Nghiên Cứu Tạo Phôi Lợn In Vitro Từ Tinh Trùng Lợn Kiềng Sắt Đông Lạnh

Nghiên cứu tạo phôi lợn in vitro từ tinh trùng đông lạnh mở ra hướng đi đầy tiềm năng trong ngành chăn nuôi… 57 trang · Học viện Nông nghiệp Việt Nam · 2022.

• Tác giả: Đinh Thị Mỹ Duyên
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Nhiên
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu tạo phôi lợn in vitro từ tinh trùng lợn Kiềng Sắt đông lạnh
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỤC LỤC
• 2. DANH MỤC BẢNG BIỂU
• 3. DANH MỤC HÌNH ẢNH
• 4. DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
• 5. TÓM TẮT KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP
• 6. MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU
• 6.1. Mục đích
• 6.2. Yêu cầu
• 7. Ý NGHĨA CỦA NGHIÊN CỨU
• 7.1. Ý nghĩa khoa học
• 7.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 8. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 8.1. Buồng trứng và quá trình hình thành tế bào trứng
• 8.1.1. Cấu tạo và hoạt động của buồng trứng
• 8.1.2. Cấu tạo và sự hình thành tế bào trứng
• 8.2. Cấu tạo tinh trùng và quá trình hình thành tinh trùng
• 8.2.1. Cấu tạo tinh trùng
• 8.2.2. Quá trình hình thành tinh trùng
• 8.3. Sự thành thục in vitro tế bào trứng lợn (IVM)
• 8.3.1. Sự thành thục nhân tế bào trứng
• 8.3.2. Sự thành thục tế bào chất
• 8.4. Vai trò của tế bào nang (tế bào cumulus) đến sự thành thục tế bào trứng
• 8.5. Vai trò của môi trường nuôi thành thục in vitro tế bào trứng lợn
• 8.6. Quá trình thụ tinh trong ống nghiệm (thụ tinh in vitro)
• 8.6.1. Hoạt hóa tinh trùng in vitro
• 8.6.2. Thụ tinh trong ống nghiệm (in vitro)
• 8.7. Nuôi phôi trong ống nghiệm (in vitro)
• 8.8. Quá trình phát triển của phôi
• 8.9. Môi trường nuôi phôi lợn in vitro
• 8.10. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
• 9. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 9.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 9.2. Nội dung nghiên cứu
• 9.3. Phương pháp nghiên cứu
• 9.3.1. Phương pháp thu buồng trứng lợn từ lò mổ
• 9.3.2. Phương pháp thu tế bào trứng từ buồng trứng lợn lò mổ
• 9.3.3. Phân loại tế bào trứng lợn sau khi thu
• 9.3.4. Phương pháp nuôi thành thục in vitro tế bào trứng lợn
• 9.3.5. Phương pháp đánh giá khả năng thành thục in vitro của tế bào trứng sau nuôi thành thục in vitro
• 9.3.6. Phương pháp thụ tinh in vitro tế bào trứng lợn
• 9.3.7. Phương pháp nuôi phôi in vitro
• 9.3.8. Phương pháp nhuộm Hoechst 33342
• 9.3.9. Phương pháp xử lý số liệu
• 10. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 10.1. Đánh giá chất lượng tế bào trứng lợn Landrace thu từ buồng trứng lợn ở lò mổ
• 10.2. Đánh giá khả năng thành thục in vitro của tế bào trứng lợn Landrace thu từ buồng trứng lò mổ
• 10.3. Đánh giá khả năng tạo phôi lợn in vitro từ tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt đông lạnh
• 10.3.1. Đánh giá khả năng xâm nhập vào tế bào trứng của tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt sau thụ tinh in vitro
• 10.3.2. Đánh giá khả năng tạo phôi lợn in vitro từ tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt đông lạnh
• 11. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Tạo Phôi Lợn In Vitro Đông Lạnh IVF Lợn

Nghiên cứu tạo phôi lợn in vitro từ tinh trùng đông lạnh mở ra hướng đi đầy tiềm năng trong ngành chăn nuôi lợn hiện đại. Kỹ thuật IVF lợn (thụ tinh trong ống nghiệm) cho phép tạo ra số lượng lớn phôi chất lượng cao, từ đó đẩy mạnh công tác giống, bảo tồn nguồn gen quý hiếm và nâng cao năng suất. Đặc biệt, việc sử dụng tinh trùng đông lạnh lợn giúp lưu giữ và khai thác tối đa tiềm năng di truyền của các cá thể đực giống ưu tú, khắc phục những hạn chế về địa lý và thời gian. Ứng dụng công nghệ sinh học trong chăn nuôi lợn, cụ thể là sản xuất phôi, tạo ra những bước tiến vượt bậc, góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành. Nghiên cứu này không chỉ tập trung vào kỹ thuật, mà còn đặt trọng tâm vào việc cải thiện hiệu quả, tối ưu hóa quy trình và đánh giá chất lượng phôi tạo ra, tạo nền tảng vững chắc cho các ứng dụng thực tiễn trong tương lai.

1.1. Tầm quan trọng của Nghiên Cứu IVF Lợn Tinh Trùng Đông Lạnh

Nghiên cứu IVF lợn và sử dụng tinh trùng đông lạnh có ý nghĩa quan trọng trong việc bảo tồn các giống lợn bản địa. Theo Nghị định 13/2020/NĐ-CP, nhiều giống lợn cần được bảo tồn. Tinh trùng đông lạnh cho phép lưu giữ các đặc tính di truyền quý. IVF lợn giúp tạo ra số lượng lớn phôi từ tinh trùng đông lạnh của các giống lợn quý hiếm, góp phần bảo tồn đa dạng sinh học và phát triển các giống lợn chất lượng cao.

1.2. Ứng dụng Công nghệ Phôi và Đông Lạnh Tinh Trùng trong Chăn Nuôi

Ứng dụng công nghệ phôi và đông lạnh tinh trùng mở ra hướng đi mới cho ngành chăn nuôi lợn. Các nghiên cứu tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất phôi lợn nhân tạo nhằm tạo ra phôi có chất lượng cao. Đồng thời, việc cải thiện chất lượng phôi lợn thông qua các kỹ thuật tiên tiến như lựa chọn phôi dựa trên các tiêu chí sinh học cũng được quan tâm đặc biệt.

