Thiết Lập Chất Đối Chiếu Hypophyllanthin, Niranthin và Xác Định Dược Động Học Cao Diệp Hạ Châu Đắng

Nghiên cứu chuyên sâu về thiết lập chất đối chiếu Hypophyllanthin, Niranthin từ Diệp hạ châu đắng. Phân tích dược động học của cao chuẩn hóa, tối ưu hóa hiệu quả.

• Tác giả: Phạm Văn Sơn
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Ngọc Vinh
• Trường học: Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất
• Đề tài: Thiết Lập Chất Đối Chiếu Hypophyllanthin, Niranthin Và Xác Định Một Số Thông Số Dược Động Học Của Cao Chuẩn Hóa Điều Chế Từ Diệp Hạ Châu Đắng (Phyllanthus Amarus Schum., Euphorbiaceae)
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Tp. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỞ ĐẦU
• 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. TỔNG QUAN DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG
• 2.1.1. Tên gọi, phân loại
• 2.1.2. Phân bố - sinh thái
• 2.1.3. Đặc điểm thực vật
• 2.1.4. Bộ phận dùng, gieo trồng, thu hái
• 2.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VỀ CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP, TINH CHẾ HỢP CHẤT LIGNAN TỪ DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG
• 2.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CÁC HỢP CHẤT LIGNAN TRONG DIỆP HẠ CHÂU
• 2.4. TỔNG QUAN VỀ ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG CỦA THUỐC
• 3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
• 3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 4.1. CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP, TINH CHẾ VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC, ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC
• 4.2. XÁC ĐỊNH CHẤT LƯỢNG VÀ THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU
• 4.3. ĐIỀU CHẾ VÀ TIÊU CHUẨN HÓA CAO DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG
• 4.4. ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ THÔNG SỐ DƯỢC ĐỘNG HỌC CỦA CAO CHUẨN HÓA ĐIỀU CHẾ TỪ DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG
• PHỤ LỤC
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Diệp Hạ Châu Đắng Dược Tính Ứng Dụng

Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum., Euphorbiaceae) là dược liệu quý trong y học cổ truyền Việt Nam và thế giới. Nó nổi tiếng với khả năng hỗ trợ điều trị các bệnh về gan, đặc biệt là viêm gan B. Các nghiên cứu hiện đại đã chứng minh nhiều tác dụng dược lý của diệp hạ châu đắng, không chỉ giới hạn ở bảo vệ gan mà còn kháng viêm, chống oxy hóa và hỗ trợ điều trị ung thư. Tuy nhiên, việc tiêu chuẩn hóa các chế phẩm từ diệp hạ châu đắng còn gặp nhiều khó khăn do thiếu các chất đối chiếu chuẩn và phương pháp định lượng đặc hiệu. Dược điển Việt Nam V và Dược điển Mỹ đều có chuyên luận về diệp hạ châu đắng, nhưng chủ yếu sử dụng phyllanthin làm chất chuẩn đối chiếu, trong khi các thành phần khác như hypophyllanthin và niranthin cũng đóng vai trò quan trọng trong tác dụng dược lý. "Tổ chức y tế thế giới và Dược điển các nước đều đã đưa ra các yêu cầu kiểm tra chất lượng các thuốc từ dược liệu phải dựa trên các kỹ thuật phân tích hiện đại, với việc sử dụng các chất đối chiếu phù hợp".

1.1. Tên gọi phân loại và đặc điểm thực vật diệp hạ châu

Diệp hạ châu đắng còn được biết đến với nhiều tên gọi khác như chó đẻ răng cưa, cam kiềm. Tên khoa học của nó là Phyllanthus amarus Schum, thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae). Đây là cây thảo cao 40-80 cm, thân tròn, phân nhánh nhiều. Lá mọc so le, xếp thành hai dãy, trông như lá kép hình lông chim. Phiến lá hình bầu dục, màu xanh thẫm ở mặt trên và xanh nhạt ở mặt dưới. Quả nang, nhẵn, hình cầu, chứa 6 hạt hình tam giác. Cây ưa sáng, ẩm nhưng không chịu ngập úng, thường mọc ở ven đồi, nương rẫy, và ven đường đi.

1.2. Lịch sử sử dụng và ứng dụng truyền thống của diệp hạ châu

Diệp hạ châu đắng có lịch sử sử dụng lâu đời trong y học cổ truyền để điều trị các bệnh về gan, mật, và tiêu hóa. Kinh nghiệm dân gian và y học cổ truyền ghi nhận khả năng giải độc, mát gan, lợi tiểu của dược liệu này. Ngày nay, các nghiên cứu khoa học đã chứng minh tác dụng bảo vệ gan của diệp hạ châu đắng, đặc biệt trong các trường hợp viêm gan do virus hoặc do rượu. Nhiều sản phẩm trên thị trường sử dụng cao toàn phần diệp hạ châu đắng để hỗ trợ chức năng gan, nhưng tiêu chuẩn chất lượng thường chỉ dựa trên các phương pháp định lượng không đặc hiệu.

II. Thách Thức Trong Kiểm Định Chất Lượng Cao Diệp Hạ Châu Đắng

Việc kiểm định chất lượng các chế phẩm từ cao diệp hạ châu đắng đang đối mặt với nhiều thách thức. Sự thiếu hụt chất đối chiếu chuẩn cho các hoạt chất quan trọng như hypophyllanthin và niranthin là một trở ngại lớn. Các tiêu chuẩn cơ sở hiện hành thường chỉ tập trung vào định lượng phyllanthin, bỏ qua vai trò của các thành phần khác. Điều này dẫn đến việc đánh giá chất lượng sản phẩm không toàn diện và có thể không phản ánh chính xác hiệu quả điều trị. Bên cạnh đó, các phương pháp định lượng hiện tại thường không đủ độ đặc hiệu, gây khó khăn trong việc phân biệt và định lượng chính xác từng hoạt chất. "Trong khi tác dụng sinh học của Diệp hạ châu đắng không chỉ do phyllanthin mà còn có hypophyllanthin và niranthin. Các chất này có vai trò hết sức quan trọng trong tác dụng bảo vệ gan, kháng viêm, chống ung thư".

2.1. Vấn đề thiếu hụt chất đối chiếu chuẩn và ảnh hưởng

Sự thiếu hụt chất đối chiếu chuẩn cho hypophyllanthin và niranthin gây khó khăn trong việc xây dựng các phương pháp định lượng đặc hiệu và chính xác. Điều này ảnh hưởng đến khả năng kiểm soát chất lượng sản phẩm, đặc biệt là các chế phẩm chứa cao diệp hạ châu đắng. Các phòng thí nghiệm kiểm nghiệm thường phải tự điều chế chất đối chiếu, tốn kém thời gian và công sức, đồng thời tiềm ẩn nguy cơ sai sót. Điều này làm giảm tính tin cậy và khả năng so sánh giữa các kết quả kiểm nghiệm khác nhau.

2.2. Sự khác biệt giữa tiêu chuẩn cơ sở và tiêu chuẩn quốc tế

Các tiêu chuẩn cơ sở tự xây dựng cho các chế phẩm cao diệp hạ châu đắng thường không đáp ứng được các yêu cầu khắt khe của tiêu chuẩn quốc tế. Các tiêu chuẩn quốc tế yêu cầu sử dụng các phương pháp phân tích hiện đại và các chất đối chiếu chuẩn để đảm bảo tính chính xác và tin cậy của kết quả. Sự khác biệt này gây khó khăn cho việc xuất khẩu và cạnh tranh của các sản phẩm cao diệp hạ châu đắng trên thị trường quốc tế. Cần có sự thống nhất và hài hòa giữa các tiêu chuẩn để nâng cao chất lượng và uy tín của sản phẩm.

2.3. Khó khăn trong việc định lượng các hoạt chất sinh học

Việc định lượng chính xác các hoạt chất sinh học trong cao diệp hạ châu đắng là một thách thức lớn. Các phương pháp định lượng không đặc hiệu thường không thể phân biệt được giữa các hoạt chất khác nhau, dẫn đến kết quả sai lệch. Các phương pháp sắc ký như HPLC và LC-MS có thể cung cấp độ đặc hiệu cao hơn, nhưng đòi hỏi phải có chất đối chiếu chuẩn và quy trình phân tích được tối ưu hóa. Việc phát triển và thẩm định các phương pháp định lượng đặc hiệu là rất cần thiết để đảm bảo chất lượng và hiệu quả của các chế phẩm cao diệp hạ châu đắng.

