HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ VI KHUẨN VÀ ĐÁNH GIÁ HÀM LƢỢNG POLYPHENOL, HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HÓA CỦA DƢỢC LIỆU NGƢU TẤT, HOA NGŨ SẮC Ngƣời thực hiện : Phạm Thị Thoan Mã sinh viên : 637077 Lớp : K63CNSHA Khoa : Công nghệ sinh học Ngƣời hƣớng dẫn : PGS. Nguyễn Thanh Hải : TS. Nguyễn Thị Thanh Hà HÀ NỘI - 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu, hình ảnh và kết quả trong báo cáo này là trung thực, khách quan và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ một công trình khoa học nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận tốt nghiệp đã đƣợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn, tài liệu tham khảo đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc trong danh mục tài liệu tham khảo của khóa luận.
Hà Nội, ngày … tháng … năm 2021 Sinh viên Phạm Thị Thoan i LỜI CẢM ƠN Quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp và một trong những giai đoạn quan trọng và ý nghĩa nhất của thời sinh viên. Trong quá trình hoàn thành luận văn tốt nghiệp của mình em đã đƣợc tiếp thu những kỹ năng nghiên cứu và những kiến thức quý báu trƣớc khi lập nghiệp. Để đạt đƣợc kết quả này, em xin phép đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến mọi ngƣời đã giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập tại trƣờng. Em xin phép gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới Ban giám đốc, các phòng ban của Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Khoa Công nghệ sinh học, các thầy cô đã tận tình giảng dạy và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý thầy cô hƣớng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thanh Hải và TS Nguyễn Thị Thanh Hà, ngƣời đã truyền đạt những vốn kiến thức quý báu, tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ em trong thời gian nghiên cứu và hoàn thành khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn bạn bè, các anh chị cũng nhƣ gia đình đã động viên, quan tâm, giúp đỡ hỗ trợ và tạo mọi điều kiện để em hoàn thành khóa luận tốt nhất. Vì kiến thức, kinh nghiệm cũng nhƣ trình độ lý luận của em còn hạn chế nên bài luận án tốt nghiệp không tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận đƣợc những ý kiến đóng góp của quý thầy cô để em học hỏi nhiều hơn về những kiến thức chuyên môn và hoàn thiện bài báo cáo khóa luận sắp tới. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Phạm Thị Thoan ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN.
ii MỤC LỤC. iii DANH MỤC BẢNG. v DANH MỤC HÌNH ẢNH. vii DANH MỤC ĐỒ THỊ.
x TÓM TẮT KHÓA LUẬN. Mục đích và yêu cầu. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Nghiên cứu và phát triển thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên.
Thành phần hóa học của cây Ngƣu Tất. Công dụng của cây và dịch chiết Ngƣu Tất. Hoa Ngũ Sắc. Đặc điểm thực vật của Hoa Ngũ Sắc.
Thành phần hóa học trong cây hoa Ngũ Sắc. Công dụng của cây Hoa Ngũ Sắc. Tổng quan về polyphenol. Phân loại polyphenol.
Vai trò của polyphenol. Hoạt tính chống oxy hóa. Sơ lƣợc về gốc tự do. Tổng quan về hoạt tính chống oxi hoá.
Một số quá trình chống oxi hoá của hợp chất polyphenol. Tổng quan về các chủng vi khuẩn sử dụng. Một số nghiên cứu về Hoa Ngũ Sắc và Ngƣu Tất trên thế giới và trong nƣớc. Một số nghiên cứu về Ngƣu Tất.
Một số nghiên cứu về dƣợc liệu Hoa Ngũ Sắc. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Vật liệu nghiên cứu. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.
Đối tƣợng nghiên cứu. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị. Nội dung nghiên cứu. Phƣơng pháp nghiên cứu.
Phƣơng pháp chiết xuất dƣợc liệu. Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết dƣợc liệu trên vi khuẩn. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng polyphenol. Phƣơng pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa.
Phƣơng pháp xử lý số liệu. 37 IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. Xác định đƣờng kính vòng vô khuẩn của các dịch chiết dƣợc liệu Hoa Ngũ Sắc và Ngƣu Tất theo phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Xác định đƣờng kính vòng vô khuẩn của các dịch chiết dƣợc liệu Ngƣu Tất theo phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch.