II. Thách Thức Trong Tạo Phôi Lợn In Vitro Từ Tinh Trùng Đông Lạnh

Mặc dù kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm (IVF) ở lợn và sử dụng tinh trùng đông lạnh đã có những thành công nhất định, vẫn còn tồn tại nhiều thách thức cần vượt qua. Một trong những vấn đề lớn nhất là tỷ lệ thành công của IVF lợn vẫn chưa cao so với các loài động vật khác. Chất lượng tinh trùng đông lạnh sau khi rã đông thường bị suy giảm, ảnh hưởng đến khả năng thụ tinh và phát triển phôi. Bên cạnh đó, các yếu tố ảnh hưởng đến IVF lợn như môi trường nuôi cấy, kỹ thuật thao tác và chất lượng tế bào trứng cũng đóng vai trò quan trọng. Cần có những nghiên cứu sâu hơn để giải quyết những thách thức này, từ đó nâng cao hiệu quả sản xuất phôi và ứng dụng rộng rãi kỹ thuật IVF lợn trong thực tiễn.

2.1. Các Yếu Tố Ảnh Hưởng Đến Tỷ Lệ Thành Công IVF Lợn

Tỷ lệ thành công IVF lợn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như chất lượng tế bào trứng, chất lượng tinh trùng đông lạnh, kỹ thuật thụ tinh và môi trường nuôi cấy. Theo Kikuchi và cs (2016), sự kết hợp giữa kỹ thuật tạo phôi lợn in vitro và kỹ thuật cấy chuyển phôi có vai trò quan trọng trong việc tạo ra lợn con từ nguồn tinh trùng lợn đông lạnh.

2.2. Suy Giảm Chất Lượng Tinh Trùng Đông Lạnh Nguyên Nhân và Giải Pháp

Quá trình đông lạnh tinh trùng lợn có thể gây tổn thương đến cấu trúc và chức năng của tinh trùng. Các nghiên cứu tập trung vào việc tìm kiếm các chất bảo vệ tế bào hiệu quả để giảm thiểu tác động tiêu cực của quá trình đông lạnh tinh trùng. Việc đánh giá chất lượng tinh trùng đông lạnh sau rã đông là bước quan trọng để đảm bảo khả năng thụ tinh thành công.

2.3. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy để phát triển phôi lợn

Môi trường nuôi cấy đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của phôi lợn. Nghiên cứu tập trung vào việc tạo ra các môi trường nuôi cấy tối ưu để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng và tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của phôi. Thành phần môi trường, điều kiện nhiệt độ, độ ẩm và pH đều cần được kiểm soát chặt chẽ.

III. Phương Pháp Thụ Tinh Ống Nghiệm IVF Lợn Từ Tinh Trùng Đông Lạnh

Quy trình thụ tinh ống nghiệm (IVF) ở lợn bắt đầu bằng việc thu thập và chọn lọc tế bào trứng chất lượng cao từ buồng trứng lợn cái. Tế bào trứng sau đó được nuôi trưởng thành trong môi trường đặc biệt. Song song đó, tinh trùng đông lạnh được rã đông và hoạt hóa để tăng khả năng thụ tinh. Quá trình thụ tinh diễn ra trong ống nghiệm, nơi tinh trùng và tế bào trứng kết hợp với nhau tạo thành hợp tử. Hợp tử sau đó được nuôi cấy trong môi trường phù hợp để phát triển thành phôi. Các phôi chất lượng tốt sẽ được lựa chọn để cấy vào tử cung lợn mẹ hoặc được bảo quản lạnh để sử dụng sau này. Kỹ thuật hỗ trợ sinh sản ở lợn này đòi hỏi sự tỉ mỉ, chính xác và kinh nghiệm của các chuyên gia.

3.1. Thu Thập và Nuôi Trưởng Thành Tế Bào Trứng Lợn

Tế bào trứng được thu thập từ buồng trứng lợn cái, thường là từ các lò mổ. Tế bào trứng được phân loại và chỉ những tế bào trứng có chất lượng tốt mới được chọn để nuôi trưởng thành. Môi trường nuôi trưởng thành tế bào trứng thường chứa các hormone và yếu tố tăng trưởng để thúc đẩy quá trình chín của tế bào trứng.

3.2. Rã Đông và Hoạt Hóa Tinh Trùng Đông Lạnh Lợn

Tinh trùng đông lạnh lợn cần được rã đông đúng cách để đảm bảo khả năng sống sót và thụ tinh. Sau khi rã đông, tinh trùng cần được hoạt hóa bằng các phương pháp khác nhau để tăng khả năng di chuyển và xâm nhập vào tế bào trứng. Quá trình hoạt hóa có thể bao gồm việc sử dụng các chất hóa học hoặc kích thích vật lý.

3.3. Quy trình thụ tinh và nuôi cấy phôi lợn in vitro

Sau khi tế bào trứng trưởng thành và tinh trùng được hoạt hóa, quá trình thụ tinh diễn ra trong ống nghiệm. Trứng và tinh trùng được ủ chung trong môi trường thích hợp để thụ tinh xảy ra. Sau khi thụ tinh, các hợp tử được nuôi cấy trong môi trường đặc biệt để phát triển thành phôi. Các phôi phát triển được theo dõi chặt chẽ và đánh giá chất lượng.

IV. Nuôi Cấy Phôi Lợn In Vitro Môi Trường và Kỹ Thuật Tối Ưu

Quá trình nuôi cấy phôi lợn in vitro đòi hỏi môi trường được kiểm soát chặt chẽ về nhiệt độ, độ ẩm, pH và thành phần dinh dưỡng. Môi trường nuôi cấy cần cung cấp đầy đủ các yếu tố cần thiết cho sự phát triển của phôi, bao gồm axit amin, vitamin, khoáng chất và protein. Kỹ thuật nuôi cấy cũng đóng vai trò quan trọng, bao gồm việc thay đổi môi trường định kỳ, kiểm tra sự phát triển của phôi và loại bỏ các phôi kém chất lượng. Mục tiêu của quá trình nuôi cấy phôi lợn in vitro là tạo ra các phôi có khả năng sống sót và phát triển thành công sau khi cấy vào tử cung lợn mẹ.

4.1. Thành Phần Dinh Dưỡng Quan Trọng Trong Môi Trường Nuôi Cấy Phôi

Môi trường nuôi cấy phôi cần cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng thiết yếu cho sự phát triển của phôi. Các axit amin, vitamin, khoáng chất và protein đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân chia tế bào và hình thành các cơ quan của phôi. Nghiên cứu tập trung vào việc xác định tỷ lệ tối ưu của các thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy.

4.2. Kiểm Soát Điều Kiện Môi Trường Nhiệt Độ Độ Ẩm pH

Nhiệt độ, độ ẩm và pH là những yếu tố quan trọng cần được kiểm soát chặt chẽ trong quá trình nuôi cấy phôi lợn. Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp có thể gây tổn thương cho phôi. Độ ẩm cần được duy trì ở mức thích hợp để đảm bảo phôi không bị khô. pH cần được điều chỉnh để tạo môi trường thuận lợi cho sự phát triển của phôi.