III. Phương Pháp Thiết Lập Chất Đối Chiếu Hypophyllanthin Niranthin

Để giải quyết vấn đề thiếu hụt chất đối chiếu, một trong những hướng đi quan trọng là tiến hành chiết xuất, phân lập và tinh chế các hoạt chất từ cây diệp hạ châu đắng. Quá trình này đòi hỏi sự kết hợp của nhiều kỹ thuật khác nhau, từ chiết xuất bằng dung môi, sắc ký cột, đến sắc ký lớp mỏng. Sau khi thu được các chất phân lập, cần tiến hành xác định cấu trúc và độ tinh khiết bằng các phương pháp hiện đại như NMR, DSC và HPLC. Việc thiết lập chất đối chiếu cần tuân thủ các quy trình nghiêm ngặt, bao gồm đánh giá liên phòng thí nghiệm và xác định giá trị ấn định.

3.1. Quy trình chiết xuất phân lập và tinh chế hypophyllanthin niranthin

Quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế hypophyllanthin và niranthin từ diệp hạ châu đắng bao gồm nhiều bước. Đầu tiên, dược liệu được chiết xuất bằng dung môi phù hợp. Sau đó, các dịch chiết được phân đoạn bằng sắc ký cột. Các phân đoạn chứa hypophyllanthin và niranthin được tinh chế tiếp bằng sắc ký lớp mỏng điều chế hoặc sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Cuối cùng, các chất phân lập được kiểm tra độ tinh khiết bằng các phương pháp như HPLC và DSC.

3.2. Xác định cấu trúc và độ tinh khiết bằng các phương pháp hiện đại

Việc xác định cấu trúc của các chất phân lập được thực hiện bằng các phương pháp phổ nghiệm như NMR (cộng hưởng từ hạt nhân). Độ tinh khiết của các chất được đánh giá bằng các phương pháp như HPLC và DSC (phân tích nhiệt vi sai). Các dữ liệu phổ nghiệm và phân tích nhiệt được so sánh với các dữ liệu đã công bố để xác định cấu trúc và đánh giá độ tinh khiết của các chất.

3.3. Đánh giá liên phòng thí nghiệm và xác định giá trị ấn định

Để đảm bảo chất lượng của chất đối chiếu, cần tiến hành đánh giá liên phòng thí nghiệm. Các mẫu chất đối chiếu được gửi đến nhiều phòng thí nghiệm khác nhau để phân tích. Kết quả phân tích từ các phòng thí nghiệm khác nhau được so sánh và đánh giá để xác định độ đồng đều và độ tin cậy của chất đối chiếu. Sau khi đánh giá liên phòng thí nghiệm, giá trị ấn định cho chất đối chiếu được xác định dựa trên kết quả phân tích từ các phòng thí nghiệm khác nhau.

IV. Tiêu Chuẩn Hóa Cao Diệp Hạ Châu Đắng Bí Quyết Kiểm Soát Chất Lượng

Việc tiêu chuẩn hóa cao diệp hạ châu đắng là bước quan trọng để đảm bảo chất lượng và hiệu quả của các chế phẩm từ dược liệu này. Quy trình tiêu chuẩn hóa bao gồm việc lựa chọn phương pháp chiết xuất tối ưu, xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho cao, và kiểm nghiệm chất lượng cao theo các tiêu chuẩn đã xây dựng. Các tiêu chuẩn chất lượng cần bao gồm các chỉ tiêu về định tính, định lượng các hoạt chất, độ ẩm, tro, kim loại nặng, và giới hạn nhiễm khuẩn. Việc áp dụng các tiêu chuẩn này sẽ giúp kiểm soát chất lượng sản phẩm từ nguyên liệu đầu vào đến thành phẩm.

4.1. Lựa chọn phương pháp chiết xuất tối ưu và quy trình chuẩn hóa

Việc lựa chọn phương pháp chiết xuất tối ưu là yếu tố quan trọng để thu được cao diệp hạ châu đắng có hàm lượng hoạt chất cao. Các yếu tố cần xem xét khi lựa chọn phương pháp chiết xuất bao gồm dung môi, nhiệt độ, thời gian chiết, và tỷ lệ dược liệu: dung môi. Sau khi lựa chọn được phương pháp chiết xuất tối ưu, cần xây dựng quy trình chuẩn hóa để đảm bảo tính ổn định và khả năng lặp lại của quy trình.

4.2. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và các chỉ tiêu kiểm nghiệm

Tiêu chuẩn chất lượng cho cao diệp hạ châu đắng cần bao gồm các chỉ tiêu về định tính, định lượng các hoạt chất, độ ẩm, tro, kim loại nặng, và giới hạn nhiễm khuẩn. Các chỉ tiêu định lượng cần bao gồm hàm lượng của phyllanthin, hypophyllanthin, và niranthin. Các phương pháp kiểm nghiệm cần được thẩm định để đảm bảo tính chính xác, độ đặc hiệu, độ nhạy, và độ tin cậy.

4.3. Ứng dụng các phương pháp sắc ký HPLC LC MS trong kiểm nghiệm

Các phương pháp sắc ký như HPLC và LC-MS được sử dụng rộng rãi trong kiểm nghiệm cao diệp hạ châu đắng. HPLC được sử dụng để định lượng các hoạt chất chính, trong khi LC-MS được sử dụng để định tính và định lượng các hoạt chất phức tạp. Việc sử dụng các phương pháp sắc ký giúp đảm bảo tính chính xác và độ đặc hiệu của kết quả kiểm nghiệm.

V. Nghiên Cứu Dược Động Học Cao Diệp Hạ Châu Đắng Đánh Giá SKD

Nghiên cứu dược động học là yếu tố then chốt để đánh giá sinh khả dụng và hiệu quả điều trị của cao diệp hạ châu đắng. Các thông số dược động học như AUC, Cmax, Tmax, và T1/2 cung cấp thông tin quan trọng về quá trình hấp thu, phân bố, chuyển hóa, và thải trừ của các hoạt chất trong cơ thể. Việc xác định các thông số này giúp tối ưu hóa liều dùng và đường dùng của cao diệp hạ châu đắng, đồng thời cung cấp cơ sở khoa học cho việc chứng minh hiệu quả điều trị.

5.1. Các thông số dược động học cần đánh giá AUC Cmax Tmax T1 2

Các thông số dược động học cần đánh giá bao gồm AUC (diện tích dưới đường cong), Cmax (nồng độ tối đa trong huyết tương), Tmax (thời gian đạt nồng độ tối đa), và T1/2 (thời gian bán thải). AUC phản ánh tổng lượng thuốc tiếp xúc với cơ thể. Cmax phản ánh tốc độ hấp thu của thuốc. Tmax phản ánh thời gian đạt nồng độ tối đa của thuốc. T1/2 phản ánh tốc độ thải trừ của thuốc.

5.2. Phương pháp phân tích dược động học HPLC MS MS và quy trình

Phương pháp LC-MS/MS (sắc ký lỏng khối phổ hai lần) là một trong những phương pháp phân tích dược động học hiệu quả. Phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho phép định lượng chính xác các hoạt chất trong mẫu sinh học như huyết tương. Quy trình phân tích dược động học bao gồm các bước chuẩn bị mẫu, phân tích bằng LC-MS/MS, và xử lý dữ liệu để tính toán các thông số dược động học.

5.3. Ứng dụng kết quả dược động học trong tối ưu hóa liều dùng

Kết quả dược động học được sử dụng để tối ưu hóa liều dùng và đường dùng của cao diệp hạ châu đắng. Dựa trên các thông số dược động học, có thể xác định liều dùng phù hợp để đạt được nồng độ thuốc hiệu quả trong cơ thể. Đồng thời, có thể lựa chọn đường dùng phù hợp để tối ưu hóa quá trình hấp thu của thuốc.

VI. Điểm Mới Hướng Phát Triển Nghiên Cứu Về Cao Diệp Hạ Châu Đắng

Nghiên cứu về cao diệp hạ châu đắng vẫn còn nhiều tiềm năng phát triển. Các nghiên cứu trong tương lai có thể tập trung vào việc khám phá các tác dụng dược lý mới của cao, đánh giá hiệu quả điều trị trên các đối tượng bệnh nhân khác nhau, và phát triển các dạng bào chế mới để nâng cao sinh khả dụng. Đồng thời, cần tiếp tục hoàn thiện quy trình tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm chất lượng để đảm bảo tính an toàn và hiệu quả của sản phẩm.

6.1. Khám phá các tác dụng dược lý mới và tiềm năng ứng dụng

Diệp hạ châu đắng được cho là có nhiều tiềm năng ứng dụng, hiện tại, các nghiên cứu mới đây tập trung vào các tác dụng dược lý mới bao gồm khả năng chống oxy hóa, kháng viêm, và hỗ trợ điều trị ung thư. Việc khám phá các tác dụng này có thể mở ra các ứng dụng mới cho cao diệp hạ châu đắng trong điều trị các bệnh khác nhau.

