Khóa Luận Tốt Nghiệp: Nghiên Cứu Tách Dòng và Thiết Kế Vector Biểu Hiện Gen Mã Hóa PETASE

Nghiên cứu về enzyme PETASE đang thu hút sự chú ý lớn trong bối cảnh ô nhiễm nhựa PET ngày càng gia tăng. 59 trang · Học viện Nông nghiệp Việt Nam · 2023.

• Tác giả: Nguyễn Thuỳ Dung
• Người hướng dẫn: TS. Lê Thị Bích Thảo
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Tách Dòng và Thiết Kế Vector Biểu Hiện Gen PETASE
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Phân loại nhựa
• 1.2. Khái niệm nhựa PET
• 1.3. Lịch sử và quá trình thương mại hoá PET
• 1.4. Tính chất của nhựa PET
• 1.5. Ưu và nhược điểm của nhựa PET
• 1.6. Tình hình sử dụng nhựa trên thế giới và Việt Nam
• 1.6.1. Trên thế giới
• 1.6.2. Tại Việt Nam
• 1.7. Phân tích về ô nhiễm rác thải nhựa tại Việt Nam
• 1.8. Tái chế nhựa PET
• 1.9. Cấu trúc không gian của PETASE
• 1.10. Ảnh hưởng của PETASE đến bề mặt nhựa PET
• 1.11. Sự khác nhau giữa enzyme PETASE và MHETASE
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.1.1. Thời gian nghiên cứu
• 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.3. Nội dung nghiên cứu
• 2.4. Sơ đồ nghiên cứu chung
• 2.5. Vật liệu, hoá chất, thiết bị, máy móc
• 2.5.1. Hoá chất, thiết bị, máy móc
• 2.6. Phương pháp
• 2.6.1. Định lượng DNA trong mẫu
• 2.6.2. Tách dòng gen mã hoá PETASE
• 2.6.3. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli bằng phương pháp sốc nhiệt
• 2.6.4. Tách chiết DNA plasmid từ các tế bào E.
• 2.6.5. Điện di phát hiện DNA trên gel agarose
• 2.6.6. Tách chiết DNA ra khỏi gel agarose
• 2.6.7. Thiết kế vector biểu hiện gen mã hoá cho PETASE
• 2.6.8. Biểu hiện PETASE ở E.
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tách dòng gen mã hoá cho PETASE
• 3.2. Nhân gen mã hoá cho PETASE bằng kỹ thuật PCR
• 3.3. Kết quả xác định trình tự gen mã hoá cho PETASE
• 3.4. Biểu hiện PETASE tái tổ hợp
• 3.5. Thiết kế vector biểu hiện PETASE – pET22b(+)
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Enzyme PETASE Giải Pháp Tái Chế

Nghiên cứu về enzyme PETASE đang thu hút sự chú ý lớn trong bối cảnh ô nhiễm nhựa PET ngày càng gia tăng. PETASE, được phân lập từ vi khuẩn Ideonella sakaiensis 201-F6, có khả năng thủy phân nhựa PET thành các monome nhỏ hơn, mở ra tiềm năng lớn trong việc tái chế và xử lý nhựa PET. Các nghiên cứu hiện tại tập trung vào việc cải thiện hoạt tính PETASE, tăng cường khả năng phân giải nhựa PET và ứng dụng nó trong các quy trình tái chế nhựa PET hiệu quả hơn. Theo một nghiên cứu từ Đại học Keio năm 2016, PETASE có khả năng phân hủy nhựa PET tốt hơn so với các enzyme khác được biết đến trước đây.

1.1. Nhựa PET và Vấn Đề Ô Nhiễm Môi Trường Toàn Cầu

Nhựa PET là một trong những loại nhựa được sử dụng rộng rãi nhất trên thế giới, đặc biệt trong ngành đóng gói thực phẩm và đồ uống. Tuy nhiên, tính bền vững của nhựa PET cũng là một vấn đề lớn, vì nó rất khó phân hủy trong môi trường tự nhiên. Điều này dẫn đến sự tích tụ rác thải nhựa khổng lồ, gây ô nhiễm đất, nước và ảnh hưởng nghiêm trọng đến hệ sinh thái. Việc tìm kiếm các giải pháp hiệu quả để tái chế và xử lý nhựa PET là vô cùng cấp thiết.

1.2. Giới Thiệu Enzyme PETASE Chiến Binh Phân Giải Nhựa PET

Enzyme PETASE là một enzyme thủy phân được phát hiện gần đây, có khả năng phân giải nhựa PET thành các thành phần nhỏ hơn như axit terephthalic và ethylene glycol. PETASE được sản xuất bởi vi khuẩn Ideonella sakaiensis 201-F6, một loại vi khuẩn được tìm thấy trong môi trường ô nhiễm nhựa PET. Khám phá này đã mở ra một hướng đi mới trong việc phát triển các phương pháp sinh học để tái chế nhựa PET.

1.3. Tiềm Năng Ứng Dụng PETASE trong Tái Chế Nhựa PET

PETASE có tiềm năng lớn trong việc ứng dụng vào các quy trình tái chế nhựa PET. Bằng cách sử dụng PETASE để phân giải nhựa PET thành các monome, chúng ta có thể tạo ra các nguyên liệu tái chế chất lượng cao để sản xuất nhựa PET mới. Điều này giúp giảm sự phụ thuộc vào nguyên liệu hóa thạch và giảm thiểu lượng rác thải nhựa thải ra môi trường. Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế phân giải PET của PETASE là rất quan trọng.

II. Thách Thức Nghiên Cứu Tối Ưu Biểu Hiện Gen PETASE

Mặc dù PETASE có tiềm năng lớn, việc sản xuất enzyme PETASE với số lượng lớn và hiệu quả vẫn còn là một thách thức. Các nghiên cứu hiện tại tập trung vào việc tối ưu hóa biểu hiện gen PETASE trong các hệ thống biểu hiện khác nhau, như E. coli và nấm men. Việc thiết kế vector biểu hiện phù hợp và cải tiến enzyme thông qua kỹ thuật đột biến định hướng là những hướng đi quan trọng để tăng cường hoạt tính PETASE và giảm chi phí sản xuất. Theo các nhà khoa học, việc cải thiện tính ổn định nhiệt của PETASE cũng là một yếu tố quan trọng để ứng dụng nó trong các quy trình công nghiệp.

