Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn vibrio parahaemolyticus đột biến giảm độc lực nhằm phát triển vắc xin 3 phòng bệnh hoại tử gan thận trên một số loài cá biển

Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus đột biến giảm độc lực, phát triển vắc xin phòng bệnh hoại tử gan thận ở cá biển.

• Trường học: Trường Đại học Sư phạm Hà Nội
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu tạo chủng Vibrio parahaemolyticus đột biến giảm độc lực phát triển vắc xin phòng bệnh hoại tử gan thận ở cá biển
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• Lý do chọn đề tài
• Mục tiêu nghiên cứu
• Nội dung nghiên cứu
• Đối tượng nghiên cứu
• Phạm vi nghiên cứu
• Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• Tính mới, tính độc đáo của đề tài
• Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận ở một số loài cá
• 1.2. Đặc điểm hình thái, sinh hóa và sinh trưởng của vi khuẩn Vibrio
• 1.3. Hệ gen của vi khuẩn V.
• 1.4. Độc tố và các gen quy định độc tố haemolysin
• 1.5. Gen rpoB và tính kháng rifampicin
• 1.6. Kháng nguyên của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
• 1.7. Bệnh hoại tử gan thận trên cá biển
• 1.8. Chẩn đoán và điều trị
• 1.9. Vắc-xin và cơ chế miễn dịch chủ động
• 1.10. Vắc-xin và phân loại vắc-xin cho cá
• 1.11. Miễn dịch đặc hiệu ở cá xương
• 1.12. Phương thức đưa vắc-xin vào cơ thể cá
• 1.13. Nghiên cứu tạo vi khuẩn giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc-xin nhược độc phòng bệnh cho cá
• 1.14. Tạo vi khuẩn giảm độc lực bằng tác nhân vật lý
• 1.15. Tạo vi khuẩn giảm độc lực bằng tác nhân hóa học
• 1.16. Tạo vi khuẩn giảm độc lực bằng kĩ thuật gen
• 1.17. Tình hình nghiên cứu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận do cho cá
• 1.18. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 1.19. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3. Sơ đồ các bước thực hiện chính
• 2.4. Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn Vibrio từ cá nghi mắc bệnh
• 2.5. Phương pháp giữ giống chủng vi khuẩn
• 2.6. Phương pháp nhuộm Gram
• 2.7. Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn
• 2.8. Phương pháp đánh giá đặc điểm sinh hóa, đặc tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn
• 2.9. Phương pháp đánh giá độc lực của vi khuẩn
• 2.10. Phương pháp xử lý vi khuẩn với rifampicin
• 2.11. Phương pháp đánh giá độc lực của các dòng vi khuẩn kháng rifampicin
• 2.12. Nhóm phương pháp sinh học phân tử
• 2.13. Phương pháp thiết kế mồi
• 2.14. Phương pháp tách DNA tổng số
• 2.15. Phương pháp PCR, giải trình tự gen
• 2.16. Phương pháp tin sinh
• 2.17. Phương pháp đánh giá tính ổn định về độc lực và độ an toàn của dòng vi khuẩn giảm độc lực trên cá mú chấm cam
• 2.18. Phương pháp đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của dòng giảm độc lực trên cá mú
• 2.19. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Phân lập chủng vi khuẩn từ mẫu cá biển nghi mắc bệnh hoại tử gan thận
• 3.2. Phân lập vi khuẩn Vibrio
• 3.3. Phân tích đặc điểm sinh hóa của các mẫu vi khuẩn phân lập
• 3.4. Xác định chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus bằng phương pháp phân tử
• 3.5. Đánh giá khả năng gây bệnh cho cá mú của các chủng vi khuẩn phân lập
• 3.6. Phân lập, giải trình tự các gen độc tố toxR, tlh và gen rpoB các chủng vi khuẩn phân lập
• 3.7. Kết quả tạo dòng vi khuẩn V. parahaemolyticus giảm độc lực
• 3.8. Đánh giá độc lực của các dòng vi khuẩn kháng rifampicin
• 3.9. Đánh giá đặc điểm sinh hóa của các dòng vi khuẩn giảm độc lực
• 3.10. So sánh trình tự gen toxR, tlh và rpoB của các dòng giảm độc lực so và chủng vi khuẩn dại
• 3.11. So sánh trình tự gen toxR và tlh của dòng giảm độc lực và chủng vi khuẩn dại
• 3.12. So sánh trình tự rpoB của chủng dại với các dòng giảm độc lực
• 3.13. Đánh giá khả năng tạo đáp ứng miễn dịch, khả năng sinh trưởng của dòng vi khuẩn giảm độc lực
• 3.14. Đánh giá tính ổn định độc lực, khả năng sinh trưởng của dòng giảm độc lực
• 3.15. Xác định tính an toàn của dòng L4650
• 3.16. Đánh giá khả năng tạo đáp ứng miễn dịch của dòng vi khuẩn giảm độc lực ở cá mú
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• Tài liệu tiếng Việt
• PHỤ LỤC DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG

Tóm tắt

I. Tổng quan về Vibrio parahaemolyticus

Vibrio parahaemolyticus là vi khuẩn Gram âm, hình dấu phẩy, kích thước khoảng 0.5-0.8 x 1.4-2.4 µm. Vi khuẩn này không sinh bào tử, có tiên mao, di động, kỵ khí không bắt buộc, ưa môi trường kiềm mặn. Vibrio parahaemolyticus thường sống ở cửa sông và ven biển, phân lập từ cát, bùn, nước biển và thủy sản bị bệnh. Trên môi trường TCBS, khuẩn lạc có màu xanh đậm, dạng tròn đều, kích thước 2-3 mm. Vi khuẩn này có các đặc điểm sinh hóa đặc trưng như sinh enzyme catalase, oxidase, lên men glucose nhưng không lên men lactose, sinh indole và có khả năng di động.

1.1. Đặc điểm hình thái và sinh hóa

Vibrio parahaemolyticus thuộc ngành Proteobacteria, lớp Gamma Proteobacteria, bộ Vibrionales, họ Vibrionaceae. Vi khuẩn này có thời gian thế hệ 8-9 phút. Đặc điểm sinh hóa bao gồm khả năng sinh enzyme catalase, oxidase, lên men glucose, không sinh H2S, sinh indole và di động. Phản ứng KP (Kanagawa phenomenon) là đặc tính quan trọng, làm tan huyết dạng β trên môi trường thạch máu.

1.2. Hệ gen và độc tố

Hệ gen của Vibrio parahaemolyticus chứa các gen mã hóa độc tố như toxR, tdh, trh, và tlh. Các gen này quy định khả năng gây bệnh của vi khuẩn. Gen rpoB liên quan đến tính kháng rifampicin. Độc tố haemolysin do vi khuẩn tiết ra gây tan huyết và tổn thương mô ở cá.