6.2. Phát triển các dạng bào chế mới để nâng cao sinh khả dụng

Việc phát triển các dạng bào chế mới có thể giúp nâng cao sinh khả dụng của cao diệp hạ châu đắng. Các dạng bào chế mới như nanoemulsion, liposome, và solid dispersion có thể cải thiện độ tan và khả năng hấp thu của các hoạt chất, từ đó tăng hiệu quả điều trị.

6.3. Hoàn thiện quy trình tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm chất lượng

Việc hoàn thiện quy trình tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm chất lượng là rất cần thiết để đảm bảo tính an toàn và hiệu quả của cao diệp hạ châu đắng. Cần xây dựng các tiêu chuẩn chất lượng toàn diện, bao gồm các chỉ tiêu về định tính, định lượng các hoạt chất, độ ẩm, tro, kim loại nặng, và giới hạn nhiễm khuẩn. Đồng thời, cần áp dụng các phương pháp kiểm nghiệm hiện đại và được thẩm định để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án Tiến sĩ Dược học với đề tài "Thiết lập chất đối chiếu hypophyllanthin, niranthin và xác định một số thông số dược động học của cao chuẩn hóa điều chế từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum., Euphorbiaceae)" được thực hiện bởi nghiên cứu sinh Phạm Văn Sơn, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Nguyễn Ngọc Vinh tại Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh (chuyên ngành Kiểm nghiệm thuốc và Độc chất, mã số 62720410, năm 2021).

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum., Euphorbiaceae) là dược liệu được sử dụng phổ biến trong y học cổ truyền và y học hiện đại với tác dụng chính là cải thiện chức năng gan, bảo vệ tế bào gan và hỗ trợ điều trị viêm gan, đặc biệt là viêm gan B. Dược điển Việt Nam V và Dược điển Mỹ (USP) hiện hành đã có các chuyên luận về dược liệu, bột và cao Diệp hạ châu đắng, tuy nhiên các chỉ tiêu định tính và định lượng hiện thời chủ yếu chỉ sử dụng một chất điểm chỉ là phyllanthin. Trong thực tế, tác dụng sinh học của Diệp hạ châu đắng còn phụ thuộc vào các hợp chất lignan quan trọng khác như hypophyllanthin và niranthin với các hoạt tính bảo vệ gan, kháng viêm, chống oxy hóa.

Hiện nay, nhiều chế phẩm thương mại từ Diệp hạ châu đắng lưu hành trên thị trường được bào chế từ cao toàn phần và công bố chất lượng theo tiêu chuẩn cơ sở tự xây dựng. Phần lớn các tiêu chuẩn này chỉ định lượng hỗn hợp toàn phần bằng phương pháp không đặc hiệu, chưa định lượng đồng thời các lignan có hoạt tính và chưa xác định mức hàm lượng hoạt chất trong liều điều trị. Nguyên nhân chính là do thiếu chất chuẩn đối chiếu (các chất chuẩn thương mại chưa sẵn có, giá thành cao), thiếu cao chuẩn đối chiếu và chưa có các nghiên cứu đầy đủ về dược động học của các hoạt chất chính từ chế phẩm chuẩn hóa.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định 4 mục tiêu cụ thể:

1. Chiết xuất, phân lập, tinh chế hypophyllanthin, niranthin từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum.).
2. Thiết lập chất đối chiếu hypophyllanthin, niranthin từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum.).
3. Điều chế và tiêu chuẩn hóa cao Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum.).
4. Đánh giá một số thông số dược động học của cao chuẩn hóa điều chế từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum.).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Toàn cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum., Euphorbiaceae); các phân đoạn chiết xuất, cao khô chuẩn hóa và các hợp chất lignan tinh khiết (hypophyllanthin, niranthin, phyllanthin, nirtetralin, phyltetralin); mẫu sinh học huyết tương thỏ sau khi sử dụng cao chuẩn hóa đường uống.
• Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu được thực hiện tại Khoa Dược – Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh và các phòng kiểm nghiệm thuộc Viện Kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ Chí Minh (Khoa Kiểm nghiệm Đông dược - Dược liệu, Khoa Thiết lập chất đối chiếu - Chất chuẩn, Khoa Vật lý đo lường, Khoa Dược lý, Khoa Vi sinh, Trung tâm Đánh giá tương đương sinh học), hoàn thành năm 2021.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước đây

Tổng quan tài liệu của luận án đã hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến thành phần hóa học, phương pháp chiết xuất, phân lập, định lượng và đánh giá sinh khả dụng/dược động học của các hợp chất lignan trong chi Phyllanthus:

Tác giả, năm công bố	Đối tượng / Hợp chất	Phương pháp chiết xuất, phân lập / Phân tích	Kết quả chính
Kassuya và cs. (2003)	P. amarus / Nirtetralin, niranthin, hypophyllanthin, phyltetralin, phyllanthin	Chiết ngâm n-hexan, sắc ký cột silica gel 60 với pha động n-hexan – ethyl acetat	Phân lập được 5 lignan chính
Maciel M. M. và cs. (2007)	P. amarus / Phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin, isolintetralin, demethylenedioxy-niranthin, 5-demethoxy-niranthin	Chiết ngấm kiệt bằng methanol, sắc ký cột silica gel	Phân lập và xác định cấu trúc 6 hợp chất lignan
Srivastava V. và cs. (2008)	P. amarus / Phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin, nirtetralin	Chiết ngấm kiệt bằng ethanol, sắc ký cột silica gel, tinh chế bằng kết tinh và sắc ký lỏng điều chế (HPLC điều chế)	Thu được 6,10 g phyllanthin; 1,60 g hypophyllanthin; 300 mg niranthin; 200 mg nirtetralin
Parvathaneni M. và cs. (2013)	P. amarus / Phyllanthin, hypophyllanthin	Chiết Soxhlet bằng n-hexan, sắc ký cột và tinh chế bằng HPLC điều chế	Độ tinh khiết các chất đạt trên 95%
Yuandani và cs. (2013)	P. amarus / Phyllanthin, hypophyllanthin	Chiết ngâm methanol, sắc ký cột chân không (VLC) và sắc ký cột thường, kết tinh lại	Thu được 115 mg phyllanthin và 235,5 mg hypophyllanthin độ tinh khiết > 98%
Liu S. và cs. (2014)	P. niruri / Niranthin	Chiết ethanol 80%, phân đoạn ether dầu hỏa, sắc ký cột silica gel	Thu được 4,1 g niranthin độ tinh khiết 99%
Garg C. và cs. (2016)	P. amarus / Phyllanthin	Chiết xuất hỗ trợ vi sóng (MAE)	Tối ưu hóa MAE với methanol 65%, thời gian 3 phút cho hàm lượng phyllanthin 0,063%
Noor M. và cs. (2019)	P. amarus / Hypophyllanthin, niranthin, lintetralin	Chiết ethanol, phân đoạn dung môi, sắc ký cột và HPLC điều chế pha đảo	Phân lập hypophyllanthin từ cao n-hexan, niranthin và lintetralin từ cao ethanol
Huỳnh Ngọc Thụy (2008)	P. amarus / Nirurin, epibubbialin, phyllanthin, acid p-coumaric, acid gallic, uracil	Chiết ethanol, phân đoạn theo định hướng tác dụng sinh học	Phân lập được 6 hợp chất tinh khiết
Lữ Thị Kim Chi, Nguyễn Ngọc Vinh (2012)	P. amarus / Phyllanthin	Chiết nóng dicloromethan quy mô 9 kg, sắc ký cột silica gel, kết tinh lại	Phân lập 890 mg phyllanthin tinh sạch và thiết lập chất chuẩn phyllanthin; định lượng HPLC-PDA
Murugaiyah V. và cs. (2007)	P. niruri / Phyllanthin, hypophyllanthin, phyltetralin, niranthin	HPLC đầu dò huỳnh quang; đánh giá dược động học đường tiêm và uống trên chuột	Tmax khoảng 1 giờ; sinh khả dụng tuyệt đối đường uống lần lượt là 0,62%; 1,52%; 4,01% và 2,66%
Fan H. và cs. (2015)	P. urinaria / Hypophyllanthin, phyllanthin, nirtetralin, niranthin	HPLC-MS/MS trong huyết tương chuột	Phát hiện hiện tượng hấp thu kép với 2 đỉnh Cmax trên đường cong nồng độ - thời gian
Nguyen Van Long và cs. (2019)	P. amarus / Phyllanthin	LC-MS/MS trong huyết tương chuột sau khi uống cao chuẩn hóa và phức hợp phospholipid	Xác định thông số dược động học của phyllanthin với liều 2 mg/kg (AUC0-t = 18,07 ng.h/mL, Cmax = 11,44 ng/mL, Tmax = 0,25 h, T1/2 = 5,24 h)

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết

Các nghiên cứu trước đây tại Việt Nam chủ yếu tập trung vào việc chiết xuất, định tính, định lượng và thiết lập chất đối chiếu đối với đơn chất phyllanthin. Chưa có công trình nào trong nước thiết lập toàn diện các chất đối chiếu quốc gia cho hypophyllanthin và niranthin theo các hướng dẫn chuẩn hóa quốc tế (ISO, AOAC, ICH). Đồng thời, các quy trình định lượng đồng thời 4 lignan chính trong dược liệu và cao chiết chưa được thẩm định hoàn chỉnh, và chưa có nghiên cứu dược động học đa thành phần của cao Diệp hạ châu đắng chuẩn hóa trên mô hình động vật thực nghiệm (thỏ) bằng phương pháp sắc ký khối phổ hai lần (LC-MS/MS).