2.1. Các Phương Pháp Tách Dòng Gen PETASE Hiện Nay

Việc tách dòng gen PETASE là bước đầu tiên quan trọng trong quá trình biểu hiện protein PETASE. Các phương pháp phổ biến bao gồm sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại gen từ vi khuẩn Ideonella sakaiensis và sau đó tách dòng vào các vector plasmid. Việc lựa chọn vector plasmid phù hợp và tối ưu hóa điều kiện PCR là rất quan trọng để đảm bảo hiệu quả tách dòng.

2.2. Thiết Kế Vector Biểu Hiện Yếu Tố Quyết Định Hiệu Quả

Thiết kế vector biểu hiện là một yếu tố then chốt trong việc biểu hiện protein PETASE tái tổ hợp. Vector biểu hiện cần chứa các yếu tố điều khiển cần thiết, như promoter mạnh, trình tự ribosome binding site (RBS) và trình tự terminator, để đảm bảo biểu hiện protein PETASE hiệu quả. Việc lựa chọn vector biểu hiện prokaryote hay vector biểu hiện eukaryote phụ thuộc vào mục đích nghiên cứu và ứng dụng.

2.3. Tối Ưu Hóa Điều Kiện Biểu Hiện Protein PETASE

Để đạt được biểu hiện protein PETASE tối ưu, cần tối ưu hóa các điều kiện biểu hiện, như nhiệt độ, thời gian, nồng độ chất cảm ứng (ví dụ: IPTG) và môi trường nuôi cấy. Việc phân tích protein bằng các kỹ thuật như điện di SDS-PAGE và Western blotting là cần thiết để đánh giá hiệu quả biểu hiện và tính ổn định của enzyme.

III. Phương Pháp Tách Dòng và Thiết Kế Vector Biểu Hiện PETASE

Nghiên cứu này tập trung vào việc tách dòng gen PETASE từ Ideonella sakaiensis và thiết kế vector biểu hiện phù hợp để biểu hiện protein PETASE trong E. coli. Các phương pháp được sử dụng bao gồm kỹ thuật PCR, cắt giới hạn enzyme, ligase DNA, và biến nạp vi khuẩn. Vector biểu hiện được thiết kế dựa trên plasmid pET22b(+), một vector biểu hiện prokaryote phổ biến. Trình tự gen PETASE được xác nhận bằng giải trình tự DNA và phân tích trình tự.

3.1. Quy Trình Tách Dòng Gen Mã Hóa PETASE Chi Tiết

Quy trình tách dòng gen mã hóa PETASE bao gồm các bước: (1) Thiết kế mồi PCR đặc hiệu cho gen PETASE. (2) Khuếch đại gen PETASE bằng kỹ thuật PCR. (3) Điện di sản phẩm PCR để kiểm tra kích thước. (4) Tách chiết DNA từ gel agarose. (5) Cắt giới hạn enzyme gen PETASE và vector pET22b(+). (6) Ligase DNA để gắn gen PETASE vào vector. (7) Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E. coli.

3.2. Thiết Kế Vector Biểu Hiện PETASE pET22b Tối Ưu Hóa

Vector biểu hiện PETASE-pET22b(+) được thiết kế để biểu hiện protein PETASE có gắn His-tag ở đầu C. His-tag giúp cho việc tinh sạch protein bằng sắc ký ái lực sau này. Vector chứa promoter T7, RBS và terminator T7 để đảm bảo biểu hiện protein hiệu quả khi được cảm ứng bằng IPTG.

3.3. Kiểm Tra và Xác Nhận Dòng Gen PETASE Tái Tổ Hợp

Để đảm bảo tính chính xác của dòng gen PETASE tái tổ hợp, cần thực hiện các bước kiểm tra và xác nhận: (1) Điện di plasmid tái tổ hợp sau khi cắt giới hạn enzyme. (2) Giải trình tự DNA của gen PETASE trong plasmid. (3) Phân tích trình tự để so sánh với trình tự gen PETASE đã được công bố trên GenBank.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Biểu Hiện Thành Công Protein PETASE

Nghiên cứu đã thành công trong việc tách dòng gen PETASE và thiết kế vector biểu hiện PETASE-pET22b(+). Protein PETASE tái tổ hợp đã được biểu hiện trong E. coli BL21(DE3) sau khi cảm ứng bằng IPTG. Phân tích điện di SDS-PAGE cho thấy sự xuất hiện của một protein có kích thước phù hợp với protein PETASE (khoảng 28 kDa). Tuy nhiên, cần thực hiện thêm các nghiên cứu để tối ưu hóa điều kiện biểu hiện và tinh sạch protein PETASE để đánh giá hoạt tính enzyme.

4.1. Kết Quả PCR và Tách Dòng Gen PETASE

Kết quả PCR cho thấy sự khuếch đại thành công của gen PETASE với kích thước khoảng 890 bp. Điện di sản phẩm PCR cho thấy một băng DNA rõ ràng ở vị trí tương ứng. Tách dòng gen PETASE vào vector pET22b(+) đã được xác nhận bằng cắt giới hạn enzyme và giải trình tự DNA.

4.2. Biểu Hiện Protein PETASE Tái Tổ Hợp trong E. coli

Biểu hiện protein PETASE tái tổ hợp trong E. coli BL21(DE3) đã được xác nhận bằng điện di SDS-PAGE. Sau khi cảm ứng bằng IPTG, một protein mới xuất hiện với kích thước khoảng 28 kDa, phù hợp với kích thước dự kiến của protein PETASE có gắn His-tag.