Xác định đƣờng kính vòng vô khuẩn của các dịch chiết dƣợc liệu Hoa Ngũ Sắc theo phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Kết quả xác định đƣờng kính vòng vô khuẩn của tinh dầu Hoa Ngũ Sắc theo phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch và phƣơng pháp xông hơi. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các dƣợc liệu. Xác định hàm lƣợng polyphenol của các dƣợc liệu.
TÀI LIỆU THAM KHẢO. 59 v DANH MỤC BẢNG Bảng 2. 1: Các thành phần hóa học trong lá, thân, rễ và Hoa Ngũ Sắc. 1: Kết quả xác định đƣờng kính vòng vô khuẩn(mm)của các dịch chiết Ngƣu Tất trên 6 chủng vi khuẩn.
Kết quả xác định đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm) của các dịch chiết dƣợc liệu Hoa Ngũ Sắc trên 3 chủng vi khuẩn. 3: Hoạt tính chống oxi hoá của chất chuẩn VTME xác định theo phƣơng pháp DPPH tạo các nồng độ khác nhau ( AA%). 4: Hoạt tính chống oxi hoá quy đổi về VTME (mg) của dƣợc liệu Hoa Ngũ Sắc và Ngƣu Tất. 5: Sự thay đổi giá trị OD Values theo nồng độ chất chuẩn acid chlorogenic (mg/ml).
6: Hàm lƣợng polyphenol tổng số quy đổi theo mg acid chlorogenic/ 100mg dƣợc liệu khô của dƣợc liệu Ngƣu Tất và Hoa Ngũ Sắc. 51 vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2. 1: Hình ảnh Ngƣu Tất. 2: Cấu trúc hóa học Niuxixinsterone D.3: Cây hoa ngũ sắc.
4: Cấu trúc của Flavnoid. 5: Phân loại các hợp chất polyphenol. 6:Công thức cấu tạo của hai axit axit hydroxybenzoic và hydroxycinnamic. 7: Hình ảnh mô phỏng quá trình hình thành gốc tự đo.
8: Sơ đồ các cơ chế chống oxy hóa. 1: Hình ảnh dƣợc liệu đã đƣợc nghiền thành bột mịn. Hình A là hình ảnh bột mịn của dƣợc liệu Ngƣu Tất. Hình B là hình ảnh bột mịn của dƣợc liệu hoa Ngũ Sắc.
2: Quá trình chuyển dƣợc liệu vào ống falcon 15ml. 3: Máy cô quay chân không RE-501 Rotary evaporator. 4: Dƣợc liệu sau khi cô cao và pha loãng trong ống eppendorf 1,5ml bảo quản trong tủ lạnh. 5: Tinh dầu hoa Ngũ Sắc thu đƣợc sau phân ly.
6: Sơ đồ mô tả phƣơng pháp trộn khuẩn. 7: Đƣờng kính vòng vô khuẩn tạo ra bởi dịch chiết dƣợc liệu trên sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trƣờng thạch Muller Hinton. 8: Dụng cụ đục lỗ có đƣờng kính 10mm. 9: Máy đo đƣờng kính vòng vô khuẩn.
10: Vùng ức chế có đƣờng kính không xác định của Edwards-Jones và cộng sự (2004). 11: Hình đĩa khuẩn sau 24h nuôi cấy ở nhiệt độ 37°C bằng phƣơng pháp xông hơi của tinh dầu hoa Ngũ Sắc. 12: Hình ảnh đĩa khuẩn sau 24h nuôi cấy ở nhiệt độ 37°C bằng phƣơng pháp khuếch tán của tinh dầu hoa Ngũ Sắc. 13: Cơ chế của phản ứng chuyển màu trong xác định hàm lƣợng polyphenol tổng số, sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteu's phenol reagent.
15: Cơ chế phản ứng của DPPH với chất chống oxy hóa. 1: Hình ảnh đối chứng là DMSO không tạo vòng vô khuẩn trên đĩa thạch chứng minh khả năng không độc và không ảnh hƣởng đến sự phát triển của vi khuẩn ( A). Nhỏ dung dịch DMSO có độ pH lần lƣợt 3, 4, 5, 12, 13; vi khuẩn E. coli ATCC 35218 vẫn mọc bình thƣờng quanh giếng nhỏ DMSO (B).
