018) đánh giá phản ứng kháng của 37 giống bản địa với 10 chủng Xoo.
  3. Phát hiện và định vị gen kháng bệnh bạc lá: Tổng hợp 43 gen kháng (Xa1 đến Xa42, xa44(t)) gồm 27 gen trội và 16 gen lặn phân bố trên các nhiễm sắc thể (trừ NST 9 và 10), trong đó NST 11 chứa tới 14 gen kháng (Kou et al., 2015; Yogesh et al., 2017; Suk-Man Kim, 2018). Có 15 gen đã được lập bản đồ vật lý và 6 gen đã được giải trình tự hoàn chỉnh (Xa1, xa5, xa13, Xa21, xa26, Xa27).
  4. Ứng dụng chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS/MABC) và quy tụ đa gen:
    • Thương mại hóa quốc tế: Điểm lại các giống lúa quy tụ gen kháng đã thương mại hóa tại Châu Á (Bảng 1.2) như giống Angke (Xa4+xa5), Conde (Xa4+Xa7) tại Indonesia (2002); NSIC Rc142, NSIC Rc154 (Xa4+Xa21) tại Philippines (2006, 2007); Guodao 1 (Xa4+Xa21) tại Trung Quốc (2004, 2006); Pusa Basmati 1 cải tiến và Sambha Mahsuri cải tiến mang tổ hợp 3 gen (xa5+xa13+Xa21) tại Ấn Độ (2007) (Valérie et al., 2011; Ali et al., 2014; Mueen et al., 2014).
    • Nghiên cứu tại Việt Nam: Nguyễn Thị Pha và Nguyễn Thị Lang (2004); Lã Vinh Hoa và cs (2010); Vũ Hồng Quảng và cs (2011); Võ Thị Minh Tuyển (2012, 2015) chuyển cụm gen Xa4, Xa7, Xa21 vào giống Bắc thơm số 7, tạo giống DT45 (xa5), DT47 (Xa7); Nguyễn Thị Lệ và cs (2014) tạo giống BT7KBL (Xa21); Nguyễn Thị Hồng Tươi và cs (2015) chọn tạo dòng tẻ cẩm mang Xa7, Xa21; Dương Xuân Tú và cs (2015, 2016) chọn tạo giống lúa thơm HDT10 mang Xa4, xa5, Xa7; Dương Đức Huy và Nguyễn Văn Hoan (2016) chuyển gen Xa7 vào dòng bố R212; Nguyễn Thị Huệ và cs (2018) tạo dòng mang Xa21; Nguyễn Thị Thu và cs (2018) tạo dòng Bắc thơm 7 cải tiến D6, D9 mang Xa7+Xa21.
Tên giống thương mại Giống gốc Tổ hợp gen kháng Quốc gia Năm thương mại Cơ quan nghiên cứu
Angke IR64 Xa4, xa5 Indonesia 2002 ICRR / ICABIOGRAD
Conde IR64 Xa4, Xa7 Indonesia 2002 ICRR / ICABIOGRAD
NSIC Rc142 IR64 Xa4, Xa21 Philippines 2006 PhilRice
NSIC Rc154 PSB Rc14 Xa4, Xa21 Philippines 2007 PhilRice
Guodao 1 Zhong9A/R8006 Xa4, Xa21 Trung Quốc 2004 CNRRI
Sambha Mahsuri cải tiến Sambha Mahsuri xa5, xa13, Xa21 Ấn Độ 2007 CVRC / DRR
Pusa Basmati-1 cải tiến Pusa Basmati 1 xa5, xa13, Xa21 Ấn Độ 2007 IARI

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Các công trình tại Việt Nam trước đây chủ yếu sử dụng dòng cận đẳng gen (NILs) của IRRI mang đơn gen hoặc sử dụng chỉ thị liên kết thông thường, dễ xảy ra hiện tượng phân ly tái tổ hợp làm giảm độ chính xác của quá trình chọn lọc. Luận án giải quyết khoảng trống này bằng cách:

