Nghiên cứu tác dụng ức chế vi khuẩn và đánh giá hàm lượng polyphenol hoạt tính chống oxi hóa của dược liệu ngưu tất hoa ngũ sắc khóa luận tốt nghiệp

Nghiên cứu tác dụng ức chế vi khuẩn và hàm lượng polyphenol chống oxi hóa trong dược liệu ngưu tất hoa ngũ sắc, ứng dụng tiềm năng trong y học.

• Tác giả: Phạm Thị Thoan
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thanh Hải
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu tác dụng ức chế vi khuẩn và đánh giá hàm lượng polyphenol, hoạt tính chống oxy hóa của dược liệu Ngưu Tất, Hoa Ngũ Sắc
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 2. DANH MỤC BẢNG
• 3. DANH MỤC HÌNH ẢNH
• 4. DANH MỤC ĐỒ THỊ
• 5. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• 6. TÓM TẮT KHÓA LUẬN
• 7. MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU
• 8. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 8.1. Nghiên cứu và phát triển thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên
• 8.2. Thành phần hóa học của cây Ngƣu Tất
• 8.3. Công dụng của cây và dịch chiết Ngƣu Tất
• 8.4. Hoa Ngũ Sắc
• 8.5. Đặc điểm thực vật của Hoa Ngũ Sắc
• 8.6. Thành phần hóa học trong cây hoa Ngũ Sắc
• 8.7. Công dụng của cây Hoa Ngũ Sắc
• 8.8. Tổng quan về polyphenol
• 8.9. Phân loại polyphenol
• 8.10. Vai trò của polyphenol
• 8.11. Hoạt tính chống oxy hóa
• 8.12. Sơ lƣợc về gốc tự do
• 8.13. Tổng quan về hoạt tính chống oxi hoá
• 8.14. Một số quá trình chống oxi hoá của hợp chất polyphenol
• 8.15. Tổng quan về các chủng vi khuẩn sử dụng
• 8.16. Một số nghiên cứu về Hoa Ngũ Sắc và Ngƣu Tất trên thế giới và trong nƣớc
• 8.16.1. Một số nghiên cứu về Ngƣu Tất
• 8.16.2. Một số nghiên cứu về dƣợc liệu Hoa Ngũ Sắc
• 9. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 9.1. Vật liệu nghiên cứu
• 9.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 9.3. Đối tƣợng nghiên cứu
• 9.4. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
• 9.5. Nội dung nghiên cứu
• 9.6. Phƣơng pháp nghiên cứu
• 9.6.1. Phƣơng pháp chiết xuất dƣợc liệu
• 9.6.2. Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết dƣợc liệu trên vi khuẩn
• 9.6.3. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng polyphenol
• 9.6.4. Phƣơng pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa
• 9.6.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu
• 10. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 10.1. Xác định đƣờng kính vòng vô khuẩn của các dịch chiết dƣợc liệu Hoa Ngũ Sắc và Ngƣu Tất theo phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch
• 10.2. Xác định đƣờng kính vòng vô khuẩn của các dịch chiết dƣợc liệu Ngƣu Tất theo phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch
• 10.3. Xác định đƣờng kính vòng vô khuẩn của các dịch chiết dƣợc liệu Hoa Ngũ Sắc theo phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch
• 10.4. Kết quả xác định đƣờng kính vòng vô khuẩn của tinh dầu Hoa Ngũ Sắc theo phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch và phƣơng pháp xông hơi
• 10.5. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các dƣợc liệu
• 10.6. Xác định hàm lƣợng polyphenol của các dƣợc liệu
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về nghiên cứu

Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá tác dụng ức chế vi khuẩn và hàm lượng polyphenol chống oxy hóa trong hai loại dược liệu Ngưu Tất và Hoa Ngũ Sắc. Mục tiêu chính là xác định khả năng kháng khuẩn của các dịch chiết từ hai loại dược liệu này, đồng thời đo lường hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa. Nghiên cứu sử dụng các phương pháp khoa học hiện đại như khuếch tán trên đĩa thạch, phương pháp Folin-Ciocalteu, và DPPH để đánh giá các chỉ số. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc ứng dụng các dược liệu tự nhiên vào y học và thực phẩm chức năng.

1.1. Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu nhằm xác định khả năng ức chế vi khuẩn của dịch chiết từ Ngưu Tất và Hoa Ngũ Sắc trên các chủng vi khuẩn phổ biến như E. coli, S. aureus, và B. subtilis. Đồng thời, nghiên cứu cũng đo lường hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa của các dịch chiết này. Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần vào việc phát triển các sản phẩm từ dược liệu tự nhiên có khả năng kháng khuẩn và chống oxy hóa.

