Đặt vấn đề Việt Nam là một trong những quốc gia có tính đa dạng sinh học cao trên thế giới với nhiều dòng/giống vật nuôi bản địa khác nhau, đặc biệt là các giống lợn bản địa. Các giống lợn bản địa của Việt Nam mặc dù có kích thƣớc nhỏ, năng suất thấp nhƣng chúng thƣờng mang những đặc tính quý nhƣ: chất lƣợng thịt thơm ngon, dễ nuôi, không cần đầu tƣ nhiều thức ăn, có khả năng kháng bệnh tốt, đáp ứng tốt điều kiện khí hậu khắc nghiệt của từng vùng, rất phù hợp cho chăn nuôi ở những vùng sâu, vùng xa, vùng cao, là nguồn gen rất đa dạng và nhiều tiềm năng quý. Tuy nhiên do áp lực đòi hỏi về năng suất để đáp ứng nhu cầu về thịt nên các giống lợn bản địa không đƣợc chú trọng dẫn đến nhiều giống bị suy giảm về mặt số lƣợng hoặc bị mất đi. Bên cạnh đó, do ảnh hƣởng của dịch bệnh nhƣ dịch tả lợn châu Phi nên một số lƣợng lớn lợn bản địa phải tiêu hủy.
Bảo tồn lạnh tinh trùng lợn bản địa là một trong những phƣơng pháp hiệu quả trong việc gìn giữ các lợn đực giống có chất lƣợng và tăng tốc độ cải thiện chất lƣợng đàn lợn bản địa Việt Nam. Bảo quản lạnh tinh trùng lợn cũng là một trong các điều kiện cần thiết để thành lập ngân hàng gen tinh trùng lợn bản địa. Cùng với đó, kỹ thuật tạo phôi lợn in vitro là kỹ thuật quan trọng có thể tạo ra đƣợc một số lƣợng lớn phôi có chất lƣợng tốt từ tinh trùng lợn đông lạnh sửdụng cho quá trình bảo quản lạnh hoặc cấy chuyển phôi. Sự kết hợp giữa kỹ thuật tạo phôi lợn in vitro với kỹ thuật cấy chuyển phôi có vai trò quan trọng trong việc tạo ra lợn con từ nguồn tinh trùng lợn đông lạnh (Kikuchi và cs, 2016).
Quy trình đông lạnh tinh trùng và tạo phôi lợn in vitro đã đƣợc thiết lập thành công trên một số giống lợn ngoại nhƣ Landrace, Large White hoặc Duroc. Tuy nhiên cho đến nay, có rất ít các báo cáo nói về khả năng tạo phôi lợn in vitro từ tinh trùng đông lạnh của các giống lợn bản địa Việt Nam, đặc biệt là tinh 1 trùng lợn bản địa đông lạnh thu bằng cách xuất tinh. Hiện nay, mới chỉ có một số ít báo cáo đánh giá khả năng tạo phôi lợn in vitro từ tinh trùng đông lạnh thu từ mào tinh hoàn của lợn Bản (Nguyen và cs, 2015; Nguyen Viet Linh và cs, 2018; Nhung và cs, 2020). Tại Việt Nam, lợn Kiềng Sắt là các giống lợn nằm trong danh mục các giống vật nuôi cần đƣợc bảo tồn theo Nghị định 13/2020/NĐ-CP ngày 21/1/2020 của Chính phủ.
Xuất phát từ nhu cầu thực tế đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tạo phôi lợn in vitro từ tinh trùng lợn Kiềng Sắt đông lạnh”. Mục đích và yêu cầu 1.1 Mục đích Tạo đƣợc nguồn phôi lợn in vitro từ tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt đông lạnh làm nguyên liệu cho các nghiên cứu về tinh trùng và phôi lợn nội.2 Yêu cầu - Tạo đƣợc phôi nang lợn in vitro từ tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt đông lạnh. - Đánh giá đƣợc chất lƣợng phôi nang lợn in vitro từ tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt đông lạnh. Ý nghĩa của nghiên cứu 1.