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

• Lý thuyết phân lập và xác định cấu trúc hợp chất tự nhiên: Dựa trên đặc tính hóa lý của nhóm lignan có khung dibenzylbutan và dẫn xuất tetralin (tính tan trong dung môi hữu cơ phân cực trung bình và kém phân cực, tính hấp phụ trên pha tĩnh silica gel, phân bố pha đảo C18). Cấu trúc hóa học được xác định thông qua phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D ($^{1}\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, NOESY), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS) và phân tích nhiệt vi sai (DSC).
• Nguyên lý thiết lập chất đối chiếu: Áp dụng theo các hướng dẫn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Dược điển Mỹ (USP), Dược điển Châu Âu (EP), Dược điển Việt Nam V và tiêu chuẩn ISO 17034 / ISO/IEC 17025 về xác định độ tinh khiết, tính đồng nhất, độ ổn định và đánh giá liên phòng thí nghiệm để ấn định giá trị hàm lượng.
• Nguyên lý phân tích sinh học và dược động học: Dựa trên hướng dẫn thẩm định phương pháp phân tích mẫu sinh học của US-FDA (2018), Cơ quan Quản lý Dược phẩm Châu Âu EMA (2015) và Dược điển Việt Nam V. Các thông số dược động học cơ bản gồm $C_{\max}$, $T_{\max}$, $\text{AUC}{0-t}$, $\text{AUC}{0-\infty}$, $T_{1/2}$, $K_e$ được xác định theo mô hình không ngăn (non-compartmental analysis).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Giám định tên khoa học dược liệu: Phương pháp hình thái học thực vật kết hợp phương pháp sinh học phân tử bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) khuếch đại đoạn gen ITS1 – ITS4 và tra cứu BLAST trên ngân hàng gen NCBI.
• Chiết xuất và phân lập:
  • Khảo sát dung môi chiết xuất: n-hexan, dicloromethan (DCM), ethyl acetat (EtOAc), ethanol (EtOH), methanol (MeOH).
  • Chiết hồi lưu phân đoạn và chiết ngấm kiệt; phân tách bằng sắc ký lỏng chân không (VLC) và sắc ký cột cổ điển (silica gel 60, kích thước hạt 0,040 - 0,063 mm và 0,063 - 0,200 mm).
  • Tinh chế chất bằng kết tinh phân đoạn với hệ dung môi thích hợp và sắc ký lỏng điều chế (Prep-HPLC).
• Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc:
  • Kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò dãy diod quang (HPLC-PDA) ở nhiều hệ dung môi và bước sóng khác nhau, phân tích nhiệt vi sai (DSC).
  • Đo điểm chảy; ghi và giải mã phổ $^{1}\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$ (500 MHz / 125 MHz), DEPT, COSY, HSQC, HMBC, NOESY.
• Thẩm định quy trình phân tích và thiết lập chất đối chiếu:
  • Thẩm định phương pháp xác định độ tinh khiết sắc ký và phương pháp định lượng đồng thời 4 lignan theo hướng dẫn ICH: tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ lặp lại, độ chính xác trung gian, độ đúng (tỷ lệ phục hồi).
  • Đánh giá liên phòng thí nghiệm giữa các phòng thí nghiệm đạt chuẩn GLP/ISO 17025.
  • Ấn định giá trị hàm lượng chất đối chiếu theo công thức cân bằng khối lượng (mass balance).
• Quy trình điều chế và tiêu chuẩn hóa cao Diệp hạ châu đắng:
  • Khảo sát các thông số chiết xuất ở quy mô phòng thí nghiệm và quy mô pilot (tỷ lệ dung môi/dược liệu, thời gian ngâm/chiết, số lần chiết).
  • Kiểm nghiệm chất lượng cao khô theo DĐVN V: cảm quan, độ ẩm (mất khối lượng do làm khô), tro toàn phần, giới hạn kim loại nặng (chì, cadmi, thủy ngân, arsen), giới hạn nhiễm khuẩn, định tính và định lượng hàm lượng lignan toàn phần và từng hợp chất.
• Phương pháp định lượng trong mẫu sinh học và đánh giá dược động học:
  • Xử lý mẫu huyết tương thỏ: Chiết lỏng - lỏng bằng dung môi hữu cơ kết hợp tủa protein huyết tương.
  • Hệ thống phân tích: Sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC-MS/MS) với chế độ theo dõi phản ứng đa kênh (MRM), sử dụng chất chuẩn nội (IS) thích hợp.
  • Thiết kế thử nghiệm dược động học: Cho thỏ thực nghiệm uống cao Diệp hạ châu đắng chuẩn hóa pha trong chất dẫn thích hợp; lấy mẫu máu tĩnh mạch tai thỏ tại các thời điểm xác định ($t = 0$ trước khi uống và các mốc thời gian sau uống); ly tâm tách huyết tương, bảo quản ở $-20^\circ\text{C}$ cho đến khi phân tích.

---

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Trình bày bối cảnh sử dụng dược liệu Diệp hạ châu đắng trong điều trị bệnh gan; thực trạng thiếu hụt chất chuẩn đối chiếu ngoài phyllanthin (đặc biệt là hypophyllanthin và niranthin); hạn chế trong công tác kiểm nghiệm và tiêu chuẩn hóa các chế phẩm thương phẩm trên thị trường; sự cần thiết của việc xây dựng quy trình chuẩn hóa cao và xác định thông số dược động học in vivo. Xác lập 4 mục tiêu nghiên cứu cụ thể của đề tài.

Tổng quan tài liệu

• Tổng quan Diệp hạ châu đắng: Vị trí phân loại thực vật (Phyllanthus amarus Schum., họ Euphorbiaceae, bộ Euphorbiales), đặc điểm hình thái thực vật, vùng phân bố sinh thái, kỹ thuật gieo trồng và thu hái toàn cây. Tổng hợp thành phần hóa học chi tiết gồm các nhóm: alkaloid (epibubbialin, securinin...), flavonoid (quercetin, rutin, astragalin...), lignan (phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin, nirtetralin, phyltetralin...), tannin và polyphenol (corilagin, geraniin, acid ellagic, acid gallic...), triterpen và sterol. Phân tích tác dụng sinh học đã được chứng minh: bảo vệ tế bào gan, kháng viêm, kháng virus (đặc biệt HBV, HIV), chống oxy hóa, hạ đường huyết, kháng khuẩn; dữ liệu độc tính cấp cho thấy dược liệu không thể hiện độc tính ở liều thử nghiệm đường uống lên đến 5000 mg/kg trên chuột.
• Phương pháp nghiên cứu chiết xuất, phân lập hợp chất lignan: Tổng quan các kỹ thuật chiết xuất bằng dung môi hữu cơ thông thường, chiết lỏng siêu tới hạn ($\text{CO}_2$ siêu tới hạn), chiết xuất có hỗ trợ vi sóng (MAE), chiết dưới áp suất cao (PLE) và các phương pháp tinh chế (kết tinh lại, sắc ký cột pha thuận/pha đảo, Prep-HPLC).
• Phương pháp định lượng lignan: Điểm luận các phương pháp phân tích trong dược liệu, cao chiết và mẫu sinh học bằng HPTLC, HPLC-UV/PDA, HPLC đầu dò huỳnh quang, UPLC và LC-MS/MS.
• Khái niệm cao đối chiếu và đánh giá sinh khả dụng/dược động học: Quy định của USP, EP về cao đối chiếu; các thông số dược động học cốt lõi ($C_{\max}$, $T_{\max}$, $\text{AUC}$, $T_{1/2}$); các yêu cầu thẩm định phương pháp phân tích dịch sinh học theo US-FDA, EMA và DĐVN V.

