Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học và Tác Dụng Ức Vi Sinh Vật của Cây Lá Lốt

Cây lá lốt (Piper lolot C.) là một loài thực vật thuộc họ hồ tiêu, nổi bật với nhiều công dụng trong y… 74 trang · Trường Đại Học Công Nghiệp Tp.Hcm · 2021.

• Tác giả: Phạm Tuấn Anh
• Người hướng dẫn: PGS. Trần Nguyễn Minh Ân
• Trường học: Trường Đại Học Công Nghiệp Tp.Hcm
• Chuyên ngành: Công Nghệ Kỹ Thuật Hóa Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học và Tác Dụng Ức Vi Sinh Vật của Cây Lá Lốt
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Tp. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN
• NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN PHẢN BIỆN
• DANH MỤC HÌNH ẢNH
• DANH MỤC BẢNG BIỂU
• DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU VỀ CÂY LÁ LỐT
• 1.1. Vị trí phân loại
• 1.2. Điều kiện sinh trưởng
• 1.3. Đặc tính thực vật
• 1.4. Thành phần hoá học
• 1.5. Hoạt tính sinh học
• 1.5.1. Hoạt tính kháng khuẩn
• 1.5.2. Hoạt tính kháng viêm
• 1.5.3. Hoạt tính kháng oxi hoá
• 1.6. Sàng lọc ảo in silico
• 1.7. Phương pháp docking phân tử
• 2. CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Mục tiêu đề tài
• 2.2. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 2.3. Nội dung nghiên cứu
• 2.4. Nghiên cứu lý thuyết
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Phương pháp cô lập và tinh chế hợp chất hữu cơ
• 2.5.2. Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất
• 2.5.3. Phương pháp định lượng kháng sinh vi pha loãng
• 2.5.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm
• 2.5.5. Phương pháp Docking phân tử trên phần mềm Autodock
• 2.6. Nguyên liệu, dụng cụ, hoá chất
• 2.7. Xử lý nguyên liệu ban đầu
• 2.8. Phân lập và tinh chế hợp chất từ cây lá lốt
• 2.8.1. Phân chia cao tổng thành cao phân đoạn
• 2.8.2. Khảo sát cao Ety Axetat
• 2.8.3. Khảo sát phân đoạn PLEA8
• 2.8.4. Khảo sát phân đoạn PLEA816
• 2.8.5. Khảo sát phân đoạn PLEA8169
• 2.8.6. Khảo sát phân đoạn PLEA81695
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Hoạt tính kháng khuẩn
• 3.2. Hoạt tính kháng viêm
• 3.3. Xác định cấu trúc hợp chất phân lập được
• 3.3.1. Cấu trúc hợp chất APL-2
• 3.3.2. Cấu trúc hợp chất APL-4
• 3.4. Kết quả docking của APL-2 VÀ APL-4
• 3.5. Đặc tính hoá lý của thuốc
• 3.6. Tính dược học của thuốc
• 3.6.1. Tính hấp thụ
• 3.6.2. Tính phân phối
• 3.6.3. Trao đổi chất
• 3.6.4. Độc tính thuốc
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về cây lá lốt và thành phần hóa học

Cây lá lốt (Piper lolot C.) là một loài thực vật thuộc họ hồ tiêu, nổi bật với nhiều công dụng trong y học cổ truyền. Thành phần hóa học của cây lá lốt rất phong phú, bao gồm các hợp chất như alkaloid, flavonoid, và phenolic. Những hợp chất này không chỉ mang lại giá trị dinh dưỡng mà còn có tác dụng kháng vi sinh vật, kháng viêm và chống oxi hóa. Nghiên cứu về thành phần hóa học của cây lá lốt đã chỉ ra rằng nó chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao, góp phần vào việc phát triển các sản phẩm dược phẩm tự nhiên.

1.1. Nguồn gốc và phân bố của cây lá lốt

Cây lá lốt có nguồn gốc từ vùng Tây Ghast, Kerala của Ấn Độ và hiện nay được trồng rộng rãi ở nhiều nước nhiệt đới, trong đó có Việt Nam. Cây thường mọc hoang dại ở các khu vực ẩm ướt, ven suối và được sử dụng phổ biến trong ẩm thực cũng như y học cổ truyền.

1.2. Đặc điểm thực vật của cây lá lốt

Cây lá lốt là loại cây thân cỏ, cao từ 30-40 cm, với lá hình tim, màu xanh đậm và có mùi thơm đặc trưng. Hoa của cây mọc từ nách lá, có bông cái dài khoảng 1 cm. Mùa ra hoa từ tháng 8 đến tháng 10, tạo ra quả mọng chứa một hạt.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu cây lá lốt

Mặc dù cây lá lốt đã được nghiên cứu nhiều, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc xác định chính xác các hợp chất hóa học và hoạt tính sinh học của nó. Việc phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ cây lá lốt gặp khó khăn do sự đa dạng của các hợp chất có trong cây. Hơn nữa, việc ứng dụng các hợp chất này trong y học hiện đại cũng cần nhiều nghiên cứu hơn để đảm bảo tính an toàn và hiệu quả.