  • Khai thác nguồn gen lặn xa5 và xa13 trực tiếp từ cơ sở dữ liệu hệ gen 36 giống lúa bản địa Việt Nam.
  • Thiết kế các cặp mồi chỉ thị chức năng SSLP đặc thù bám sát các đoạn đột biến thêm/bớt (InDels) nội tại của gen để loại bỏ sai số phân ly.
  • Tiến hành tích hợp đồng thời 2–3 gen kháng vào các giống lúa chất lượng cao miền Bắc kết hợp giám định các alen chất lượng cơm (Waxy) và hương thơm (BADH2).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

  • Học thuyết tương tác gen đối gen (Gene-for-gene hypothesis): Tính kháng của cây lúa đối với vi khuẩn Xoo được kích hoạt khi protein thụ thể do gen kháng (R) của cây nhận biết trực tiếp hoặc gián tiếp protein độc lực do gen avr của vi khuẩn tiết ra.
  • Nguyên lý chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS) và lai hồi giao (MABC): Áp dụng mô hình lai hồi giao kết hợp chỉ thị phân tử của Hospital (2003) nhằm chọn lọc cá thể mang alen đích từ dòng cho ở trạng thái dị hợp tử qua các thế hệ hồi giao (BC1F1 đến BC3F1), sau đó cho tự thụ phấn để thu nhận cá thể đồng hợp tử về các gen kháng ở thế hệ BC3F2 và BC3F3, đồng thời đẩy nhanh quá trình phục hồi tối đa nền di truyền của giống nhận (recurrent parent).
  • Cơ chế phân tử của các gen kháng và gen chất lượng nghiên cứu:
    • Gen Xa4 (NST 11): Gen trội quy định tính kháng nòi 1 Philippines.
    • Gen xa5 (NST 5): Mã hóa tiểu đơn vị gamma của nhân tố phiên mã TFIIA (TFIIAγ). Alen lặn mang đột biến thay thế 2 bp ở exon 2 làm thay đổi axit amin từ Valine sang Glutamate ở vị trí 39, gây rối loạn chức năng phiên mã của vi khuẩn.
    • Gen Xa7 (NST 6): Gen đồng trội, duy trì tính kháng mạnh ở giai đoạn ra trỗ và kháng bền với nhiệt độ cao.
    • Gen xa13 (NST 8): Mã hóa protein màng Os8N3 (họ MtN3/saliva). Đột biến InDels tại promoter ngăn cản yếu tố phiên mã pthXo1 của Xoo bám vào, làm vi khuẩn không chiếm đoạt được nguồn đường.
    • Gen Xa21 (NST 11): Mã hóa thụ thể kinase giàu leucine (LRR kinase), có phổ kháng rộng.
    • Gen Waxy (NST 6): Kiểm soát hàm lượng amylose (AC) thông qua các alen Wx-a, Wx-b, Wx-in, wx và 2 vị trí SNP (WxIn1 ở intron 1 và Ex6A/C ở exon 6).
    • Gen BADH2 (NST 8): Kiểm soát mùi thơm; đột biến mất 8 bp ở exon 7 làm bất hoạt enzym Betaine Aldehyde Dehydrogenase 2, thúc đẩy tích lũy chất thơm 2-Acetyl-1-Pyrroline (2-AP).