1.2. Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc ứng dụng các dược liệu tự nhiên vào y học và thực phẩm chức năng. Ngưu Tất và Hoa Ngũ Sắc là hai loại dược liệu phổ biến trong y học cổ truyền, và việc chứng minh được tác dụng kháng khuẩn và chống oxy hóa của chúng sẽ mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các sản phẩm từ thiên nhiên.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp khoa học hiện đại để đánh giá tác dụng ức chế vi khuẩn và hàm lượng polyphenol chống oxy hóa trong Ngưu Tất và Hoa Ngũ Sắc. Các phương pháp bao gồm khuếch tán trên đĩa thạch để xác định khả năng kháng khuẩn, phương pháp Folin-Ciocalteu để đo lường hàm lượng polyphenol, và phương pháp DPPH để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa. Các kết quả được phân tích và so sánh để đưa ra kết luận chính xác.

2.1. Phương pháp chiết xuất dược liệu

Các dịch chiết từ Ngưu Tất và Hoa Ngũ Sắc được thực hiện bằng cách sử dụng các dung môi khác nhau như methanol, ethanol, và hexan. Quá trình chiết xuất được thực hiện trong điều kiện kiểm soát để đảm bảo chất lượng và hiệu quả của dịch chiết.

2.2. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn

Khả năng ức chế vi khuẩn của các dịch chiết được đánh giá thông qua phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Các chủng vi khuẩn được sử dụng bao gồm E. coli, S. aureus, và B. subtilis. Đường kính vòng vô khuẩn được đo để xác định hiệu quả kháng khuẩn của các dịch chiết.

2.3. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol

Hàm lượng polyphenol trong các dịch chiết được xác định bằng phương pháp Folin-Ciocalteu. Phương pháp này dựa trên phản ứng giữa polyphenol và thuốc thử Folin-Ciocalteu, tạo ra màu xanh có thể đo được bằng máy quang phổ.

2.4. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa

Hoạt tính chống oxy hóa của các dịch chiết được đánh giá bằng phương pháp DPPH. Phương pháp này dựa trên khả năng của các chất chống oxy hóa trong việc khử gốc tự do DPPH, tạo ra sự thay đổi màu sắc có thể đo được.

III. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy các dịch chiết từ Ngưu Tất và Hoa Ngũ Sắc có khả năng ức chế vi khuẩn đáng kể trên các chủng vi khuẩn được thử nghiệm. Đặc biệt, dịch chiết từ Ngưu Tất bằng methanol cho thấy hiệu quả kháng khuẩn cao nhất trên chủng B. subtilis. Hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa của các dịch chiết cũng được xác định, với kết quả cho thấy các dịch chiết từ Hoa Ngũ Sắc có hàm lượng polyphenol cao hơn so với Ngưu Tất. Các kết quả này mở ra tiềm năng ứng dụng của hai loại dược liệu này trong y học và thực phẩm chức năng.

3.1. Khả năng ức chế vi khuẩn

Các dịch chiết từ Ngưu Tất và Hoa Ngũ Sắc cho thấy khả năng ức chế vi khuẩn đáng kể trên các chủng vi khuẩn được thử nghiệm. Đặc biệt, dịch chiết từ Ngưu Tất bằng methanol cho thấy hiệu quả kháng khuẩn cao nhất trên chủng B. subtilis, với đường kính vòng vô khuẩn lớn nhất là 14mm.

3.2. Hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa

Hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa của các dịch chiết được xác định bằng phương pháp Folin-Ciocalteu và DPPH. Kết quả cho thấy các dịch chiết từ Hoa Ngũ Sắc có hàm lượng polyphenol cao hơn so với Ngưu Tất, đồng thời cũng thể hiện hoạt tính chống oxy hóa mạnh hơn.

IV. Kết luận và ứng dụng

Nghiên cứu đã chứng minh được tác dụng ức chế vi khuẩn và hàm lượng polyphenol chống oxy hóa trong Ngưu Tất và Hoa Ngũ Sắc. Các kết quả này mở ra tiềm năng ứng dụng của hai loại dược liệu này trong y học và thực phẩm chức năng. Ngưu Tất và Hoa Ngũ Sắc có thể được sử dụng để phát triển các sản phẩm kháng khuẩn và chống oxy hóa tự nhiên, góp phần vào việc bảo vệ sức khỏe con người.