4.3. Đánh Giá Chất Lượng Phôi Lợn Trong Quá Trình Nuôi Cấy In Vitro

Phát triển phôi lợn được đánh giá dựa trên các tiêu chí như hình thái, số lượng tế bào và khả năng phát triển thành phôi nang. Các phôi có hình thái bình thường, số lượng tế bào đủ và khả năng phát triển tốt được coi là phôi có chất lượng cao và có khả năng sống sót cao sau khi cấy vào tử cung lợn mẹ. Kỹ thuật nuôi cấy phôi lợn in vitro là kỹ thuật quan trọng tạo ra phôi số lượng lớn, chất lượng cao từ tinh trùng lợn đông lạnh cho quá trình bảo quản lạnh hoặc cấy chuyển phôi.

V. Nghiên Cứu Ứng Dụng Thực Tiễn Tạo Phôi Lợn Kiềng Sắt Từ IVF

Nghiên cứu tạo phôi lợn Kiềng Sắt in vitro từ tinh trùng đông lạnh mang ý nghĩa to lớn trong công tác bảo tồn và phát triển giống lợn quý hiếm này. Lợn Kiềng Sắt là một trong những giống lợn bản địa cần được bảo tồn theo Nghị định 13/2020/NĐ-CP của Chính phủ. Kỹ thuật IVF lợn cho phép tạo ra số lượng lớn phôi từ tinh trùng của những con lợn đực Kiềng Sắt ưu tú, từ đó tăng cường khả năng duy trì và phát triển giống. Kết quả nghiên cứu này mở ra hướng đi mới trong việc ứng dụng công nghệ sinh học vào bảo tồn các giống vật nuôi quý hiếm của Việt Nam.

5.1. Mục tiêu và phương pháp tạo phôi lợn Kiềng Sắt in vitro

Mục tiêu chính của nghiên cứu là tạo ra nguồn phôi lợn Kiềng Sắt in vitro từ tinh trùng đông lạnh để bảo tồn và phát triển giống lợn quý hiếm này. Phương pháp nghiên cứu bao gồm các bước như thu thập tế bào trứng từ buồng trứng lợn, rã đông và hoạt hóa tinh trùng lợn Kiềng Sắt đông lạnh, thụ tinh trong ống nghiệm, nuôi cấy phôi và đánh giá chất lượng phôi.

5.2. Đánh giá chất lượng phôi nang lợn Kiềng Sắt in vitro

Chất lượng phôi nang lợn Kiềng Sắt in vitro được đánh giá dựa trên các tiêu chí như hình thái, số lượng tế bào và khả năng phát triển. Các phôi có hình thái bình thường, số lượng tế bào đủ và khả năng phát triển tốt được coi là phôi có chất lượng cao và có khả năng sống sót cao sau khi cấy vào tử cung lợn mẹ. Các nghiên cứu ứng dụng của IVF lợn sẽ tạo tiền đề cho việc mở rộng hướng nghiên cứu ứng dụng công nghệ phôi và đông lạnh tinh trùng lợn tại Việt Nam.

VI. Kết Luận và Hướng Phát Triển Nghiên Cứu IVF Lợn Trong Tương Lai

Nghiên cứu tạo phôi lợn in vitro từ tinh trùng đông lạnh đã đạt được những kết quả đáng khích lệ, mở ra nhiều triển vọng trong ngành chăn nuôi lợn. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều vấn đề cần được nghiên cứu và giải quyết để nâng cao hiệu quả kỹ thuật và ứng dụng rộng rãi trong thực tiễn. Trong tương lai, các nghiên cứu nên tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình IVF lợn, cải thiện chất lượng tinh trùng đông lạnh, phát triển các môi trường nuôi cấy phôi tốt hơn và tìm kiếm các phương pháp đánh giá chất lượng phôi chính xác hơn. Đồng thời, cần có sự hợp tác chặt chẽ giữa các nhà khoa học, nhà chăn nuôi và các doanh nghiệp để đưa những kết quả nghiên cứu vào ứng dụng thực tế, góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành chăn nuôi lợn Việt Nam.

6.1. Tối ưu hóa quy trình IVF lợn và cải thiện chất lượng tinh trùng

Việc tối ưu hóa quy trình IVF lợn bao gồm việc cải thiện các bước như thu thập và nuôi trưởng thành tế bào trứng, rã đông và hoạt hóa tinh trùng, thụ tinh trong ống nghiệm và nuôi cấy phôi. Cải thiện chất lượng tinh trùng đông lạnh là yếu tố quan trọng để tăng tỷ lệ thành công của IVF lợn. Nghiên cứu tập trung vào việc tìm kiếm các chất bảo vệ tế bào hiệu quả để giảm thiểu tác động tiêu cực của quá trình đông lạnh tinh trùng.

6.2. Phát triển môi trường nuôi cấy phôi tốt hơn và ứng dụng công nghệ tiên tiến

Môi trường nuôi cấy phôi đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của phôi lợn. Nghiên cứu tập trung vào việc tạo ra các môi trường nuôi cấy tối ưu để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng và tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của phôi. Ứng dụng các công nghệ tiên tiến như kỹ thuật hỗ trợ sinh sản và công nghệ sinh học có thể giúp cải thiện hiệu quả của IVF lợn.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Việt Nam là quốc gia có nguồn tài nguyên di truyền vật nuôi bản địa phong phú, trong đó các giống lợn nội mang nhiều đặc tính quý như chất lượng thịt thơm ngon, khả năng kháng bệnh cao, tiêu tốn ít chi phí thức ăn và thích nghi tốt với các điều kiện sinh thái khắc nghiệt. Tuy nhiên, trước áp lực cạnh tranh về năng suất từ các giống ngoại nhập cùng ảnh hưởng nặng nề từ các đợt dịch bệnh nguy hiểm như dịch tả lợn châu Phi, số lượng cá thể của nhiều giống lợn bản địa đã suy giảm nghiêm trọng, dẫn đến nguy cơ xói mòn hoặc mất nguồn gen. Trong số đó, giống lợn Kiềng Sắt đã được xếp vào danh mục giống vật nuôi cần bảo tồn theo Nghị định số 13/2020/NĐ-CP ngày 21/01/2020 của Chính phủ.

Bảo tồn lạnh tinh trùng kết hợp với công nghệ tạo phôi trong ống nghiệm (in vitro) và cấy chuyển phôi là giải pháp khoa học then chốt nhằm lưu giữ lâu dài nguồn vật liệu di truyền và tái tạo đàn giống quý. Mặc dù quy trình tạo phôi in vitro từ tinh trùng đông lạnh đã được chuẩn hóa trên các giống lợn ngoại như Landrace, Large White hay Duroc, các nghiên cứu trên lợn bản địa Việt Nam còn rất hạn chế. Phần lớn các công bố trước đây chỉ tập trung đánh giá tinh trùng thu nhận từ mào tinh hoàn lợn Bản sau mổ thịt, trong khi dữ liệu thực nghiệm về tạo phôi từ nguồn tinh dịch thu nhận qua xuất tinh tự nhiên của lợn Kiềng Sắt đông lạnh gần như chưa có.