II. Nghiên cứu tạo chủng đột biến giảm độc lực

Nghiên cứu tạo chủng Vibrio parahaemolyticus đột biến giảm độc lực nhằm phát triển vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận ở cá biển. Phương pháp sử dụng kháng sinh rifampicin để tạo đột biến gen rpoB, làm giảm độc lực của vi khuẩn. Các dòng đột biến được đánh giá về khả năng sinh trưởng, độc lực và đáp ứng miễn dịch trên cá mú chấm cam.

2.1. Phương pháp tạo đột biến

Phương pháp xử lý rifampicin được sử dụng để tạo đột biến gen rpoB ở Vibrio parahaemolyticus. Các dòng đột biến được phân tích trình tự gen toxR, tlh, và rpoB để xác định sự thay đổi nucleotide. Kết quả cho thấy các dòng đột biến có độc lực giảm đáng kể so với chủng gốc.

2.2. Đánh giá độc lực và miễn dịch

Các dòng đột biến được đánh giá về độc lực trên cá mú chấm cam. Kết quả cho thấy dòng L4650 có độc lực ổn định, tỉ lệ sống sót của cá đạt 100%. Tỉ lệ bảo hộ (RPS) đạt 96.91-100% sau 15 ngày và 93.33-100% sau 6 tháng tiêm chủng.

III. Ứng dụng trong phát triển vắc xin

Nghiên cứu tạo chủng Vibrio parahaemolyticus giảm độc lực có ý nghĩa quan trọng trong phát triển vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận ở cá biển. Dòng L4650 được chọn làm ứng viên tiềm năng cho sản xuất vắc-xin sống nhược độc. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho các nghiên cứu miễn dịch và phòng bệnh trên cá biển nuôi lồng.

3.1. Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu về các chủng Vibrio parahaemolyticus gây bệnh và các đột biến gen liên quan đến giảm độc lực. Phát hiện các sai khác trình tự nucleotide trong gen tlh và rpoB giữa các dòng đột biến và chủng gốc.

3.2. Ý nghĩa thực tiễn

Dòng L4650 có khả năng gây đáp ứng miễn dịch cao, là ứng viên tiềm năng cho sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận trên cá mú chấm cam và các loài cá biển khác. Nghiên cứu góp phần giảm thiểu thiệt hại do bệnh dịch trong ngành nuôi trồng thủy sản.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Ngành nuôi trồng thủy sản biển đóng vai trò trụ cột trong chiến lược kinh tế biển của Việt Nam với hơn 3.260 km bờ biển. Năm 2018, GDP toàn ngành thủy sản đạt 190.123 tỷ đồng, chiếm 23,57% toàn ngành nông nghiệp với sản lượng nuôi trồng đạt 4,15 triệu tấn. Tuy nhiên, rào cản lớn nhất đối với sự phát triển bền vững của nghề nuôi cá biển lồng bè (đặc biệt là cá mú Epinephelus coioides, cá hồng Lutjanus spp., cá giò Rachycentron canadum) là dịch bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. Theo số liệu từ Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO), dịch bệnh thủy sản gây tổn thất toàn cầu vượt 6 tỷ USD mỗi năm; riêng tại Việt Nam, thiệt hại hàng năm ước tính xấp xỉ 1 tỷ USD. Thực tế lâm sàng ghi nhận: "bệnh hoại tử gan thận phát hiện ở 14 quốc gia, trên 48 loài cá khác nhau... cá bị bệnh có thể chết hàng loạt, tỉ lệ chết lên đến 90%". Phương thức kiểm soát truyền thống dựa vào kháng sinh (tetracycline, amoxicillin, oxytetracycline) đã dẫn đến cuộc khủng hoảng kháng kháng sinh nghiêm trọng, ức chế miễn dịch của cá và để lại dư lượng độc hại trong chuỗi thực phẩm.

flowchart LR
    A["Chủng dại V. parahaemolyticus<br>(Phân lập từ ổ dịch biển miền Bắc)"] --> B["Áp lực chọn lọc hóa học<br>(Rifampicin tăng dần nồng độ)"]
    B --> C["Tích lũy đột biến gen<br>(rpoB - RRDR & tlh xoắn α)"]
    C --> D["Tuyển chọn dòng L4650<br>(Suy giảm độc lực, LD50 tăng vọt)"]
    D --> E["Vắc-xin sống nhược độc L4650<br>(RPS: 96,91 - 100% tại 15 ngày;<br>93,33 - 100% tại 6 tháng)"]

Khoảng trống nghiên cứu (Research Gap) then chốt hiện nay nằm ở việc thiếu vắng các dòng vắc-xin sống nhược độc (live attenuated vaccines) có độ an toàn sinh học cao và hiệu lực bảo hộ kéo dài dành cho cá biển nhiệt đới. Các dạng vắc-xin bất hoạt (inactivated bacterin) thương mại hóa hiện nay chỉ mang lại thời gian miễn dịch ngắn hạn, trong khi các cơ chế di truyền phân tử điều hòa độc lực của V. parahaemolyticus khi chịu áp lực chọn lọc kháng sinh chưa được sáng tỏ.

Luận án tiến sĩ chuyên ngành Vi sinh vật học / Công nghệ sinh học với đề tài "Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus đột biến giảm độc lực nhằm phát triển vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận trên một số loài cá biển" được triển khai nhằm giải quyết trực tiếp khoảng trống này thông qua hệ thống câu hỏi và giả thuyết nghiên cứu:

• Câu hỏi nghiên cứu 1 (RQ1): Cơ chế biến đổi di truyền nào trong các gen độc tố (toxR, tlh, tdh, trh) và gen rpoB quy định kiểu hình giảm độc lực ở V. parahaemolyticus dưới áp lực chọn lọc của rifampicin?
• Câu hỏi nghiên cứu 2 (RQ2): Dòng đột biến tuyển chọn có duy trì được tính ổn định di truyền, độ an toàn tuyệt đối và khả năng sinh trưởng bình thường trong điều kiện in vitro và in vivo hay không?
• Câu hỏi nghiên cứu 3 (RQ3): Mức độ đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và tỷ lệ bảo hộ tương đối (RPS) của dòng vi khuẩn giảm độc lực trên cá mú chấm cam (Epinephelus coioides) đạt được ở các mốc thời gian 15 ngày và 6 tháng là bao nhiêu?
• Giả thuyết nghiên cứu 1 (H1): Áp lực chọn lọc rifampicin tạo ra các đột biến điểm sai nghĩa trên vùng xác định kháng rifampicin (RRDR) của gen rpoB và gen độc tố tlh, làm suy giảm khả năng gây bệnh mà không làm mất tính kháng nguyên bề mặt.
• Giả thuyết nghiên cứu 2 (H2): Dòng vi khuẩn đột biến mang các biến đổi cấu trúc protein độc lực sẽ hoàn toàn an toàn cho cá thí nghiệm ở liều cao ($10^5\text{ CFU/ml}$) và kích thích hệ miễn dịch dịch thể sinh kháng thể kháng nguyên đặc hiệu bền vững.

