MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Mỗi năm, trên thế giới, số ngƣời tử vong vì không đƣợc cầm máu kịp thời do tổn thƣơng mạch máu ngày càng gia tăng và không có dấu hiệu thuyên giảm. Các tác nhân dẫn đến sự tổn thƣơng của mạch máu chủ yếu do tác động bên ngoài nhƣ xung đột, các hoạt động sinh hoạt bình thƣờng của con ngƣời nhƣ tham gia giao thông, sử dụng vật sắc nhọn, vết thƣơng do côn trùng, động vật hút máu … gây nên. Ngoài ra, còn do bên trong cơ thể có nhiều mô chết hoặc tổn thƣơng khiến các yếu tố đông máu đã bị sử dụng trong quá trình đông máu không tập trung, không còn đủ để duy trì cầm máu khi mạch máu bị tổn thƣơng.
Khi gặp những trƣờng hợp nhƣ vậy, cần có các phƣơng pháp cầm máu nhanh, đơn giản, hiệu quả nhất. Tuy nhiên, vì không có kỹ năng vận dụng sơ cứu cùng tâm lý bất ổn định khiến việc sơ cứu trở nên khó khăn dẫn đến những trƣờng hợp đáng tiếc. Ở Việt Nam, theo một nghiên cứu khảo sát ở Bệnh viện Việt Đức Hà Nội, khi phân tích hơn 324.000 bệnh án của bệnh nhân nhập viện từ năm 1990 đến 2002, các nghiên cứu viên nhận ra rằng bệnh nhân đƣợc sơ cấp cứu rất thấp (khoảng 5 - 10%), trong đó chỉ khoảng 50% số trƣờng hợp sơ cứu thành công. Hiện nay, các phƣơng pháp cầm máu tại chỗ thƣờng là các phƣơng pháp vật lý nhƣ băng chèn, băng ép, đặt garo - đòi hỏi phải có dụng cụ phù hợp và ngƣời sơ cứu phải có kĩ năng chuẩn, thao tác nhanh, chính xác.
Tuy nhiên, đa số ngƣời dân đều chƣa đƣợc trang bị những kĩ năng trên, hoặc chƣa có ý thức tự tìm hiểu nên hiệu quả của những phƣơng pháp trên đôi khi không cao, dẫn đến rất nhiều trƣờng hợp đáng tiếc đã xảy ra. Vì vậy, có một phƣơng pháp sơ cứu cầm máu đơn giản, hiệu quả nhanh là một nhu cầu cấp thiết. Thrombin là yếu tố có vai trò rất quan trọng trong sinh lý đông máu cũng nhƣ các tình trạng bệnh lý. Thrombin sau khi đƣợc hình thành đã chuyển fibrinogen thành fibrin đơn phân.
Các fibrin đơn phân tự trùng hợp thành fibrin ở dạng sợi, một mạng lƣới fibrin đƣợc hình thành. Giai đoạn này cũng có sự tham gia của ion Ca2+ các tế bào máu đƣợc giữ lại trên lƣới fibrin và tạo nên cục máu đông. Chính mạng lƣới này dính vào vị trí tổn thƣơng của thành mạch để ngăn cản sự chảy máu. Bản chất của máu đông là hình thành lƣới fibrin từ fibrinogen nhờ thrombin.
Chính vì những ứng dụng tiềm năng lớn của thrombin, do vậy chúng tôi tiến hành đề tài : “Nghiên cứu tách chiết thrombin từ phổi bò ứng dụng làm nguyên liệu tạo băng gạc cầm máu nhanh vết thƣơng”. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn c Luận văn Tốt nghiệp khóa K17 – 2015 Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật 2. Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu quy trình tách chiết thrombin từ phổi bò, các điều kiện tinh sạch thrombin , đánh giá ảnh hƣởng của một số chất an định lên hoạt tính của thrombin đƣợc tách chiết. Nội dung nghiên cứu - Thu thập, đánh giá, xây dựng nguồn nguyên liệu: Khảo sát hoạt tính của thrombin ở một số mẫu phổi bò đƣợc thu thập ở các vùng khác nhau.