4.3. Đánh Giá Hoạt Tính Enzyme PETASE Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo

Mặc dù protein PETASE đã được biểu hiện thành công, cần thực hiện thêm các nghiên cứu để đánh giá hoạt tính enzyme. Các phương pháp đánh giá hoạt tính enzyme bao gồm sử dụng nhựa PET làm cơ chất và đo lượng sản phẩm thủy phân được tạo ra. Việc tối ưu hóa điều kiện phản ứng và tinh sạch protein PETASE là cần thiết để có kết quả chính xác.

V. Ứng Dụng PETASE Giải Pháp Sinh Học Cho Ô Nhiễm Nhựa

Nghiên cứu về PETASE mở ra tiềm năng lớn trong việc phát triển các giải pháp sinh học để giải quyết vấn đề ô nhiễm nhựa PET. PETASE có thể được sử dụng để tái chế sinh học nhựa PET, tạo ra các nguyên liệu tái chế chất lượng cao và giảm sự phụ thuộc vào nguyên liệu hóa thạch. Ngoài ra, PETASE có thể được sử dụng để xử lý rác thải nhựa tại các bãi chôn lấp, giảm thiểu lượng rác thải nhựa thải ra môi trường. Việc cải tiến enzyme và tối ưu hóa quy trình là cần thiết để ứng dụng PETASE trong thực tế.

5.1. Tái Chế Sinh Học Nhựa PET Hướng Đi Bền Vững

Tái chế sinh học nhựa PET bằng PETASE là một hướng đi bền vững để giảm thiểu ô nhiễm nhựa. Bằng cách sử dụng PETASE để phân giải nhựa PET thành các monome, chúng ta có thể tạo ra các nguyên liệu tái chế chất lượng cao để sản xuất nhựa PET mới. Điều này giúp giảm sự phụ thuộc vào nguyên liệu hóa thạch và giảm thiểu lượng rác thải nhựa thải ra môi trường.

5.2. Xử Lý Rác Thải Nhựa PET Bằng Enzyme PETASE

PETASE có thể được sử dụng để xử lý rác thải nhựa tại các bãi chôn lấp, giảm thiểu lượng rác thải nhựa thải ra môi trường. Bằng cách phun enzyme PETASE lên rác thải nhựa, chúng ta có thể phân giải nhựa PET thành các thành phần nhỏ hơn, giảm thể tích rác thải và giảm nguy cơ ô nhiễm.

5.3. Tiềm Năng Ứng Dụng Công Nghiệp và Thương Mại Hóa PETASE

PETASE có tiềm năng lớn trong việc ứng dụng công nghiệp và thương mại hóa. Các công ty có thể sử dụng PETASE để tái chế nhựa PET và sản xuất các sản phẩm nhựa tái chế. Ngoài ra, PETASE có thể được sử dụng để phát triển các sản phẩm mới, như màng phân hủy sinh học và vật liệu đóng gói thân thiện với môi trường.

VI. Kết Luận Tương Lai Nghiên Cứu và Ứng Dụng Enzyme PETASE

Nghiên cứu về PETASE đang mở ra một chương mới trong việc giải quyết vấn đề ô nhiễm nhựa PET. Việc tách dòng gen PETASE, thiết kế vector biểu hiện và biểu hiện protein PETASE là những bước quan trọng để hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của enzyme và tối ưu hóa khả năng phân giải nhựa PET. Tương lai của nghiên cứu PETASE tập trung vào việc cải tiến enzyme, tối ưu hóa quy trình và ứng dụng nó trong các quy trình tái chế và xử lý rác thải nhựa hiệu quả hơn.

6.1. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Cải Tiến và Tối Ưu Hóa PETASE

Các hướng nghiên cứu tiếp theo về PETASE bao gồm: (1) Cải thiện hoạt tính xúc tác của PETASE thông qua đột biến định hướng. (2) Tăng cường tính ổn định nhiệt và tính ổn định pH của PETASE. (3) Tối ưu hóa điều kiện phản ứng để tăng hiệu quả phân giải nhựa PET.

6.2. Thách Thức và Cơ Hội trong Ứng Dụng PETASE

Thách thức trong việc ứng dụng PETASE bao gồm: (1) Chi phí sản xuất enzyme cao. (2) Khả năng hoạt động của enzyme trong môi trường thực tế (ví dụ: rác thải nhựa lẫn tạp chất). (3) Quy định pháp lý về sử dụng enzyme trong tái chế và xử lý rác thải. Cơ hội bao gồm: (1) Nhu cầu ngày càng tăng về các giải pháp tái chế và xử lý rác thải nhựa bền vững. (2) Sự phát triển của công nghệ sinh học và kỹ thuật cải tiến enzyme.

6.3. PETASE Góp Phần Vào Kinh Tế Tuần Hoàn và Phát Triển Bền Vững

PETASE có tiềm năng đóng góp quan trọng vào kinh tế tuần hoàn và phát triển bền vững. Bằng cách tái chế nhựa PET và giảm thiểu rác thải nhựa, PETASE giúp bảo vệ môi trường, tiết kiệm tài nguyên và tạo ra các sản phẩm nhựa thân thiện với môi trường.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Ô nhiễm rác thải nhựa đang là thách thức sinh thái nghiêm trọng trên quy mô toàn cầu. Theo các số liệu thống kê được tác giả dẫn giải, sản lượng nhựa toàn thế giới năm 2017 đạt gần 350 triệu tấn, trong đó lĩnh vực bao bì chiếm tỷ trọng lớn nhất với 39,7% tổng nhu cầu. Đến năm 2018, sản lượng này tăng lên 359 triệu tấn và duy trì tốc độ tăng trưởng dự kiến khoảng 3,5% mỗi năm. Trong số các dòng polymer nhiệt dẻo, Polyethylene terephthalate (PET) được sử dụng phổ biến nhất để sản xuất chai nước giải khát, khay thực phẩm và sợi tổng hợp nhờ độ bền cơ học cao, tính trơ hóa học và khả năng kháng khí. Tuy nhiên, cấu trúc bền vững này khiến PET rất khó phân hủy tự nhiên trong điều kiện môi trường thông thường.