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

• Đối tượng, nguyên vật liệu và thiết bị: Dược liệu Diệp hạ châu đắng thu hái và kiểm tra chất lượng; động vật thí nghiệm (thỏ); danh mục hóa chất, dung môi tinh khiết phân tích, chất chuẩn đối chiếu thương mại; hệ thống thiết bị phân tích sắc ký HPLC-PDA, Prep-HPLC, LC-MS/MS, máy đo nhiệt vi sai DSC, máy quang phổ NMR 500 MHz.
• Nội dung và các bước tiến hành: Sơ đồ nghiên cứu tổng thể; quy trình định danh dược liệu bằng giải trình tự gen đoạn ITS1 – ITS4; quy trình chiết xuất cao toàn phần bằng dicloromethan quy mô lớn; quy trình sắc ký cột phân lập các phân đoạn giàu lignan; kỹ thuật tinh chế phân đoạn VII và XII; phương pháp thẩm định quy trình xác định độ tinh khiết và quy trình định lượng; quy trình điều chế cao khô quy mô pilot; quy trình chiết mẫu huyết tương thỏ và thẩm định phương pháp LC-MS/MS; thiết kế lấy mẫu máu tai thỏ và tính toán thông số dược động học.

Kết quả nghiên cứu

Nội dung kết quả nghiên cứu được triển khai theo 4 phần trọng tâm:

[Dược liệu Phyllanthus amarus]
           Định lượng LC-MS/MS trong huyết tương & Tính toán thông số PK:
           Cmax, Tmax, AUC(0-t), AUC(0-inf), T1/2 của Phyllanthin, 
           Hypophyllanthin, Niranthin

1. Chiết xuất, phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc các chất

• Định danh dược liệu: Mẫu dược liệu nghiên cứu có đặc điểm hình thái và giải phẫu phù hợp với mô tả của Phyllanthus amarus Schum. Kết quả tra cứu BLAST trên NCBI đoạn gen khuếch đại với cặp mồi ITS1 – ITS4 xác nhận độ tương đồng 99-100% với loài Phyllanthus amarus.
• Chiết xuất và phân lập: Từ cao chiết dicloromethan (DCM) toàn phần, thực hiện sắc ký cột silica gel thu được các phân đoạn chính. Phân đoạn VII và phân đoạn XII là các phân đoạn giàu lignan. Sau khi khảo sát các điều kiện sắc ký điều chế và kết tinh lại, đã phân lập và tinh chế thành công 5 hợp chất lignan tinh khiết:
  • Chất PA2: Niranthin
  • Chất PA3: Nirtetralin
  • Chất PA4: Hypophyllanthin
  • Chất PA5: Phyltetralin
  • Chất PA6: Phyllanthin
• Xác định cấu trúc hóa học: Cấu trúc của các chất PA2, PA3, PA4, PA5, PA6 được khẳng định chính xác thông qua đối chiếu đầy đủ các số liệu phổ $^{1}\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, NOESY với các tài liệu chuẩn đã công bố quốc tế.
• Kiểm tra độ tinh khiết ban đầu: Các hợp chất phân lập được kiểm tra trên SKLM (cho 1 vết duy nhất với các hệ dung môi khác nhau), HPLC-PDA (độ tinh khiết pic sắc ký > 98%) và nhiệt vi sai DSC (nhiệt độ nóng chảy sắc nét, hàm lượng nhiệt động học cao).

2. Xác định chất lượng và thiết lập chất đối chiếu

• Đã xây dựng và thẩm định đầy đủ phương pháp xác định độ tinh khiết sắc ký trên HPLC-PDA cho hypophyllanthin, niranthin và nirtetralin. Các phương pháp đều đạt yêu cầu nghiêm ngặt về tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu (pic đối xứng, không có pic tạp chồng lấn), khoảng tuyến tính có hệ số tương quan $r > 0{,}999$, độ lặp lại và độ chính xác trung gian có $\text{RSD} < 1{,}0%$.
• Tiến hành đánh giá liên phòng thí nghiệm độc lập tại các phòng kiểm nghiệm đạt chuẩn GLP/ISO 17025 đối với hypophyllanthin và niranthin.
• Tính toán cân bằng khối lượng (trừ đi hàm lượng ẩm, tro, dung môi tồn dư và tạp chất hữu cơ) để ấn định giá trị hàm lượng chuẩn:
  • Thiết lập chất đối chiếu Hypophyllanthin: Độ tinh khiết ấn định đạt mức chất chuẩn đối chiếu dùng trong phân tích định lượng.
  • Thiết lập chất đối chiếu Niranthin: Độ tinh khiết ấn định đạt mức chất chuẩn đối chiếu dùng trong phân tích định lượng.
  • Xác định độ tinh khiết và thiết lập hồ sơ kiểm soát cho nirtetralin.

3. Điều chế và tiêu chuẩn hóa cao Diệp hạ châu đắng

• Khảo sát quy trình chiết xuất: Khảo sát ảnh hưởng của các loại dung môi (nước, ethanol các độ cồn khác nhau, dicloromethan, ethyl acetat), tỷ lệ dược liệu : dung môi, thời gian ngâm và số lần chiết ở quy mô phòng thí nghiệm và quy mô pilot. Lựa chọn được điều kiện chiết tối ưu cho hiệu suất thu hồi 4 lignan (phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin, nirtetralin) cao nhất và lượng cắn phù hợp.
• Xây dựng quy trình định lượng đồng thời 4 lignan: Phát triển phương pháp HPLC pha đảo sử dụng đầu dò UV-Vis/PDA để định lượng đồng thời phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin và nirtetralin trong mẫu dược liệu và cao khô. Phương pháp được thẩm định đầy đủ về khoảng tuyến tính, LOD, LOQ, độ lặp lại ($\text{RSD} < 2{,}0%$) và độ đúng (độ thu hồi từ 98% đến 102%).
• Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho cao khô Diệp hạ châu đắng: Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn chất lượng gồm các chỉ tiêu: Cảm quan (bột khô tơi, màu nâu, vị đắng đặc trưng), mất khối lượng do làm khô, tro toàn phần, giới hạn kim loại nặng (Pb, Cd, Hg, As), giới hạn vi sinh vật, định tính bằng SKLM và HPLC so sánh với cao chuẩn/chất chuẩn đối chiếu, định lượng hàm lượng phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin và nirtetralin.

4. Đánh giá một số thông số dược động học trên thỏ

• Phát triển và thẩm định phương pháp LC-MS/MS:
  • Tối ưu hóa điều kiện sắc ký khối phổ: Cột sắc ký pha đảo, hệ pha động chứa đệm amoni format 5 mM – acetonitril, khảo sát thế phân mảnh và ion phân mảnh đặc trưng cho từng lignan và chất chuẩn nội (IS) ở chế độ MRM.
  • Tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu huyết tương thỏ: Khảo sát dung môi tủa protein và dung môi chiết lỏng - lỏng (n-hexan), thể tích dung môi và số lần chiết, đạt hiệu suất chiết cao và ổn định, hệ số ảnh hưởng nền mẫu ($\text{Matrix Factor}$) nằm trong giới hạn cho phép theo EMA/US-FDA.
  • Thẩm định phương pháp trên huyết tương: Đạt yêu cầu về tính chọn lọc/đặc hiệu, khoảng tuyến tính, LLOQ, độ đúng và độ chính xác trong ngày và khác ngày ($\text{CV} \le 15%$, tại LLOQ $\le 20%$), độ ổn định mẫu trong các điều kiện bảo quản và rã đông.
• Kết quả dược động học in vivo: Cho thỏ uống hỗn dịch cao Diệp hạ châu đắng chuẩn hóa. Định lượng nồng độ phyllanthin, hypophyllanthin và niranthin trong huyết tương tại các thời điểm lấy mẫu sau khi uống. Xây dựng đường cong nồng độ thuốc trong huyết tương theo thời gian và tính toán các thông số dược động học trung bình: nồng độ đỉnh ($C_{\max}$), thời gian đạt nồng độ đỉnh ($T_{\max}$), diện tích dưới đường cong ($\text{AUC}{0-t}$ và $\text{AUC}{0-\infty}$), thời gian bán thải ($T_{1/2}$) và hằng số tốc độ thải trừ ($K_e$) của từng hoạt chất.