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Đinh Thị Mỹ Duyên (Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, thực hiện tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào động vật – Viện Chăn nuôi từ tháng 02/2022 đến tháng 08/2022) được tiến hành nhằm giải quyết vấn đề thực tiễn trên.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài được xác định cụ thể:

1. Mục đích: Tạo nguồn phôi lợn in vitro từ tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt đông lạnh làm nguyên liệu phục vụ cho các nghiên cứu về tinh trùng và phôi lợn nội.
2. Yêu cầu/Nhiệm vụ cụ thể:
   • Tạo được phôi nang lợn in vitro từ tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt đông lạnh kết hợp với tế bào trứng lợn thu nhận từ buồng trứng lò mổ.
   • Đánh giá chất lượng và số lượng tế bào của phôi nang lợn in vitro thu được.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
   • Đối tượng nghiên cứu: Tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt đông lạnh (thu bằng phương pháp xuất tinh) và tế bào trứng thu từ buồng trứng lợn Landrace lò mổ.
   • Không gian thực hiện: Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào động vật – Viện Chăn nuôi; nguồn buồng trứng thu tại các lò mổ địa phương khu vực Hưng Yên và Đông Anh (Hà Nội).
   • Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 02/2022 đến tháng 08/2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thiết lập dựa trên cơ sở sinh lý học sinh sản động vật có vú, bao gồm các quá trình: sự tạo giao tử cái và giảm phân của noãn bào qua các giai đoạn nang trứng (sơ cấp, thứ cấp, nang có hốc Graaf); quá trình thành thục nhân (từ giai đoạn túi mầm GV đến trung kỳ II - Metaphase II giải phóng thể cực thứ nhất) và thành thục tế bào chất dưới tác động của gonadotropin (eCG, hCG, cAMP, EGF); cấu trúc và phản ứng thể đỉnh của tinh trùng; cùng các cơ chế thụ tinh in vitro (IVF) và nuôi cấy phôi in vitro (IVC) đến giai đoạn phôi dâu và phôi nang.

Tác giả đã áp dụng hệ thống phương pháp thực nghiệm tế bào động vật chuyên sâu theo các quy trình chuẩn hóa:

• Thu thập và xử lý buồng trứng: Buồng trứng lợn Landrace được thu ngay sau khi giết mổ, rửa 3 lần bằng dung dịch NaCl 0,9% có bổ sung 100 IU/ml penicillin và 1000 µg/ml streptomycin, bảo quản trong bình ổn nhiệt 38°C và vận chuyển về phòng thí nghiệm trong 2-3 giờ.
• Thu và phân loại tế bào trứng: Sử dụng phương pháp cắt lát (slicing) bề mặt buồng trứng để rạch các nang có đường kính 3-6 mm. Tế bào trứng được tìm dưới kính hiển vi soi nổi và phân loại theo tiêu chuẩn Goodhand và cộng sự: Loại A (>4 lớp tế bào cumulus liên kết chặt, tế bào chất đồng nhất); Loại B (≥2 lớp tế bào cumulus); Loại C (mất một phần cumulus); Loại D (trần, không có cumulus). Nghiên cứu chỉ chọn trứng loại A và B để làm thí nghiệm.
• Nuôi thành thục in vitro (IVM): Thực hiện theo quy trình Kikuchi và cộng sự (2002) cải biến qua 2 giai đoạn:
  • Giai đoạn IVM1 (22-24 giờ): Môi trường POM bổ sung 1 mM dbcAMP, 10 IU/ml eCG, 10 IU/ml hCG và EGF.
  • Giai đoạn IVM2 (22-24 giờ tiếp theo): Môi trường POM bổ sung 10 IU/ml eCG, 10 IU/ml hCG và EGF (không có dbcAMP). Điều kiện nuôi: tủ vô trùng 5% CO₂, 38,5°C, độ ẩm bão hòa dưới lớp dầu khoáng Wako. Đánh giá tỷ lệ sống và thành thục dựa trên sự hình thành thể cực thứ nhất sau khi xử lý loại cumulus bằng Hyaluronidase.
• Thụ tinh in vitro (IVF): Tế bào trứng sau khi nuôi thành thục được loại bỏ bớt cumulus bằng hyaluronidase 0,1% (giữ lại 1 lớp tế bào quanh màng trong suốt). Môi trường thụ tinh là Pig-FM (Suzuki và cộng sự, 2002) chứa NaCl, KCl, NaHCO₃, NaH₂PO₄, MgSO₄, sodium lactate, HEPES, CaCl₂, sodium pyruvate, caffeine và 5 mg/ml BSA. Tinh trùng Kiềng Sắt đông lạnh được giải đông ở 37°C, rửa bằng môi trường M199 (pH 7,8), ly tâm ở 580 × g trong 2 phút. Chọn mẫu có hoạt lực vận động ≥30%, hiệu chỉnh mật độ thụ tinh đạt 1 × 10⁶ tinh trùng/ml. Thời gian đồng nuôi cấy trứng và tinh trùng là 6 giờ tại 38,5°C, 5% CO₂.
• Nuôi cấy phôi in vitro (IVC): Sau IVF, hợp tử được loại bỏ tinh trùng thừa và tế bào cumulus bằng phương pháp cơ học, chuyển vào đĩa 4 giếng chứa môi trường PZM3 (bổ sung 10% huyết thanh thai bê - FCS vào cuối ngày 4 hoặc ngày 5), nuôi ở 38,5°C, 5% CO₂, 5% O₂ và độ ẩm bão hòa.
• Nhuộm nhân đánh giá chất lượng phôi nang: Phôi nang ở ngày thứ 7 được cố định và nhuộm huỳnh quang bằng thuốc nhuộm Hoechst 33342 (dung dịch gốc 250 µg/ml trong ethanol tuyệt đối), rửa qua PBS + 0,3% PVP và glycerol, sau đó quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang để đếm tổng số tế bào/phôi.
• Xử lý số liệu: Thống kê và tính toán trên phần mềm Microsoft Excel 2010.