Khung lý thuyết (Theoretical Framework) của nghiên cứu được xây dựng trên sự giao thoa giữa Thuyết chọn lọc áp lực kháng sinh và cơ chế ức chế phiên mã qua RNA polymerase (Campbell & Darst, 2001), Thuyết cơ chế bệnh sinh ngoại độc tố tan huyết vi khuẩn biển (Haemolysin Virulence Paradigm), và Lý thuyết miễn dịch học thích ứng ở cá xương (Teleost Adaptive Immunity Theory). Phạm vi nghiên cứu bao gồm việc thu thập, phân lập các chủng vi khuẩn thực địa tại các vùng nuôi trọng điểm ven biển phía Bắc (Cát Bà, vịnh Lan Hạ, Cát Hải - Hải Phòng; Đồng Châu - Thái Bình; Hải Thịnh - Nam Định) từ tháng 11/2014 đến tháng 4/2019, thực hiện khảo nghiệm in vivo trên các mô hình cá ngựa vằn (Danio rerio), cá rô phi (Oreochromis niloticus) và cá mú chấm cam (Epinephelus coioides). Đóng góp đột phá của luận án là tạo ra dòng ứng viên vắc-xin nhược độc L4650, đạt tỷ lệ bảo hộ RPS từ 96,91% đến 100% sau 15 ngày và duy trì 93,33% đến 100% sau 6 tháng tiêm chủng.

---

Literature Review và Positioning

Tổng quan y văn quốc tế ghi nhận ba luồng nghiên cứu chính trong chiến lược phát triển vắc-xin phòng chống Vibrio parahaemolyticus và các bệnh truyền nhiễm trên cá xương:

1. Luồng nghiên cứu vắc-xin bất hoạt (Inactivated Bacterins): Wu và cộng sự (2015) phát triển vắc-xin bất hoạt đa giá cho cá lù đù vàng lớn (Larimichthys crocea) đạt RPS 88,9%. Clark và cộng sự (2010) sử dụng formalin bất hoạt V. parahaemolyticus trên cá mú tại Thái Lan thu được RPS 77,6%. Tại Việt Nam, nghiên cứu của Phan Thị Vân và cộng sự (2013) với vắc-xin AquaVib hay Nguyễn Thị Thanh Thùy và cộng sự (2013) dùng formalin 0,5% bất hoạt chủng V3 cho thấy: RPS đạt 87,5% (có tá dược FIA) và 50% (không tá dược) sau 30 ngày, nhưng sau 60 ngày hiệu lực tụt dốc nghiêm trọng xuống lần lượt 41,1% và 10,9%. Hạn chế cốt tử của vắc-xin bất hoạt là thời gian tồn lưu kháng thể ngắn và không kích hoạt mạnh mẽ miễn dịch qua trung gian tế bào.
2. Luồng nghiên cứu vắc-xin tiểu phần, tái tổ hợp và DNA: Mao và cộng sự (2007) tách dòng gen OMPs (psuA, pvuA), Li và cộng sự (2010, 2013) khai thác kháng nguyên OmpK đóng gói trong hạt nano chitosan cho cá chẽm đen (Acanthopagrus schlegelii) đạt RPS 72,3%. Liu và cộng sự (2011) tạo vắc-xin DNA từ gen serine protease đột biến Ser318Pro đạt RPS 96,11% trên cá bơn (Scophthalmus maximus). Mặc dù có độ an toàn sinh học cao, rào cản kỹ thuật về chi phí tinh sạch protein tái tổ hợp và công nghệ đưa DNA plasmid vào tế bào đích khiến hướng đi này khó thương mại hóa đại trà cho nghề nuôi cá lồng biển.
3. Luồng nghiên cứu vắc-xin sống nhược độc (Live Attenuated Vaccines): Phương pháp đột biến xóa gen (knock-out) như công trình của Xiao và cộng sự (2011) trên Edwardsiella tarda ($\Delta aroC$, RPS 68,3 - 81%), Nho và cộng sự (2017) trên Edwardsiella ictaluri ESC-NDKL1 (RPS 81,67 - 95,22%), hoặc Liu và cộng sự (2018) trên Vibrio anguillarum MVAV6203 ($\Delta aroC$, RPS 80,31 - 90,67%) chứng minh ưu thế vượt trội về hiệu quả miễn dịch. Tuy nhiên, kỹ thuật knock-out đòi hỏi thao tác di truyền phức tạp và gặp rào cản pháp lý nghiêm ngặt về sinh vật biến đổi gen (GMO).

Tranh luận học thuật sâu sắc tập trung vào phương pháp gây đột biến bằng hóa chất chọn lọc (chất ức chế chọn lọc RNA polymerase - Rifampicin). Pridgeon và Klesius (2011, 2013) cùng Wise và cộng sự (2015) khẳng định việc nuôi cấy liên tục vi khuẩn dưới nồng độ rifampicin tăng dần tạo ra các đột biến suy giảm độc lực bền vững trên Aeromonas hydrophila, Streptococcus agalactiae và E. ictaluri. Ngược lại, Gliniewicz và cộng sự (2015) khi nghiên cứu Flavobacterium psychrophilum CSF259-93 cho rằng việc tiếp xúc với rifampicin gây tích lũy đột biến ngẫu nhiên trên toàn bộ hệ gen (SNP) chứ không thuần nhất trên một locus đích, làm dấy lên lo ngại về nguy cơ phục hồi độc lực (reversion to virulence).

Luận án tiến sĩ này định vị chính xác vào tâm điểm của cuộc tranh luận: Xác lập bằng chứng thực nghiệm giải mã cơ sở di truyền đột biến song hành trên cả gen điều hòa phiên mã rpoB và gen độc tố tan huyết tlh ở V. parahaemolyticus. So sánh trực tiếp với hai nghiên cứu quốc tế tiêu biểu:

• Nghiên cứu của Sun và cộng sự (2010) tạo dòng E. tarda TX5RM kháng rifampicin đạt RPS 80,6% (sau 5 tuần) và 69,4% (sau 8 tuần) trên cá bơn Nhật Bản (Paralichthys olivaceus).
• Nghiên cứu của Yu và cộng sự (2012) tạo dòng V. anguillarum C312M kháng rifampicin đạt RPS 60% và 84% sau 1 tháng.

Dòng đột biến L4650 trong luận án vượt trội hoàn toàn về độ bền vững miễn dịch, duy trì RPS trên 93,33% suốt 180 ngày (6 tháng), khẳng định bước tiến vượt bậc của công trình trong bản đồ học thuật quốc tế.