Điểm mới của đề tài

Tổng hợp các phát hiện mới mang tính hệ thống từ công trình phân lập, thiết lập chất đối chiếu, tiêu chuẩn hóa cao đến dữ liệu dược động học in vivo của các lignan chính trong Diệp hạ châu đắng.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học và lý luận

1. Đã phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc hóa học hoàn chỉnh bằng các phương pháp phổ hiện đại ($^{1}\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, NOESY, MS, DSC) cho 5 hợp chất lignan tinh khiết từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum.) gồm: phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin, nirtetralin và phyltetralin.
2. Thiết lập thành công 2 chất đối chiếu mới là Hypophyllanthin và Niranthin theo đúng các nguyên tắc và hướng dẫn quốc tế (ISO, AOAC, ICH, DĐVN V), được thẩm định phương pháp phân tích độ tinh khiết và đánh giá liên phòng thí nghiệm để ấn định giá trị hàm lượng làm chất đối chiếu chuẩn hóa.
3. Cung cấp dữ liệu khoa học toàn diện đầu tiên về các thông số dược động học ($C_{\max}$, $T_{\max}$, $\text{AUC}{0-t}$, $\text{AUC}{0-\infty}$, $T_{1/2}$) của đồng thời các lignan (phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin) sau khi cho thỏ uống cao Diệp hạ châu đắng chuẩn hóa bằng phương pháp phân tích độ nhạy cao LC-MS/MS.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn

1. Cung cấp nguồn chất đối chiếu hypophyllanthin và niranthin chất lượng cao, phục vụ trực tiếp cho công tác kiểm tra, giám sát chất lượng dược liệu và các chế phẩm chứa Diệp hạ châu đắng tại các viện kiểm nghiệm và nhà máy sản xuất dược phẩm trong nước, giảm phụ thuộc vào nguồn chuẩn nhập khẩu đắt tiền.
2. Xây dựng và thẩm định thành công quy trình HPLC-PDA định lượng đồng thời 4 hợp chất lignan có hoạt tính sinh học trong dược liệu và cao chiết, có thể ứng dụng trong kiểm nghiệm thường quy.
3. Hoàn thiện quy trình điều chế ở quy mô pilot và xây dựng bộ tiêu chuẩn cơ sở hoàn chỉnh cho nguyên liệu cao khô Diệp hạ châu đắng chuẩn hóa hàm lượng hoạt chất, tạo tiền đề nâng cao chất lượng các dạng thuốc thành phẩm bảo vệ gan từ thảo dược.
4. Dữ liệu dược động học trên động vật thực nghiệm là cơ sở khoa học quan trọng phục vụ việc ước định liều dùng, thiết kế chế độ phân liều và tối ưu hóa dạng bào chế cho các sản phẩm từ Diệp hạ châu đắng.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Đề xuất Hội đồng Dược điển Việt Nam xem xét bổ sung chỉ tiêu định lượng đồng thời hypophyllanthin và niranthin bên cạnh phyllanthin trong chuyên luận Dược liệu Diệp hạ châu đắng và Cao đặc/Cao khô Diệp hạ châu đắng trong các lần tái bản tiếp theo của Dược điển Việt Nam.
• Khuyến nghị các cơ sở sản xuất thuốc dược liệu chuyển đổi từ việc sử dụng cao toàn phần không định lượng sang sử dụng cao khô chuẩn hóa có kiểm soát hàm lượng tối thiểu của các hợp chất lignan chính.
• Mở rộng ứng dụng quy trình phân tích LC-MS/MS đã thẩm định vào các nghiên cứu tương đương sinh học và sinh khả dụng trên người đối với các sản phẩm thành phẩm chứa Diệp hạ châu đắng.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế:
  • Thử nghiệm dược động học của cao chuẩn hóa mới được thực hiện trên động vật thực nghiệm (thỏ), chưa tiến hành đánh giá sinh khả dụng và dược động học trực tiếp trên người tình nguyện khỏe mạnh hoặc bệnh nhân viêm gan.
  • Số lượng chất đối chiếu được thiết lập hoàn chỉnh hồ sơ liên phòng thí nghiệm dừng lại ở 2 chất chính (hypophyllanthin và niranthin); nirtetralin và phyltetralin mới chỉ dừng ở mức xác định độ tinh khiết và kiểm soát nội bộ.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Tiếp tục hoàn thiện hồ sơ thiết lập chất đối chiếu cấp quốc gia cho các lignan còn lại (nirtetralin, phyltetralin).
  • Nghiên cứu phát triển các dạng bào chế hiện đại (như phức hợp phospholipid, tự vi nhũ hóa, hạt nano) từ cao chuẩn hóa nhằm cải thiện độ tan và tăng sinh khả dụng đường uống của các hợp chất lignan kém tan.
  • Tiến hành thử nghiệm lâm sàng đánh giá dược động học và hiệu quả điều trị bảo vệ gan của cao chuẩn hóa trên người.

---

Giá trị tham khảo

Luận án có giá trị tham khảo chuyên môn cao trong các lĩnh vực:

• Nghiên cứu sinh và học viên cao học ngành Kiểm nghiệm thuốc, Dược liệu - Dược học cổ truyền, Hóa hợp chất thiên nhiên: Tham khảo quy trình phân lập, tinh chế lignan, quy trình xử lý và giải đoán phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều ($^{1}\text{H}$, $^{13}\text{C}$, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, NOESY), phương pháp phân tích nhiệt vi sai DSC và quy trình thẩm định phương pháp phân tích sắc ký theo hướng dẫn ICH.
• Các Viện, Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc và phòng kiểm nghiệm nhà máy dược phẩm: Ứng dụng quy trình định lượng đồng thời 4 lignan bằng HPLC-PDA, sử dụng chất đối chiếu hypophyllanthin và niranthin để xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và kiểm soát chất lượng nguyên liệu, thành phẩm chứa Diệp hạ châu đắng.
• Các nhà nghiên cứu Dược lý và Dược động học: Tham khảo phương pháp phát triển và thẩm định quy trình định lượng hoạt chất tự nhiên trong mẫu sinh học bằng kỹ thuật LC-MS/MS theo hướng dẫn của US-FDA/EMA và phương pháp xử lý dữ liệu dược động học in vivo.
• Nhà hoạch định chính sách và Hội đồng Dược điển: Cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm để nâng cấp các chuyên luận dược liệu và cao thuốc trong Dược điển Việt Nam.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao luận án cần thiết lập thêm chất đối chiếu hypophyllanthin và niranthin ngoài phyllanthin?

Dược điển Việt Nam V và Dược điển Mỹ hiện hành chỉ quy định phyllanthin làm chất điểm chỉ định tính và định lượng. Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu dược lý đã chứng minh tác dụng bảo vệ gan, kháng viêm và chống khối u của Diệp hạ châu đắng là tác dụng tổng hợp của nhiều lignan, trong đó hypophyllanthin và niranthin đóng vai trò then chốt. Việc chỉ kiểm soát phyllanthin không phản ánh đầy đủ chất lượng toàn diện của dược liệu và chế phẩm, trong khi hai chất chuẩn này chưa sẵn có trên thị trường trong nước và giá thành nhập ngoại rất đắt.

2. Các hợp chất lignan tinh khiết nào đã được phân lập và xác định cấu trúc trong luận án?

Luận án đã phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc hóa học bằng các phương pháp quang phổ hiện đại ($^{1}\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, 2D-NMR, MS, DSC) cho 5 hợp chất lignan từ cao dicloromethan của Diệp hạ châu đắng gồm:

• PA2: Niranthin ($\text{C}{24}\text{H}{32}\text{O}_7$, phân tử lượng 432,5 g/mol)
• PA3: Nirtetralin ($\text{C}{24}\text{H}{30}\text{O}_7$, phân tử lượng 430,5 g/mol)
• PA4: Hypophyllanthin ($\text{C}{24}\text{H}{30}\text{O}_7$, phân tử lượng 430,5 g/mol)
• PA5: Phyltetralin ($\text{C}{24}\text{H}{32}\text{O}_6$, phân tử lượng 416,5 g/mol)
• PA6: Phyllanthin ($\text{C}{24}\text{H}{34}\text{O}_6$, phân tử lượng 418,5 g/mol)

3. Kỹ thuật phân tích nào được sử dụng để định lượng lignan trong mẫu huyết tương thỏ?

Luận án sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC-MS/MS) vận hành ở chế độ theo dõi phản ứng đa kênh (MRM), kết hợp chất chuẩn nội (IS) thích hợp. Phương pháp xử lý mẫu là chiết lỏng - lỏng bằng dung môi n-hexan sau khi tủa protein huyết tương. Phương pháp được thẩm định đầy đủ theo các tiêu chí khắt khe của US-FDA (2018) và EMA (2015) về tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới (LLOQ), độ đúng, độ chính xác và hệ số ảnh hưởng nền mẫu.