Nội dung chính theo từng nội dung nghiên cứu

Khóa luận được triển khai qua 3 nội dung thực nghiệm chính:

Đánh giá chất lượng tế bào trứng lợn Landrace thu từ buồng trứng lợn ở lò mổ

Tác giả đã thực hiện 6 đợt thí nghiệm cắt lát trên tổng số 123 buồng trứng đạt tiêu chuẩn thu từ lò mổ khu vực Hưng Yên và Đông Anh. Kết quả thu nhận và phân loại tế bào trứng được tổng hợp chi tiết:

Lần TN	Số buồng trứng (chiếc)	Tổng số trứng thu được	Số trứng TB / buồng trứng	Số trứng loại A, B	Số trứng loại A, B / buồng trứng	Tỷ lệ trứng loại A, B (%)
1	18	342	19,00	264	14,67	77,20
2	21	370	17,60	315	15,00	85,14
3	20	380	19,00	311	15,55	81,84
4	24	399	16,63	360	15,00	90,23
5	16	291	18,20	249	15,56	85,57
6	24	456	19,00	345	14,40	75,66
Tổng	123	2.238	18,20	1.844	14,99	82,39

Tỷ lệ thu nhận tế bào trứng đạt tiêu chuẩn (loại A, B) dao động từ 75,66% đến 90,23%. Số lượng trứng loại A, B trung bình đạt 14,40 - 15,56 trứng/buồng trứng, tương đồng với công bố của Nguyễn Thị Hương (2009) là 15,43 trứng/buồng trứng, đáp ứng yêu cầu nguyên liệu cho các bước nuôi cấy tiếp theo.

Đánh giá khả năng thành thục in vitro của tế bào trứng lợn Landrace thu từ buồng trứng lò mổ

Tổng số 1.844 tế bào trứng loại A và B đã được đưa vào hệ thống nuôi IVM hai bước (IVM1 và IVM2). Khả năng sống và tỷ lệ thành thục (dựa trên sự xuất hiện của thể cực thứ nhất) được thể hiện qua bảng sau:

Lần TN	Số tế bào trứng nuôi	Số trứng sống sau nuôi	Tỷ lệ trứng sống (%)	Số trứng thành thục (có PB1)	Tỷ lệ thành thục (%)
1	264	187	70,83	154	58,33
2	315	298	94,60	221	70,16
3	311	274	88,10	194	62,38
4	360	264	73,33	212	58,89
5	249	204	81,93	160	64,26
6	345	282	81,74	207	60,00
Tổng	1.844	1.509	81,76	1.148	62,34

Tỷ lệ tế bào trứng sống trung bình sau 44-48 giờ nuôi đạt 81,76% và tỷ lệ trứng đạt thành thục nhân giải phóng thể cực thứ nhất đạt 62,34%. Tác giả giải thích tỷ lệ thành thục này thấp hơn so với một số nghiên cứu trước (như Mariana và cs., 2015 đạt >90%; Nguyễn Thị Thoa và cs., 2009 đạt >93%) do đề tài sử dụng kết hợp cả trứng loại B (có lớp cumulus mỏng hơn, từ 2 lớp) và thời gian bảo quản, vận chuyển buồng trứng kéo dài 4-5 tiếng trước khi tách tế bào.

Đánh giá khả năng tạo phôi lợn in vitro từ tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt đông lạnh

Nội dung này được chia thành hai bước đánh giá cụ thể:

Đánh giá khả năng xâm nhập vào tế bào trứng của tinh trùng tại thời điểm 10 giờ sau IVF

Từ 1.148 trứng thành thục, tác giả tiến hành lấy mẫu 114 trứng sau thụ tinh 10 giờ để kiểm tra sự hình thành tiền nhân dưới kính hiển vi:

Lần TN	Số trứng thành thục làm IVF	Số phôi kiểm tra	Số phôi có tinh trùng xâm nhập [n (%)]	Phôi có 2 tiền nhân (đơn tinh trùng) [n (%)]	Phôi có >2 tiền nhân (đa tinh trùng) [n (%)]
1	154	15	7 (46,67%)	5 (33,33%)	2 (13,33%)
2	221	23	14 (60,87%)	8 (34,78%)	6 (26,09%)
3	194	19	13 (68,42%)	7 (36,84%)	6 (31,58%)
4	212	21	11 (52,38%)	10 (47,62%)	1 (4,76%)
5	160	16	9 (56,25%)	6 (37,50%)	3 (18,75%)
6	207	20	15 (75,00%)	11 (55,00%)	4 (20,00%)
Tổng	1.148	114	69 (60,52%)	47 (41,22%)	22 (19,29%)

Kết quả chỉ ra tỷ lệ xâm nhập tổng số đạt 60,52%, trong đó tỷ lệ thụ tinh bình thường (hình thành 2 tiền nhân) đạt 41,22% và tỷ lệ thụ tinh đa tinh trùng (>2 tiền nhân) là 19,29%. So với nghiên cứu của Nguyễn Việt Linh và cộng sự (2018) trên tinh trùng mào tinh hoàn lợn Bản (tỷ lệ xâm nhập 25,8%, tỷ lệ 2 tiền nhân 61,4%), tinh trùng Kiềng Sắt thu qua xuất tinh đông lạnh có khả năng xâm nhập cao hơn nhưng tỷ lệ đa tinh trùng cũng cao hơn.

Đánh giá khả năng phân chia và phát triển đến phôi nang trong môi trường IVC

Tổng số 1.034 hợp tử giả định sau IVF được nuôi cấy trong môi trường PZM3 bổ sung 10% FCS ở giai đoạn ngày 4-5. Sự phân chia phôi được ghi nhận ở ngày thứ 2, tỷ lệ hình thành phôi nang ghi nhận ở ngày thứ 7 và tổng số tế bào/phôi nang được xác định qua nhuộm Hoechst 33342:

Lần TN	Số phôi đưa vào IVC	Phôi phân chia ngày 2 [n (%)]	Phôi nang ngày 7 [n (%)]	Số tế bào TB / phôi nang (tế bào)
1	139	80 (57,55%)	25 (17,98%)	49,98
2	198	122 (61,61%)	36 (18,18%)	51,25
3	175	102 (58,28%)	33 (18,86%)	50,02
4	191	121 (63,35%)	42 (21,99%)	53,01
5	144	94 (65,28%)	26 (18,06%)	48,89
6	187	115 (61,49%)	34 (18,18%)	49,31
Tổng	1.034	634 (61,13%)	196 (18,95%)	50,41

Tổng cộng đã tạo ra 196 phôi nang đạt tỷ lệ 18,95% (tính trên tổng số phôi nuôi cấy) với tỷ lệ phân chia đạt 61,13%. Chất lượng phôi nang được đánh giá thông qua số lượng tế bào đạt trung bình 50,41 tế bào/phôi nang (dao động từ 48,89 đến 53,01 tế bào), phản ánh phôi có tiềm năng phát triển tốt.