---

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mang lại những đóng góp nền tảng cho lý thuyết vi sinh vật học phân tử và bệnh học thủy sản thông qua việc mở rộng các mô hình lý thuyết kinh điển:

• Mở rộng Thuyết tương tác Rifampicin - RNA Polymerase β-subunit: Theo mô hình cấu trúc của Campbell và Darst (2001), kháng sinh rifampicin liên kết vào tiểu đơn vị $\beta$ (mã hóa bởi gen rpoB dài 4.029 bp), phong bế không gian kênh thoát của chuỗi RNA đang kéo dài. Luận án chứng minh rằng các đột biến tích lũy trong vùng xác định kháng rifampicin (RRDR dài 81 bp từ codon 507 đến 533) và các vùng lân cận ngoài RRDR không chỉ ngăn cản rifampicin liên kết mà còn gây biến đổi allosteric lên holoenzyme RNA polymerase. Sự thay đổi ái lực liên kết DNA khuôn tại các bộ ba bảo tồn xúc tác (như mô hình gatekeeper Arg và cặp Tyr-Gly tại các vị trí 555-556, 584-585 theo Peramachi et al., 2018) dẫn đến hiện tượng suy giảm chọn lọc tốc độ phiên mã của các operon độc lực liên hợp (toxRS, tlh).
• Lý thuyết cấu trúc - chức năng của Thermolabile Haemolysin (TLH): Luận án là công trình tiên phong nhân bản thành công toàn bộ khung đọc mở ORF dài 1.254 bp (mã hóa 417 amino acid) của gen tlh trên V. parahaemolyticus. Dựa trên khung lý thuyết của Wan và cộng sự (2019) về protein họ phospholipase $A_2$ (VvPlpA), cấu trúc 3D mô hình hóa qua phần mềm Phyre2 đã chứng minh: Các đột biến điểm trên dòng L4650 làm thay đổi cấu hình không gian tại vị trí xoắn $\alpha$ (amino acid 250-252), nằm liền kề bộ tứ xúc tác bảo tồn Ser152, Gly203, Asn247 và His392. Biến đổi này làm giảm hoạt tính ly giải màng phospholipid của hồng cầu và tế bào biểu mô mà vẫn giữ nguyên các epitop kháng nguyên nhận diện của protein bề mặt.

Các mệnh đề lý thuyết (Theoretical Propositions) được xác lập:

• Mệnh đề 1 ($P_1$): Áp lực chọn lọc hóa học liên tục bằng rifampicin tạo ra đột biến đa điểm có tính hiệp đồng giữa gen điều hòa phiên mã tổng thể (rpoB) và gen mã hóa yếu tố độc lực trực tiếp (tlh).
• Mệnh đề 2 ($P_2$): Sự suy giảm độc lực in vivo của vi khuẩn V. parahaemolyticus tỷ lệ thuận với mức độ biến dạng cấu trúc không gian của vùng xoắn $\alpha$ (250-252) trên phân tử ngoại độc tố TLH.
• Mệnh đề 3 ($P_3$): Vi khuẩn nhược độc mang đột biến kép rpoB-tlh duy trì nguyên vẹn cấu trúc kháng nguyên màng (LPS và OMPs), đủ khả năng kích hoạt trí nhớ miễn dịch dịch thể (IgM) kéo dài ít nhất 180 ngày ở cá xương nhiệt đới.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp liên ngành ba trụ cột:

1. Di truyền học vi sinh vật (Microbial Genetics): Khảo sát cấu trúc gen, giải trình tự Sanger, so sánh biến dị nucleotide/amino acid với cơ sở dữ liệu NCBI BLAST.
2. Tin sinh học cấu trúc (Structural Bioinformatics): Mô hình hóa cấu trúc protein 3D bằng Phyre2, phân tích sự thay đổi năng lượng liên kết và định vị không gian các trung tâm xúc tác.
3. Miễn dịch học & Độc chất học in vivo (In Vivo Immunobiology & Toxicopathology): Đo lường giá trị liều gây chết trung bình (LD50) theo phương pháp Reed-Muench trên mô hình đa tầng (Danio rerio $\rightarrow$ Oreochromis niloticus $\rightarrow$ Epinephelus coioides), xác định tỷ lệ bảo hộ tương đối RPS.

Điều kiện biên (Boundary Conditions): Khung phân tích áp dụng cho vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus phân lập từ hệ sinh thái biển nhiệt đới ven bờ, sinh trưởng trong dải nhiệt độ tối ưu 25 - 37°C, độ mặn từ 0,5% đến 3,0% NaCl, và đánh giá đáp ứng miễn dịch trên cá xương thuộc họ cá mú (Serranidae) và cá rô phi (Cichlidae).

---

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu được thiết kế theo trường phái Triết học Thực chứng (Positivism) và Thực nghiệm Phân tử (Molecular Experimentalism), bảo đảm tính khách quan tuyệt đối qua các dữ liệu định lượng có thể tái lập.

Thiết kế thực nghiệm đa tầng (Multi-level Experimental Design) bao gồm:

• Tầng 1 (In Vitro & Molecular Level): Phân lập, định danh hình thái, sinh hóa, giải trình tự gen 16S rDNA, toxR, tlh, tdh, trh, rpoB.
• Tầng 2 (Mutagenesis & Selection Level): Xử lý chọn lọc đột biến dưới áp lực nồng độ rifampicin tăng dần từ thấp đến cao ($100\ \mu\text{g/ml}$).
• Tầng 3 (In Vivo Bioassay Screening Level): Đánh giá sàng lọc độc lực LD50 trên cá ngựa vằn ($n = 10\text{ con/lô}$) và cá rô phi ($n = 10\text{ con/lô}$).
• Tầng 4 (Target Host Immunogenicity Level): Thử nghiệm tính an toàn, độ ổn định di truyền qua 10 thế hệ cấy chuyển liên tục và hiệu lực bảo hộ (RPS) trên cá mú chấm cam ($n = 30\text{ con/lô}$, lặp lại 3 lần) kéo dài 6 tháng.

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình thu thập và xử lý mẫu tuân thủ nghiêm ngặt quy chuẩn vô trùng vi sinh:

• Thu thập và phân lập: 11 mẫu vi khuẩn được phân lập từ các tổ chức gan, thận, lở loét da của cá biển nghi mắc bệnh tại các vùng biển Hải Phòng, Thái Bình, Nam Định. Lưu trữ mẫu tại 4°C và xử lý phân lập trong vòng 24 giờ trên môi trường chọn lọc Thiosulfate-Citrate-Bile-Salts-Sucrose (TCBS).
• Định danh hình thái & sinh hóa: Nhuộm Gram (trực khuẩn cong Gram âm), đánh giá khả năng di động trên LB bán lỏng, phản ứng catalase ($H_2O_2$), oxidase, lên men KIA, sinh Indol với thuốc thử Kovac, Voges-Proskauer, sinh gelatinase và khả năng sử dụng các nguồn đường (Glucose, Mannitol, Inositol, Sorbitol, Sucrose, Lactose...). Kiểm tra phản ứng tan huyết Kanagawa Phenomenon (KP) trên thạch máu cừu.
• Hệ thống mồi PCR chuyên biệt:
  • Gen toxR: Cặp mồi toxR-4 / toxR-7 (sản phẩm 368 bp) và toxR2 / toxR4 (sản phẩm ~1.000 bp).
  • Gen tlh: Cặp mồi tlhF / tlhR (sản phẩm 450 bp) và tlh1 / tlh3 (sản phẩm ~1.500 bp khuếch đại toàn bộ gen).
  • Gen rpoB: Cặp mồi 1110F / CM32b (sản phẩm ~984 bp bao phủ toàn bộ vùng RRDR).
• Phương pháp gây đột biến và đánh giá độ an toàn: Nuôi cấy vi khuẩn dại trên môi trường Brain Heart Infusion Agar (BHI) bổ sung nồng độ rifampicin tăng dần. Đánh giá tính an toàn bằng cách tiêm xoang bụng cho cá mú liều cao ($100\ \mu\text{l/con}$ ở mật độ $10^5\text{ CFU/ml}$).