4. Quy trình điều chế cao khô Diệp hạ châu đắng chuẩn hóa được kiểm soát những chỉ tiêu chất lượng nào?

Quy trình điều chế cao khô được tối ưu hóa ở quy mô pilot và kiểm soát theo dự thảo Tiêu chuẩn cơ sở gồm các chỉ tiêu: cảm quan, độ ẩm (mất khối lượng do làm khô), tro toàn phần, giới hạn kim loại nặng (chì, cadmi, thủy ngân, arsen), giới hạn nhiễm khuẩn theo DĐVN V; định tính bằng SKLM và HPLC; định lượng đồng thời hàm lượng 4 hợp chất lignan hoạt tính (phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin và nirtetralin) bằng phương pháp HPLC-PDA đã được thẩm định.

---

Kết luận

Luận án Tiến sĩ Dược học của nghiên cứu sinh Phạm Văn Sơn là một công trình nghiên cứu thực nghiệm toàn diện trong chuyên ngành Kiểm nghiệm thuốc và Độc chất, kết hợp chặt chẽ giữa hóa học phân tích, kiểm nghiệm dược liệu và dược động học. Tác giả đã phân lập thành công 5 lignan tinh khiết, thiết lập và ấn định giá trị hàm lượng cho 2 chất đối chiếu mới là hypophyllanthin và niranthin theo chuẩn mực quốc tế. Đồng thời, luận án đã chuẩn hóa quy trình điều chế cao khô Diệp hạ châu đắng giàu hoạt chất ở quy mô pilot và xác định đầy đủ các thông số dược động học in vivo của các lignan chính trên động vật thực nghiệm bằng kỹ thuật LC-MS/MS hiện đại. Kết quả nghiên cứu đóng góp trực tiếp vào công tác nâng cao tiêu chuẩn kiểm nghiệm và đảm bảo chất lượng các sản phẩm điều trị bệnh gan từ Diệp hạ châu đắng tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Việt Nam có kinh nghiệm từ lâu đời về việc sử dụng dược liệu và chế phẩm có nguồn gốc dược liệu để điều trị bệnh. Nhiều dược liệu đã được sử dụng từ rất lâu qua kinh nghiệm dân gian, kiến thức y học cổ truyền, bài thuốc gia truyền,. Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum., Euphorbiaceae) là một trong những dược liệu được sử dụng rất phổ biến và đã được công nhận sử dụng chẳng những theo Y học Việt Nam mà còn khắp nơi trên thế giới với tác dụng chính là cải thiện chức năng gan ở các đối tượng viêm gan do nhiều nguyên nhân khác nhau, đặc biệt là viêm gan B [4], [21], [53], [56], [76], [100]. Tổ chức y tế thế giới và Dược điển các nước đều đã đưa ra các yêu cầu kiểm tra chất lượng các thuốc từ dược liệu phải dựa trên các kỹ thuật phân tích hiện đại, với việc sử dụng các chất đối chiếu phù hợp [103].

Dược điển Việt Nam V đã có chuyên luận Diệp hạ châu đắng và cao đặc Diệp hạ châu đắng [2]. Dược điển Mỹ hiện hành cũng đã có các chuyên luận dược liệu Diệp hạ châu đắng, bột Diệp hạ châu đắng [98]. Các chuyên luận trên đều có các chỉ tiêu định tính, định lượng sử dụng chất chuẩn đối chiếu là chất điểm chỉ phyllanthin. Hiện nay, trên thị trường nhiều sản phẩm từ Diệp hạ châu đắng, chủ yếu được bào chế từ nguyên liệu là cao toàn phần, với công dụng là có hiệu quả trong tác dụng bảo vệ gan.

Tất cả những sản phẩm này đều công bố chất lượng dựa trên tiêu chuẩn cơ sở tự xây dựng. Đa số, các tiêu chuẩn cơ sở của các thành phẩm được xây dựng chỉ dựa trên việc định lượng hỗn hợp toàn phần bằng phương pháp không đặc hiệu, không đưa được chỉ tiêu định lượng các hợp chất có hoạt tính sinh học cũng như chưa xác định mức hàm lượng cho các chất có hoạt tính trong liều điều trị do thiếu chất chuẩn đối chiếu và chưa có nghiên cứu về dược động học của các chất có hoạt tính sinh học cho các sản phẩm từ dược liệu này. Trong khi tác dụng sinh học của Diệp hạ châu đắng không chỉ do phyllanthin mà còn có hypophyllanthin và niranthin. Các chất này có vai trò hết sức quan trọng trong tác dụng bảo vệ gan, kháng viêm, chống ung thư [30], [67].

Bên cạnh đó, công tác tiêu chuẩn hóa dược liệu hay sản phẩm từ dược liệu còn tương đối khó khăn và đang còn bỏ ngõ trong lĩnh vực kiểm nghiệm do thiếu phương pháp thử, chất chuẩn đối chiếu, cao chuẩn đối chiếu,. Mặt khác, các chất chuẩn đối chiếu chưa sẵn có và giá thành rất cao; phương pháp thử cũng cần xây dựng cho phù hợp với trình độ khoa học kỹ thuật chung của cả thế giới để nâng cao chất lượng các sản phẩm trên. Ngoài ra, nghiên cứu sinh khả dụng nhằm đánh giá các thông số dược động học của chế phẩm từ Diệp hạ châu đắng sẽ giúp minh chứng hỗ trợ điều trị bảo vệ gan hiệu quả hơn. Do đó, việc phân lập các chất có hoạt tính sinh học làm chất đối chiếu, tiêu chuẩn hóa cao Diệp hạ châu đắng cũng như xác định sinh khả dụng của chế phẩm để làm cơ sở cho việc kiểm tra chất lượng và ước định liều dùng cho các sản phẩm từ Diệp hạ châu đắng là hết sức cần thiết.

Từ các lý do trên, đề tài “Thiết lập chất đối chiếu hypophyllanthin, niranthin và đánh giá một số thông số dược động học của cao chuẩn hóa điều chế từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum., Euphorbiaceae)” được thực hiện với các mục tiêu cụ thể như sau: - Chiết xuất, phân lập, tinh chế hypophyllanthin, niranthin từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. - Thiết lập chất đối chiếu hypophyllanthin, niranthin từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. - Điều chế và tiêu chuẩn hóa cao Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. - Đánh giá một số thông số dược động học của cao chuẩn hóa điều chế từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. TỔNG QUAN DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG 1. Tên gọi, phân loại [1], [4] Tên thực vật: Diệp hạ châu đắng. Tên khác: Chó đẻ răng cưa, chó đẻ thân xanh, cam kiềm, kiền đắng, cỏ trân châu, rút đất, trân châu thảo, lão nha châu, diệp hòa thái.

Tên khoa học: Phyllanthus amarus Schum. Theo hệ thống phân loại của Takhtajan A. năm 2009 [94], cây Diệp hạ châu đắng có vị trí phân loại thực vật như sau: Giới (regnum) Plantae Ngành (division) Magnoliophyta (ngọc lan) Lớp (class) Magnoliopsida (ngọc lan) Bộ (ordo) Euphorbiales (thầu dầu) Họ (familia) Euphorbiaceae (thầu dầu) Chi (genus) Phyllanthus Loài (species) Phyllathus amarus Schum. Phân bố - sinh thái Euphorbiaceae là một họ thực vật lớn bao gồm khoảng 6.500 loài trong 300 chi.

Phyllanthus cũng là một chi lớn, có khoảng 200 loài ở Mỹ, 100 loài ở Châu Phi, 70 loài ở Madagascar, phần còn lại ở châu Á và châu Úc. Diệp hạ châu đắng là cây ưa sáng, ưa ẩm nhưng không chịu được ngập úng. Cây sống được trên nhiều loại đất (đất bazan, đất pha cát, đất cát, đất phù sa.) pH từ 5,0 đến 6,5. Biên độ nhiệt thích hợp cho cây sinh trưởng là 25-30 oC.

Cây ra hoa quả nhiều, tái sinh tốt từ hạt, vòng đời kéo dài 3-5 tháng. Trong tự nhiên, cây thường mọc trên đất ẩm ở ven đồi, trên nương rẫy, bãi hoang hay ven đường đi và quanh làng bản, ở cả miền núi lẫn trung du và đồng bằng [21]. Đặc điểm thực vật Cây thảo cao 40-80 cm, thân tròn, bóng, màu xanh, phân nhánh đều, nhiều. Lá mọc so le xếp thành hai dãy sít nhau trông như lá kép hình lông chim.

Phiến lá hình bầu dục, dài từ 5 mm đến 10 mm, rộng 3 mm đến 6 mm, màu xanh thẫm ở mặt trên,. màu xanh nhạt ở mặt dưới. Hoa đực và hoa cái mọc thành cụm. Hoa đực có cuống ngắn 1 mm đến 2 mm, đài 5, có tuyến mật, nhị 3, chỉ nhị dính nhau.