Tại Việt Nam, tình trạng ô nhiễm chất thải nhựa diễn biến phức tạp. Mức độ tiêu thụ nhựa bình quân đầu người đã tăng từ 33 kg/người/năm (năm 2010) lên 41 kg/người/năm (năm 2015) và đạt khoảng 81 kg/người/năm trở thành rác thải, trong khi tỷ lệ tái chế phục vụ công nghiệp chỉ đạt 23 kg/người/năm. Hơn một nửa lượng rác thải nhựa phát sinh (khoảng 3,6 triệu tấn/năm) chưa được thu gom và xử lý thích đáng; khối lượng rác nhựa thải ra môi trường đất liền ước tính từ 2,8 đến 3,1 triệu tấn/năm và thải ra biển khoảng 280.000 tấn/năm. Các giải pháp xử lý truyền thống như chôn lấp làm gia tăng áp lực mặt bằng, trong khi phương pháp tái chế cơ học (nghiền, rửa) dễ lẫn tạp chất vô cơ/hữu cơ làm giảm chất lượng vật liệu, còn tái chế hóa học đòi hỏi điều kiện nhiệt độ, áp suất cao và tiêu tốn năng lượng.

Năm 2016, việc nhóm nghiên cứu tại Đại học Keio phát hiện chủng vi khuẩn Ideonella sakaiensis 201-F6 có khả năng tiết ra enzyme PETase (polyethylene terephthalate hydrolase) phân giải mạch polymer PET ở nhiệt độ 20–40°C đã mở ra triển vọng phân hủy sinh học chất thải nhựa. Mặc dù vậy, việc thu nhận enzyme tự nhiên hoặc tổng hợp bằng con đường hóa học gặp nhiều trở ngại do quy trình nhiều công đoạn và chi phí cao. Tại Việt Nam, hướng nghiên cứu biểu hiện enzyme PETase tái tổ hợp còn mới mẻ và mới bước đầu triển khai tại Phòng Hóa sinh Protein, Viện Công nghệ sinh học. Do đó, khóa luận tập trung thực hiện đề tài "Nghiên cứu tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hoá PETase" nhằm tạo nguồn vật liệu tái tổ hợp phục vụ nghiên cứu ứng dụng xử lý môi trường.

Mục tiêu chung của đề tài là tách được dòng và thiết kế thành công vector biểu hiện gen mã hóa enzyme PETase. Để đạt được mục tiêu này, nghiên cứu thực hiện hai nhiệm vụ/yêu cầu cụ thể:

1. Tách dòng gen mã hoá PETase.
2. Thiết kế vector biểu hiện gen mã hoá PETase.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Đoạn gen mã hóa enzyme PETase (enzyme có khả năng thủy phân nhựa PET).
• Phạm vi thời gian: Đề tài được triển khai thực hiện từ tháng 7 năm 2022 đến tháng 2 năm 2023.
• Phạm vi không gian: Nghiên cứu thực nghiệm được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Hóa sinh Protein, Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Về cơ sở lý thuyết, nghiên cứu dựa trên các đặc tính sinh hóa và cấu trúc phân tử của enzyme PETase từ Ideonella sakaiensis 201-F6. Enzyme này thuộc họ esterase với nếp gấp α/β-hydrolase điển hình, bao gồm một phiến gấp β trung tâm cấu thành từ 9 chuỗi β kẹp giữa 6 chuỗi xoắn α. Hoạt tính xúc tác của enzyme được điều khiển bởi bộ ba axit amin xúc tác nằm trên bề mặt phân tử gồm Serine 131 (S131), Histidine 208 (H208) và Aspartate 177 (D177) (hoặc tương ứng Ser160-His237-Asp206 tùy hệ thống đánh số chuỗi peptide). PETase thủy phân liên kết ester trong chuỗi polymer PET tạo thành các phân tử oligomer và monomer trung gian như bis(2-hydroxyethyl) terephthalate (BHET), mono(2-hydroxyethyl) terephthalate (MHET) và axit terephthalic (TPA). Điểm đặc biệt của PETase so với các cutinase thông thường là sự hiện diện của hai cầu nối disulfide (DS1 và DS2), trong đó DS1 nằm gần vị trí hoạt động giúp duy trì cấu trúc không gian ổn định cho bộ ba xúc tác và tạo độ linh động cho vòng loop tiếp xúc cơ chất.

Hệ thống vật liệu sinh học và hóa chất phục vụ nghiên cứu bao gồm:

• Chủng vi sinh vật: Escherichia coli DH5α và DH10B dùng cho mục đích nhân dòng, lưu giữ plasmid tái tổ hợp; Escherichia coli BL21(DE3) dùng làm tế bào chủ để biểu hiện protein tái tổ hợp (cung cấp bởi Invitrogen và Novagen).
• Mẫu gen và vector plasmid: Gen mã hóa PETase được thiết kế tối ưu và cung cấp bởi hãng Biomatik; vector tách dòng trung gian pBT (kích thước 2705 bp, mang gen kháng ampicillin, cải biến từ pUC18 do Phòng Công nghệ Tế bào thực vật cung cấp); vector biểu hiện pET22b(+) (kích thước 5493 bp, mang promoter LacI/T7, gen kháng ampicillin, do Novagen cung cấp).
• Hóa chất và enzyme: Enzyme cắt giới hạn NdeI, BamHI, EcoRI; T4 DNA ligase; Taq polymerase; kit tinh sạch DNA gel QIAquick Gel Extraction (QIAGEN); các hóa chất điện di protein và chọn lọc như ampicillin, IPTG, X-Gal, acrylamide, bis-acrylamide, TEMED, APS, SDS.