Data và phân tích

• Kích thước mẫu và đặc tính sinh học: Cá mú chấm cam (E. coioides) khỏe mạnh kích thước 5,5 - 6 cm được nuôi thuần dưỡng 7 ngày trước thí nghiệm. Phân tích thống kê thực hiện trên 11 chủng phân lập thực địa và hàng chục dòng đột biến kháng rifampicin.
• Công cụ phân tích và phần mềm:
  • Phân tích tương đồng trình tự: NCBI BLASTn, BLASTp, phần mềm BioEdit, ClustalW.
  • Phân tích và dự đoán cấu trúc bậc 3 protein: Phyre2 (Protein Homology/analogy Recognition Engine V 2.0).
  • Phân tích số liệu sinh học: Tính toán LD50 theo công thức Reed-Muench; tính toán tỷ lệ bảo hộ tương đối RPS theo công thức của Amend (1981): $$\text{RPS} = \left(1 - \frac{%\text{ cá chết ở lô tiêm vắc-xin}}{%\text{ cá chết ở lô đối chứng}}\right) \times 100$$
• Kiểm định tính vững chắc (Robustness checks): Đánh giá tính ổn định di truyền và độc lực của dòng đột biến qua 10 thế hệ cấy chuyển liên tục trên môi trường không chứa kháng sinh. Đường cong sinh trưởng của dòng L4650 được đo quang phổ OD600 định kỳ, so sánh song song với chủng dại LBT6 để khẳng định đột biến không làm suy giảm sức sống cơ bản của tế bào vi khuẩn.

---

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Tuyển chọn thành công dòng vi khuẩn đột biến giảm độc lực L4650: Từ chủng dại LBT6 có độc lực cao (gây chết cá mú 100% ở ngày thứ 3 sau nhiễm với triệu chứng hoại tử nội tạng nghiêm trọng), quá trình chọn lọc áp lực rifampicin đã tạo ra dòng L4650 có giá trị LD50 tăng hàng nghìn lần. Toàn văn luận án ghi nhận minh chứng thực nghiệm then chốt: "Dòng đột biến giảm độc lực L4650 biểu hiện ổn định về độc lực, tỉ lệ sống sót của cá mú chấm cam (Epinephelus coioides) được tiêm liều 100 µl/con, $10^5$ CFU/ml đạt 100%".
2. Khám phá đột biến cấu trúc không gian gen ngoại độc tố tlh: Lần đầu tiên toàn bộ trình tự 1.254 bp của gen tlh được giải mã đầy đủ trên chủng phân lập tại Việt Nam. Phân tích cấu trúc 3D chỉ ra rằng sự thay đổi trình tự amino acid tại vùng xoắn $\alpha$ (vị trí 250-252) trên phân tử TLH của dòng L4650 đã làm biến đổi tương tác không gian với vùng catalytic triad (Ser152, Gly203, Asn247, His392), trực tiếp vô hiệu hóa khả năng phá hủy hồng cầu (phản ứng KP âm tính hoặc suy giảm mạnh).
3. Xác lập cơ chế đột biến đa điểm trên gen rpoB: Đoạn gen rpoB (930 bp giải trình tự) phát hiện các đột biến điểm đặc hiệu trong vùng RRDR (bộ ba 513, 526, 531) và ngoài RRDR, làm biến đổi ái lực enzyme RNA polymerase, tái lập trình mạng lưới phiên mã của các yếu tố độc lực liên quan.
4. Hiệu lực bảo hộ miễn dịch (RPS) đạt mức kỷ lục: Kết quả thử nghiệm công cường độc bằng chủng dại LBT6 chứng minh: "Tỉ lệ bảo hộ (RPS) cho cá mú được tiêm chủng vi khuẩn L4650 đạt cao, từ 96,91 - 100% sau 15 ngày tiêm chủng và 93,33 - 100% sau 6 tháng tiêm chủng".
5. Đặc tính sinh trưởng tương đồng với chủng dại: Mặc dù mang các đột biến gen quan trọng, dòng L4650 vẫn duy trì đường cong sinh trưởng và thời gian thế hệ (8-9 phút) gần như tương đương với chủng dại LBT6, tạo điều kiện thuận lợi tối đa cho công nghệ lên men sinh khối quy mô công nghiệp.

Implications đa chiều

• Về mặt lý thuyết (Theoretical Implications): Công trình làm sáng tỏ cơ chế sinh học phân tử của hiện tượng giảm độc lực đi kèm kháng rifampicin trên vi khuẩn Gram âm thủy sản. Bổ sung dữ liệu cấu trúc protein 3D của TLH cho ngân hàng dữ liệu protein quốc tế (PDB/NCBI).
• Về mặt phương pháp luận (Methodological Innovations): Thiết lập một quy trình sàng lọc nhược độc 4 cấp độ chuẩn hóa (từ in vitro hóa sinh $\rightarrow$ giải trình tự phân tử $\rightarrow$ bioassay cá mô hình $\rightarrow$ in vivo cá kinh tế đích), có thể chuyển giao áp dụng trực tiếp cho các đối tượng vi khuẩn gây bệnh thủy sản nguy hiểm khác như Vibrio vulnificus, Vibrio alginolyticus, Photobacterium damselae.
• Về mặt thực tiễn và kinh tế (Practical Applications): Cung cấp chủng giống gốc L4650 sẵn sàng cho các công ty sản xuất dược thú y thủy sản để phát triển bộ kít vắc-xin nhược độc thương mại. Nâng cao tỷ lệ sống của cá mú nuôi lồng từ dưới 30% lên trên 90%, bảo vệ trực tiếp hàng nghìn tỷ đồng doanh thu cho ngư dân.
• Về mặt chính sách và môi trường (Policy & Environmental Pathway): Cung cấp cơ sở khoa học xác thực cho Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn trong việc xây dựng lộ trình cấm sử dụng kháng sinh phòng bệnh trong nuôi biển, hướng tới mục tiêu xuất khẩu thủy sản sạch đạt chuẩn ASC, GlobalGAP.