Phương pháp nghiên cứu thực tế

  • Phương pháp tin sinh học: Khai thác dữ liệu giải trình tự toàn bộ hệ gen của 36 giống lúa bản địa Việt Nam (Bảng 2.1), so sánh chuỗi trình tự vùng mã hóa (CDS) và vùng điều hòa promoter với trình tự tham chiếu trên ngân hàng gen NCBI để phát hiện các vị trí đột biến InDels.
  • Phương pháp thiết kế chỉ thị SSLP: Dựa trên các đoạn InDels phát hiện được, thiết kế các cặp mồi nhận diện chuyên biệt:
    • Cặp mồi xa5add35 (nhận diện đoạn mất 35 bp ở gen ứng viên xa5).
    • Cặp mồi xa13add4 (nhận diện đoạn mất 4 bp ở gen ứng viên xa13).
    • Sử dụng các cặp mồi liên kết/chức năng đã công bố: MP1-2 (cho gen Xa4), P3 (cho gen Xa7), pTA248 (cho gen Xa21), cùng các cặp mồi khuếch đại gen BADH2 và Waxy.
  • Kỹ thuật sinh học phân tử: Tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp CTAB cải tiến; thực hiện phản ứng khuếch đại gen (PCR); điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose nồng độ 1,5–3,0% và gel polyacrylamide nồng độ 6–8%, nhuộm ethidium bromide (EtBr) và soi dưới ánh sáng tử ngoại.
  • Phương pháp đánh giá kiểu hình bằng lây nhiễm nhân tạo: Nuôi cấy các chủng vi khuẩn Xoo thu thập tại miền Bắc trên môi trường thạch PSA (Potato semi-synthetic agar). Lây nhiễm nhân tạo vào giai đoạn đẻ nhánh rộ và làm đòng bằng phương pháp cắt góc lá (clip-inoculation), đo chiều dài vết bệnh sau 14–21 ngày và đánh giá cấp bệnh theo thang điểm chuẩn của IRRI (2014) từ cấp 1 (kháng cao) đến cấp 9 (nhiễm nặng).
  • Phương pháp bố trí thí nghiệm đồng ruộng và xử lý số liệu: Thí nghiệm theo dõi nông sinh học, sâu bệnh hại và năng suất được bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh (RCBD) qua các vụ Xuân, vụ Mùa tại Tây Tựu, Thạch Thất (Hà Nội) và Văn Lâm (Hưng Yên). Xử lý và phân tích số liệu thống kê bằng phần mềm IRRISTAT.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 1 cung cấp cơ sở lý luận và tổng thuật toàn diện các công trình nghiên cứu về vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae, bản chất của 43 gen kháng bệnh bạc lá đã được ghi nhận, cơ chế hoạt động của các chỉ thị phân tử (RFLP, AFLP, SSR, SSLP, STS, CAPS, dCAPS, SNP) và vai trò của phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS). Chương này cũng điểm lại các thành tựu thương mại hóa giống lúa mang đa gen kháng trên thế giới và tại Việt Nam, đồng thời phân tích cơ chế di truyền của các gen chất lượng hạt gạo (Waxy quy định hàm lượng amylose và BADH2 quy định mùi thơm).

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn vật liệu nghiên cứu gồm 36 giống lúa bản địa đã giải trình tự hệ gen (Bảng 2.1), các giống lúa ưu tú làm giống nhận (An Dân 11, DT39, Thủ Đô 1, Bắc thơm số 7), các dòng/giống cho gen (Chấn thơm, Hom râu, IRBB62) (Bảng 2.2). Chương này trình bày chi tiết danh mục các trình tự mồi (Bảng 2.3), quy trình thiết kế chỉ thị SSLP (Hình 2.1), quy trình PCR, phương pháp đánh giá bệnh nhân tạo theo thang điểm IRRI 2014 (Bảng 2.4), cùng sơ đồ lai tạo tổng quát các thế hệ hồi giao (Hình 2.2).

Chương 3: Kết quả và thảo luận

1. Xác định gen kháng và thiết kế mồi nhận diện gen ứng viên

  • Gen ứng viên xa5: Phân tích trình tự CDS của các giống lúa bản địa phát hiện đoạn mất 35 bp (từ nucleotide 203 đến 237) (Hình 3.1). Luận án thiết kế thành công cặp mồi chức năng xa5add35 (Hình 3.2), kiểm tra điện di cho thấy phân biệt rõ ràng đoạn sản phẩm mang gen kháng và gen nhiễm (Hình 3.3).
  • Gen ứng viên xa13: Phân tích vùng CDS phát hiện đoạn mất 4 bp (từ vị trí 716 đến 719) (Hình 3.4). Luận án thiết kế cặp mồi chức năng xa13add4 (Hình 3.5), cho phép nhận diện chính xác các alen ứng viên xa13 trên gel điện di (Hình 3.6).
  • Sàng lọc tập đoàn bố mẹ: Đã kiểm tra sự có mặt của các gen Xa4, xa5, Xa7, xa13, Xa21 trên tập đoàn 36 giống bản địa và các giống ưu tú (Bảng 3.5, Hình 3.7–3.9). Đánh giá tính kháng bằng lây nhiễm nhân tạo trong vụ Xuân 2014 tại Thạch Thất làm cơ sở lựa chọn bố mẹ cho các tổ hợp lai (Bảng 3.6, Hình 3.10–3.11).