- Tách chiết, tinh sạch thrombin từ phổi bò: Đánh giá ảnh hƣởng của một số chất đến quá trình tách chiết thrombin từ phổi bò; Nghiên cứu các điều kiện tách chiết, tinh sạch thrombin từ phổi bò. - Đánh giá ảnh hƣởng của một số chất an định lên hoạt tính của thrombin. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn 12 Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui c Luận văn Tốt nghiệp khóa K17 – 2015 Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CƠ CHẾ CẦM MÁU VÀ CÁC PHƢƠNG PHÁP CẦM MÁU 1. Cơ chế cầm máu Oxy và chất dinh dƣỡng đƣợc phân phối khắp cơ thể thông qua hệ tuần hoàn máu điều này dẫn đến hai thách thức lớn.
Đầu tiên, nếu cơ thể bị tổn thƣơng dẫn đến nhiễm trùng, vi khuẩn và virus sẽ di chuyển một cách nhanh chóng tới khắp mọi nơi mà máu đi. Hệ thống miễn dịch, kháng thể của cơ thể sẽ đối phó với vấn đề này. Thứ hai, máu đƣợc bơm khắp cơ thể dƣới áp lực, bất kỳ rò rỉ nhỏ nào ở hệ tuần hoàn máu đều có thể dẫn đến sự thất thoát lớn lƣợng máu của cơ thể. Tuy nhiên, máu mang một hệ thống sửa chữa khẩn cấp: hệ thống đông máu.
Khi chúng ta bị cắt hoặc bị thƣơng, máu của chúng ta xây dựng một hệ thống tạm thời để ngăn chặn những thiệt hại, tạo thời gian cho các mô xung quanh xây dựng một hệ thống sửa chữa lâu dài hơn. Sự đông máu là một quá trình phức tạp qua đó tạo ra các cục máu đông. Đông máu là một cơ chế quan trọng trong quá trình cầm máu. Khi thành mạch máu bị tổn thƣơng, máu đƣợc cầm nhờ chỗ tổn thƣơng đƣợc che phủ bởi cục máu đông chứa tiểu cầu và sợi huyết.
Rối loạn đông máu có thể làm tăng nguy cơ chảy máu hoặc tạo cục máu đông và huyết tắc. Đông máu là một quá trình máu chuyển từ thể lỏng thành thể đặc do chuyển fibrinogen thành fibrin không hòa tan và các sợi fibrin này bị trùng hợp tạo thành mạng lƣới giam giữ các thành phần của máu làm máu đông lại. Bình thƣờng, trong máu và trong các mô có các chất gây đông và chất chống đông, nhƣng các chất gây đông ở dạng tiền chất, không có hoạt tính. Khi mạch máu bị tổn thƣơng sẽ hoạt hóa các yếu tố đông máu theo kiểu dây truyền làm cho máu đông lại.
Các yếu tố đông máu Bảng 1. Các yếu tố đông máu: Ký Phụ thuộc hiệu Tên thƣờng dùng Nơi cƣ trú vitamin K I Fibrinogen Trong huyết tƣơng Không II Prothrombin Trong huyết tƣơng Có Yếu tố tổ chức, Trong tổ chức (thành III thromboplastin mạch) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn 13 Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui c Luận văn Tốt nghiệp khóa K17 – 2015 Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật IV Ion Canxi Trong huyết tƣơng Proaccelerin, Plasma V accelerator globulin Trong huyết tƣơng Không VII Proconvertin Trong huyết tƣơng Có Yếu tố chống Hemophilie VIII A Trong huyết tƣơng Không Yếu tố chống Hemophilie IX B, yếu tố Chrismas Trong huyết tƣơng Có X Yếu tố Stuart Trong huyết tƣơng Có Yếu tố chống Hemophilie C, plasma thromboplastin XI antecedent Trong huyết tƣơng Không Yếu tố Hageman, yếu tố XII tiếp xúc Trong huyết tƣơng Không XIII Yếu tố ổn định sợi huyết Trong tiểu cầu Không 1. Các giai đoạn của cầm máu Cầm máu có tính chất sinh mạng, nếu quá trình cầm máu có rối loạn (tăng đông hoặc giảm đông) và mất kiểm soát thì đều có nguy cơ cao gây tử vong. Quá trình cầm máu gồm 4 giai đoạn: 1.
