ĐẶT VẤN ĐỀ Da là một cơ quan lớn nhất của cơ thể. Ở cơ thể ngƣời trƣởng thành, da chiếm khoảng 15 – 20% trọng lƣợng cơ thể và bao phủ 1,5 – 2 cm2 bề mặt cơ thể. Da có chức năng bảo vệ cơ thể chống lại các tác nhân gây hại đến từ môi trƣờng bên ngoài nên da cũng đƣợc xem là một trong những hệ miễn dịch không đặc hiệu. Khi có vấn đề bất thƣờng xảy ra ở da nhƣ vết thƣơng lóc da, vết loét lớn, hay ở những tổn thƣơng da do bỏng (đặc biệt là bỏng độ II trở lên) hàng rào bảo vệ này mất đi dẫn đến nhiều mối nguy hại cho cơ thể ngƣời bệnh đặc biệt là nhiễm trùng.
Khi đó, việc tìm ra nguồn mô da thay thế cho phần da bị tổn thƣơng là rất cần thiết và vô cùng quan trọng. Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới (WHO) thì tai nạn thƣơng tích là một trong những mối đe dọa hàng đầu của thế giới chiếm tới 9% tử vong toàn cầu, tƣơng ứng với hơn 5 triệu trƣờng hợp tử vong mỗi năm và là nguyên nhân của hơn một nửa số trƣờng hợp tàn tật mới mắc. Trong tai nạn thƣơng tích nói chung, bỏng là nhóm nguyên nhân đứng hàng thứ năm về số trƣờng hợp mắc nhƣng lại là nhóm nguyên nhân dẫn đầu về tử vong và nhất là để lại di chứng cho ngƣời bệnh. Khi bị bỏng, dù ở mức độ nhẹ cũng có thể gây mất muối, nƣớc, huyết hƣơng dẫn tới sốc, nhiễm khuẩn, nhiễm độc, gầy mòn và có thể tử vong.
Bỏng thƣờng gây đau đớn dẫn đến hoảng sợ và gây sốc. Đặc biệt, trẻ em là đối tƣợng có làn da mỏng nên khi bị bỏng dễ bị ảnh hƣởng đến tận cơ, xƣơng, mạch máu, thần kinh. Nhiều trẻ đau do bỏng đã làm thay đổi tính tình, suy giảm sức đề kháng, gây rối loạn tâm lý, tình cảm, thậm chí về lâu dài có thể ảnh hƣởng đến sự phát triển nhân cách của trẻ. Vết bỏng nặng có thể gây tổn thƣơng nghiêm trọng nhƣ để lại sẹo vĩnh viễn, ảnh hƣởng đến cử động do dính, thậm chí gây cắt cụt chi, cứng khớp, làm biến dạng cơ thể, gây tàn phế suốt đời.
Ghép da tự thân là “tiêu chuẩn vàng” để che phủ và tái tạo bề mặt vết thƣơng trong điều trị bỏng. Tuy nhiên, có một nhƣợc điểm rất lớn khi sử dụng loại da ghép này là nguồn da tự thân phải lấy từ một vị trí khác trên chính ngƣời bệnh. Việc này không những gây thêm nỗi đau cho bệnh nhân mà còn không thể áp dụng đối với 2 các loại bỏng hoặc tổn thƣơng mất da diện rộng. Vấn đề nan giải này đòi hỏi các nhà nghiên cứu và lâm sàng phải tìm ra các phƣơng pháp điều trị hữu hiệu hơn.
Tế bào gốc (stem cell) đã không còn xa lạ với các nhà khoa học bởi những tiềm năng và ứng dụng to lớn của nó. Tế bào gốc không chỉ ảnh hƣởng trong lĩnh vực y sinh học với các phƣơng pháp chữa trị mới, hiệu quả trên các bệnh nan y mà còn lan rộng đến các lĩnh vực khác nhƣ dƣợc học, thẩm mỹ, kinh tế. Có thể nói tế bào gốc đã tạo ra một cuộc cách mạng lớn và ngày càng trở thành mục tiêu hàng đầu cho các nhà nghiên cứu khoa học. Tế bào gốc là những tế bào chƣa hoặc ít biệt hóa, có khả năng phân chia và tự đổi mới trong các cơ thể sống, có nguồn gốc từ phôi, thai hay từ các mô trong cơ thể trƣởng thành.
