HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHƯƠNG HỮU PHA THIẾT KẾ VÀ ỨNG DỤNG CÁC CHỈ THỊ ADN XÁC ĐỊNH CÁC GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH KHÁNG ĐẠO ÔN Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA BẢN ĐỊA CỦA VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Người hướng dẫn khoa học: PGS. Trần Đăng Khánh PGS. Đồng Huy Giới c NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019 2 c LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS. Trần Đăng Khánh và PGS.
Đồng Huy Giới. Các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 13 tháng 05 năm 2019 Tác giả luận văn Phương Hữu Pha i c LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.
Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS. Trần Đăng Khánh và PGS. Đồng Huy Giới đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức bộ môn Kỹ thuật di truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp, đặc biệt cảm ơn NCS Nguyễn Trường Khoa đã giúp đỡ, cùng phân tích và cho phép sử dụng một số vật liệu, số liệu sử dụng trong luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt để tôi hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày 13 tháng 05 năm 2019 Tác giả luận văn Phương Hữu Pha ii c MỤC LỤC Lời cam đoan. II Mục lục .III Danh mục chữ viết tắt.
V Danh mục bảng. VI Danh mục hình. VII Trích yếu luận văn. VIII Thesis abstract.
Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu của đề tài. Phạm vi nghiên cứu. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn.
Tổng quan tài liệu. Giới thiệu về cây lúa. Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới. Tình hình sản xuất lúa gạo ở Việt Nam.
Tình hình thiệt hại gây ra bởi bệnh đạo ôn. Thiệt hại gây ra bởi bệnh đạo ôn trên thế giới. Thiệt hại gây ra bởi bệnh đạo ôn ở Việt Nam. Tình hình nghiên cứu hệ gen của lúa.
Tình hình nghiên cứu các gen kháng đạo ôn trên cây lúa. Công nghệ giải trình tự thế hệ mới và ứng dụng tin sinh học. Hệ thống giải trình tự gen Illumina. Ứng dụng tin sinh học trong phân tích kết quả giải trình tự gen.
Chỉ thị phân tử SNP. Chỉ thị ADN trong xác định gen liên quan đến kháng đạo ôn. Chỉ thị ADN. Phương pháp thiết kế chỉ thị phân tử.
Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa kháng đạo ôn. Vật liệu và phương pháp. Thời gian và địa điểm nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu.
Nguồn vật liệu. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm. Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp tầm soát gen Pit và Pi21 dựa trên trình tự genome.
Phương pháp thiết kế mồi gen Pit và Pi21 kiểm tra gen kháng Pit, Pi21. Kết quả và thảo luận. Kết quả tầm soát gen Pit kháng đạo ôn dựa trên dữ liệu trình tự genome của các giống lúa bản địa đã được giải mã. Kết quả thiết kế chỉ thị xác định gen Pit có khả năng kháng đạo ôn.
Kết quả tầm soát gen Pi21 kháng đạo ôn dựa trên dữ liệu trình tự genome của các giống lúa bản địa đã được giải mã. Kết quả thiết kế chỉ thị xác định gen Pi21 có khả năng kháng đạo ôn. Kết luận và kiến nghị .53 Danh mục các công trình, công bố .54 Tài liệu tham khảo .55 iv c DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt aa Amino acid Axit amin ADN Axit Deoxyribonucleic Vật liệu di truyền AFLP Amplified Fragment Length Đa hình chiều dài các đoạn Polymorphism được nhân bản chọn lọc Bp Base pair Cặp bazơ nitơ cs Cộng sự Cộng sự CDS Coding ADN Sequence Vùng mã hóa gen CSDL Cơ sở dữ liệu Cơ sở dữ liệu dNTP Deoxynucleotide triphosphate Đơn phân của ADN đã đươ ̣c triphosphoryl hóa GATK Genome Analysis Tool Kit Bộ công cụ phân tích hệ gen MABC Marker Assisted Backcrossing Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử kết hợp lai trở lại MAS Marker Assisted Selection Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử NGS Next generation sequencing Công nghệ giải trình tự thế hệ mới nu Nucleotide Đơn phân của RNA, AND PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp QTL/ QTLs Quantitative Trait Loci - Locus Kiểm soát tính trạng số lượng RAPD Random Amplification of Đa hình ADN được nhân Polymorphic ADN bản ngẫu nhiên RFLP Restriction Fragment Length Đa hình chiều dài mảnh Polymorphism phân cắt giới hạn SNP Single Nucleotide Polymorphisms Đa hình nucleotide đơn SSLP Simple Sequence Length Đa hình các đoạn lặp đơn Polymorphism giản SSR Simple Sequence Repeat Sự lặp lại của trình tự đơn giản v c DANH MỤC BẢNG Bảng 2. Diện tích trồng và sản lượng lúa ở Việt Nam từ năm 2007 - 2017.
Bảng vật liệu nghiên cứu. Bảng thống kê số lượng và tỉ lệ nucleotide của các gen Pit ở các giống lúa đã giải trình tự. Bảng thống kê số lượng amino acid của các gen ứng viên Pit ở các giống lúa đã giải trình tự. Bảng thống kê số lượng và tỉ lệ nucleotide của các gen Pi21 ở các giống lúa đã giải trình tự.