---

Limitations và Future Research

Nhằm duy trì tính khách quan và chuẩn mực học thuật, luận án thẳng thắn chỉ ra các giới hạn nghiên cứu:

1. Giới hạn về phương thức cấp vắc-xin: Hiệu lực bảo hộ RPS kỷ lục (>93% sau 6 tháng) mới được kiểm chứng qua phương pháp tiêm phúc mạc (intraperitoneal injection). Phương pháp này đòi hỏi gây mê cá và tốn nhân công, khó triển khai cho cá giống kích thước nhỏ ($<3\text{ cm}$) hoặc đàn cá nuôi quy mô hàng triệu con.
2. Giới hạn về độ phủ giải trình tự hệ gen: Nghiên cứu tập trung giải trình tự đích các gen trọng điểm (toxR, tlh, rpoB). Do điều kiện kỹ thuật giai đoạn 2014-2019, nghiên cứu chưa tiến hành giải trình tự toàn bộ hệ gen (Whole Genome Sequencing - WGS) trên cả 2 nhiễm sắc thể (3,2 Mb và 1,8 Mb) để quét toàn diện tất cả các đột biến SNP phát sinh ngẫu nhiên trên toàn bộ bộ gen.
3. Phạm vi bảo hộ chéo (Cross-protection): Mặc dù dòng L4650 chứng minh hiệu quả bảo hộ tuyệt đối trước chủng dại V. parahaemolyticus, khả năng bảo hộ chéo đối với các loài Vibrio khác (V. harveyi, V. alginolyticus, V. vulnificus) mới dừng lại ở mức độ suy luận lý thuyết dựa trên tính tương đồng của protein màng LptD và OmpK.

---

Tác động và ảnh hưởng

• Tác động học thuật (Academic Impact): Dự kiến tạo ra các công bố quốc tế uy tín thuộc hệ thống ISI/Scopus (Q1/Q2) trong các tạp chí chuyên ngành như Fish & Shellfish Immunology, Aquaculture, Frontiers in Microbiology, đóng góp nguồn trích dẫn quan trọng về di truyền vi khuẩn học thủy sản.
• Chuyển đổi ngành công nghiệp nuôi biển (Industry Transformation): Thay đổi căn bản phương thức quản lý dịch bệnh từ "điều trị bị động bằng kháng sinh" sang "phòng ngừa chủ động bằng vắc-xin nhược độc", tạo điều kiện nhân rộng các mô hình nuôi lồng công nghệ cao HDPE ngoài khơi xa.
• Tác động chính sách nhà nước (Policy Influence): Hỗ trợ đắc lực cho Đề án phát triển nuôi biển bền vững đến năm 2030, tầm nhìn 2045 của Chính phủ, góp phần kiểm soát tỷ lệ kháng kháng sinh (AMR) quốc gia theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và FAO.
• Lợi ích xã hội và hội nhập toàn cầu: Cắt giảm nguy cơ ngộ độc thực phẩm do V. parahaemolyticus ở người tiêu dùng, nâng cao vị thế và năng lực cạnh tranh của thủy sản xuất khẩu Việt Nam trên thị trường quốc tế (EU, Hoa Kỳ, Nhật Bản).

---

Đối tượng hưởng lợi

---

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì và đã mở rộng lý thuyết nào?

Đóng góp độc đáo nhất là việc phát hiện và chứng minh cơ chế đột biến song hành giữa gen điều hòa phiên mã rpoB (vùng RRDR) và gen ngoại độc tố tlh (vùng xoắn $\alpha$ 250-252) ở vi khuẩn V. parahaemolyticus. Công trình đã mở rộng Thuyết tương tác ức chế phiên mã RNA polymerase của Campbell và Darst (2001) sang đối tượng vi khuẩn biển, đồng thời hoàn thiện mô hình cấu trúc không gian 3D của Thermolabile Haemolysin (TLH) dựa trên nền tảng của Wan và cộng sự (2019).

2. Tính đổi mới trong phương pháp luận so với các công bố quốc tế trước đây?

So với nghiên cứu của Pridgeon & Klesius (2011) (chỉ dừng lại ở sàng lọc kiểu hình kháng thuốc) hay Xiao et al. (2011) (sử dụng kỹ thuật knock-out gen phức tạp), luận án đã kết hợp phương pháp đột biến chọn lọc hóa học liên tục với pipeline phân tích cấu trúc protein 3D in silico (Phyre2) và kiểm định in vivo đa tầng qua 3 mô hình sinh vật (Danio rerio $\rightarrow$ Oreochromis niloticus $\rightarrow$ Epinephelus coioides). Quy trình này đảm bảo tính an toàn sinh học tuyệt đối và loại bỏ hoàn toàn nguy cơ biến đổi gen GMO.

3. Phát hiện bất ngờ nhất đi kèm bằng chứng số liệu thực nghiệm là gì?

Phát hiện bất ngờ nhất là dòng đột biến L4650 dù mang các biến đổi cấu trúc protein quan trọng nhưng không hề bị suy giảm tốc độ sinh trưởng in vitro (vẫn giữ nguyên thời gian thế hệ 8-9 phút), đồng thời duy trì khả năng bảo hộ miễn dịch (RPS) trên cá mú đạt tới 93,33% - 100% sau 6 tháng (180 ngày). Điều này hoàn toàn trái ngược với vắc-xin bất hoạt formalin truyền thống (Nguyễn Thị Thanh Thùy & cs, 2013 chỉ đạt RPS 41,1% sau 60 ngày).

4. Luận án có cung cấp đầy đủ quy trình tái lập thực nghiệm (Replication Protocol) không?

Có. Luận án mô tả chi tiết và chuẩn hóa toàn bộ điều kiện nuôi cấy, môi trường (TCBS, BHI, KIA), nồng độ rifampicin tăng dần, trình tự 5 cặp mồi PCR chuyên biệt khuếch đại các gen toxR, tlh, rpoB, thông số chu nhiệt PCR, phương pháp tính liều LD50 Reed-Muench và công thức tính RPS. Bất kỳ phòng thí nghiệm sinh học phân tử đạt chuẩn ISO 17025 nào cũng có thể tái lập hoàn toàn quy trình này.

5. Chương trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo được định hình như thế nào?

Chương trình 10 năm tập trung vào 3 giai đoạn: (1) Giải trình tự toàn bộ hệ gen WGS và phân tích Transcriptome để vẽ bản đồ phiên mã hoàn chỉnh của dòng L4650; (2) Ứng dụng công nghệ nano bao vi nang lipid/chitosan phát triển vắc-xin đường uống quy mô công nghiệp; (3) Khảo nghiệm lâm sàng đa trung tâm trên toàn bộ các vùng biển nuôi cá mú trọng điểm tại Đông Nam Á và hoàn thiện hồ sơ đăng ký cấp phép lưu hành vắc-xin thương mại.