Ý nghĩa khoa học - Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ tạo tiền đề cho việc mở rộng hƣớng nghiên cứu ứng dụng công nghệ phôi và đông lạnh tinh trùng lợn tại Việt Nam; từ đó mở ra hƣớng bảo tồn nguồn vật liệu di truyền của các loài vật nuôi có giá trị và quý hiếm khác tại Việt Nam. Ý nghĩa thực tiễn - Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần vào việc phát triển ngành chăn nuôi lợn tại Việt Nam. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Buồng trứng và quá trình hình thành tế bào trứng 2.
Cấu tạo và hoạt động của buồng trứng Buồng trứng là cơ quan tạo giao tử cái (noãn bào - tế bào trứng) ở động vật nói chung cũng nhƣ ở các gia súc nói riêng. Không giống nhƣ tinh hoàn, buồng trứng nằm trong xoang bụng, sau thận, dƣới đỉnh và trƣớc khung xƣơng chậu. Buồng trứng ở mỗi con cái gồm một buồng trứng bên trái và một buồng trứng bên phải. Chức năng của buồng trứng là: tạo ra tế bào trứng và sản xuất hormone sinh dục cái.
Buồng trứng tạo trứng thành thục theo một tần suất nhất định. Ở lợn, mỗi chu kỳ rụng trứng tạo ra khoảng 10-20 tế bào trứng mỗi. Tế bào trứng nằm trong các nang trứng. Các hormone đƣợc buồng trứng tiết ra là estrogen và progesterone.
Estrogen đƣợc tiết ra từ các nang trứng còn progesterone đƣợc tiết ra từ các thể vàng, cả hai hormone này đều thuộc nhóm hormone steroid. Estrogen có chức năng: kích thích sự phát triển của các cơ quan sinh dục cái; tăng hành vi liên quan đến động dục nhƣ chịu đực; kích thích sự phát triển của tuyến vú; kích thích các đặc tính sinh dục của lợn nái. Progesterone có vai trò quan trọng trong việc chuẩn bị tử cung để cho phôi làm tổ; ngăn cản sự thành thục của các tế bào trứng khác trong quá trình mang thai; duy trì sự có chửa và kết hợp với estrogen và các chất khác để kích thích sự phát triển của tuyến. Buồng trứng gồm có 2 miền, miền tủy bên trong và miền vỏ bên ngoài.
Miền tủy có nhiều mạch máu, thần kinh và mô liên kết. Miền vỏ gồm các tế bào và các lớp mô có nhiệm vụ tạo ra tế bào trứng và hormone. Lớp ngoài cùng của miền vỏ buồng trứng là biểu mô bề mặt. Biểu mô bề mặt là một lớp tế bào lập phƣơng bao phủ toàn bộ bề mặt của buồng trứng.
Ngay bên dƣới biểu mô bề mặt là một lớp mỏng, dày đặc các mô liên kết, gọi là áo trắng buồng trứng. Phía dƣới áo trắng buồng trứng là nhu mô, đƣợc coi là lớp chức năng bởi vì nó chứa nang trứng và các tế bào phân tiết hormone buồng trứng (Sofie Tanghe và cs. 3 Hình 1: Sơ đồ sự phát triển của nang trứng (nguồn: Bearden và Fuquay, 2000) Trong buồng trứng ở cá thể đã thành thục thƣờng xuyên có các nang trứng ở trạng thái phát triển và thành thục. Giải phẫu miền vỏ của một gia súc cái có hoạt động sinh sản sẽ cho thấy các giai đoạn thành thục này (Hình 1).
Ngoài các nang trứng nguyên thủy còn có các nang trứng sơ cấp hay còn gọi là nang bậc 1. Đây là những nang có dấu hiệu phát triển từ nang nguyên thủy với lớp tế bào nang bắt đầu biến đổi thành dạng hình trụ vuông hay chữ nhật. Sau giai đoạn nang sơ cấp là sự tăng sinh các tế bào hạt bao quanh một tế bào trứng có khả năng phát triển. Khi số lƣợng tế bào hạt tăng thành 2 rồi thành nhiều lớp thì nang trứng giai đoạn này đƣợc gọi là nang thứ cấp (nang bậc II - secondary follicle).