2.1. Khó khăn trong việc phân lập hợp chất

Quá trình phân lập các hợp chất từ cây lá lốt thường gặp khó khăn do sự tương tác phức tạp giữa các hợp chất. Điều này đòi hỏi các phương pháp chiết xuất và phân tích hiện đại để đạt được kết quả chính xác.

2.2. Thách thức trong ứng dụng y học

Việc ứng dụng các hợp chất từ cây lá lốt trong y học hiện đại cần phải trải qua nhiều thử nghiệm lâm sàng để đảm bảo tính an toàn và hiệu quả. Điều này là một thách thức lớn đối với các nhà nghiên cứu và phát triển sản phẩm.

III. Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học của cây lá lốt

Nghiên cứu thành phần hóa học của cây lá lốt thường sử dụng các phương pháp chiết xuất như chiết xuất bằng dung môi, sắc ký lớp mỏng và phân tích NMR. Những phương pháp này giúp xác định cấu trúc và hoạt tính của các hợp chất có trong cây. Việc áp dụng công nghệ hiện đại trong nghiên cứu sẽ giúp nâng cao độ chính xác và hiệu quả trong việc phân tích thành phần hóa học.

3.1. Phương pháp chiết xuất và phân lập

Các phương pháp chiết xuất như chiết xuất bằng ethanol hoặc methanol thường được sử dụng để thu nhận các hợp chất từ cây lá lốt. Sau đó, các hợp chất này sẽ được phân lập bằng sắc ký lớp mỏng để xác định cấu trúc.

3.2. Phân tích cấu trúc hợp chất

Phân tích cấu trúc của các hợp chất được thực hiện thông qua các kỹ thuật như NMR và GC-MS. Những phương pháp này giúp xác định chính xác cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất.

IV. Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh vật của cây lá lốt

Nghiên cứu cho thấy cây lá lốt có hoạt tính kháng vi sinh vật đáng kể, đặc biệt là đối với một số chủng vi khuẩn như Salmonella spp và Staphylococcus aureus. Các hợp chất chiết xuất từ lá lốt đã được chứng minh có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn, mở ra tiềm năng ứng dụng trong y học và dược phẩm.

4.1. Hoạt tính kháng khuẩn của chiết xuất lá lốt

Chiết xuất từ lá lốt cho thấy khả năng kháng khuẩn mạnh mẽ, đặc biệt là đối với các vi khuẩn gây bệnh. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng chiết xuất có thể ức chế sự phát triển của nhiều chủng vi khuẩn khác nhau.

4.2. Ứng dụng trong điều trị bệnh

Với hoạt tính kháng vi sinh vật cao, chiết xuất từ cây lá lốt có thể được ứng dụng trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn. Điều này mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm dược phẩm tự nhiên từ cây lá lốt.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu cây lá lốt

Cây lá lốt không chỉ là một loại thực phẩm mà còn là một nguồn dược liệu quý giá với nhiều hoạt tính sinh học. Nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng của cây lá lốt cần được tiếp tục để khai thác tối đa giá trị của nó trong y học và nông nghiệp. Tương lai của nghiên cứu cây lá lốt hứa hẹn sẽ mang lại nhiều ứng dụng mới và hiệu quả trong việc phát triển sản phẩm tự nhiên.

5.1. Tương lai của nghiên cứu cây lá lốt

Nghiên cứu về cây lá lốt sẽ tiếp tục được mở rộng, đặc biệt là trong việc khám phá các hợp chất mới và ứng dụng của chúng trong y học. Các nghiên cứu lâm sàng sẽ giúp xác định rõ hơn về hiệu quả và an toàn của các sản phẩm từ cây lá lốt.

5.2. Khuyến nghị cho nghiên cứu tiếp theo

Cần có thêm nhiều nghiên cứu về cây lá lốt để xác định rõ hơn về các hợp chất có hoạt tính sinh học. Việc hợp tác giữa các nhà khoa học và các tổ chức y tế sẽ giúp thúc đẩy nghiên cứu và phát triển sản phẩm từ cây lá lốt.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Thực vật tự nhiên từ lâu đã là nguồn cung cấp các hợp chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học đa dạng như phenolic, alkaloid, flavonoid, saponin, đóng vai trò nền tảng trong y học cổ truyền và nghiên cứu phát triển tân dược. Chi Hồ tiêu (Piper L.) thuộc họ Hồ tiêu (Piperaceae) bao gồm hơn 2.000 loài phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Trong đó, cây lá lốt (Piper lolot C.) là loài thực vật quen thuộc tại Việt Nam, vừa được sử dụng phổ biến trong ẩm thực làm rau gia vị, vừa là vị thuốc dân gian có vị nồng, hơi cay, tính ấm, tác dụng ôn trung, giảm đau lưng, đau khớp, trị nôn mửa, đầy hơi, khó tiêu và tiêu chảy.