2. Kết quả lai hồi giao và chọn lọc cá thể mang đa gen kháng

Luận án đã thiết lập các tổ hợp lai hồi giao và tiến hành chọn lọc phân tử qua từng thế hệ:

  • Thế hệ BC1F1 (Vụ Xuân 2015 tại Tây Tựu): Kiểm tra PCR các cá thể lai từ các tổ hợp như Thủ Đô 12/Chấn thơm, Bắc thơm số 72/IRBB62; sàng lọc các cá thể mang kiểu gen dị hợp tử về các gen kháng mục tiêu (Xa4, xa5, Xa7, Xa21) để tạo hạt BC2F1 (Bảng 3.8, Hình 3.12–3.14).
  • Thế hệ BC2F1 (Vụ Mùa 2015 tại Tây Tựu): Tiếp tục kiểm tra bằng các cặp mồi MP1-2, xa5add35, P3, pTA248; chọn lọc các cá thể mang đầy đủ các gen kháng mong muốn để lai hồi giao lần 3 tạo hạt BC3F1 (Bảng 3.9, Hình 3.15–3.17).
  • Thế hệ BC3F1 (Vụ Xuân 2016 tại Thạch Thất): Sàng lọc các cá thể mang tổ hợp đa gen kháng mục tiêu (ví dụ: tổ hợp An Dân 11*4/Hom râu mang 3 gen ứng viên xa5+Xa7+xa13), sau đó cho tự thụ phấn để thu nhận thế hệ phân ly BC3F2 (Bảng 3.10, Hình 3.18–3.20).
  • Thế hệ BC3F2 (Vụ Mùa 2016 tại Thạch Thất): Phân tích kiểu gen để chọn lọc các cá thể đồng hợp tử mang 2–3 gen kháng bệnh bạc lá (Bảng 3.11–3.14, Hình 3.21–3.23), đồng thời kiểm tra sự có mặt của gen quy định mùi thơm BADH2 và hàm lượng amylose Waxy (Bảng 3.16, Hình 3.24) và theo dõi đặc điểm hình thái (Bảng 3.15).

3. Đánh giá đặc tính nông sinh học và khả năng kháng bệnh của các dòng BC3F3

Trong vụ Xuân 2017 tại Thạch Thất, các dòng BC3F3 mang đa gen kháng được đánh giá toàn diện trên các nền di truyền nhận gen:

  • Nền di truyền giống An Dân 11 (tổ hợp An Dân 11/Hom râu): Các dòng mang 3 gen ứng viên (xa5+Xa7+xa13) thể hiện khả năng kháng bệnh bạc lá cao khi lây nhiễm nhân tạo (Bảng 3.17, Hình 3.26), có thời gian sinh trưởng và đặc điểm nông học tương đương giống gốc An Dân 11 (Bảng 3.18), duy trì tốt các yếu tố cấu thành năng suất (Bảng 3.19, Hình 3.27).
  • Nền di truyền giống DT39 (tổ hợp DT39/Chấn thơm): Các dòng mang 2 gen ứng viên (Xa4+xa5) có khả năng kháng bệnh bạc lá rõ rệt so với giống gốc DT39 bị nhiễm (Bảng 3.20, Hình 3.29), giữ được các đặc tính sinh trưởng và năng suất hạt tốt (Bảng 3.21, Bảng 3.22, Hình 3.30).
  • Nền di truyền giống Thủ Đô 1: Các dòng từ tổ hợp Thủ Đô 1/Chấn thơm (Xa4+xa5) và Thủ Đô 1/IRBB62 (Xa4+Xa7+Xa21) kháng bệnh tốt với vết bệnh ngắn (Bảng 3.23), cây sinh trưởng đồng đều, năng suất tương đương giống Thủ Đô 1 đối chứng (Bảng 3.24, Bảng 3.25, Hình 3.31–3.32).
  • Nền di truyền giống Bắc thơm số 7 (tổ hợp Bắc thơm số 7/IRBB62): Các dòng mang 3 gen kháng (Xa4+Xa7+Xa21) thể hiện tính kháng bệnh bạc lá vượt trội so với giống gốc Bắc thơm số 7 bị nhiễm nặng (Bảng 3.26), duy trì thời gian sinh trưởng ngắn, phẩm chất gạo thơm và năng suất ổn định (Bảng 3.27, Bảng 3.28, Hình 3.33–3.34).
Nhóm nền di truyền Tổ hợp lai Tổ hợp gen kháng tích hợp Khả năng kháng bệnh bạc lá nhân tạo (Vụ Xuân 2017)
An Dân 11 An Dân 11/Hom râu xa5 + Xa7 + xa13 Kháng cao (cấp 1–3), vết bệnh ngắn
DT39 DT39/Chấn thơm Xa4 + xa5 Kháng (cấp 1–3), vượt trội so với DT39 gốc
Thủ Đô 1 Thủ Đô 1/Chấn thơm; Thủ Đô 1/IRBB62 Xa4 + xa5; Xa4 + Xa7 + Xa21 Kháng tốt, vết bệnh hạn chế
Bắc thơm số 7 Bắc thơm số 7/IRBB62 Xa4 + Xa7 + Xa21 Kháng cao (cấp 1–3), Bắc thơm số 7 gốc nhiễm cấp 9

4. Chọn tạo và khảo nghiệm dòng triển vọng KTDT18

  • Qua đánh giá phản ứng kháng bệnh (Bảng 3.29) và khảo nghiệm đồng ruộng tại Văn Lâm (Hưng Yên) trong vụ Mùa 2017, dòng KTDT18 (chọn từ tổ hợp lai mang 2 gen ứng viên Xa4+xa5 có nguồn gốc từ giống bản địa) thể hiện mức độ nhiễm sâu bệnh hại ngoài đồng ruộng rất thấp (Bảng 3.30).
  • Dòng KTDT18 có đặc điểm sinh trưởng tốt, thời gian sinh trưởng phù hợp cho cơ cấu vụ Mùa (Bảng 3.31), các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu đạt cao (Bảng 3.32, Bảng 3.34).
  • Đánh giá phẩm chất cho thấy dòng KTDT18 có tỷ lệ gạo nguyên cao, dạng hạt gạo thon dài, cơm mềm bóng, giữ được các chỉ tiêu chất lượng hạt tốt (Bảng 3.33, Hình 3.35–3.36).

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới của đề tài

  1. Lần đầu tiên ứng dụng công cụ tin sinh học để khai thác cơ sở dữ liệu trình tự toàn bộ hệ gen của 36 giống lúa bản địa Việt Nam, xác định được các gen ứng viên xa5 (mang đoạn mất 35 bp) và xa13 (mang đoạn mất 4 bp). Từ đó, thiết kế thành công các cặp mồi chỉ thị chức năng SSLP (xa5add35 và xa13add4), phục vụ hiệu quả cho việc nhận diện chính xác gen đích và tích hợp gen kháng vào các giống lúa ưu tú.
  2. Tạo ra 10 nguồn vật liệu mang 2–3 gen/gen ứng viên kháng bệnh bạc lá gồm:
    • Các tổ hợp gen có nguồn gốc từ dòng NIL của IRRI: Xa4+xa5, Xa4+Xa7, xa5+Xa7, xa5+xa13, xa5+Xa7+xa13.
    • Các tổ hợp gen có nguồn gốc từ giống lúa bản địa: Xa4+Xa7, Xa4+Xa21, Xa7+Xa21, Xa4+Xa7+Xa21.
    • Các nguồn vật liệu này mang nền di truyền của các giống lúa ưu tú (An Dân 11, DT39, Thủ Đô 1, Bắc thơm số 7), có khả năng kháng bệnh bạc lá, phục vụ cho công tác chọn tạo giống lúa năng suất cao, chất lượng tốt.
  3. Chọn tạo được 01 dòng lúa triển vọng (KTDT18) mang 2 gen ứng viên Xa4+xa5 (có nguồn gốc từ giống lúa bản địa), có khả năng kháng bệnh bạc lá, năng suất cao, chất lượng gạo tốt, đáp ứng yêu cầu phát triển phục vụ sản xuất.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