Hoa cái có cuống dài hơn hoa đực. Quả nang, nhẵn, hình cầu, đường kính 1,8 mm đến 2 mm, có đài tồn tại. Quả chứa 6 hạt hình tam giác, đường kính 1 mm, hạt có sọc dọc ở lưng [1]. Cây Diệp hạ châu đắng Phyllanthus amarus Schum.

Mặt dưới của lá (trái) và các quả (phải) Diệp hạ châu đắng [76] 1. Bộ phận dùng, gieo trồng, thu hái [4]. Bộ phận dùng: Toàn cây - Herba Phyllanthi amari Gieo trồng: Gieo hạt ở vườn ươm: tháng 1-2, trồng cây con: tháng 2-3, thu hoạch: tháng 4-5 (sau khi trồng 45-50 ngày). Nhìn chung, thời vụ trồng Diệp hạ châu đắng kéo dài cả mùa khô, tận dụng trời nắng để phơi.

Thu hái: Sau khi trồng khoảng 45-50 ngày, cây Diệp hạ châu đắng cao 60-70 cm là thu hoạch. Năng suất đạt 10-12 tấn tươi/ha/vụ. Một năm có thể trồng 2 vụ. Diệp hạ châu đắng là cây thuốc dễ trồng, cây không kén đất.

Thành phần hóa học trong Diệp hạ châu đắng Thành phần hóa học của Phyllanthus amarus bao gồm: lignan, alkaloid, flavonoid, tannin thủy phân (Ellagitannin), polyphenol, triterpen, sterol và tinh dầu, như bảng liệt kê trong Bảng 1. Thành phần hóa học trong Diệp hạ châu đắng Nhóm Hoạt chất Tài liệu Alkaloid Epibubbialin, isobubbialin, norsecurinin, securinin, securinol, [8], [46], 4-methoxy-nor-securinin, dihydrosecurinin, allo-securin, [76] tetrahydrosecurinin, 4-methoxy dihydrosecurinin, 4-hydrosecurinin, 4-methoxy tetrahydrosecurinin Flavonoid Quercetin, rhamnocitrin, rutin, apigenin, luteolin, kaempferol, [5], [47], allocatechin, astragalin, quercetin-3-O-glucosid, quercitrin, [76], [89] 4′,5,7-triethoxy-3,3′,6-trimethoxy flavon, phyllanthusiin Lignan Phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin, phyltetralin, [10], [53], nirtetralin, isonirtetralin, hinokinin, lintetralin, isolintetralin, [54], [76], demethylenedioxy niranthin, 5-demethoxy-niranthin, 7′- [81], [84], oxocubebin dimethyl ether, (3-(3,4-dimethoxybenzyl)-4-(7- [85], [90], methoxybenzo[1,3]dioxol-5-yl-methyl)-dihydrofuran-2-on, và [91]. Sterol Amarosterol A, amarosterol B, cycloeucalenyl acetat, [47], [76] macdougallin, ergosta-5,7,22-trien-3-ol acetat, 17-(1,5- dimethylhexyl)-6-hydroxy-5-methylestr-9-en-3-yl acetat, stigmasterol, β-sitosterol, daucosterol, stigmast-5-en-3-ol oleat, 6,7-epoxypregn-4-en-9,11,18-triol-3,20-dion, 11,18- diacetat, bufalin, 3-acetoxy-7,8-epoxylanostan-11-ol Tannin và Amariin, acid amariinic, amarulon, corilagin, geraniin, acid [47], [76] polyphenol geranic, furosin, phyllanthusiin A, B, C và D, acid ellagic, acid repandusinic, elaeocarpusin, acid 4-galloyl quinic, acid gallic, gallocatechin, 1,6-digalloylglucopyranose, acid 4-O- galloylquinic, acid quicnic, acid geraniinic B, cidrepandusinic A, isocorilagin, melatonin. Triterpen Phyllanosid, 2Z, 6Z, 10Z, 14E, 18E, 22E-farnesyl farnesol, [47], [56], linalool, phytol, olean-13(18)-en, methyl ursolat, barringenol [76] R1, Phenazin và dẫn chất phenazin 2Z, 6Z, 10Z, 14E, 18E, 22E-farnesyl farnesol, lupeol, phyllanthenol, phyllanthenon, phyllantheol, acid oleanolic, acid ursolic Nhóm Acid cinnamic, acid 4-hydroxy-3-methoxy-benzoic, acid [47], [76] khác brevifolin carboxylic, rhodopin 1.

Tính chất lý hóa một số hợp chất lignan 1. Phyllanthin [105] Công thức phân tử: C24H34O6 Phyllanthin (IUPAC): 4-[(2S,3S)-3-[(3,4-dimethoxyphenyl)methyl]-4- methoxy-2-(methoxymethyl)butyl]-1,2-dimethoxybenzen CAS: 10351-88-9 Khối lượng phân tử: 418,5 g/mol. Hệ số phân bố: log Pow = 3,2 Tính tan: tan trong dung môi hữu cơ như cloroform, methanol, ethanol, kém tan trong nước Điểm chảy: 96 C 1. Hypophyllanthin [105] Công thức phân tử: C24H30O7 Hypophyllanthin (IUPAC): (7R,8R,9S)-9-(3,4-dimethoxyphenyl)-4-methoxy- 7,8-bis(methoxymethyl)-6,7,8,9-tetrahydrobenzo[g][1,3]benzodioxol CAS: 33676-00-5 Khối lượng phân tử: 430,5 g/mol Hệ số phân bố: log Pow = 3,6 Tính tan: Tan trong dung môi hữu cơ như cloroform, dicloromethan, ethyl acetat, dimethylsulfoxid, aceton ~ 0,2 trong ethanol, ~10 mg/mL trong dimethylsulfoxid, ~ 30 mg/mL trong dimethylformamid.

Niranthin [105] Công thức phân tử: C24H32O7. Niranthin (IUPAC): 6-[(2R,3R)-3-[(3,4-dimethoxyphenyl)methyl]-4- methoxy-2-(methoxymethyl)butyl]-4-methoxy-1,3-benzodioxol. CAS: 50656-77-4 Khối lượng phân tử: 432,5 g/mol Hệ số phân bố: log Pow = 4,1 Tính tan: Tan trong dung môi cloroform, dicloromethan, ethyl acetat, dimethylsulfoxid, aceton. Nirtetralin [105] Công thức phân tử: C24H30O7 Nirtetralin (IUPAC): (5R,6S,7S)-5-(3,4-dimethoxyphenyl)-4-methoxy-6,7- bis(methoxymethyl)-5,6,7,8-tetrahydrobenzo[f] [1,3]benzodioxol CAS: 50656-78-5 Khối lượng phân tử: 430,5 g/mol Hệ số phân bố: log Pow = 3,6.

Tính tan: Tan trong dung môi cloroform, dicloromethan, ethyl acetat, dimethylsulfoxid, aceton. Phyltetralin [105] Công thức phân tử: C24H32O6 Phyltetralin (IUPAC): ((1R,2S,3S)-1-(3,4-dimethoxyphenyl)-6,7-dimethoxy- 2,3-bis(methoxymethyl)-1,2,3,4-tetrahydronaphthalen CAS: 123048-17-9 Khối lượng phân tử: 416,5 g/mol Hệ số phân bố: log Pow = 3,8 Tính tan: Tan trong: cloroform, dicloromethan, ethyl acetat, dimethylsulfoxid, aceton. MeO OMe OMe MeO OMe OMe Phyllanthin Hypophyllanthin O MeO O OMe OMe OMe OMe OMe OMe O O MeO OMe OMe OMe OMe OMe OMe OMe OMe Niranthin Nirtetralin Phyltetralin Hình 1. Công thức hóa học của một số lignan 1.

Tác dụng sinh học Diệp hạ châu đắng là một thảo dược đã được sử dụng làm thuốc từ lâu đời. Thành phần hóa học của cây rất phong phú, đa dạng, có chứa nhiều nhóm chất như alkaloid, flavonoid, lignan, tannin thủy phân (ellagitannin), polyphenol, triterpen,. sterol và tinh dầu. Diệp hạ châu đắng có nhiều tác dụng dược lý có ích trong điều trị bệnh, đã có rất nhiều công trình khoa học nghiên cứu về tác dụng dược lý của cây Diệp hạ châu đắng như tác dụng bảo vệ tế bào gan, trị viêm gan, hoạt tính kháng khối u, tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm và ký sinh trùng.

Ngoài ra, còn có hoạt tính kháng HIV, chống oxy hóa, hạ đường huyết và cholesterol trong máu. Nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng của Phyllanthus amarus trong nước cũng như trên thế giới, có thể liệt kê trong bảng sau: Bảng 1.