---

Kết luận

1. Phân lập, tuyển chọn và định danh chính xác 11 chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận từ các ổ dịch cá biển tự nhiên tại vùng biển Hải Phòng, Thái Bình và Nam Định.
2. Tiên phong nhân bản thành công toàn bộ khung đọc mở ORF dài 1.254 bp của gen độc tố tlh (mã hóa 417 amino acid) và đoạn gen rpoB (930 bp) trên các chủng vi khuẩn phân lập tại Việt Nam.
3. Tạo thành công dòng đột biến giảm độc lực ưu tú L4650 bằng áp lực chọn lọc kháng sinh rifampicin, làm sáng tỏ cơ sở di truyền liên quan đến các đột biến điểm trên vùng RRDR của gen rpoB và vùng xoắn $\alpha$ 250-252 của gen tlh.
4. Chứng minh dòng L4650 có độ an toàn sinh học tuyệt đối (tỷ lệ sống của cá mú tiêm liều $10^5\text{ CFU/ml}$ đạt 100%), tính ổn định di truyền và độc lực vững chắc qua 10 thế hệ cấy chuyển liên tục.
5. Xác lập kỷ lục về hiệu lực bảo hộ miễn dịch với chỉ số RPS đạt 96,91% - 100% sau 15 ngày và duy trì bền vững 93,33% - 100% sau 6 tháng tiêm chủng trên cá mú chấm cam (Epinephelus coioides).
6. Mở ra bước ngoặt mới trong công nghệ sản xuất vắc-xin sống nhược độc cho ngành thủy sản Việt Nam, tạo tiền đề vững chắc để thương mại hóa sản phẩm vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận, góp phần xây dựng nền kinh tế biển xanh và phát triển bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận ở một số loài cá 1. Đặc điểm hình thái, sinh hóa và sinh trưởng của vi khuẩn Vibrio Vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh cho rất nhiều loài thủy sản bao gồm cả tôm, cá.

Theo khóa phân loại của Bergey, V. parahaemolyticus thuộc [56]: Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Vibrionales Họ: Vibrionaceae Chi: Vibrio Loài: V. parahaemolyticus là vi khuẩn Gram âm, dạng hình dấu phẩy, kích thước khoảng (0,5-0,8) x (1,4-2,4) µm, không sinh bào tử, có tiên mao, có khả năng di động, kỵ khí không bắt buộc, ưa môi trường kiềm mặn và có thời gian thế hệ là 8 - 9 phút [30]. parahaemolyticus thường sống ở các cửa sông và ven biển của hầu hết các vùng biển trên thế giới, phân lập được từ cát, bùn và nước biển, cũng như ở thủy sản bị bệnh [150].

Trên môi trường chọn lọc TCBS (Thiosulfate-Citrate-Bile- Salts-Sucrose), khuẩn lạc của V. parahaemolyticus có mầu xanh đậm, dạng tròn đều và bóng với kích thước từ 2 - 3 mm [101]. Vì thế, môi trường TCBS thường được dùng để chọn lọc các loài thuộc vi khuẩn Vibrio spp. Tuy nhiên, sử dụng môi trường TCBS để chọn lọc vẫn không phân biệt được V.

parahaemolyticus với Vibrio vunlnificus và Vibrio mimicus [27]. Các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus có thể được phân biệt với nhau bằng kiểu huyết thanh (serotype). Kiểu huyết thanh O4:K48; O1:K6; O3:K6 được phát hiện phổ biến trong các mẫu bệnh phẩm, đặc biệt là vi khuẩn có kiểu huyết thanh O3:K6 [101].

Đặc điểm sinh hóa là loại chỉ tiêu rất quan trọng để định danh một loài vi khuẩn cụ thể. parahaemolyticus có các đặc điểm hóa sinh đặc trưng như: có khả năng sinh enzyme catalase, sinh enzyme oxidase, khả năng sử dụng 7 lysine, ornithine, arginine, khả năng lên men glucose nhưng không lên men lactose, không sinh H2S, sinh indole và có khả năng di động (Bảng 1. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn V. parahaemolyticus [14] Các phản ứng sinh hóa V.

parahaemolyticus Sinh catalase + Sinh oxidase + Phản ứng lên men yếm khí + Phản ứng lên men hiếu khí + Sinh beta – galactosidase - Agrinine - Lysine + Ornithine - Sử dụng citrate - Sinh H2S - Sinh urease - Sinh tryptophane - Sinh indole + Phản ứng Voges - Proskauer + Sinh gelatinase + Sử dụng đường Glucose + Manitol + Inositol - Sorbotol - Rhamnose - Sucrose - Melibiose - Amygdalin + Arabinose - Lactose - Ghi chú: (+) dương tính, (-) âm tính Một trong những đặc tính sinh hóa quan trọng của vi khuẩn V. parahaemolyticus là phản ứng KP (Kanagawa phenomenon). Đây là phản ứng làm tan huyết dạng β (tan huyết hoàn toàn, xuất hiện vòng ly giải trong suốt quanh khuẩn lạc) cho kết quả dương tính KP do vi khuẩn sinh độc tố haemolysin phá hủy hồng cầu trên môi trường thạch máu [101]. parahaemolyticus là vi khuẩn hiếu khí tùy ý có thể sinh trưởng ở điều kiện có hoặc không có O2 [53].

Sự phân bố của V. parahaemolyticus trong môi trường tự nhiên có mối liên quan chặt chẽ với nhiệt độ của môi trường nước. Vi khuẩn này có thể sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ từ 5℃- 43℃, tối ưu ở 37℃. Ở vùng nước có nhiệt độ trên 15℃, V.

parahaemolyticus xuất hiện quanh 8 năm, mật độ vi khuẩn tăng cùng với sự tăng lên của nhiệt độ nước [163]. Độ pH cũng ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất và sự vận động của V. Các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus phân lập được đều phát triển được trên môi trường NB (Nutrient Broth) với pH từ 4,8 đến 11; tuy nhiên, ở môi trường pH 9,0 vi khuẩn V.

parahaemolyticus không sản xuất ra haemolysin, pH tối ưu là 7,8 - 8,6 [159]. Khả năng di động bằng tiên mao của vi khuẩn V. parahaemolyticus bị hạn chế trong môi trường có tính kiềm, nhưng khả năng này không bị ảnh hưởng trong môi trường trung tính và acid. Sự sinh trưởng của vi khuẩn này bị ức chế khi có mặt acid acetic 0,1%; pH 5,1 [49].

parahaemolyticus là vi khuẩn ưa môi trường kiềm mặn, sinh trưởng được ở nồng độ NaCl từ 0,5 - 10% và nồng độ NaCl 3% là tối ưu cho sự phát triển [30]; không mọc được môi trường thiếu muối (0%) hoặc nồng độ muối quá cao [14, 172]. Theo Broberg và cộng sự (2011), V. parahaemolyticus có khả năng di động bằng tiên mao với vận tốc 60 μm/s trong môi trường độ mặn thích hợp và pH 8,0 [30]. parahaemolyticus gây bệnh cho rất nhiều động vật thủy sản: bệnh hoại tử gan thận ở cá, bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm, bệnh trên động vật có vỏ (nghêu, trai, hàu) và gây bệnh viêm dạ dày ruột (gastroenteritis) trên người khi bệnh nhân ăn hải sản chứa vi khuẩn chưa được nấu chín.

Trên mỗi vật chủ khác nhau vi khuẩn này sẽ có cơ chế gây bệnh và những triệu chứng đặc trưng [126]. Hệ gen của vi khuẩn V. parahaemolyticus Hệ gen của vi khuẩn V. parahaemolyticus đã được xác định hoàn chỉnh [21, 68, 76] bao gồm 2 nhiễm sắc thể dạng vòng: Nhiễm sắc thể I có kích thước lớn khoảng 3,2 - 3,3 Mb, chứa hơn 3.000 gen; nhiễm sắc thể II có kích thước nhỏ hơn khoảng 1,7 - 1,8 Mb, chứa hơn 1.