Cùng với sự phát triển của hóa học các hợp chất thiên nhiên và phương pháp mô phỏng máy tính (in silico), việc chiết tách, giải mã cấu trúc hóa học và đánh giá hoạt tính sinh học của các phân đoạn cao chiết từ cây lá lốt trở thành hướng tiếp cận quan trọng nhằm cung cấp cơ sở dữ liệu khoa học cho việc ứng dụng và tổng hợp các hoạt chất trị liệu.

Mục tiêu nghiên cứu của khóa luận được xác định cụ thể gồm:

1. Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất hóa học từ dịch chiết cây lá lốt (Piper lolot C.).
2. Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật và hoạt tính kháng viêm của các cao chiết phân đoạn từ cây lá lốt.
3. Tiến hành sàng lọc ảo mô phỏng docking phân tử (in silico) và đánh giá đặc tính dược động học (ADMET) của các hợp chất phân lập được với thụ thể protein đích mã hiệu 2VF5:PDB.

Nhiệm vụ nghiên cứu bao gồm:

1. Điều chế và chiết các cao phân đoạn từ mẫu cây lá lốt thu hái thực tế.
2. Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ sạch.
3. Thử nghiệm đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng viêm của các cao chiết phân đoạn.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Cây lá lốt (Piper lolot C.) thuộc họ Hồ tiêu (Piperaceae).
• Phạm vi không gian: Mẫu thực vật tươi được thu hái tại huyện Tân Hiệp, tỉnh Kiên Giang; quá trình thực nghiệm chiết xuất, thử nghiệm hoạt tính sinh học được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Hóa sinh dược - Viện Vật liệu ứng dụng (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) phối hợp với Khoa Công nghệ Hóa học - Trường Đại học Công nghiệp TP.HCM; phổ NMR đo tại Viện Hóa học và phổ LC/MS đo tại Viện Hóa sinh biển (Hà Nội).
• Phạm vi thời gian: Đề tài thực hiện từ ngày 25/09/2021 đến ngày 14/11/2021.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Về cơ sở thực vật học và hóa học, đề tài xác định vị trí phân loại học của cây lá lốt: Giới Plantae, Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta), Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida), Phân lớp Ngọc Lan (Magnoliidae), Bộ Hồ tiêu (Piperales), Họ Hồ tiêu (Piperaceae), Chi Hồ tiêu (Piper), Loài Piper lolot C. Nghiên cứu tổng quan các nhóm hợp chất đặc trưng đã công bố trên chi Piper như alkaloid, neolignan, benzoic acid, flavonoid, cùng các nghiên cứu trong nước về thành phần tinh dầu lá lốt (chứa các cấu tử chính như $\beta$-caryophyllene, $\alpha$-muurolene, $\gamma$-cadinene).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm và công cụ phân tích bao gồm:

• Phương pháp chiết xuất và phân lập: Áp dụng kỹ thuật ngâm dầm bột mẫu khô với dung môi ethanol 96° ở nhiệt độ phòng (3 lần, mỗi lần 3 ngày) để thu cao toàn phần. Phân chia cao tổng thành các cao phân đoạn bằng phương pháp chiết rắn - lỏng / lỏng - lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexane, ethyl acetate (EA) và methanol (Me).
• Kỹ thuật sắc ký: Sử dụng sắc ký lớp mỏng (TLC) pha thuận trên bản mỏng tráng sẵn silica gel để thăm dò hệ dung môi và theo dõi phân đoạn; hiện hình vết sắc ký bằng đèn tử ngoại và thuốc thử $H_2SO_4$ 2% trong EtOH 50%. Tách phân đoạn bằng sắc ký cột cổ điển (Column Chromatography - CC) với chất hấp phụ pha tĩnh silica gel. Tinh chế hợp chất sạch bằng sắc ký lớp mỏng điều chế (Preparative TLC - PTLC).
• Phương pháp xác định cấu trúc hóa học: Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D gồm phổ proton ($^1\text{H-NMR}$, 500 MHz), phổ carbon ($^{13}\text{C-NMR}$, 125 MHz), DEPT, HMBC, HSQC trên máy BRUKER Avante 500 với chất chuẩn nội TMS (sử dụng dung môi MeOD hoặc $CDCl_3 + MeOD$). Phổ khối ghi trên thiết bị Agilent 1260 series single quadrupole LC/MS.
• Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn: Sử dụng phương pháp định lượng kháng sinh vi pha loãng trên đĩa 96 giếng với môi trường canh thang Mueller-Hinton để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) trên hai chủng vi khuẩn thử nghiệm: Pseudomonas aeruginosa (vi khuẩn Gram âm) và Methicillin-resistant Staphylococcus aureus - MRSA (vi khuẩn Gram dương).
• Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm và độc tính tế bào in vitro: Đo độc tính tế bào trên dòng tế bào đại thực bào chuột RAW 264.7. Đánh giá hoạt tính kháng viêm thông qua khả năng ức chế sản sinh gốc tự do Nitric Oxide ($\bullet\text{NO}$) kích thích bởi lipopolysaccharide (LPS, 1 $\mu\text{g/mL}$) trên tế bào RAW 264.7 bằng phản ứng so màu với thuốc thử Griess (hỗn hợp sulfanilamide 1% và N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride 0,1%), đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 540 nm; sử dụng Dexamethasone (15 $\mu\text{M}$) và L-NMMA làm đối chứng.
• Phương pháp sàng lọc ảo in silico (Molecular Docking và ADMET): Mô phỏng gắn kết phối tử - protein (ligand-receptor docking) bằng phần mềm AutoDock / AutoDockTools-1; tối ưu hóa cấu trúc ligand bằng phần mềm Avogadro; trực quan hóa liên kết 2D/3D bằng Discovery Studio 2021 Client và Molegro Molecular Viewer. Thụ thể đích được chọn là enzyme có mã hiệu 2VF5:PDB (tâm hoạt tính chuỗi X, tọa độ X=26.11). Đánh giá các thông số năng lượng tự do Gibbs ($\Delta G^\circ$), hằng số ức chế ($K_i$), liên kết hydro và các chỉ số ADMET (hấp thụ, phân phối, chuyển hóa, thải trừ, độc tính).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Giới thiệu về cây lá lốt (Piper lolot C.)