Trong điều kiện nuôi cấy hay có những tín hiệu kích thích phù hợp, tế bào gốc sẽ biệt hóa thành các tế bào có hình dạng và chức năng chuyên biệt (tế bào cơ tim, tế bào da, tế bào thần kinh, tế bào máu) [20]. Trong số các nhóm tế bào gốc đang đƣợc nghiên cứu hiện nay thì tế bào gốc trung mô thu nhận chủ yếu từ máu cuống rốn, cuống rốn, tủy xƣơng, mỡ, da, gan, tuyến tiêu hóa, nang tóc. Trong đó, máu cuống rốn và cuống rốn là những nguồn cung cấp tế bào gốc ít bị ảnh hƣởng bởi các phƣơng diện đạo đức hay pháp luật và trở thành đối tƣợng đƣợc quan tâm nghiên cứu nhiều nhất [35]. Khi tạo đƣợc môi trƣờng nuôi cấy thuận lợi và thích hợp, các tế bào gốc này sẽ biệt hoá tạo thành các loại tế bào chuyên biệt theo ý muốn.
Trong số các tế bào gốc trung mô, các nhà khoa học đặc biệt quan tâm đến tế bào gốc trung mô thu nhận từ máu cuống rốn vì một số đặc tính đặc biệt của nó [47]: + Thu nhận máu cuống rốn dễ dàng, không gây đau đớn, không ảnh hƣởng đến mẹ và bé. Có thể nói việc thu nhận và bảo quản máu cuống rốn đã trở thành một vấn đề thƣờng quy. + Nhiều nghiên cứu cho thấy tế bào gốc máu cuống rốn có khả năng gây đáp ứng miễn dịch thấp và ít gây ra phản ứng đào thải miếng ghép ở ngƣời nhận. + Trong máu cuống rốn có những tế bào có khả năng biệt hoá thành tế bào xƣơng, sụn, mỡ, gan, thần kinh, cơ và tế bào sừng.
3 Song song với việc nghiên cứu tế bào ghép ứng dụng, các sản phẩm có nguồn gốc từ sinh học (có nguồn gốc từ ngƣời hoặc động vật) hoặc các loại màng đƣợc tổng hợp hóa học dùng để che phủ và tái tạo bề mặt da ở các vết bỏng hoặc mất da cũng đƣợc tìm tòi và phát triển không ngừng. Trong đó, màng ối ngƣời đƣợc xem nhƣ là một loại màng sinh học điều trị hiệu quả vì chúng có khả năng kháng viêm, kháng khuẩn và khả năng gây ra các đáp ứng miễn dịch khi ghép là rất thấp [13]. Công nghệ mô với sự kết hợp của tế bào gốc và giá thể tƣơng ứng là một phƣơng pháp và hƣớng đi rất hiệu quả trong việc điều trị bỏng, tổn thƣơng mất da, điều trị thẩm mỹ. Với công nghệ này, nhiều nƣớc trên thế giới đã đạt đƣợc những tiến bộ rất lớn và hiệu quả trong việc điều trị bỏng và tổn thƣơng mất da, nhiều ngƣời bệnh bỏng sâu, diện rộng trên 70% diện tích cơ thể đã đƣợc cứu sống cũng nhƣ giảm thiểu các di chứng nặng nề do bỏng sâu để lại [18],[39],[42].
Từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Tạo tấm tế bào sừng từ máu cuống rốn trên giá thể màng ối”. 4 MỤC TIÊU Mục tiêu tổng quát: Tạo tấm tế bào sừng có nhiều lớp tế bào trên giá thể màng ối. Mục tiêu cụ thể: - Thu nhận tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn ngƣời. - Tạo giá thể collagen dùng để mang tế bào từ màng ối ngƣời.
- Tạo tấm tế bào sừng có nhiều lớp tế bào từ sự kết hợp giữa tế bào gốc trung mô và màng collagen. 5 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Nguồn gốc và cấu trúc cuống rốn Cuống rốn gồm cuống phôi, niệu nang và các mạch máu. Trong lúc phôi khép, đuôi phôi cong lên, đƣa cuống rốn lại gần ống noãn hoàng.