Co mạch tại chỗ Khi thành mạch bị tổn thƣơng, mạch máu lập tức co lại để làm giảm lƣu lƣợng máu và hạn chế sự mất máu. Co mạch là do sự co thắt của cơ trơn trong thành mạch tại chỗ và do các phản xạ giao cảm. Trong các mạch máu nhỏ, co mạch đƣợc duy trì nhờ sự giải phóng các chất gây co mạch do các tiểu cầu bắt đầu kết tụ lại ở vị trí tổn thƣơng và giải phóng ra. Một trong những chất đó là serotonin.
Co mạch tại chỗ làm hạn chế lƣợng máu chảy và tạo điều kiện hình thành nút tiểu cầu. Tạo nút tiểu cầu Các tế bào tổn thƣơng của thành mạch giải phóng ra ADP. ADP hấp dẫn tiểu cầu đến tiếp xúc với các sợi collagen đƣợc bộc lộ ở thành mạch. Các tiểu cầu trở nên hoạt hoá và khử hạt, giải phóng ADP, serotonin và những yếu tố tiểu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn 14 Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui c Luận văn Tốt nghiệp khóa K17 – 2015 Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật cầu cần cho sự đông máu.
Sự giải phóng ADP của tiểu cầu hấp dẫn thêm các tiểu cầu khác, làm chúng phồng lên và trở nên kết dính (tiểu cầu hoạt hoá). Một số lớn tiểu cầu kết tụ ở chỗ tổn thƣơng tạo thành nút tiểu cầu để bịt miệng vết thƣơng và tạo ra một bộ khung cho cục máu đông hình thành. Các tiểu cầu hoạt hoá cũng giải phóng ra thromboxan A2, một chất gây co mạch rất mạnh và prostaglandin H2, một chất kết tụ tiểu cầu. Khi nút tiểu cầu đƣợc tạo ra máu sẽ ngừng chảy đối với những tổn thƣơng nhỏ và tạo điều kiện để hình thành cục máu đông.
Tạo cục máu đông Đông máu phát triển trong vòng 15 đến 20 giây nếu là tổn thƣơng nặng và trong 1 đến 2 phút nếu là tổn thƣơng nhẹ. Đây là là một chuỗi các phản ứng hoá học của các yếu tố đông máu có trong huyết tƣơng, có trong mô tổn thƣơng và đặc biệt quan trọng là tiểu cầu. Những chất hoá học do thành mạch bị tổn thƣơng và do tiểu cầu giải phóng ra sẽ cùng với các yếu tố đông máu trong huyết tƣơng khởi động quá trình đông máu. Nếu vết thƣơng không quá rộng, trong vòng 3 đến 6 phút, cục máu đông sẽ bịt kín chỗ tổn thƣơng một cách vững chắc.
Tạo cục máu đông là một chuỗi các phản ứng phức tạp, gồm nhiều giai đoạn, về cơ bản có thể chia làm 3 giai đoạn chính: (1) Tạo prothombinase Giai đoạn này bắt đầu khi máu tiếp xúc với mô tổn thƣơng (đông máu ngoại sinh) hoặc đƣợc khởi động khi không có tổn thƣơng mô (đông máu nội sinh). - Đông máu ngoại sinh (extrinsic pathway): Khi máu tiếp xúc với mô tổn thƣơng, yếu tố III của mô đƣợc giải phóng ra sẽ tƣơng tác với yếu tố VII có trong huyết tƣơng và ion calci tạo thành một tác nhân hoạt hoá yếu tố X. Yếu tố X hoạt hoá (Xh) với sự có mặt của ion calci, tƣơng tác với yếu tố V trên các hạt mixen phospholipid của mô tạo ra phức hợp protrombinase. - Đông máu nội sinh (intrinsic pathway): Có thể xảy ra bên trong hoặc bên ngoài cơ thể với bƣớc đầu tiên là sự hoạt hoá của yếu tố XII.
Trong cơ thể, sự hoạt hoá của yếu tố XII xảy ra khi tiếp xúc với collagen, fibrin, màng tiểu cầu trong quá trình kết tụ tiểu cầu. Yếu tố XII cũng có thể đƣợc hoạt hoá trong một số trạng thái nhƣ stress, lo lắng, sợ hãi…Ở bên ngoài cơ thể (trong ống nghiệm) yếu tố XII đƣợc hoạt hoá khi máu tiếp xúc với bề mặt lạ. Yếu tố XIIh xúc tác cho sự hoạt hoá của yếu tố XI.