Kết quả và đóng góp

• Hệ thống kết quả định lượng cụ thể:

  • Thu nhận từ 123 buồng trứng lò mổ đạt 2.238 trứng; chọn được 1.844 trứng loại A và B (tỷ lệ 82,39%), trung bình đạt 14,99 trứng đạt chuẩn/buồng trứng.
  • Tỷ lệ tế bào trứng sống và thành thục in vitro sau 44-48 giờ nuôi cấy trong môi trường POM bổ sung EGF và hormone lần lượt đạt 81,76% và 62,34%.
  • Tỷ lệ tinh trùng Kiềng Sắt đông lạnh xâm nhập vào trứng sau 10 giờ IVF đạt 60,52%; trong đó tỷ lệ tạo hợp tử bình thường (2 tiền nhân) đạt 41,22% và tỷ lệ đa tinh trùng là 19,29%.
  • Tỷ lệ phôi phân chia ở ngày thứ 2 đạt 61,13% (634/1.034 phôi); tỷ lệ phát triển thành phôi nang ở ngày thứ 7 đạt 18,95% (196/1.034 phôi).
  • Chất lượng phôi nang đạt mức trung bình 50,41 tế bào/phôi.

• Đề xuất kỹ thuật của tác giả:

  • Áp dụng phương pháp cắt lát (slicing) trên nang trứng kích thước 3-6 mm để tối ưu hóa lượng trứng thu nhận từ buồng trứng phụ phẩm lò mổ.
  • Sử dụng hệ thống môi trường POM bổ sung EGF và dbcAMP ở pha đầu giúp cải thiện nồng độ glutathione nội bào (GSH) và đồng bộ hóa thành thục nhân - tế bào chất.
  • Loại bỏ bớt tế bào cumulus bằng hyaluronidase 0,1% nhưng duy trì lại 1 lớp tế bào quanh màng zona pellucida trước khi IVF nhằm tăng khả năng thâm nhập của tinh trùng và hạn chế rào cản cơ học.
  • Bổ sung 10% huyết thanh thai bê (FCS) vào môi trường PZM3 vào ngày thứ 4 hoặc 5 của quá trình nuôi cấy phôi để cung cấp dưỡng chất cần thiết cho giai đoạn phôi dâu chuyển tiếp sang phôi nang giãn nở.

• Đóng góp khoa học và thực tiễn:

  • Đây là nghiên cứu thực nghiệm đầu tiên tại Việt Nam công bố dữ liệu tạo phôi lợn in vitro thành công từ nguồn tinh trùng lợn Kiềng Sắt (giống bản địa quý hiếm thuộc diện cần bảo tồn) được thu nhận qua xuất tinh và bảo quản đông lạnh.
  • Kết quả chứng minh khả năng thụ tinh và tiềm năng phát triển phôi nang của tinh trùng lợn nội đông lạnh, cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm phục vụ việc xây dựng ngân hàng gen và ứng dụng công nghệ phôi trong bảo tồn vật nuôi bản địa.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp theo

• Hạn chế được ghi nhận từ văn bản:

  • Nguồn tế bào trứng phụ thuộc vào buồng trứng thu nhận từ lò mổ; thời gian vận chuyển và xử lý ban đầu kéo dài (4-5 tiếng) làm giảm tỷ lệ sống và tỷ lệ thành thục in vitro so với điều kiện tối ưu.
  • Hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng vẫn ở mức đáng kể (19,29%), làm giảm hiệu suất tạo hợp tử bình thường mang 2 tiền nhân.
  • Nghiên cứu chỉ dừng lại ở bước đánh giá hình thái, tỷ lệ tạo phôi nang và đếm số tế bào phôi bằng nhuộm huỳnh quang; chưa thực hiện cấy chuyển phôi vào lợn nhận để đánh giá khả năng đậu thai và sinh lợn con.

• Hướng nghiên cứu tiếp theo:

  • Nghiên cứu tối ưu hóa nồng độ tinh trùng và thời gian đồng nuôi cấy trong bước IVF để hạn chế hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng.
  • Tiếp tục hoàn thiện môi trường nuôi cấy IVM/IVC nhằm nâng cao tỷ lệ thành thục noãn bào và tỷ lệ phôi nang.
  • Ứng dụng nguồn phôi in vitro tạo ra để thực hiện thử nghiệm cấy chuyển phôi trên lợn nái nhận, hướng tới việc tạo ra cá thể lợn Kiềng Sắt từ vật liệu di truyền bảo quản lạnh.

Giá trị tham khảo và đối tượng thụ hưởng

Khóa luận có giá trị tham khảo chuyên môn cao đối với:

• Sinh viên, học viên và nghiên cứu viên: Thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Công nghệ tế bào động vật, Thú y, Chăn nuôi đang thực hiện các đề tài về công nghệ hỗ trợ sinh sản (ART), thụ tinh trong ống nghiệm (IVF), bảo tồn nguồn gen động vật.
• Nội dung kỹ thuật hữu ích:
  • Quy trình chi tiết thu nhận và phân loại tế bào trứng từ buồng trứng lò mổ.
  • Công thức môi trường và quy trình nuôi thành thục 2 bước (IVM1/IVM2) với hệ POM.
  • Kỹ thuật giải đông, hoạt hóa tinh trùng lợn đông lạnh và quy trình nhuộm nhân phôi nang bằng Hoechst 33342.

Câu hỏi thường gặp

1. Nghiên cứu sử dụng nguồn tế bào trứng và tinh trùng từ những giống lợn nào?
Nghiên cứu sử dụng tế bào trứng thu nhận từ buồng trứng lợn ngoại Landrace tại các lò mổ địa phương (Hưng Yên, Đông Anh) và nguồn tinh trùng đông lạnh thu nhận qua phương pháp xuất tinh của lợn đực bản địa Kiềng Sắt.

2. Môi trường nào được sử dụng cho quá trình nuôi thành thục trứng và nuôi cấy phôi trong nghiên cứu?
Quá trình nuôi thành thục trứng (IVM) sử dụng môi trường POM bổ sung EGF, hormone (eCG, hCG) và dbcAMP (ở ngày 1); quá trình thụ tinh (IVF) sử dụng môi trường Pig-FM; và quá trình nuôi cấy phôi (IVC) sử dụng môi trường PZM3 có bổ sung 10% huyết thanh thai bê (FCS) ở ngày 4-5.

3. Tiêu chí nào được dùng để xác định tế bào trứng đã thành thục in vitro và phôi đã thụ tinh bình thường?
Tế bào trứng thành thục được xác định dựa trên sự xuất hiện của thể cực thứ nhất (first polar body). Trứng thụ tinh bình thường (đơn tinh trùng) được xác định tại thời điểm 10 giờ sau IVF khi quan sát thấy tế bào trứng xuất hiện 2 tiền nhân.

