Luận án tiến sĩ sinh học: Nghiên cứu tạo chủng Vibrio parahaemolyticus đột biến giảm độc lực để phát triển vắc xin phòng bệnh hoại tử gan thận trên cá biển

• Trường học: Trường Đại học Sư phạm Hà Nội
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu tạo chủng Vibrio parahaemolyticus đột biến giảm độc lực phát triển vắc xin phòng bệnh hoại tử gan thận ở cá biển
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

• MỞ ĐẦU
• Lý do chọn đề tài
• Mục tiêu nghiên cứu
• Nội dung nghiên cứu
• Đối tượng nghiên cứu
• Phạm vi nghiên cứu
• Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• Tính mới, tính độc đáo của đề tài
• Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận ở một số loài cá
• 1.2. Đặc điểm hình thái, sinh hóa và sinh trưởng của vi khuẩn Vibrio
• 1.3. Hệ gen của vi khuẩn V.
• 1.4. Độc tố và các gen quy định độc tố haemolysin
• 1.5. Gen rpoB và tính kháng rifampicin
• 1.6. Kháng nguyên của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
• 1.7. Bệnh hoại tử gan thận trên cá biển
• 1.8. Chẩn đoán và điều trị
• 1.9. Vắc-xin và cơ chế miễn dịch chủ động
• 1.10. Vắc-xin và phân loại vắc-xin cho cá
• 1.11. Miễn dịch đặc hiệu ở cá xương
• 1.12. Phương thức đưa vắc-xin vào cơ thể cá
• 1.13. Nghiên cứu tạo vi khuẩn giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc-xin nhược độc phòng bệnh cho cá
• 1.14. Tạo vi khuẩn giảm độc lực bằng tác nhân vật lý
• 1.15. Tạo vi khuẩn giảm độc lực bằng tác nhân hóa học
• 1.16. Tạo vi khuẩn giảm độc lực bằng kĩ thuật gen
• 1.17. Tình hình nghiên cứu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận do cho cá
• 1.18. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 1.19. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3. Sơ đồ các bước thực hiện chính
• 2.4. Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn Vibrio từ cá nghi mắc bệnh
• 2.5. Phương pháp giữ giống chủng vi khuẩn
• 2.6. Phương pháp nhuộm Gram
• 2.7. Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn
• 2.8. Phương pháp đánh giá đặc điểm sinh hóa, đặc tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn
• 2.9. Phương pháp đánh giá độc lực của vi khuẩn
• 2.10. Phương pháp xử lý vi khuẩn với rifampicin
• 2.11. Phương pháp đánh giá độc lực của các dòng vi khuẩn kháng rifampicin
• 2.12. Nhóm phương pháp sinh học phân tử
• 2.13. Phương pháp thiết kế mồi
• 2.14. Phương pháp tách DNA tổng số
• 2.15. Phương pháp PCR, giải trình tự gen
• 2.16. Phương pháp tin sinh
• 2.17. Phương pháp đánh giá tính ổn định về độc lực và độ an toàn của dòng vi khuẩn giảm độc lực trên cá mú chấm cam
• 2.18. Phương pháp đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của dòng giảm độc lực trên cá mú
• 2.19. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Phân lập chủng vi khuẩn từ mẫu cá biển nghi mắc bệnh hoại tử gan thận
• 3.2. Phân lập vi khuẩn Vibrio
• 3.3. Phân tích đặc điểm sinh hóa của các mẫu vi khuẩn phân lập
• 3.4. Xác định chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus bằng phương pháp phân tử
• 3.5. Đánh giá khả năng gây bệnh cho cá mú của các chủng vi khuẩn phân lập
• 3.6. Phân lập, giải trình tự các gen độc tố toxR, tlh và gen rpoB các chủng vi khuẩn phân lập
• 3.7. Kết quả tạo dòng vi khuẩn V. parahaemolyticus giảm độc lực
• 3.8. Đánh giá độc lực của các dòng vi khuẩn kháng rifampicin
• 3.9. Đánh giá đặc điểm sinh hóa của các dòng vi khuẩn giảm độc lực
• 3.10. So sánh trình tự gen toxR, tlh và rpoB của các dòng giảm độc lực so và chủng vi khuẩn dại
• 3.11. So sánh trình tự gen toxR và tlh của dòng giảm độc lực và chủng vi khuẩn dại
• 3.12. So sánh trình tự rpoB của chủng dại với các dòng giảm độc lực
• 3.13. Đánh giá khả năng tạo đáp ứng miễn dịch, khả năng sinh trưởng của dòng vi khuẩn giảm độc lực
• 3.14. Đánh giá tính ổn định độc lực, khả năng sinh trưởng của dòng giảm độc lực
• 3.15. Xác định tính an toàn của dòng L4650
• 3.16. Đánh giá khả năng tạo đáp ứng miễn dịch của dòng vi khuẩn giảm độc lực ở cá mú
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• Tài liệu tiếng Việt
• PHỤ LỤC DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG

I. Tổng quan về Vibrio parahaemolyticus

Vibrio parahaemolyticus là vi khuẩn Gram âm, hình dấu phẩy, kích thước khoảng 0.5-0.8 x 1.4-2.4 µm. Vi khuẩn này không sinh bào tử, có tiên mao, di động, kỵ khí không bắt buộc, ưa môi trường kiềm mặn. Vibrio parahaemolyticus thường sống ở cửa sông và ven biển, phân lập từ cát, bùn, nước biển và thủy sản bị bệnh. Trên môi trường TCBS, khuẩn lạc có màu xanh đậm, dạng tròn đều, kích thước 2-3 mm. Vi khuẩn này có các đặc điểm sinh hóa đặc trưng như sinh enzyme catalase, oxidase, lên men glucose nhưng không lên men lactose, sinh indole và có khả năng di động.

1.1. Đặc điểm hình thái và sinh hóa

Vibrio parahaemolyticus thuộc ngành Proteobacteria, lớp Gamma Proteobacteria, bộ Vibrionales, họ Vibrionaceae. Vi khuẩn này có thời gian thế hệ 8-9 phút. Đặc điểm sinh hóa bao gồm khả năng sinh enzyme catalase, oxidase, lên men glucose, không sinh H2S, sinh indole và di động. Phản ứng KP (Kanagawa phenomenon) là đặc tính quan trọng, làm tan huyết dạng β trên môi trường thạch máu.

1.2. Hệ gen và độc tố

Hệ gen của Vibrio parahaemolyticus chứa các gen mã hóa độc tố như toxR, tdh, trh, và tlh. Các gen này quy định khả năng gây bệnh của vi khuẩn. Gen rpoB liên quan đến tính kháng rifampicin. Độc tố haemolysin do vi khuẩn tiết ra gây tan huyết và tổn thương mô ở cá.

II. Nghiên cứu tạo chủng đột biến giảm độc lực

Nghiên cứu tạo chủng Vibrio parahaemolyticus đột biến giảm độc lực nhằm phát triển vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận ở cá biển. Phương pháp sử dụng kháng sinh rifampicin để tạo đột biến gen rpoB, làm giảm độc lực của vi khuẩn. Các dòng đột biến được đánh giá về khả năng sinh trưởng, độc lực và đáp ứng miễn dịch trên cá mú chấm cam.

2.1. Phương pháp tạo đột biến

Phương pháp xử lý rifampicin được sử dụng để tạo đột biến gen rpoB ở Vibrio parahaemolyticus. Các dòng đột biến được phân tích trình tự gen toxR, tlh, và rpoB để xác định sự thay đổi nucleotide. Kết quả cho thấy các dòng đột biến có độc lực giảm đáng kể so với chủng gốc.

2.2. Đánh giá độc lực và miễn dịch

Các dòng đột biến được đánh giá về độc lực trên cá mú chấm cam. Kết quả cho thấy dòng L4650 có độc lực ổn định, tỉ lệ sống sót của cá đạt 100%. Tỉ lệ bảo hộ (RPS) đạt 96.91-100% sau 15 ngày và 93.33-100% sau 6 tháng tiêm chủng.

III. Ứng dụng trong phát triển vắc xin

Nghiên cứu tạo chủng Vibrio parahaemolyticus giảm độc lực có ý nghĩa quan trọng trong phát triển vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận ở cá biển. Dòng L4650 được chọn làm ứng viên tiềm năng cho sản xuất vắc-xin sống nhược độc. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho các nghiên cứu miễn dịch và phòng bệnh trên cá biển nuôi lồng.

3.1. Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu về các chủng Vibrio parahaemolyticus gây bệnh và các đột biến gen liên quan đến giảm độc lực. Phát hiện các sai khác trình tự nucleotide trong gen tlh và rpoB giữa các dòng đột biến và chủng gốc.

3.2. Ý nghĩa thực tiễn

Dòng L4650 có khả năng gây đáp ứng miễn dịch cao, là ứng viên tiềm năng cho sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận trên cá mú chấm cam và các loài cá biển khác. Nghiên cứu góp phần giảm thiểu thiệt hại do bệnh dịch trong ngành nuôi trồng thủy sản.