Nhóm đối tượng	Danh mục cụ thể	Nguồn gốc / Đơn vị cung cấp
Chủng vi khuẩn chủ	E. coli DH5α, E. coli DH10B, E. coli BL21(DE3)	Invitrogen, Novagen (Hoa Kỳ)
Vector plasmid	pBT (2705 bp), pET22b(+) (5493 bp)	Viện Công nghệ sinh học, Novagen
Cặp mồi PCR	Mồi xuôi: mang vị trí cắt NdeI Mồi ngược: mang vị trí cắt EcoRI	Phù Sa (Việt Nam)
Enzyme sinh học phân tử	NdeI, BamHI, EcoRI, T4 DNA ligase, Taq DNA polymerase	Thermo Scientific, New England Biolabs
Kit tách chiết hóa chất	QIAquick Gel Extraction Kit, hóa chất điện di protein	QIAGEN (Hà Lan), Sigma-Aldrich (Hoa Kỳ)

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được tiến hành theo quy trình sinh học phân tử chuẩn mực:

• Phương pháp định lượng DNA: Đo mật độ quang học (OD) tại bước sóng 260 nm bằng máy quang phổ; độ tinh sạch của dịch chiết DNA được thẩm định qua tỷ số OD260/OD280 nm (khoảng giá trị đạt chuẩn đánh giá là 1,8–2,0).
• Phương pháp nhân bản gen (PCR): Sử dụng phản ứng chuỗi trùng hợp với cặp mồi đặc hiệu được bổ sung vị trí nhận biết enzyme cắt giới hạn: mồi xuôi mang vị trí NdeI (5’-CTGGCGGTGACATATGGCATGAACTTC-3’) và mồi ngược mang vị trí EcoRI (5’-ACCGAGCGCGAATTCTTATTAGCTGCA-3’). Chu trình nhiệt gồm: 94°C trong 3 phút; 25 chu kỳ (94°C trong 0,3 phút, 56°C trong 0,3 phút, 72°C trong 1 phút); kéo dài hoàn tất ở 72°C trong 8 phút; bảo quản ở 4°C.
• Phương pháp tạo dòng và biến nạp: Phản ứng ghép nối sản phẩm PCR vào vector pBT bằng enzyme T4 DNA ligase ở 22°C qua đêm (16 giờ). Chuyển plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli DH5α đã được xử lý dung dịch CaCl2 100 mM thông qua kỹ thuật sốc nhiệt ở 42°C trong 30 giây. Sàng lọc dòng tế bào mang gen tái tổ hợp dựa trên nguyên lý khuẩn lạc xanh - trắng trên môi trường thạch LB có bổ sung ampicillin (100 µg/ml) và X-Gal (40 mg/ml).
• Phương pháp tách chiết và kiểm tra DNA: Chiết tách plasmid bằng phương pháp kiềm biến tính với hệ dung dịch I (Tris-HCl, EDTA, glucose), dung dịch II (NaOH, SDS) và dung dịch III (potassium acetate, acetic acid), kết hợp làm sạch bằng hỗn hợp dung môi chloroform : isoamyl alcohol (24:1) và tủa bằng ethanol. Kiểm tra kích thước đoạn gen và vector bằng phương pháp điện di trên gel agarose nồng độ 0,8% (chạy ở hiệu điện thế 120 V) và nhuộm ethidium bromide (0,5 µg/ml) dưới ánh sáng tia UV.
• Phương pháp tái tổ hợp vector biểu hiện và tinh sạch DNA: Cắt đồng thời plasmid tái tổ hợp PETase-pBT và vector pET22b(+) bằng hai enzyme giới hạn NdeI và BamHI. Tinh sạch đoạn gen và vector mở vòng từ bản gel agarose bằng kit QIAquick Gel Extraction, sau đó tiến hành ghép nối bằng T4 DNA ligase ở 22°C trong 16 giờ và biến nạp vào chủng E. coli DH5α, sau đó chuyển vào chủng biểu hiện E. coli BL21(DE3).
• Phương pháp cảm ứng biểu hiện và phân tích protein: Chủng E. coli BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng chứa ampicillin ở 37°C, lắc 170 vòng/phút đến khi mật độ quang OD600 đạt 0,5–0,7 thì bổ sung IPTG với nồng độ cuối cùng 0,4 mM để cảm ứng phiên mã. Tế bào được thu nhận tại thời điểm trước khi cảm ứng (0 giờ) và sau cảm ứng 3 giờ. Khối lượng và sự tích lũy của protein tái tổ hợp được phân tích bằng điện di SDS-PAGE trên gel polyacrylamide biến tính (gel phân tách nồng độ 12,6%) và nhuộm màu bằng thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue (CBB).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp các cơ sở lý luận về cấu trúc phân tử polymer, phân loại chất dẻo thành nhựa nhiệt dẻo (chiếm 80%, có khả năng tái chế nhiệt) và nhựa nhiệt rắn (chiếm 20%, không thể tái chế nhiệt). Tác giả làm rõ vị trí của PET trong hệ thống mã nhận diện quốc tế (mã số 1) và tính chất hóa lý đặc thù: PET vô định hình trong suốt trong khi PET bán tinh thể mờ đục; nhiệt độ biến dạng co rút màng ở 70°C; bền vững trước các tác nhân môi trường nhưng nhạy cảm với phản ứng thủy phân liên kết ester. Phần thực trạng đưa ra bức tranh toàn cảnh về khối lượng rác thải nhựa tại các lưu vực sông ngòi, vùng ven biển Việt Nam và mức độ tiêu thụ nguyên liệu nhựa nhập khẩu. Tác giả đối chiếu các giải pháp tái chế truyền thống với phương pháp tái chế sinh học bằng enzyme phân giải polyester (cutinase, esterase, lipase). Trọng tâm chương phân tích chi tiết cơ chế hoạt động của enzyme PETase từ chủng Ideonella sakaiensis 201-F6, sự khác biệt cấu trúc không gian so với MHETase, cấu tạo vị trí xúc tác Ser-His-Asp và vai trò của hai liên kết disulfide đặc trưng giúp PETase có hoạt tính phân giải màng film PET cao gấp 5 đến 120 lần so với các enzyme cùng nhóm ở nhiệt độ sinh lý 30°C.

Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Nội dung chương trình bày chi tiết danh mục chủng vi sinh vật, vector phân tử, trang thiết bị thí nghiệm và thông số kỹ thuật của từng công đoạn thực nghiệm. Chương mô tả công thức các môi trường nuôi cấy (LB lỏng, LB thạch), hệ dung dịch ly giải kiềm (dung dịch I, II, III), dung dịch đệm SDS-PAGE (gel tập trung, gel phân tách 12,6%, đệm mẫu 5x, đệm điện di). Quy trình thao tác được chuẩn hóa từ khâu thiết kế mồi nhân gen, thiết lập chu trình nhiệt cho phản ứng PCR, kỹ thuật tạo tế bào khả biến E. coli DH5α bằng CaCl2, quy trình sốc nhiệt 42°C, kỹ thuật phân lập khuẩn lạc trắng trên môi trường chọn lọc Amp/X-Gal, đến phương pháp cắt kép enzyme giới hạn NdeI và BamHI để định hướng chèn đoạn gen vào vector biểu hiện pET22b(+). Công đoạn thu mẫu cảm ứng tế bào E. coli BL21(DE3) bằng IPTG 0,4 mM và quy trình biến tính mẫu protein ở 95°C trong 10 phút trước khi chạy điện di SDS-PAGE cũng được quy định cụ thể.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương kết quả thể hiện các dẫn liệu thực nghiệm thu được qua từng giai đoạn nghiên cứu:

• Kết quả nhân bản gen: Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen đích từ mẫu gen thiết kế cho ra một băng DNA đơn nhất, rõ nét trên bản gel agarose 0,8% tại vị trí tương ứng khoảng 900 bp (phù hợp với kích thước lý thuyết tính toán là 890 bp).
• Kết quả tách dòng gen: Sau khi nối ghép sản phẩm PCR vào vector trung gian pBT và biến nạp vào E. coli DH5α, hệ thống chỉ thị màu X-Gal/Ampicillin phân tách rõ hai nhóm khuẩn lạc: khuẩn lạc màu xanh (vector tự đóng vòng, phục hồi hoạt tính enzyme chuyển hóa X-Gal) và khuẩn lạc màu trắng (vector tái tổ hợp mang đoạn gen chèn làm gián đoạn khung đọc). Kết quả tách chiết plasmid từ các khuẩn lạc trắng cho thấy vector tái tổ hợp có độ dài lớn hơn plasmid pBT gốc (2705 bp). Phản ứng cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng hai enzyme NdeI và BamHI giải phóng hai băng DNA rõ rệt: băng 2705 bp tương ứng với vector pBT mở vòng và băng kích thước khoảng 900 bp tương ứng với gen PETase. Dòng plasmid tái tổ hợp này được định danh là PETase-pBT.
• Kết quả xác định trình tự nucleotide: Dữ liệu giải trình tự gen xử lý qua phần mềm BioEdit cho thấy đoạn gen thu nhận có mức độ tương đồng 99,26% so với trình tự chuẩn của gen PETase công bố trên ngân hàng GenBank (mã số đăng ký: BBYR01000074.1). Những sai khác nucleotide quan sát được là các đột biến đồng nghĩa (silent mutation), không làm biến đổi cấu trúc chuỗi axit amin của phân tử protein enzyme.
• Kết quả thiết kế vector biểu hiện và cảm ứng protein: Đoạn gen mã hóa PETase sau khi tách khỏi vector pBT bằng enzyme NdeI và BamHI được gắn nối thành công vào vector biểu hiện pET22b(+) đã được mở vòng cùng cặp enzyme cắt. Vector tái tổ hợp PETase-pET22b(+) được biến nạp vào chủng E. coli BL21(DE3). Kết quả phân tích điện di SDS-PAGE sau 3 giờ cảm ứng với IPTG nồng độ 0,4 mM cho thấy sự xuất hiện của một băng protein mới đậm nét ở mức khối lượng phân tử xấp xỉ 28 kDa, hoàn toàn phù hợp với khối lượng phân tử lý thuyết của protein dung hợp PETase.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã thực hiện đầy đủ các bước thực nghiệm theo sơ đồ quy trình công nghệ sinh học phân tử, thu được các kết quả định lượng cụ thể:

• Nhân bản thành công đoạn gen mã hóa PETase bằng kỹ thuật PCR với kích thước xác định là 890 bp (quan sát trên bản điện di gel agarose tương đương vị trí 900 bp).
• Xây dựng thành công vector tách dòng trung gian PETase-pBT kích thước khoảng 3,6 kb; kiểm tra cắt giới hạn kép bằng NdeI và BamHI chứng minh sự hiện diện của đoạn chèn kích thước ~900 bp tách rời khỏi khung vector 2705 bp.
• Xác định trình tự đoạn gen tách dòng đạt độ tương đồng 99,26% so với trình tự chuẩn BBYR01000074.1 trên GenBank, bảo tồn hoàn toàn cấu trúc chuỗi polypeptide của enzyme.
• Thiết kế thành công cấu trúc vector biểu hiện tái tổ hợp PETase-pET22b(+) (tổng kích thước khoảng 6,38 kb trên cơ sở vector gốc 5493 bp).
• Biểu hiện thành công protein tái tổ hợp trong tế bào chủ E. coli BL21(DE3) dưới điều kiện cảm ứng bằng IPTG 0,4 mM sau 3 giờ nuôi cấy ở 37°C; khối lượng phân tử của phân tử protein dung hợp xác định qua điện di SDS-PAGE đạt khoảng 28 kDa.