Chương 1 tổng thuật các kiến thức về cây lá lốt và chi Piper, bao gồm nguồn gốc phân bố (từ vùng Tây Ghats, Kerala của Ấn Độ, du nhập vào Đông Dương thế kỷ 17–18, phân bố rộng ở Việt Nam với các tên gọi địa phương như tất bát, pâu pat, phjăc pat, anakhia táo, lau khuẩy), vị trí phân loại học và đặc tính thực vật học (cây thân thảo cao 30–40 cm, lá đơn hình tim mọc so le, hoa cụm bông khác gốc, quả mọng 1 hạt).

Tác giả hệ thống hóa các nghiên cứu thành phần hóa học trên các loài chi Piper trên thế giới (phân lập các dẫn xuất benzoic acid, neolignan, flavonoid, alkaloid như piperolactam, brachyamide, cenocladamide) và tại Việt Nam (nghiên cứu chưng cất tinh dầu của Nguyễn Xuân Dũng năm 1995 xác định $\beta$-caryophyllene chiếm 30,9% ở thân và 27,1% ở lá; nghiên cứu GC-MS của Đặng Thị Thanh Nhàn năm 2013). Chương này cũng tổng hợp dữ liệu về các hoạt tính sinh học đã công bố: hoạt tính kháng khuẩn của Huỳnh Kim Diệu và Nguyễn Thành Văn (2011) trên 8 chủng vi khuẩn; hoạt tính kháng viêm trên mô hình chuột của Wibool Ridtitid (2007); hoạt tính chống oxy hóa quét gốc DPPH của Hồ Bá Vương và Nguyễn Xuân Duy. Đồng thời, chương 1 cung cấp cơ sở lý thuyết về kỹ thuật sàng lọc ảo in silico và phương pháp docking phân tử trong nghiên cứu phát triển thuốc.

Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 trình bày chi tiết mục tiêu, đối tượng, nội dung và các quy trình kỹ thuật được áp dụng trong đề tài. Nội dung bao gồm nguyên lý hoạt động và các bước tiến hành của:

• Phương pháp chiết xuất ngâm dầm với cồn 96°.
• Các kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột pha thuận (CC) và sắc ký lớp mỏng điều chế (PTLC).
• Nguyên lý phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT, COSY, HMBC, HSQC) và phương pháp xác định độ dịch chuyển hóa học, hằng số ghép spin ($J$).
• Quy trình thử nghiệm vi pha loãng xác định MIC và MBC đối với vi khuẩn trên môi trường Mueller-Hinton theo chuẩn CLSI.
• Quy trình đánh giá độc tính tế bào và định lượng hàm lượng nitrite/NO bằng thuốc thử Griess trên tế bào RAW 264.7.
• Quy trình thiết lập hộp lưới (grid parameter file), chuẩn bị thụ thể protein 2VF5:PDB và mô phỏng docking trên phần mềm AutoDock.

Chương 3. Nguyên liệu, dụng cụ, hoá chất

Chương 3 mô tả quá trình thu thập nguyên liệu và tiến trình thực nghiệm phân lập hóa học:

• Xử lý nguyên liệu ban đầu: Thu hái 20 kg cây lá lốt tươi tại huyện Tân Hiệp, tỉnh Kiên Giang, làm sạch, phơi khô trong bóng râm, xay nhỏ thu được 3 kg bột khô. Tiến hành ngâm dầm 3 lần với ethanol 96° (mỗi lần 3 ngày), lọc và cô quay chân không thu được 230 g cao tổng toàn phần.
• Phân chia cao tổng: 230 g cao tổng được phân tách rắn - lỏng thu được 10 g cao n-hexane, 50 g cao ethyl acetate (EA) và 170 g cao methanol.
• Quy trình phân lập từ 50 g cao EA:
  1. Tiến hành sắc ký cột pha thuận 50 g cao EA với hệ dung môi n-hexane : ethyl acetate : methanol (20:1:0,2 đến 100% MeOH), thu được 18 phân đoạn (ký hiệu PLEA1 đến PLEA18).
  2. Phân đoạn PLEA8 (khối lượng 4,4964 g) được chọn để sắc ký cột tiếp theo với hệ dung môi ete dầu hỏa : ethyl acetate : methanol (15:1:0,2 đến 12:1:0,2), thu được 17 phân đoạn (PLEA81 đến PLEA817).
  3. Phân đoạn PLEA816 (khối lượng 1,200 g) được sắc ký cột với hệ ete dầu hỏa : acetone : methanol (20:2:0,x), thu được 11 phân đoạn (PLEA8161 đến PLEA81611).
  4. Phân đoạn PLEA8169 (khối lượng 253,5 mg) được sắc ký cột pha thuận qua các hệ dung môi (2:1 Ete:Chloroform, 1:1 Ete:Chloroform, Chloroform 100%, 9:1 Chloroform:EA), thu được 8 phân đoạn (PLEA81691 đến PLEA81698).
  5. Phân đoạn PLEA81695 hiển thị 2 vết tách rời rõ rệt trên TLC; do lượng mẫu nhỏ, tác giả sử dụng sắc ký lớp mỏng điều chế (PTLC) với hệ dung môi Chloroform : Ethyl acetate (2:1), phân lập thành công 2 hợp chất sạch: APL-2 (7 mg) và APL-4 (6 mg).

Chương 4. Kết quả nghiên cứu

Chương 4 công bố toàn bộ dữ liệu thực nghiệm và kết quả phân tích:

1. Hoạt tính kháng khuẩn: Đánh giá giá trị MIC và MBC của các cao phân đoạn (PL-H, PL-M, PL-W, PL-EA) trên 2 chủng P. aeruginosa và MRSA.
2. Hoạt tính kháng viêm và độc tính tế bào:
   • Độc tính: Ở nồng độ 50 $\mu\text{g/mL}$, toàn bộ các cao chiết và đối chứng Dexamethasone (15 $\mu\text{M}$) không gây độc cho tế bào RAW 264.7. Cao nước an toàn nhất (ở 500 $\mu\text{g/mL}$ tỷ lệ tế bào sống sót đạt 93,65%), trong khi cao methanol gây độc ở nồng độ cao (ở 100 $\mu\text{g/mL}$ tỷ lệ sống sót còn khoảng 60%).
   • Kháng viêm: Tất cả các cao phân đoạn đều thể hiện hoạt tính ức chế sinh NO rõ rệt ở nồng độ từ 10 $\mu\text{g/mL}$ trở lên. Cao hexane và ethyl acetate thể hiện hoạt tính kháng viêm nổi bật nhất thông qua ức chế mạnh mẽ NO trên tế bào RAW 264.7.
3. Xác định cấu trúc hóa học 2 hợp chất phân lập:
   • Hợp chất APL-2 (7 mg): Bột màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 208–210 °C. Dữ liệu phổ $^1\text{H-NMR}$ ($\text{MeOD}$, 500 MHz): $\delta_\text{H}$ 7,57 (1H, d, $J=2\text{ Hz}$, H-2), 6,84 (1H, d, $J=9\text{ Hz}$, H-5), 7,56 (1H, dd, $J=2\text{ và }9\text{ Hz}$, H-6), 3,91 (3H, s, $-\text{OCH}3$). Phổ $^{13}\text{C-NMR}$ ($\text{MeOD}$, 125 MHz): $\delta\text{C}$ 123,1 (C-1), 125,2 (C-2), 152,6 (C-3), 148,6 (C-4), 115,8 (C-5), 113,8 (C-6), 170,1 (C-7, $-\text{COOH}$), 56,4 (C-8, $-\text{OCH}_3$). Kết hợp tương quan HMBC và tài liệu tham khảo, APL-2 được xác định là 4-hydroxy-3-methoxybenzoic acid (Vanillic acid).
   • Hợp chất APL-4 (6 mg): Bột màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 112–116 °C. Dữ liệu phổ $^1\text{H-NMR}$ ($CDCl_3 + MeOD$, 500 MHz): $\delta_\text{H}$ 9,79 (1H, s, $-\text{CHO}$), 7,75 (2H, d, $J=8,5\text{ Hz}$, H-2/H-6), 6,92 (2H, d, $J=9\text{ Hz}$, H-3/H-5). Phổ $^{13}\text{C-NMR}$ ($CDCl_3 + MeOD$, 125 MHz): $\delta_\text{C}$ 128,7 (C-1), 115,8 (C-2/C-6), 132,3 (C-3/C-5), 163,2 (C-4), 191,4 (C-7, $-\text{CHO}$). Phân tích phổ HSQC, HMBC và so sánh tài liệu tham khảo nhận danh APL-4 là 4-hydroxybenzaldehyde.
4. Kết quả mô phỏng Docking phân tử và ADMET:
   • Mô phỏng tương tác của APL-2 và APL-4 trên protein thụ thể 2VF5:PDB (chuỗi X). Cấu dạng bền nhất của APL-2 (pose 404/500) hình thành liên kết hydro với các acid amin hoạt tính trên chuỗi X gồm ARG599 (khoảng cách 2,64 Å với nguyên tử NE và 2,94 Å với NH2) và ASN600 (với nguyên tử OD1). Cấu dạng bền nhất của APL-4 là pose 460/500.