2: Kích thƣớc đƣờng kính vòng vô khuẩn của dƣợc liệu Ngƣu Tất trên 2 chủng vi khuẩn B. subtilis và Sal (Salmonella ATCC 13311). Hình bên trái là kết quả đƣờng kính vòng vô khuẩn của dịch chiết methanol trên chủng vi khuẩn B. subtilis ở 4 nồng độ 2g/ml, 1g/ml, 0.
Hình phải là kết quả đƣờng kính vòng vô khuẩn của dịch chiết ethanol trên chủng vi khuẩn Sal (Salmonella ATCC 13311) ở 4 nồng độ 2g/ml, 1g/ml, 0. 3: : Kết quả đƣờng kính vòng vô khuẩn Hoa Ngũ Sắc ở hai dịch chiết methanol và hexan trên vi khuẩn B.subtilis ở 4 nồng độ 2g/ml, 1g/ml, 0. 4: Hình ảnh đối chứng ethyl acetate không tạo vòng vô khuẩn trên đĩa thạch chứng minh khả năng không độc và không ảnh hƣởng đến sự phát triển của vi khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 25923 theo hai phƣơng pháp khuếch tán ( A) và xông hơi (B). 5: Các cuvet thể hiện sự thay đổi màu sắc của dung dịch DPPH tạo ra bởi hoạt tính chống oxi hóa của VTME (chất chuẩn) tại các nồng độ khác nhau (từ trái sang: Control, VTME 0,1 mg/ml; 0,15 mg/ml; 0,2 mg/ml; 0,25 mg/ml; 0,3 mg/ml; 0,35 mg/ml).
6: Các cuvet thể hiện sự thay đổi màu sắc của dung dịch DPPH tạo ra bởi dung môi dƣợc liệu Ngƣu Tất ở 4 dung môi tại nồng độ 40mg/ml. 7: Các cuvet cho thấy sự thay đổi màu sắc của dung dịch DPPH tạo ra bởi dung môi acetone, ethanol, hexan, ethyl acetate của dƣợc liệu Hoa Ngũ Sắc tại các nồng nồng độ khác nhau. 8: Hoạt tính chống oxi hoá tổng số của dƣợc liệu Ngƣu Tất và Hoa Ngũ Sắc quy đổi theo hàm lƣợng VTME (mg/100mg dƣợc liệu ). 9: So sánh hàm lƣợng polyphenol (quy đổi theo mg acid chlorogenic/ 100 mg dƣợc liệu) của dƣợc liệu Ngƣu Tất, Hoa Ngũ Sắc.
52 ix DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị 4. 1: Mối tƣơng quan của nồng độ của VTME (mg/ml) với mức độ gia tăng giá trị đo mật độ quang (OD value). 2: Mối tƣơng quan giữa hàm lƣợng chất chuẩn acid chlorogenic (mg/ml) với mức độ gia tăng giá trị đo mật độ quang (OD value). 50 x DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Viết đầy đủ ATCC American Type Culture Collection B.subtilis Bacillus subtilis DMSO Dimethyl Sulfoxide DPPH 1,1-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl E.coli Eschrichia Coli G.philus Geobacillus stearothermophilus P.seudo Pseudomonas aeruginosa S.aureus Staphylococcus aureus VTME Vitamin E Sal Salmonella ATCC 13311 NT Ngƣu Tất HNS Hoa Ngũ Sắc DW Nƣớc nóng xi TÓM TẮT KHÓA LUẬN - Sử dụng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch để xác định khả năng ức chế sự phát triển của các dịch chiết trên các chủng vi khuẩn: Escheria coli (E.
coli ATCC 35218; Staphylococcus aureus (S. aureus ATCC 25023; Pseudomonas aeruginosa (P. Aeruginosa) ATCC 9027; Bacillus subtilis (B. subtilis) ATCC 7953; Geobacillus stearothermophilus (G.
Stearothermophilus) ATCC 7953, Salmonella ATCC 13311. Qua nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của các dịch chiết dƣợc liệu Ngƣu Tất và Hoa Ngũ Sắc cho thấy đƣợc khả năng ức chế trên các chủng vi khuẩn: S. seudo ATCC 9027, Salmonella ATCC 13311. Ở dƣợc liệu Ngƣu Tất tại dung môi methanol trên vi khuẩn G.