Bảng thống kê số lượng amino acid của các gen ứng viên Pi21 ở các giống lúa đã giải trình tự. 47 vi c DANH MỤC HÌNH Hình 2. Mô hình SNP(ww.com/singlepost /2017/03/27/What-is-a-SNP). Phương pháp tầm soát các gen Pit và Pi21 của 17 giống lúa đã giải trình tự bằng phần mềm NextGENe_V2.
Phương pháp thiết kế mồi bằng phần mềm Vetor NTI 11. Phương pháp kiểm tra tính đặc hiệu của mồi bằng phần mềm MEGA 6. Ảnh dóng hàng, dóng cột so sánh trình tự một đoạn gen kháng đạo ôn Pit của một số giống lúa bản địa. Vị trí 3 nucleotide bị thiếu ảnh hưởng làm mất 2 amino acid sau khi dịch mã.
Ảnh thiết kế mồi nhân đoạn ADN có chứa vùng chèn thêm 17 nucleotide thông qua phần mềm Vetor NTI 11. Kiểm tra sự bắt cặp của cặp mồi Pit trên 17 giống lúa. Kết quả BLAST với mồi PitF: TCTT AACGACTGCCC AA AACT. Kết quả BLAST với mồi PitR: AGATTACAGAGATTGG AAATTCTC.
Ảnh điện di sản phẩm PCR đối với cặp mồi Pit nhận biết gen Pit ở các giống lúa bản địa của Việt Nam (thứ tự các mẫu theo bảng 1). Ảnh dóng hàng, dóng cột so sánh trình tự một đoạn gen kháng đạo ôn Pi21 của một số giống lúa bản địa. Ảnh thiết kế mồi nhân đoạn ADN có chứa vùng chèn thêm 17 nucleotide thông qua phần mềm Vetor NTI 11. Kiểm tra sự bắt cặp của cặp mồi Pi21 ở vùng CDS trên 17 giống lúa.
Kết quả BLAST với mồi Pi21F: GACCCGGAGAAGCTGTGCAA GA. Kết quả BLAST với mồi Pi21R: CTTTGGGCAGCACCACTGCC. Ảnh điện di sản phẩm PCR đối với cặp mồi Pi21 nhận biết gen Pi21 ở các giống lúa bản địa của Việt Nam (thứ tự các mẫu theo bảng 1). 52 vii c TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Phương Hữu Pha Tên Luận văn: Thiết kế và ứng dụng các chỉ thị ADN xác định các gen liên quan đến tính kháng đạo ôn ở một số giống lúa bản địa của Việt Nam.
Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu - Tầm soát các gen Pit, Pi21 liên quan đến tính kháng đạo ôn ở một số giống lúa bản địa của Việt Nam đã giải trình tự. - Thiết kế được các chỉ thị ADN đặc trưng cho từng gen Pit, Pi21 kháng đạo ôn phục vụ công tác nghiên cứu, chọn tạo giống lúa kháng đạo ôn. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp tầm soát gen Pit và Pi21 dựa trên trình tự genome: - Lắp ráp và gọi SNP sử dụng phần mềm NextGENe_V2.3 (SoftGenetics LLC, State College, PA, USA) (Biswas et al.php và phần mềm phân tích di truyền tiến hóa phân tử MEGA 6.0 cho hệ điều hành Windows để dóng hàng và cột cho 17 giống lúa (http://www.php) (Tamura et al., 2013, Huu Trung Khuat và cs. Phương pháp thiết kế mồi gen Pit và Pi21 kiểm tra gen kháng Pit, Pi21: - Cặp mồi đặc hiệu được thiết kế bằng phần mềm Vector NTI Advance 11.0 được công bố vào ngày 15/12/2008 - đây là phần mềm của hãng Invirogen, Carlsbad (Jia et al.
- Mẫu lá lúa (3 tuần tuổi) được thu thập và tách chiết ADN tổng số theo phương pháp CTAB của (Obara et al. - Phản ứng PCR được tiến hành trên máy Veriti 96 giếng Thermal cycler. Tổng thể tích phản ứng là 15 µl, bao gồm: 5 µl ADN (nồng độ 10ng); 0,15 µM mồi; 0,2 mM dNTPs; 1X Buffer PCR; 2,5 mM MgCl2 và 0,25 đơn vị Taq polymerase. - Sản phẩm PCR được điện di trên gel polyacrylamide 6,0% hoặc trên gel agarose và được phát hiện dưới tia cực tím bằng phương pháp nhuộm ethidium bromide.
Kết quả chính và kết luận Tất cả 17 giống lúa bản địa nghiên cứu đều mang trình tự tương đồng với cả gen Pit và Pi21. Đối với gen Pit đã thu nhận được 9 đoạn trình tự tương đồng có độ dài ít hơn 3 nucleotide và 8 đoạn trình tự tương đồng có độ dài ít hơn 20 nucleotide (bao gồm 3 nucleotide bên trên và đoạn mất 17 nucleotide) viii c Đối với gen Pi21 đã thu nhận được 9 đoạn trình tự tương đồng có độ dài bằng và tám đoạn trình tự tương đồng của các giống còn lại có độ dài ít hơn 24 nucleotide.