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã thu được các kết quả định lượng cụ thể qua các bảng thực nghiệm:

Chủng vi khuẩn thử nghiệm	Cao phân đoạn / Mẫu thử	Giá trị MIC (mg/mL)	Giá trị MBC (mg/mL)
Pseudomonas aeruginosa	Cao Hexane (PL-H)	4	> 4
	Cao Methanol (PL-M)	2	> 4
	Cao Nước (PL-W)	2	> 4
	Cao Ethyl Acetate (PL-EA)	4	> 4
	DMSO (Đối chứng)	8%	8%
MRSA	Cao Hexane (PL-H)	2	> 4
	Cao Methanol (PL-M)	4	> 4
	Cao Nước (PL-W)	> 4	> 4
	Cao Ethyl Acetate (PL-EA)	2	> 4
	DMSO (Đối chứng)	16%	16%

Ký hiệu mẫu	Khối lượng thu nhận	Trạng thái / Tính chất vật lý	Tên hợp chất xác định
APL-2	7 mg	Bột màu trắng, $t^\circ_\text{nc} = 208\text{--}210\text{ }^\circ\text{C}$	Vanillic acid (4-hydroxy-3-methoxybenzoic acid)
APL-4	6 mg	Bột màu trắng, $t^\circ_\text{nc} = 112\text{--}116\text{ }^\circ\text{C}$	4-hydroxybenzaldehyde

Các phát hiện và đóng góp chính của đề tài bao gồm:

• Thiết lập quy trình chiết xuất và phân lập tuần tự qua nhiều bước sắc ký cột pha thuận và sắc ký lớp mỏng điều chế từ cao ethyl acetate của cây lá lốt, tinh chế thành công 2 hợp chất phenolic đơn phân tử có độ tinh khiết cao.
• Khẳng định hoạt tính kháng khuẩn in vitro của các cao phân đoạn lá lốt ở mức độ kìm khuẩn trung bình trên cả vi khuẩn Gram âm (P. aeruginosa) và Gram dương kháng thuốc (MRSA), trong đó cao n-hexane và ethyl acetate có hoạt tính ức chế tốt nhất trên MRSA (MIC = 2 mg/mL).
• Cung cấp dẫn chứng thực nghiệm về tính an toàn tế bào (ở nồng độ $\le 50\text{ }\mu\text{g/mL}$) và hoạt tính kháng viêm mạnh mẽ của các cao phân đoạn thông qua khả năng ức chế con đường tiết NO trên dòng tế bào đại thực bào RAW 264.7.
• Kết hợp thành công giữa hóa học thực nghiệm và mô hình tính toán sinh học phân tử in silico, làm sáng tỏ cơ chế liên kết phối tử - protein giữa các hợp chất phân lập với thụ thể 2VF5:PDB qua các liên kết hydro đặc hiệu với acid amin ARG599 và ASN600.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

• Quá trình phân lập mới chỉ thực hiện trên một nhánh phân đoạn nhỏ của cao ethyl acetate (phân đoạn PLEA81695), chưa mở rộng khảo sát các phân đoạn khác của cao ethyl acetate cũng như toàn bộ cao n-hexane và cao methanol.
• Lượng hợp chất sạch thu được còn hạn chế (APL-2: 7 mg; APL-4: 6 mg), chỉ đủ phục vụ đo phổ cấu trúc NMR và mô phỏng in silico, chưa tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn và kháng viêm trực tiếp trên từng đơn chất sạch.
• Thử nghiệm sinh học mới dừng lại ở mức in vitro trên 2 chủng vi khuẩn và 1 dòng tế bào đại thực bào chuột.

Hướng nghiên cứu tiếp theo được đề xuất:

• Tiếp tục phân lập và tinh chế các hợp chất hữu cơ từ các phân đoạn còn lại của cao ethyl acetate, cao n-hexane và cao methanol.
• Mở rộng đánh giá hoạt tính sinh học (kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, chống oxy hóa) trực tiếp trên các hợp chất tinh khiết APL-2 và APL-4.
• Thực hiện các thử nghiệm in vivo trên mô hình động vật nhằm đánh giá toàn diện cơ chế dược lý và độc tính trước khi ứng dụng vào nghiên cứu tiền lâm sàng.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo thiết thực cho:

• Sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ Kỹ thuật Hóa học, Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa Dược, Dược học và Công nghệ Sinh học.
• Những người thực hiện đề tài về chiết xuất dược liệu và phân lập hoạt chất tự nhiên từ các loài thuộc chi Hồ tiêu (Piper).