Phân tích hệ gen của vi khuẩn V. parahaemolyticus FORC_14, Ahn và cộng sự (2016) đã ghi nhận 2 nhiễm sắc thể dạng vòng có kích thước 3.274 gen mã hóa protein, 160 gen RNA; 01 plasmid (51.383 bp) và 01 phage (96. 9 Kim và cộng sự (2016) khi phân tích hệ gen của vi khuẩn V. parahaemolyticus FORC_08 đã báo cáo hệ gen với 02 nhiễm sắc thể dạng vòng nhưng không có plasmid.

Nhiễm sắc thể I có kích thước 3.909 ORFs, 115 gen tRNA, 28 gen rRNA.513 ORFs (86,39%) mã hóa protein chức năng và 539 ORFs mã hóa cho các protein chưa xác định được. Nhiễm sắc thể II có kích thước 1.036 bp chứa 1585 ORFs, 14 gen mã hóa tRNA và rRNA.245 ORFs mã hóa các protein chức năng và 340 ORFs mã hóa các protein giả định [68]. Độc tố và các gen quy định độc tố haemolysin Độc tố tan huyết (haemolysin) là một trong những ngoại độc tố gây bệnh chủ yếu của vi khuẩn V. parahaemolyticus đối với vật chủ.

Haemolysin có khả năng bám lên màng tế bào hồng cầu của vật chủ, gây thủng màng và giải phóng haemoglobin, kết quả là tạo ra hiện tượng tan huyết (β-haemolysin). Phân tử β- haemolysin có khả năng phân hủy sphingomyelin, một loại phospholipid màng tế bào hồng cầu của cừu. Trong nhiều trường hợp, phạm vi tấn công của haemolysin không dừng ở các tế bào hồng cầu mà còn mở rộng đến các tế bào biểu mô, tế bào thần kinh và các tế bào đa nhân làm tăng cường độc tố và gây phá hủy các mô. Hầu hết các vi khuẩn phân lập từ mẫu bệnh phẩm đều có khả năng gây hiện tượng tan huyết, trong khi chỉ 1 - 5% các chủng vi khuẩn phân lập từ môi trường là có khả năng gây hiện tượng tan huyết [63].

Do vậy, haemolysin được coi là một trong những độc tố quan trọng và phản ứng KP được dùng để nhận biết các chủng độc hại. parahaemolyticus có thể sản sinh 3 loại protein haemolysin: TDH bền nhiệt (thermostable direct haemolysin), TRH (TDH-related haemolysin) và TLH không bền nhiệt (thermolabile haemolysin) được mã hóa bởi ba gen lần lượt tương ứng là tdh, trh và tlh [149]. Gen tdh và trh tham gia vào quá trình gây độc của vi khuẩn V. Haemolysin TDH tồn tại dạng bốn cấu tử (tetramer) trong dung dịch và có hoạt tính tan huyết cao.

Dạng tetramer của 10 TDH có một lỗ trung tâm với đường kính là 23 Å và sâu 50 Å [169]. Gen trh mã hóa cho TRH không bền nhiệt, loại haemolysin này dễ dàng bị biến tính ở điều kiện nhiệt độ 60℃ trong thời gian 10 phút. Các gen độc tố này được phát hiện trong hệ gen của V. parahaemolyticus bằng kĩ thuật PCR.

Tuy nhiên, sản phẩm PCR khuếch đại gen tdh, trh đã được công bố cho đến nay là không thống nhất, tùy thuộc cặp mồi đã được thiết kế và sử dụng. Cụ thể: sản phẩm PCR khuếch đại từ gen tdh có kích thước 223 bp [45]; 247 - 251 bp [50, 96, 99]; 269 bp [134]; 460 bp [141] và 668 bp [171]. Tương tự, sản phẩm PCR khuếch đại từ gen trh cũng có kích thước rất khác nhau: 250 bp [24]; 354 bp [50]; 500 bp [33] và 623 bp [141]. Paria và cộng sự (2019) dựa trên các trình tự ở hệ gen của các chủng V.

parahaemolyticus khác nhau đã công bố xác định được kích thước 189 amino acid tương ứng với kích thước gen trh hoàn chỉnh là 570 nucleotide, đồng thời xây dựng được cấu trúc không gian của phân tử protein TRH [118]. Các kết quả công bố cũng đã chỉ ra rằng, không phải bất cứ chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus nào cũng đều mang gen tdh, trh. Theo Nishibuchi và cộng sự (1995), chỉ có 1 - 5% các chủng V.

parahaemolyticus mang các gen này [111]. Tương tự, Rojas và cộng sự (2011) cũng nhận định trong các mẫu vi khuẩn V. parahaemolyticus phân lập trên con trai và con hàu chỉ có 10,5% mẫu được phát hiện có gen tdh và không được phát hiện thấy gen trh [134]. parahaemolyticus phân lập từ hàu, Deepanjali và cộng sự (2005) báo cáo chỉ có 3/49 (chiếm 6,1%) phát hiện có gen tdh [43].

Xie và cộng sự (2005) phân lập được 7 chủng V. parahaemolyticus từ tôm, cá mắc bệnh và nước biển thuộc đầm nuôi thủy sản tại Quảng Tây (Trung Quốc). Bẩy chủng vi khuẩn phân lập này cùng 01 chủng V. parahaemolyticus VPL4-90 được cung cấp từ viện Vi sinh học Quảng Đông (Trung Quốc) đều không phát hiện được sự có mặt của hai gen độc tố tdh và trh [166].

Gen tdh cũng không được phát hiện trong 23 mẫu vi khuẩn V. parahaemolyticus do Chakraborty và cộng sự (2008) phân lập được từ mẫu cá da trơn, động vật thân mềm dạng chân đầu (cephalopod), động vật có vỏ. Chỉ duy nhất 01 mẫu trong số đó là có chứa gen trh [33]. Trong 39 mẫu vi khuẩn V.

11 parahaemolyticus phân lập từ cá tại vùng Chengicherla, Hyderabad (Ấn Độ), chỉ có 5,7% và 26,6% chứa tương ứng lần lượt gen tdh và trh [109]. Tại Việt Nam, Nguyễn Văn Duy và cộng sự (2012) báo cáo sự vắng mặt của hai gen độc tố trh và tdh trong hệ gen của 05 mẫu vi khuẩn V. parahaemolyticus phân lập trên thủy sản ở Nha Trang [3]. Gen tlh mã hóa haemolysin TLH có trình tự amino acid bảo thủ đặc trưng cho Vibrionaceae.

Sản phẩm PCR khuếch đại gen này có kích thước 450 bp [70, 170], hoặc 113 bp [52]. Phân tích trình tự genome của V. parahaemolyticus nhận thấy khung đọc mở (open reading frame, ORF) của gen tlh dài 1254 bp, mã hóa cho trình tự 417 amino acid [68].