Thông số / Đối tượng thực nghiệm	Giá trị thực nghiệm ghi nhận	Cơ sở đối chiếu / Lý thuyết
Kích thước đoạn gen PETase nhân bản	~890 bp (băng gel ~900 bp)	Trình tự thiết kế ban đầu
Kích thước vector dòng hóa pBT	2705 bp	Vector cải biến từ pUC18
Độ tương đồng trình tự nucleotide	99,26%	Mã GenBank: BBYR01000074.1
Kích thước vector biểu hiện pET22b(+)	5493 bp	Dữ liệu nhà sản xuất Novagen
Nồng độ IPTG cảm ứng biểu hiện	0,4 mM	Điều kiện tối ưu hóa nuôi cấy
Khối lượng phân tử protein biểu hiện	~28 kDa	Phân tích điện di biến tính SDS-PAGE

Về mặt đóng góp khoa học, tác giả đã thiết lập được quy trình tạo dòng và hệ thống vector biểu hiện ổn định cho gen mã hóa PETase trong vi khuẩn E. coli. Đây là tiền đề vật liệu di truyền có ý nghĩa thực tiễn đối với hướng nghiên cứu sản xuất enzyme tái tổ hợp quy mô lớn tại Việt Nam, mở ra triển vọng ứng dụng chất xúc tác sinh học trong xử lý và phân hủy phế thải nhựa PET thay thế các biện pháp hóa học và cơ học truyền thống.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận hoàn thành mục tiêu thiết kế hệ thống vector và xác nhận mức độ biểu hiện của protein PETase ở quy mô phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, nội dung nghiên cứu còn một số giới hạn được phản ánh qua phạm vi thực hiện:

• Nghiên cứu dừng lại ở bước phát hiện băng protein tái tổ hợp có kích thước 28 kDa trên điện di đồ SDS-PAGE dịch chiết tế bào tổng số, chưa tiến hành tinh sạch phân tử protein PETase đến độ tinh khiết cao qua các cột sắc ký ái lực.
• Chưa khảo sát tỷ lệ protein biểu hiện ở dạng tan (soluble) so với dạng thể vùi (inclusion bodies) trong tế bào E. coli.
• Đề tài chưa triển khai thử nghiệm thực tế hoạt tính sinh học phân giải màng nhựa PET film của enzyme tái tổ hợp thu nhận (như định lượng độ giảm khối lượng màng nhựa hoặc quan sát hình thái bề mặt film bị ăn mòn qua kính hiển vi điện tử quét SEM).

Hướng nghiên cứu tiếp theo được xác định bao gồm việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy cảm ứng (nhiệt độ, thời gian, nồng độ chất cảm ứng IPTG) để nâng cao hàm lượng protein tan; thực hiện tinh sạch protein dung hợp PETase bằng sắc ký; và tiến hành các phép thử nghiệm sinh hóa đo hoạt tính thủy phân cơ chất PET nhân tạo cũng như rác thải nhựa PET thực tế.

Giá trị tham khảo

Báo cáo khóa luận cung cấp hệ thống dữ liệu thực nghiệm chi tiết và quy trình thao tác chuẩn mực, có giá trị tham khảo thiết thực cho:

• Sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Sinh học phân tử, Hóa sinh học và Kỹ thuật môi trường đang thực hiện các đề tài liên quan đến tạo dòng gen, kỹ thuật tái tổ hợp DNA và biểu hiện protein ngoại lai trong tế bào vi khuẩn.
• Các nhóm nghiên cứu phát triển enzyme phân hủy chất dẻo hoặc nghiên cứu cải biến di truyền enzyme phân hủy rác thải sinh học.
• Những nội dung có giá trị tham khảo kỹ thuật cao gồm: thiết kế cặp mồi mang vị trí enzyme cắt giới hạn phục vụ ghép nối định hướng; quy trình dòng hóa trung gian qua vector pBT bằng phản ứng ghép nối đầu T; hệ thống dung dịch và quy trình ly giải kiềm tách chiết plasmid tái tổ hợp; công thức pha chế gel điện di SDS-PAGE và phương pháp cảm ứng biểu hiện protein dung hợp bằng hệ thống promoter LacI/T7.

Câu hỏi thường gặp

Enzyme PETase được phân lập từ loài vi sinh vật nào và có khả năng hoạt động ở khoảng nhiệt độ nào?

Enzyme PETase được phân lập từ vi khuẩn Ideonella sakaiensis 201-F6 (phát hiện năm 2016 tại Nhật Bản). Khác với các cutinase ưa nhiệt trước đây phải hoạt động ở 50°C, PETase có khả năng xúc tác thủy phân mạch polymer PET ở điều kiện nhiệt độ sinh lý từ 20°C đến 40°C, với hoạt tính phân giải màng film PET cao gấp 5 đến 120 lần tại 30°C.

Đoạn gen mã hóa PETase trong nghiên cứu có kích thước bao nhiêu và mức độ tương đồng trình tự nucleotide đạt tỷ lệ nào?

Đoạn gen mã hóa PETase được nhân bản bằng kỹ thuật PCR có kích thước lý thuyết 890 bp (hiển thị tương đương mức 900 bp trên gel agarose 0,8%). Kết quả giải trình tự và phân tích qua phần mềm BioEdit cho thấy đoạn gen đạt mức độ tương đồng 99,26% so với trình tự chuẩn trên GenBank mang mã số đăng ký BBYR01000074.1, trong đó các sai khác nucleotide không làm thay đổi cấu trúc axit amin của protein.

Cặp enzyme cắt giới hạn nào được sử dụng để chuyển gen PETase từ vector tách dòng sang vector biểu hiện?

Nghiên cứu sử dụng cặp enzyme cắt giới hạn NdeI và BamHI để cắt đồng thời plasmid tái tổ hợp PETase-pBT và vector biểu hiện pET22b(+), tạo ra các đầu dính tương hợp phục vụ phản ứng ghép nối định hướng đoạn gen đích vào vị trí vùng đa điểm cắt của vector biểu hiện.

Điều kiện cảm ứng biểu hiện protein PETase trong chủng E. coli BL21(DE3) được thiết lập như thế nào?