Trong quá trình phát triển, các tế bào hạt nang thứ cấp tiết ra dịch, đẩy chúng tách rời và hình thành các xoang giữa các nang bào. Các xoang nhỏ lớn dần cùng sự phát triển của trứng và sau đó thì kết hợp làm một. Khi một xoang đã đƣợc hình thành thì nang đó đƣợc gọi là nang bậc III (tertiary follicle) hay còn gọi là nang có hốc. Nang bậc III thành thục khi quan sát thấy nó chứa đầy dịch và nổi lên bề mặt buồng trứng và đƣợc gọi là nang Graaf.
Dịch trong nang bậc III đƣợc gọi là dịch nang trứng. Đây là một dịch nhớt giàu hormone sinh sản steroid. Nhiều hormone sinh sản khác cũng nhƣ các yếu tố không phải hormone giúp điều hoà chức năng buồng trứng cũng đã đƣợc tìm thấy trong dịch nang trứng) (Keller, P. 4 Quá trình biến đổi của nang trứng đã làm nang trứng tăng thể tích lên khoảng 500 lần, kích thƣớc noãn bào cũng tăng lên nhƣng không nhiều nhƣ nang trứng, ở ngƣời nó tăng từ 10m ở nang nguyên thuỷ lên 80m ở bao Graaf.
Dấu hiệu trƣớc khi rụng trứng là xuất hiện một vùng màu nhạt ở cực nang trứng phần lồi lên mặt buồng trứng do sự ngừng lƣu thông máu cho các mao mạch nằm ở lớp vỏ trong của nang trứng chín. Ở vùng này, lớp biểu mô phủ buồng trứng, lớp màng trắng của buồng trứng và vỏ ngoài của nang trứng gián đoạn để lộ ra lớp vỏ trong. Khi nang trứng vỡ ra, noãn bào 2 cùng với vòng tia tách khỏi thành hốc lọt qua chỗ vỡ ra ngoài, đồng thời dịch nang trứng trong hốc nang trứng trào ra ngoài. Hiện tƣợng này gọi là sự rụng trứng.
Phần nang trứng còn lại gọi là thể vàng (hoàng thể). Tuỳ thuộc trứng có làm tổ trong niêm mạc tử cung hay không mà thể vàng tiếp tục phát triển thành thể vàng có mang hoặc tiêu giảm và biến mất (Keller, P. Cấu tạo và sự hình thành tế bào trứng 2. Cấu tạo tế bào trứng Trứng lợn có hình cầu, đƣờng kính của trứng chín không kể màng sáng dao động trong khoảng 120-170 μm (Hình 2).
Trứng là loại tế bào có kích thƣớc lớn nhất trong cơ thể, đƣợc biệt hóa cao độ và có khả năng kết hợp với tinh trùng để hình thành hợp tử. Hợp tử này sẽ phát triển thành một cơ thể mới. Lớp vỏ tế bào trứng lợn đƣợc gọi là màng sáng, nó do chính tế bào trứng tạo nên. Màng sáng là dạng chuyên hoá cao của khuôn ngoại bào (glicocalix) của tế bào trứng, là sự mở rộng các glycoprotein màng từ màng sinh chất.
Nó bao trực tiếp quanh màng bào tƣơng. Lớp này khá dày, nó bảo vệ trứng khỏi các tác động cơ học có hại. Nó còn có tính đặc hiệu loài và ngăn cản không cho các tinh trùng khác loài xâm nhập. Ở nhiều loài động vật, màng trứng thứ nhất thƣờng có những vi lỗ xuyên qua gọi là noãn khổng (micropile).
Trên màng trứng noãn khổng có vị trí khác nhau tuỳ loài, ở cực trên, cực dƣới hoặc ở nơi trứng dính vào buồng trứng. Xuyên qua màng sáng có các chồi tế bào chất xuất phát từ các nang bào để tăng 5 cƣờng mối liên kết và trao đổi chất với tế bào trứng. Ở động vật có vú còn có các tế bào nang bao quanh trứng gọi là vành phóng xạ có chức năng nuôi dƣỡng trứng trong thời gian trứng đã giải phóng khỏi buồng trứng, tinh trùng phải chui qua đƣợc các lớp tế bào này mới thụ tinh đƣợc cho trứng. Bên trong tế bào chất có một lớp mỏng tế bào chất ngoại vi (khoảng 5m), ngay dƣới màng trứng có cấu tạo đặc biệt có độ quánh lớn hơn lớp tế bào chất bên trong gọi là lớp vỏ.