4.1. Tiềm năng ứng dụng trong y học

Các kết quả nghiên cứu cho thấy Ngưu Tất và Hoa Ngũ Sắc có tiềm năng lớn trong việc phát triển các sản phẩm y học, đặc biệt là các sản phẩm kháng khuẩn và chống oxy hóa tự nhiên. Các sản phẩm này có thể được sử dụng để điều trị các bệnh do vi khuẩn gây ra và ngăn ngừa các bệnh liên quan đến stress oxy hóa.

4.2. Tiềm năng ứng dụng trong thực phẩm chức năng

Với hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa cao, Ngưu Tất và Hoa Ngũ Sắc có thể được sử dụng để phát triển các sản phẩm thực phẩm chức năng. Các sản phẩm này có thể giúp cải thiện sức khỏe, tăng cường miễn dịch, và ngăn ngừa các bệnh mãn tính.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong bối cảnh y học hiện đại và ngành chăn nuôi công nghiệp đang phải đối mặt với thực trạng gia tăng tỷ lệ đề kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh, việc lạm dụng kháng sinh tổng hợp đã dẫn đến nhiều hệ lụy nghiêm trọng như tích tụ tồn dư kháng sinh trong thực phẩm (thịt, trứng, sữa) và làm xuất hiện các chủng vi sinh vật kháng đa thuốc. Xu hướng nghiên cứu, tìm kiếm và phát triển các hoạt chất kháng sinh cùng các hợp chất có hoạt tính sinh học từ tự nhiên ngày càng được chú trọng nhờ những ưu điểm: phổ tác dụng sinh học phù hợp với sinh lý cơ thể, ít gây phản ứng phụ, không để lại tồn dư độc hại và chi phí hợp lý.

Ngưu Tất (Achyranthes bidentata Blume) và Hoa Ngũ Sắc (Ageratum conyzoides L.) là hai loài cây thuốc quen thuộc trong y học cổ truyền Việt Nam, vốn được ứng dụng rộng rãi trong các bài thuốc tiêu viêm, sát trùng, giải độc và chữa các bệnh lý nhiễm khuẩn đường hô hấp, tiết niệu hay xương khớp. Các nghiên cứu hóa thực vật hiện đại cho thấy hai dược liệu này chứa hàm lượng dồi dào các hợp chất polyphenol – nhóm chất chuyển hóa thứ cấp có khả năng kháng khuẩn tự nhiên và chống oxy hóa mạnh mẽ, đóng vai trò quan trọng trong việc dập tắt các gốc tự do (ROS) gây tổn thương tế bào. Xuất phát từ thực tiễn trên, đề tài khóa luận "Nghiên cứu tác dụng ức chế vi khuẩn và đánh giá hàm lượng polyphenol, hoạt tính chống oxy hóa của dược liệu Ngưu Tất, Hoa Ngũ Sắc" đã được thực hiện.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài được tác giả xác định cụ thể như sau:

1. Xác định khả năng ức chế sự phát triển của dịch chiết dược liệu Ngưu Tất và Hoa Ngũ Sắc trên các chủng vi khuẩn kiểm định.
2. Xác định khả năng ức chế vi khuẩn của tinh dầu Hoa Ngũ Sắc thông qua phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch và phương pháp xông hơi.
3. Khảo sát, định lượng hàm lượng polyphenol tổng số và đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn dịch chiết từ dược liệu Ngưu Tất và Hoa Ngũ Sắc trong các hệ dung môi khác nhau.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Dược liệu rễ Ngưu Tất (Achyranthes bidentata Blume) và toàn cây Hoa Ngũ Sắc (Ageratum conyzoides L.) đã qua sơ chế khô, thu mua từ Công ty Dược liệu cổ truyền Bình An (làng Nghĩa Trai, xã Tân Quang, huyện Văn Lâm, tỉnh Hưng Yên).
• Vi sinh vật kiểm định: Các chủng vi khuẩn chuẩn do Viện Công nghệ sinh học cung cấp, bao gồm Escherichia coli ATCC 35218, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Bacillus subtilis ATCC 7953, Geobacillus stearothermophilus ATCC 7953 và Salmonella ATCC 13311.
• Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 09/2021 đến tháng 04/2022.
• Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Bộ môn Nội - Chẩn - Dược - Độc chất, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận được xây dựng trên nền tảng lý thuyết sinh hóa thực vật học và vi sinh vật học thực nghiệm. Về mặt hóa thực vật, rễ Ngưu Tất chứa các nhóm chất chuyển hóa chính bao gồm polysaccharide, saponin triterpenoid, ketosteroid, flavonoid, sterol, alkaloid cùng các phytoecdysteroid đặc trưng như Niuxixinsterone D, inokosterone và các isoflavonoid glycoside (Achyranthosides A và B). Đối với cây Hoa Ngũ Sắc (họ Cúc - Asteraceae), thành phần hoạt chất tập trung ở các nhóm flavonoid methoxy hóa, chromenes, benzofurans, terpenoids và tinh dầu (chiếm 0,7–2% sinh khối khô, với các cấu tử chủ đạo là ageratochromene/precocene II, precocene I và β-caryophyllene).