  • Tiếp tục đưa dòng triển vọng KTDT18 vào hệ thống khảo nghiệm quốc gia (khảo nghiệm VCU và DUS) tại các vùng sinh thái khác nhau để sớm công nhận giống đưa vào sản xuất đại trà.
  • Khai thác 10 nguồn vật liệu mang đa gen kháng đã tạo ra làm nguồn bố mẹ cho các chương trình lai tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá tại các viện và trung tâm nghiên cứu giống cây trồng.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Nghiên cứu tập trung khai thác trên tập đoàn 36 giống lúa bản địa đã giải trình tự hệ gen; số lượng giống bản địa được khảo sát còn hạn chế so với tổng thể nguồn tài nguyên di truyền lúa phong phú của Việt Nam.
  • Các thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo và khảo nghiệm đồng ruộng chủ yếu được thực hiện tại một số địa bàn thuộc miền Bắc (Hà Nội, Hưng Yên, Thanh Hóa) trong giai đoạn 2014–2017.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Mở rộng khảo nghiệm dòng triển vọng KTDT18 và các dòng mang đa gen kháng tại các vùng sinh thái trồng lúa khác nhau trên phạm vi toàn quốc để đánh giá tính thích ứng rộng và độ bền vững của tính kháng trước sự biến động chủng nòi của vi khuẩn Xoo.
  • Tiếp tục giải trình tự và ứng dụng tin sinh học để tìm kiếm thêm các gen/QTL kháng mới từ nguồn gen lúa bản địa và lúa hoang dại tại Việt Nam.
  • Nghiên cứu sâu hơn về tương tác giữa các tổ hợp gen kháng (Xa4, xa5, Xa7, xa13, Xa21) với các cấu trúc độc lực phân tử (avr/pth) của các isolate Xoo mới phân lập.

Giá trị tham khảo

  • Đối với nghiên cứu sinh và học viên chuyên ngành Di truyền học, Công nghệ sinh học và Chọn giống cây trồng: Luận án là tài liệu tham khảo chi tiết về phương pháp khai thác dữ liệu giải trình tự hệ gen, kỹ thuật thiết kế chỉ thị phân tử chức năng (SSLP) dựa trên đột biến InDels, và quy trình thực hiện lai hồi giao có sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử (MABC).
  • Đối với giảng viên và cán bộ nghiên cứu nông nghiệp: Cung cấp hệ thống dữ liệu toàn diện về 43 gen kháng bệnh bạc lá, lịch sử và tình hình phân bố chủng nòi vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae tại Việt Nam, cũng như phương pháp tích hợp đồng thời gen kháng bệnh và gen chất lượng (Waxy, BADH2).
  • Đối với các nhà chọn tạo giống và cơ quan quản lý sản xuất nông nghiệp: Cung cấp 10 nguồn vật liệu mang tổ hợp đa gen kháng đã được ổn định kiểu gen và dòng triển vọng KTDT18 có tiềm năng ứng dụng trực tiếp để cải thiện năng suất, giảm thiểu việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học trong canh tác lúa.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã phát hiện ra những đột biến nào trên gen ứng viên xa5 và xa13 ở các giống lúa bản địa Việt Nam và đã thiết kế các cặp mồi nào?

