CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận ở một số loài cá 1. Đặc điểm hình thái, sinh hóa và sinh trưởng của vi khuẩn Vibrio Vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh cho rất nhiều loài thủy sản bao gồm cả tôm, cá.
Theo khóa phân loại của Bergey, V. parahaemolyticus thuộc [56]: Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Vibrionales Họ: Vibrionaceae Chi: Vibrio Loài: V. parahaemolyticus là vi khuẩn Gram âm, dạng hình dấu phẩy, kích thước khoảng (0,5-0,8) x (1,4-2,4) µm, không sinh bào tử, có tiên mao, có khả năng di động, kỵ khí không bắt buộc, ưa môi trường kiềm mặn và có thời gian thế hệ là 8 - 9 phút [30]. parahaemolyticus thường sống ở các cửa sông và ven biển của hầu hết các vùng biển trên thế giới, phân lập được từ cát, bùn và nước biển, cũng như ở thủy sản bị bệnh [150].
Trên môi trường chọn lọc TCBS (Thiosulfate-Citrate-Bile- Salts-Sucrose), khuẩn lạc của V. parahaemolyticus có mầu xanh đậm, dạng tròn đều và bóng với kích thước từ 2 - 3 mm [101]. Vì thế, môi trường TCBS thường được dùng để chọn lọc các loài thuộc vi khuẩn Vibrio spp. Tuy nhiên, sử dụng môi trường TCBS để chọn lọc vẫn không phân biệt được V.
parahaemolyticus với Vibrio vunlnificus và Vibrio mimicus [27]. Các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus có thể được phân biệt với nhau bằng kiểu huyết thanh (serotype). Kiểu huyết thanh O4:K48; O1:K6; O3:K6 được phát hiện phổ biến trong các mẫu bệnh phẩm, đặc biệt là vi khuẩn có kiểu huyết thanh O3:K6 [101].
Đặc điểm sinh hóa là loại chỉ tiêu rất quan trọng để định danh một loài vi khuẩn cụ thể. parahaemolyticus có các đặc điểm hóa sinh đặc trưng như: có khả năng sinh enzyme catalase, sinh enzyme oxidase, khả năng sử dụng 7 lysine, ornithine, arginine, khả năng lên men glucose nhưng không lên men lactose, không sinh H2S, sinh indole và có khả năng di động (Bảng 1. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn V. parahaemolyticus [14] Các phản ứng sinh hóa V.
parahaemolyticus Sinh catalase + Sinh oxidase + Phản ứng lên men yếm khí + Phản ứng lên men hiếu khí + Sinh beta – galactosidase - Agrinine - Lysine + Ornithine - Sử dụng citrate - Sinh H2S - Sinh urease - Sinh tryptophane - Sinh indole + Phản ứng Voges - Proskauer + Sinh gelatinase + Sử dụng đường Glucose + Manitol + Inositol - Sorbotol - Rhamnose - Sucrose - Melibiose - Amygdalin + Arabinose - Lactose - Ghi chú: (+) dương tính, (-) âm tính Một trong những đặc tính sinh hóa quan trọng của vi khuẩn V. parahaemolyticus là phản ứng KP (Kanagawa phenomenon). Đây là phản ứng làm tan huyết dạng β (tan huyết hoàn toàn, xuất hiện vòng ly giải trong suốt quanh khuẩn lạc) cho kết quả dương tính KP do vi khuẩn sinh độc tố haemolysin phá hủy hồng cầu trên môi trường thạch máu [101]. parahaemolyticus là vi khuẩn hiếu khí tùy ý có thể sinh trưởng ở điều kiện có hoặc không có O2 [53].
Sự phân bố của V. parahaemolyticus trong môi trường tự nhiên có mối liên quan chặt chẽ với nhiệt độ của môi trường nước. Vi khuẩn này có thể sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ từ 5℃- 43℃, tối ưu ở 37℃. Ở vùng nước có nhiệt độ trên 15℃, V.
parahaemolyticus xuất hiện quanh 8 năm, mật độ vi khuẩn tăng cùng với sự tăng lên của nhiệt độ nước [163]. Độ pH cũng ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất và sự vận động của V. Các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus phân lập được đều phát triển được trên môi trường NB (Nutrient Broth) với pH từ 4,8 đến 11; tuy nhiên, ở môi trường pH 9,0 vi khuẩn V.