Các nội dung có giá trị tham khảo cao trong khóa luận:

• Sơ đồ phân tách và quy trình lựa chọn hệ dung môi sắc ký cột phân đoạn từ cao tổng (230 g) đến các phân đoạn nhỏ (PLEA8 $\rightarrow$ PLEA816 $\rightarrow$ PLEA8169 $\rightarrow$ PLEA81695) và kỹ thuật PTLC.
• Bộ dữ liệu phổ và phương pháp biện luận cấu trúc hóa học chi tiết bằng phổ $^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT, HSQC, HMBC đối với các hợp chất vòng thơm dẫn xuất benzoic acid và benzaldehyde.
• Quy trình phối hợp phương pháp sàng lọc hoạt tính sinh học in vitro (vi pha loãng, ức chế NO trên tế bào RAW 264.7) với phương pháp tính toán mô phỏng docking phân tử trên phần mềm AutoDock.

Câu hỏi thường gặp

1. Khóa luận đã phân lập và xác định cấu trúc của những hợp chất sạch nào từ cây lá lốt? Khóa luận đã phân lập được 2 hợp chất sạch từ phân đoạn PLEA81695 của cao ethyl acetate:

• Hợp chất APL-2 (7 mg): Bột màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 208–210 °C, được xác định là Vanillic acid (4-hydroxy-3-methoxybenzoic acid).
• Hợp chất APL-4 (6 mg): Bột màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 112–116 °C, được xác định là 4-hydroxybenzaldehyde.

2. Nguồn nguyên liệu thu hái ở đâu và quy trình chiết xuất thu được khối lượng cao tổng là bao nhiêu? Mẫu cây lá lốt tươi được thu hái tại huyện Tân Hiệp, tỉnh Kiên Giang. Từ 20 kg nguyên liệu tươi phơi khô trong bóng râm thu được 3 kg bột khô. Sau 3 lần chiết ngâm dầm với ethanol 96° và cô quay chân không, tác giả thu được 230 g cao tổng toàn phần (từ đó phân chia thành 10 g cao n-hexane, 50 g cao ethyl acetate và 170 g cao methanol).

3. Hoạt tính kháng khuẩn của các cao phân đoạn cây lá lốt trên hai chủng vi khuẩn thử nghiệm đạt mức độ nào? Các cao phân đoạn đều có tác dụng kìm khuẩn ở mức trung bình và không có khả năng diệt khuẩn (toàn bộ giá trị MBC > 4 mg/mL). Cụ thể: đối với vi khuẩn Gram âm P. aeruginosa, cao methanol và cao nước cho hoạt tính tốt hơn (MIC = 2 mg/mL) so với cao hexane và cao ethyl acetate (MIC = 4 mg/mL); đối với vi khuẩn Gram dương MRSA, cao hexane và cao ethyl acetate cho hoạt tính tốt nhất (MIC = 2 mg/mL), cao methanol có MIC = 4 mg/mL, còn cao nước không thể hiện hoạt tính ức chế (MIC > 4 mg/mL).

4. Khả năng kháng viêm và tính an toàn tế bào của các cao chiết được đánh giá ra sao trên tế bào RAW 264.7? Ở nồng độ 50 $\mu\text{g/mL}$, tất cả các cao chiết đều an toàn, không gây độc cho tế bào đại thực bào RAW 264.7. Trong đó, cao nước ít độc nhất (ở 500 $\mu\text{g/mL}$ tế bào sống sót 93,65%), còn cao methanol gây độc ở nồng độ cao (ở 100 $\mu\text{g/mL}$ tế bào sống sót 60%). Về hoạt tính kháng viêm, từ nồng độ 10 $\mu\text{g/mL}$ trở lên, tất cả các cao phân đoạn đều ức chế mạnh mẽ quá trình tiết Nitric Oxide (NO) do LPS kích thích, trong đó cao hexane và cao ethyl acetate thể hiện hiệu quả kháng viêm tốt nhất.

5. Mô phỏng docking phân tử in silico được thực hiện trên thụ thể nào và hợp chất APL-2 tạo liên kết gì? Mô phỏng docking phân tử được thực hiện trên thụ thể enzyme mã PDB 2VF5 tại tâm hoạt tính chuỗi X (tọa độ X=26.11) bằng phần mềm AutoDock. Cấu dạng liên kết bền nhất của APL-2 (pose 404) hình thành các liên kết hydro quan trọng với các gốc acid amin trên chuỗi xoắn X gồm ARG599 (với nguyên tử NE ở khoảng cách 2,64 Å và NH2 ở khoảng cách 2,94 Å) và ASN600 (với nguyên tử OD1).