Khi phôi khép xong, cuống phôi bao lấy ống noãn hoàng, màng ối phủ ngoài cuống phôi, ngoại bì màng ối trở thành biểu mô của cuống rốn. Cuống rốn đƣợc hình thành vào tuần thứ 5 của thai kỳ, cung cấp dinh dƣỡng cho thai thay cho túi noãn hoàng. Cuống rốn không thông trực tiếp với hệ tuần hoàn mẹ, mà thông qua bánh nhau, giúp trao đổi chất với máu mẹ mà không trộn lẫn trực tiếp máu con và máu mẹ. Cuống rốn thƣờng cắm ở trung tâm bánh nhau, nhƣng cũng có thể ở vị trí khác, đƣờng kính cuống rốn khoảng 1 – 2 cm, chiều dài trung bình khoảng 50 cm ở trẻ sơ sinh đủ tháng.
Bình thƣờng, cuống rốn chứa 1 tĩnh mạch (mang O2 và chất dinh dƣỡng đến thai) và 2 động mạch (mang CO2 và máu không có chất dinh dƣỡng đến bánh nhau). Ba cấu trúc trên đƣợc bao quanh bởi mô chất đông, đƣợc gọi là thạch Wharton. Lớp thạch Wharton có nhiều phân tử collagen I, collagen II, collagen III, lamina, heparin sulfate proteoglycan có vai trò nhƣ chất nền đệm, đƣợc bao quanh bởi các tế bào đệm có dạng thon dài nhƣ dạng sợi cơ gồm vimentin và actin. Cấu trúc và thành phần của cuống rốn là mô đệm có tính đàn hồi cao, chức năng là giúp bảo vệ mạch máu khỏi áp lực, tạo thuận lợi cho sự trao đổi chất giữa mẹ và con thông qua bánh nhau.
Tế bào gốc máu cuống rốn Tế bào gốc (TBG) máu cuống rốn (MCR) thuộc nhóm TBG nhũ nhi, là nhóm tế bào thuộc mô ngoài phôi (bao gồm máu cuống rốn, cuống rốn, nhau thai, và nƣớc ối). Các loại TBG trong MCR: - Tế bào gốc tạo máu: TBG tạo máu là những tế bào đa năng, có khả năng tái tạo trong thời gian dài. Các tế bào này dƣơng tính với CD34. Tuy nhiên, số lƣợng các TBG tạo máu trong MCR tƣơng đối hiếm, tần số từ 1/100000 đến 1/10000 tế bào.
Do đó, ngƣời ta phải tăng sinh các tế bào này ngoài cơ thể trƣớc, hay phải sử dụng hai đơn vị máu hoặc nhiều hơn cho việc cấy ghép TBG tạo máu [35]. - Tế bào gốc trung mô (MSC - mesenchymal stem cell): là những tế bào có khả năng tăng sinh và biệt hóa thành các tế bào dòng trung mô, nhƣ tế bào xƣơng, sụn, cơ, mỡ, và các tế bào khác [46]. Hiện nay, các MSC đƣợc thu nhận phổ biến từ tủy xƣơng. Tuy nhiên, việc thu nhận từ tủy xƣơng của bệnh nhân có nhƣợc điểm vì đây là một quy trình xâm lấn.
Hơn nữa, MSC từ tủy xƣơng giảm theo tuổi về số lƣợng và tính tiềm năng. Vì vậy, ngày nay ngƣời ta đã tìm kiếm những nguồn MSC khác thay thế. MCR là một nguồn thay thế hiệu quả. - Tế bào gốc sinh dƣỡng không giới hạn: Kogler và cộng sự (2004) đã xác định các TBG âm tính với HLA–II và CD45 trong MCR.
Các tế bào này đƣợc gọi là TBG sinh dƣỡng không giới hạn vì có khả năng tăng sinh mà không biệt hóa tự phát. Nhƣng có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau, bao gồm các tế bào có nguồn gốc từ trung mô, nội mô và ngoại mô. Các tế bào này có tiềm năng biệt hóa lớn hơn và có kiểu hình miễn dịch khác với MSC [29]. - Tế bào gốc phôi thu nhận từ máu cuống rốn: Các TBG phôi đƣợc Wteve Navran và cộng sự báo cáo năm 2004, với kiểu hình TBG phôi đƣợc thu nhận từ MCR.
Các tế bào này có phản ứng miễn dịch cho các gien chuyên biệt TBG phôi [76].