4. Hiệu suất tạo phôi nang và tổng số tế bào trung bình trên mỗi phôi nang đạt được là bao nhiêu?
Sau 7 ngày nuôi cấy trong môi trường IVC, tỷ lệ tạo phôi nang đạt 18,95% (196 phôi nang trên 1.034 phôi đưa vào nuôi cấy). Chất lượng phôi nang đánh giá qua nhuộm huỳnh quang Hoechst 33342 đạt trung bình 50,41 tế bào/phôi.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Đinh Thị Mỹ Duyên đã thiết lập và thực hiện thành công quy trình tạo phôi lợn in vitro từ nguồn tinh trùng lợn Kiềng Sắt đông lạnh kết hợp với noãn bào thu từ lò mổ. Đề tài đạt tỷ lệ thành thục trứng 62,34%, tỷ lệ xâm nhập tinh trùng 60,52%, tỷ lệ phân chia 61,13% và tỷ lệ tạo phôi nang 18,95% với chất lượng trung bình 50,41 tế bào/phôi. Kết quả này cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm quan trọng cho công nghệ phôi trên lợn nội và mở ra triển vọng ứng dụng trong công tác bảo tồn nguồn gen vật nuôi bản địa quý hiếm tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Việt Nam là một trong những quốc gia có tính đa dạng sinh học cao trên thế giới với nhiều dòng/giống vật nuôi bản địa khác nhau, đặc biệt là các giống lợn bản địa. Các giống lợn bản địa của Việt Nam mặc dù có kích thƣớc nhỏ, năng suất thấp nhƣng chúng thƣờng mang những đặc tính quý nhƣ: chất lƣợng thịt thơm ngon, dễ nuôi, không cần đầu tƣ nhiều thức ăn, có khả năng kháng bệnh tốt, đáp ứng tốt điều kiện khí hậu khắc nghiệt của từng vùng, rất phù hợp cho chăn nuôi ở những vùng sâu, vùng xa, vùng cao, là nguồn gen rất đa dạng và nhiều tiềm năng quý. Tuy nhiên do áp lực đòi hỏi về năng suất để đáp ứng nhu cầu về thịt nên các giống lợn bản địa không đƣợc chú trọng dẫn đến nhiều giống bị suy giảm về mặt số lƣợng hoặc bị mất đi. Bên cạnh đó, do ảnh hƣởng của dịch bệnh nhƣ dịch tả lợn châu Phi nên một số lƣợng lớn lợn bản địa phải tiêu hủy.

Bảo tồn lạnh tinh trùng lợn bản địa là một trong những phƣơng pháp hiệu quả trong việc gìn giữ các lợn đực giống có chất lƣợng và tăng tốc độ cải thiện chất lƣợng đàn lợn bản địa Việt Nam. Bảo quản lạnh tinh trùng lợn cũng là một trong các điều kiện cần thiết để thành lập ngân hàng gen tinh trùng lợn bản địa. Cùng với đó, kỹ thuật tạo phôi lợn in vitro là kỹ thuật quan trọng có thể tạo ra đƣợc một số lƣợng lớn phôi có chất lƣợng tốt từ tinh trùng lợn đông lạnh sửdụng cho quá trình bảo quản lạnh hoặc cấy chuyển phôi. Sự kết hợp giữa kỹ thuật tạo phôi lợn in vitro với kỹ thuật cấy chuyển phôi có vai trò quan trọng trong việc tạo ra lợn con từ nguồn tinh trùng lợn đông lạnh (Kikuchi và cs, 2016).

Quy trình đông lạnh tinh trùng và tạo phôi lợn in vitro đã đƣợc thiết lập thành công trên một số giống lợn ngoại nhƣ Landrace, Large White hoặc Duroc. Tuy nhiên cho đến nay, có rất ít các báo cáo nói về khả năng tạo phôi lợn in vitro từ tinh trùng đông lạnh của các giống lợn bản địa Việt Nam, đặc biệt là tinh 1 trùng lợn bản địa đông lạnh thu bằng cách xuất tinh. Hiện nay, mới chỉ có một số ít báo cáo đánh giá khả năng tạo phôi lợn in vitro từ tinh trùng đông lạnh thu từ mào tinh hoàn của lợn Bản (Nguyen và cs, 2015; Nguyen Viet Linh và cs, 2018; Nhung và cs, 2020). Tại Việt Nam, lợn Kiềng Sắt là các giống lợn nằm trong danh mục các giống vật nuôi cần đƣợc bảo tồn theo Nghị định 13/2020/NĐ-CP ngày 21/1/2020 của Chính phủ.

Xuất phát từ nhu cầu thực tế đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tạo phôi lợn in vitro từ tinh trùng lợn Kiềng Sắt đông lạnh”. Mục đích và yêu cầu 1.1 Mục đích Tạo đƣợc nguồn phôi lợn in vitro từ tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt đông lạnh làm nguyên liệu cho các nghiên cứu về tinh trùng và phôi lợn nội.2 Yêu cầu - Tạo đƣợc phôi nang lợn in vitro từ tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt đông lạnh. - Đánh giá đƣợc chất lƣợng phôi nang lợn in vitro từ tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt đông lạnh. Ý nghĩa của nghiên cứu 1.

Ý nghĩa khoa học - Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ tạo tiền đề cho việc mở rộng hƣớng nghiên cứu ứng dụng công nghệ phôi và đông lạnh tinh trùng lợn tại Việt Nam; từ đó mở ra hƣớng bảo tồn nguồn vật liệu di truyền của các loài vật nuôi có giá trị và quý hiếm khác tại Việt Nam. Ý nghĩa thực tiễn - Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần vào việc phát triển ngành chăn nuôi lợn tại Việt Nam. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Buồng trứng và quá trình hình thành tế bào trứng 2.

Cấu tạo và hoạt động của buồng trứng Buồng trứng là cơ quan tạo giao tử cái (noãn bào - tế bào trứng) ở động vật nói chung cũng nhƣ ở các gia súc nói riêng. Không giống nhƣ tinh hoàn, buồng trứng nằm trong xoang bụng, sau thận, dƣới đỉnh và trƣớc khung xƣơng chậu. Buồng trứng ở mỗi con cái gồm một buồng trứng bên trái và một buồng trứng bên phải. Chức năng của buồng trứng là: tạo ra tế bào trứng và sản xuất hormone sinh dục cái.

Buồng trứng tạo trứng thành thục theo một tần suất nhất định. Ở lợn, mỗi chu kỳ rụng trứng tạo ra khoảng 10-20 tế bào trứng mỗi. Tế bào trứng nằm trong các nang trứng. Các hormone đƣợc buồng trứng tiết ra là estrogen và progesterone.