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp đã thực hiện hoàn chỉnh quy trình chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hai hợp chất phenolic gồm vanillic acid (APL-2) và 4-hydroxybenzaldehyde (APL-4) từ cao ethyl acetate của cây lá lốt (Piper lolot C.) thu hái tại Kiên Giang. Các kết quả thực nghiệm sinh học in vitro khẳng định các phân đoạn cao chiết lá lốt có hoạt tính kìm khuẩn trung bình trên hai chủng P. aeruginosa, MRSA và thể hiện khả năng kháng viêm hiệu quả thông qua ức chế sản sinh NO trên tế bào đại thực bào RAW 264.7. Đồng thời, nghiên cứu đã ứng dụng thành công phương pháp sàng lọc ảo docking phân tử trên thụ thể protein 2VF5 và đánh giá các đặc tính dược học ADMET, cung cấp nguồn dữ liệu khoa học thực nghiệm và lý thuyết có giá trị cho hướng nghiên cứu phát triển dược phẩm từ nguồn thảo dược tự nhiên.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Bên cạnh rừng và biển thì thực vật cũng là một món quà mà thiên nhiên mang lại cho con người chúng ta. Thực vật được sử dụng với nhiều công dụng khác nhau như làm thuốc chữa bệnh, làm gia vị cho thức ăn, làm vật liệu để xây dựng…Chính vì vậy mà có rất nhiều ngành nghiên cứu đến thực vật ra đời đời tiêu biểu trong số đó phải kể đến ngành dược học y học cổ truyền, một ngành nghề đã bắt đầu phát triển từ lúc con người xuất hiện. Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học hiện đại con người không còn sử dụng các loại dược liệu một cách kinh nghiệm mà thay vào đó là sự tìm hiểu, nghiên cứu các hợp chất có chứa trong dược liệu có tác dụng sinh học. Các nhà khoa học công nhận rằng hầu hết các cây cỏ đều có tính kháng sinh, đó là khả năng miễn dịch tự nhiên của thực vật.

Tác dụng kháng khuẩn do các hợp chất tự nhiên có mặt phổ biến trong thực vật như phenolic, , ancaloid, flavonoid, saponin, [1],[2],[3]. Cho đến nay, nhiều hợp chất tự nhiên đã được giải mã về cấu trúc, những hợp chất này được chiết xuất từ cây cỏ để làm thuốc. Dựa vào cấu trúc được giải mã, người ta có thể tổng hợp nên các chất nhân tạo để chữa bệnh. Chi hồ tiêu (Piper) thuộc họ hồ tiêu (Piperaceae) có hơn 2000 loài [4].

Lá lốt (Piper lolot C.) là một loài thuộc chi hồ tiêu (Piper) được tìm thấy hầu như ở khắp các vùng miền Việt Nam, nó có công dụng như một vị thuốc trong y học cổ truyền. Trong y học cổ truyền, lá lốt có vị nồng, hơi cay, tính ấm, công dụng ôn trung (làm ấm bụng), giảm đau lưng, đau chân, trị nôn mửa, đầy hơi, khó tiêu, tiêu chảy… Chính vì có nhiều công dụng nêu ở trên nên lá lốt đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu phân lập xác định cấu trúc hoá học, đánh giá hoạt tính sinh học. Thông qua đó có thể tổng hợp nên những loại thước có giá trị sử dụng cao. Để góp phần nhỏ vào công trình nghiên cứu này, Trong khoá luận tốt nghiệp lần này tôi thực hiện nghiên cứu thành phần hoá học của cây lá lốt tác dụng ức chế vi sinh vật.

Giới thiệu về cây lá lốt (Piper CD. Nguồn gốc Cây lá lốt có nguồn gốc từ vùng Tây Ghast, Kerela của Ấn Độ được phân bố khắp vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới nơi có nhiều họ hồ tiêu (Piperaceae) sống ngoài tự nhiện. Lá lốt đã được phát hiện cách đây hơn vài ngàn năm. Sau đó đó chung được con người đem về trồng.

Lá lốt được đem đến vào Đông Dương từ thế kỉ 17 nhưng mà đến đầu thế kỉ 18 mới bắt đầu phát triển mạnh khi mà món gói thịt bầm trong lá nho để nướng có nguồn gốc ở Trung Đông, đã được đưa đến Ấn Độ bởi người Ba Tư, sau đó đã được giới thiệu bởi những người Ấn Độ đến khu vực Đông Nam Á. Tuy nhiên, nho không phát triển tốt ở vùng khí hậu nhiệt đới, do đó, người Việt Nam bắt đầu sử dụng lá lốt thay vì lá nho. Chính món thịt nướng lá lốt này từ Việt Nam phổ biến sang nhiều nước Đông Nam Á khác. Phân bố Cây lá lốt có mặt ở nhiều nơi vùng nhiệt đới như: Trung Quốc, Lào, Campuchia, Thái Lan, Việt Nam…Ở nước ta, cây chủ yếu sinh sống mọc hoang trong rừng, nơi ẩm hay dọc quanh các bãi đất ven suối, phân bố khắp cả nước [5].