Qua phân tích trình tự vùng mã hóa (CDS), luận án phát hiện gen ứng viên xa5 ở các giống lúa bản địa có một đoạn mất 35 nucleotide (từ vị trí 203 đến 237), từ đó thiết kế cặp mồi chức năng xa5add35. Đối với gen ứng viên xa13, phát hiện một đoạn mất 4 nucleotide (từ vị trí 716 đến 719), từ đó thiết kế cặp mồi chức năng xa13add4.

2. Sự khác biệt giữa nguồn gen kháng từ các dòng NIL của IRRI và nguồn gen lúa bản địa trong nghiên cứu này là gì?

Các dòng NILs của IRRI (như IRBB62) mang các gen kháng ngoại lai được chuyển nạp vào nền giống chuẩn quốc tế. Trong khi đó, các gen kháng từ giống bản địa (như Chấn thơm, Hom râu) là các alen nội tại đã thích ứng lâu đời với điều kiện sinh thái và quần thể vi khuẩn Xoo tại Việt Nam, giúp nâng cao tính tương thích di truyền và độ bền vững khi tích hợp vào các giống lúa thuần miền Bắc.

3. Dòng triển vọng KTDT18 mang tổ hợp gen kháng nào và có những đặc tính gì nổi bật?

Dòng KTDT18 mang 2 gen ứng viên kháng bệnh bạc lá Xa4+xa5 có nguồn gốc từ giống lúa bản địa trên nền di truyền cải tiến. Dòng này thể hiện khả năng kháng bệnh bạc lá cao trong điều kiện lây nhiễm nhân tạo và đồng ruộng, nhiễm sâu bệnh thấp, thời gian sinh trưởng phù hợp vụ Mùa, năng suất cao và phẩm chất gạo ngon (cơm mềm bóng, tỷ lệ gạo nguyên cao).

4. Phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS/MABC) có ưu thế gì so với phương pháp chọn giống truyền thống trong luận án này?

MAS/MABC cho phép sàng lọc và nhận diện chính xác cá thể mang gen kháng mục tiêu ngay từ giai đoạn cây con mà không phụ thuộc vào điều kiện thời tiết hay sự phát triển của dịch bệnh. Phương pháp này phân biệt được trạng thái dị hợp tử/đồng hợp tử, hỗ trợ chọn lọc hiệu quả các alen lặn (xa5, xa13) và giúp quy tụ đồng thời 2–3 gen kháng vào một cá thể với số thế hệ hồi giao ít hơn (từ BC1F1 đến BC3F2).

5. Luận án đã kiểm soát các gen quy định tính trạng chất lượng nào trong quá trình chọn giống?

Song song với việc tích hợp các gen kháng bệnh bạc lá, luận án sử dụng các chỉ thị phân tử để kiểm tra và duy trì gen Waxy (trên NST số 6, kiểm soát hàm lượng amylose thích hợp cho độ dẻo của cơm) và gen BADH2 (trên NST số 8, kiểm soát tính trạng mùi thơm cơm nhờ sự tích lũy hợp chất 2-AP).

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Nguyễn Thúy Điệp đã hoàn thành việc ứng dụng công cụ tin sinh học để khai thác cơ sở dữ liệu hệ gen của 36 giống lúa bản địa Việt Nam, xác định các gen ứng viên xa5, xa13 và thiết kế thành công các cặp chỉ thị chức năng SSLP (xa5add35, xa13add4). Bằng phương pháp lai hồi giao kết hợp chỉ thị phân tử (MABC), công trình đã tạo ra 10 nguồn vật liệu mang 2–3 gen kháng bệnh bạc lá (Xa4, xa5, Xa7, xa13, Xa21) trên nền di truyền của các giống lúa ưu tú miền Bắc, đồng thời kiểm soát tốt các gen chất lượng hạt (Waxy, BADH2). Kết quả nghiên cứu đã chọn tạo được dòng triển vọng KTDT18 mang 2 gen ứng viên Xa4+xa5, có khả năng kháng bệnh bạc lá, năng suất cao và chất lượng tốt, đóng góp nguồn vật liệu và cơ sở khoa học giá trị cho công tác chọn tạo giống lúa kháng bệnh tại Việt Nam.