Sau khi nuôi cấy dịch vi khuẩn trong môi trường LB lỏng chứa ampicillin ở 37°C đến khi giá trị mật độ quang OD600 đạt khoảng 0,5–0,7, quá trình biểu hiện được kích hoạt bằng chất cảm ứng IPTG với nồng độ cuối cùng là 0,4 mM. Tế bào được tiếp tục nuôi cấy lắc trong 3 giờ trước khi thu nhận sinh khối để phân tích protein.

Khối lượng phân tử của protein PETase tái tổ hợp xác định qua phương pháp SDS-PAGE là bao nhiêu?

Trên bản điện di gel polyacrylamide biến tính (SDS-PAGE) nồng độ gel phân tách 12,6%, sau khi nhuộm bằng thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue, protein dung hợp PETase được ghi nhận xuất hiện dưới dạng một băng vạch đậm có khối lượng phân tử xấp xỉ 28 kDa.

Kết luận

Khóa luận đã nhân bản thành công đoạn gen mã hóa PETase kích thước 890 bp từ vi khuẩn Ideonella sakaiensis 201-F6 và dòng hóa thành công vào vector trung gian pBT với độ tương đồng trình tự đạt 99,26%. Tác giả đã thiết kế thành công vector biểu hiện tái tổ hợp PETase-pET22b(+) và chuyển nạp vào tế bào chủ Escherichia coli BL21(DE3). Kết quả cảm ứng bằng IPTG nồng độ 0,4 mM đã biểu hiện thành công protein tái tổ hợp có khối lượng phân tử khoảng 28 kDa trên điện di đồ SDS-PAGE. Công trình tạo lập nền tảng vật liệu di truyền và quy trình kỹ thuật tin cậy phục vụ các nghiên cứu tinh sạch và ứng dụng enzyme phân hủy sinh học chất thải nhựa PET tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Hiện nay, vấn đề môi trường và bảo vệ môi trường không chỉ là vấn đề của riêng từng quốc gia mà còn là vấn đề chung của toàn cầu, đang thu hút sự quan tâm đặc biệt của khắp các quốc gia trên thế giới. Tại các hội thảo quốc tế, nhiều biện pháp về bảo vệ môi trường đã được đưa ra và thu hút được sự quan tâm của những người tham dự. Bởi nó không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của một quốc gia, mà còn quyết định sự tồn tại của con người trên thế giới hôm nay và các thế hệ tương lai. Xã hội ngày càng phát triển nên nhu cầu tiêu thụ hàng hoá tiêu dùng của mọi người cũng ngày càng tăng.

Điều đó làm cho lượng rác thải thải ra môi trường cũng ngày càng nhiều, đặc biệt là rác thải nhựa. Tại Việt Nam, mức độ tiêu thụ nhựa bình quân đầu người là 81kg/người/năm trở thành rác thải và 23kg/người/năm được tái chế phục vụ cho các ngành công nghiệp. Và hơn một nửa số rác thải nhựa phát sinh tại Việt Nam – khoảng 3,6 triệu tấn/năm vẫn chưa được thu gom và xử lý (Asia et al. Còn trên thế giới, người ta ước tính rằng sản lượng nhựa thế giới gần đạt 350 triệu tấn trong năm 2017 và lĩnh vực ứng dụng lớn nhất là bao bì, đạt giá trị 39,7% tổng nhu cầu nhựa.

Polyethylene terephthalate (PET) là một trong những polyme nhựa nhiệt dẻo phổ biến nhất và được sử dụng rộng rãi cho chai nước giải khát và bao bì thực phẩm (Puspitasari et al. Việc tìm kiếm các phương án mới trong việc giải quyết vấn đề ô nhiễm từ rác thải nhựa vẫn đang là nỗ lực của các nhà khoa học trong nhiều năm qua. Một vật liệu có khả năng phân huỷ rác thải nhựa, cụ thể là nhựa PET có nguồn gốc từ vi khuẩn Ideonella sakaiensis 201-F6 đã và đang được đầu tư nghiên cứu trong thời gian gần đây. Đó là PETase (có bản chất là protein) được phân lập từ vi khuẩn Ideonella sakaiensis 201-F6, có tác động phân huỷ lên bề mặt nhựa PET nên được ứng dụng trong việc tạo nguồn vật liệu để phân huỷ rác thải nhựa, ngăn ngừa ô nhiễm môi trường… 1 Cho đến nay, PETase thường được tổng hợp bằng con đường hoá học.

Tuy nhiên phương pháp tổng hợp hoá học bị hạn chế bởi cách thức tổng hợp thường qua nhiều khâu và giá thành sản xuất cao. Vì vậy PETase đang được chú trọng nghiên cứu, tạo ra bằng công nghệ DNA tái tổ hợp. Ở Việt Nam, hướng nghiên cứu về PETase tự nhiên và tái tổ hợp vẫn còn hạn chế và mới bắt đầu được triển khai tại Phòng Hoá sinh Protein., Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Chính vì vậy, tôi đã thực hiện đề tài khoá luận tốt nghiệp “ Nghiên cứu tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hoá PETase ”.

Mục đích Tách được dòng và thiết kế được vector biểu hiện gen mã hoá PETase 1. Yêu cầu (1) Tách dòng gen mã hoá PETase. (2) Thiết kế vector biểu hiện gen mã hoá PETase. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.

Khái niệm Nhựa (hay còn gọi là chất dẻo) là một loại vật liệu được điều chế từ các nhóm cao phân tử, được sử dụng để sản xuất các vật liệu tiêu dùng hàng ngày hay các vật liệu phục vụ cho công nghiệp ( Phạm Văn Đan Thuỷ và cs, 2011). Phân loại nhựa Nhựa có thể được phân loại thành nhựa nhiệt rắn (thermoset) và nhựa nhiệt dẻo (thermoplast) (United Nations Environment Programme, 2009). Nhựa nhiệt dẻo: Nóng chảy dưới tác dụng của nhiệt độ và đông đặc lại khi làm nguội để tạo ra các hình dạng và sản phẩm mới.