Estrogen đƣợc tiết ra từ các nang trứng còn progesterone đƣợc tiết ra từ các thể vàng, cả hai hormone này đều thuộc nhóm hormone steroid. Estrogen có chức năng: kích thích sự phát triển của các cơ quan sinh dục cái; tăng hành vi liên quan đến động dục nhƣ chịu đực; kích thích sự phát triển của tuyến vú; kích thích các đặc tính sinh dục của lợn nái. Progesterone có vai trò quan trọng trong việc chuẩn bị tử cung để cho phôi làm tổ; ngăn cản sự thành thục của các tế bào trứng khác trong quá trình mang thai; duy trì sự có chửa và kết hợp với estrogen và các chất khác để kích thích sự phát triển của tuyến. Buồng trứng gồm có 2 miền, miền tủy bên trong và miền vỏ bên ngoài.

Miền tủy có nhiều mạch máu, thần kinh và mô liên kết. Miền vỏ gồm các tế bào và các lớp mô có nhiệm vụ tạo ra tế bào trứng và hormone. Lớp ngoài cùng của miền vỏ buồng trứng là biểu mô bề mặt. Biểu mô bề mặt là một lớp tế bào lập phƣơng bao phủ toàn bộ bề mặt của buồng trứng.

Ngay bên dƣới biểu mô bề mặt là một lớp mỏng, dày đặc các mô liên kết, gọi là áo trắng buồng trứng. Phía dƣới áo trắng buồng trứng là nhu mô, đƣợc coi là lớp chức năng bởi vì nó chứa nang trứng và các tế bào phân tiết hormone buồng trứng (Sofie Tanghe và cs. 3 Hình 1: Sơ đồ sự phát triển của nang trứng (nguồn: Bearden và Fuquay, 2000) Trong buồng trứng ở cá thể đã thành thục thƣờng xuyên có các nang trứng ở trạng thái phát triển và thành thục. Giải phẫu miền vỏ của một gia súc cái có hoạt động sinh sản sẽ cho thấy các giai đoạn thành thục này (Hình 1).

Ngoài các nang trứng nguyên thủy còn có các nang trứng sơ cấp hay còn gọi là nang bậc 1. Đây là những nang có dấu hiệu phát triển từ nang nguyên thủy với lớp tế bào nang bắt đầu biến đổi thành dạng hình trụ vuông hay chữ nhật. Sau giai đoạn nang sơ cấp là sự tăng sinh các tế bào hạt bao quanh một tế bào trứng có khả năng phát triển. Khi số lƣợng tế bào hạt tăng thành 2 rồi thành nhiều lớp thì nang trứng giai đoạn này đƣợc gọi là nang thứ cấp (nang bậc II - secondary follicle).

Trong quá trình phát triển, các tế bào hạt nang thứ cấp tiết ra dịch, đẩy chúng tách rời và hình thành các xoang giữa các nang bào. Các xoang nhỏ lớn dần cùng sự phát triển của trứng và sau đó thì kết hợp làm một. Khi một xoang đã đƣợc hình thành thì nang đó đƣợc gọi là nang bậc III (tertiary follicle) hay còn gọi là nang có hốc. Nang bậc III thành thục khi quan sát thấy nó chứa đầy dịch và nổi lên bề mặt buồng trứng và đƣợc gọi là nang Graaf.

Dịch trong nang bậc III đƣợc gọi là dịch nang trứng. Đây là một dịch nhớt giàu hormone sinh sản steroid. Nhiều hormone sinh sản khác cũng nhƣ các yếu tố không phải hormone giúp điều hoà chức năng buồng trứng cũng đã đƣợc tìm thấy trong dịch nang trứng) (Keller, P. 4 Quá trình biến đổi của nang trứng đã làm nang trứng tăng thể tích lên khoảng 500 lần, kích thƣớc noãn bào cũng tăng lên nhƣng không nhiều nhƣ nang trứng, ở ngƣời nó tăng từ 10m ở nang nguyên thuỷ lên 80m ở bao Graaf.

Dấu hiệu trƣớc khi rụng trứng là xuất hiện một vùng màu nhạt ở cực nang trứng phần lồi lên mặt buồng trứng do sự ngừng lƣu thông máu cho các mao mạch nằm ở lớp vỏ trong của nang trứng chín. Ở vùng này, lớp biểu mô phủ buồng trứng, lớp màng trắng của buồng trứng và vỏ ngoài của nang trứng gián đoạn để lộ ra lớp vỏ trong. Khi nang trứng vỡ ra, noãn bào 2 cùng với vòng tia tách khỏi thành hốc lọt qua chỗ vỡ ra ngoài, đồng thời dịch nang trứng trong hốc nang trứng trào ra ngoài. Hiện tƣợng này gọi là sự rụng trứng.

Phần nang trứng còn lại gọi là thể vàng (hoàng thể). Tuỳ thuộc trứng có làm tổ trong niêm mạc tử cung hay không mà thể vàng tiếp tục phát triển thành thể vàng có mang hoặc tiêu giảm và biến mất (Keller, P. Cấu tạo và sự hình thành tế bào trứng 2. Cấu tạo tế bào trứng Trứng lợn có hình cầu, đƣờng kính của trứng chín không kể màng sáng dao động trong khoảng 120-170 μm (Hình 2).

Trứng là loại tế bào có kích thƣớc lớn nhất trong cơ thể, đƣợc biệt hóa cao độ và có khả năng kết hợp với tinh trùng để hình thành hợp tử. Hợp tử này sẽ phát triển thành một cơ thể mới. Lớp vỏ tế bào trứng lợn đƣợc gọi là màng sáng, nó do chính tế bào trứng tạo nên. Màng sáng là dạng chuyên hoá cao của khuôn ngoại bào (glicocalix) của tế bào trứng, là sự mở rộng các glycoprotein màng từ màng sinh chất.

Nó bao trực tiếp quanh màng bào tƣơng. Lớp này khá dày, nó bảo vệ trứng khỏi các tác động cơ học có hại. Nó còn có tính đặc hiệu loài và ngăn cản không cho các tinh trùng khác loài xâm nhập. Ở nhiều loài động vật, màng trứng thứ nhất thƣờng có những vi lỗ xuyên qua gọi là noãn khổng (micropile).

Trên màng trứng noãn khổng có vị trí khác nhau tuỳ loài, ở cực trên, cực dƣới hoặc ở nơi trứng dính vào buồng trứng. Xuyên qua màng sáng có các chồi tế bào chất xuất phát từ các nang bào để tăng 5 cƣờng mối liên kết và trao đổi chất với tế bào trứng. Ở động vật có vú còn có các tế bào nang bao quanh trứng gọi là vành phóng xạ có chức năng nuôi dƣỡng trứng trong thời gian trứng đã giải phóng khỏi buồng trứng, tinh trùng phải chui qua đƣợc các lớp tế bào này mới thụ tinh đƣợc cho trứng. Bên trong tế bào chất có một lớp mỏng tế bào chất ngoại vi (khoảng 5m), ngay dƣới màng trứng có cấu tạo đặc biệt có độ quánh lớn hơn lớp tế bào chất bên trong gọi là lớp vỏ.