parahaemolyticus không sản xuất ra haemolysin, pH tối ưu là 7,8 - 8,6 [159]. Khả năng di động bằng tiên mao của vi khuẩn V. parahaemolyticus bị hạn chế trong môi trường có tính kiềm, nhưng khả năng này không bị ảnh hưởng trong môi trường trung tính và acid. Sự sinh trưởng của vi khuẩn này bị ức chế khi có mặt acid acetic 0,1%; pH 5,1 [49].
parahaemolyticus là vi khuẩn ưa môi trường kiềm mặn, sinh trưởng được ở nồng độ NaCl từ 0,5 - 10% và nồng độ NaCl 3% là tối ưu cho sự phát triển [30]; không mọc được môi trường thiếu muối (0%) hoặc nồng độ muối quá cao [14, 172]. Theo Broberg và cộng sự (2011), V. parahaemolyticus có khả năng di động bằng tiên mao với vận tốc 60 μm/s trong môi trường độ mặn thích hợp và pH 8,0 [30]. parahaemolyticus gây bệnh cho rất nhiều động vật thủy sản: bệnh hoại tử gan thận ở cá, bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm, bệnh trên động vật có vỏ (nghêu, trai, hàu) và gây bệnh viêm dạ dày ruột (gastroenteritis) trên người khi bệnh nhân ăn hải sản chứa vi khuẩn chưa được nấu chín.
Trên mỗi vật chủ khác nhau vi khuẩn này sẽ có cơ chế gây bệnh và những triệu chứng đặc trưng [126]. Hệ gen của vi khuẩn V. parahaemolyticus Hệ gen của vi khuẩn V. parahaemolyticus đã được xác định hoàn chỉnh [21, 68, 76] bao gồm 2 nhiễm sắc thể dạng vòng: Nhiễm sắc thể I có kích thước lớn khoảng 3,2 - 3,3 Mb, chứa hơn 3.000 gen; nhiễm sắc thể II có kích thước nhỏ hơn khoảng 1,7 - 1,8 Mb, chứa hơn 1.
Phân tích hệ gen của vi khuẩn V. parahaemolyticus FORC_14, Ahn và cộng sự (2016) đã ghi nhận 2 nhiễm sắc thể dạng vòng có kích thước 3.274 gen mã hóa protein, 160 gen RNA; 01 plasmid (51.383 bp) và 01 phage (96. 9 Kim và cộng sự (2016) khi phân tích hệ gen của vi khuẩn V. parahaemolyticus FORC_08 đã báo cáo hệ gen với 02 nhiễm sắc thể dạng vòng nhưng không có plasmid.
Nhiễm sắc thể I có kích thước 3.909 ORFs, 115 gen tRNA, 28 gen rRNA.513 ORFs (86,39%) mã hóa protein chức năng và 539 ORFs mã hóa cho các protein chưa xác định được. Nhiễm sắc thể II có kích thước 1.036 bp chứa 1585 ORFs, 14 gen mã hóa tRNA và rRNA.245 ORFs mã hóa các protein chức năng và 340 ORFs mã hóa các protein giả định [68]. Độc tố và các gen quy định độc tố haemolysin Độc tố tan huyết (haemolysin) là một trong những ngoại độc tố gây bệnh chủ yếu của vi khuẩn V. parahaemolyticus đối với vật chủ.
Haemolysin có khả năng bám lên màng tế bào hồng cầu của vật chủ, gây thủng màng và giải phóng haemoglobin, kết quả là tạo ra hiện tượng tan huyết (β-haemolysin). Phân tử β- haemolysin có khả năng phân hủy sphingomyelin, một loại phospholipid màng tế bào hồng cầu của cừu. Trong nhiều trường hợp, phạm vi tấn công của haemolysin không dừng ở các tế bào hồng cầu mà còn mở rộng đến các tế bào biểu mô, tế bào thần kinh và các tế bào đa nhân làm tăng cường độc tố và gây phá hủy các mô. Hầu hết các vi khuẩn phân lập từ mẫu bệnh phẩm đều có khả năng gây hiện tượng tan huyết, trong khi chỉ 1 - 5% các chủng vi khuẩn phân lập từ môi trường là có khả năng gây hiện tượng tan huyết [63].
Do vậy, haemolysin được coi là một trong những độc tố quan trọng và phản ứng KP được dùng để nhận biết các chủng độc hại. parahaemolyticus có thể sản sinh 3 loại protein haemolysin: TDH bền nhiệt (thermostable direct haemolysin), TRH (TDH-related haemolysin) và TLH không bền nhiệt (thermolabile haemolysin) được mã hóa bởi ba gen lần lượt tương ứng là tdh, trh và tlh [149]. Gen tdh và trh tham gia vào quá trình gây độc của vi khuẩn V. Haemolysin TDH tồn tại dạng bốn cấu tử (tetramer) trong dung dịch và có hoạt tính tan huyết cao.
Dạng tetramer của 10 TDH có một lỗ trung tâm với đường kính là 23 Å và sâu 50 Å [169]. Gen trh mã hóa cho TRH không bền nhiệt, loại haemolysin này dễ dàng bị biến tính ở điều kiện nhiệt độ 60℃ trong thời gian 10 phút. Các gen độc tố này được phát hiện trong hệ gen của V. parahaemolyticus bằng kĩ thuật PCR.
Tuy nhiên, sản phẩm PCR khuếch đại gen tdh, trh đã được công bố cho đến nay là không thống nhất, tùy thuộc cặp mồi đã được thiết kế và sử dụng. Cụ thể: sản phẩm PCR khuếch đại từ gen tdh có kích thước 223 bp [45]; 247 - 251 bp [50, 96, 99]; 269 bp [134]; 460 bp [141] và 668 bp [171]. Tương tự, sản phẩm PCR khuếch đại từ gen trh cũng có kích thước rất khác nhau: 250 bp [24]; 354 bp [50]; 500 bp [33] và 623 bp [141]. Paria và cộng sự (2019) dựa trên các trình tự ở hệ gen của các chủng V.
parahaemolyticus khác nhau đã công bố xác định được kích thước 189 amino acid tương ứng với kích thước gen trh hoàn chỉnh là 570 nucleotide, đồng thời xây dựng được cấu trúc không gian của phân tử protein TRH [118]. Các kết quả công bố cũng đã chỉ ra rằng, không phải bất cứ chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus nào cũng đều mang gen tdh, trh. Theo Nishibuchi và cộng sự (1995), chỉ có 1 - 5% các chủng V.
parahaemolyticus mang các gen này [111]. Tương tự, Rojas và cộng sự (2011) cũng nhận định trong các mẫu vi khuẩn V. parahaemolyticus phân lập trên con trai và con hàu chỉ có 10,5% mẫu được phát hiện có gen tdh và không được phát hiện thấy gen trh [134]. parahaemolyticus phân lập từ hàu, Deepanjali và cộng sự (2005) báo cáo chỉ có 3/49 (chiếm 6,1%) phát hiện có gen tdh [43].
Xie và cộng sự (2005) phân lập được 7 chủng V. parahaemolyticus từ tôm, cá mắc bệnh và nước biển thuộc đầm nuôi thủy sản tại Quảng Tây (Trung Quốc). Bẩy chủng vi khuẩn phân lập này cùng 01 chủng V. parahaemolyticus VPL4-90 được cung cấp từ viện Vi sinh học Quảng Đông (Trung Quốc) đều không phát hiện được sự có mặt của hai gen độc tố tdh và trh [166].
Gen tdh cũng không được phát hiện trong 23 mẫu vi khuẩn V. parahaemolyticus do Chakraborty và cộng sự (2008) phân lập được từ mẫu cá da trơn, động vật thân mềm dạng chân đầu (cephalopod), động vật có vỏ. Chỉ duy nhất 01 mẫu trong số đó là có chứa gen trh [33]. Trong 39 mẫu vi khuẩn V.
11 parahaemolyticus phân lập từ cá tại vùng Chengicherla, Hyderabad (Ấn Độ), chỉ có 5,7% và 26,6% chứa tương ứng lần lượt gen tdh và trh [109]. Tại Việt Nam, Nguyễn Văn Duy và cộng sự (2012) báo cáo sự vắng mặt của hai gen độc tố trh và tdh trong hệ gen của 05 mẫu vi khuẩn V. parahaemolyticus phân lập trên thủy sản ở Nha Trang [3]. Gen tlh mã hóa haemolysin TLH có trình tự amino acid bảo thủ đặc trưng cho Vibrionaceae.
Sản phẩm PCR khuếch đại gen này có kích thước 450 bp [70, 170], hoặc 113 bp [52]. Phân tích trình tự genome của V. parahaemolyticus nhận thấy khung đọc mở (open reading frame, ORF) của gen tlh dài 1254 bp, mã hóa cho trình tự 417 amino acid [68].