Về mặt lý thuyết chống oxy hóa và kháng khuẩn, nhóm polyphenol (bao gồm axit phenolic, flavonoid, stilbenes, lignans, tannins) có cấu trúc đặc trưng chứa vòng benzen liên kết với các nhóm hydroxyl tự do. Cơ chế ức chế gốc tự do của polyphenol được giải thích qua ba mô hình phản ứng chính:

• Cơ chế chuyển nguyên tử hydro (Hydrogen Atom Transfer - HAT): Dập tắt gốc tự do bằng cách nhượng nguyên tử hydro từ nhóm hydroxyl của polyphenol cho gốc peroxy ($ROO^\bullet + ArOH \rightarrow ROOH + ArO^\bullet$).
• Cơ chế chuyển một electron kèm chuyển proton (Single Electron Transfer followed by Proton Transfer - SET-PT): Phản ứng tách electron tạo cation gốc trước khi phân ly trao đổi proton.
• Cơ chế chuyển proton mất electron (Sequential Proton Loss Electron Transfer - SPLET): Tách proton tạo anion phenolat trước khi chuyển electron dập tắt gốc tự do.

Tác dụng kháng khuẩn của polyphenol được cơ sở hóa dựa trên sự biến đổi tính thấm của màng sinh chất, ức chế các enzyme nội bào, tiêu giảm nồng độ ATP và làm sụt giảm điện thế màng vi khuẩn. Sự khác biệt về cấu trúc thành tế bào giữa vi khuẩn Gram dương (lớp peptidoglycan dày, không có màng ngoài) và vi khuẩn Gram âm (có màng ngoài kỵ nước ngăn cản sự thâm nhập của các hợp chất phân cực) quyết định mức độ nhạy cảm khác nhau của từng chủng đối với dịch chiết thực vật.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được thiết kế đồng bộ theo các quy trình chuẩn hóa:

• Phương pháp chiết xuất cao dược liệu: Bột dược liệu khô nghiền mịn (<0,05 mm) được chiết xuất phân đoạn với 6 dung môi có độ phân cực khác nhau: hexan, ethyl acetate, acetone, ethanol, methanol và nước nóng. Quá trình ngâm chiết với dung môi hữu cơ tiến hành trong bóng tối ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ theo tỷ lệ mẫu/dung môi là 1/30 (10 g bột trong 300 ml dung môi), kết hợp khuấy từ 10 phút. Đối với dung môi nước nóng, mẫu được khuấy sắc với nước cất đun sôi trong 30 phút theo tỷ lệ 1/30. Dịch chiết sau ly tâm (3500 vòng/phút trong 10 phút) và lọc qua giấy lọc được thu hồi dung môi bằng hệ thống máy cô quay chân không RE-501 ở nhiệt độ kiểm soát $\le 45^\circ\text{C}$. Cao chiết đậm đặc được tái hòa tan trong dimethyl sulfoxide (DMSO) tạo nồng độ gốc 2000 mg/ml, sau đó pha loãng thành dải nồng độ khảo sát: 2000, 1000, 500 và 250 mg/ml.
• Phương pháp chiết xuất tinh dầu: Mẫu thân lá Hoa Ngũ Sắc được xay nhỏ, ngâm trong dung dịch NaCl 30% trong 12 giờ rồi tiến hành chưng cất lôi cuốn hơi nước. Nhiệt độ dịch ngưng được kiểm soát trong khoảng 30–40°C để hạn chế bay hơi tinh dầu. Tinh dầu phân ly được pha loãng bằng ethyl acetate vô trùng thành các nồng độ thử nghiệm: 1/2, 1/4, 1/8, 1/10, 1/20, 1/40 và 1/80.
• Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn: Sử dụng kỹ thuật khuếch tán giếng thạch cải tiến từ phương pháp Kirby-Bauer trên môi trường Mueller-Hinton Agar (MHA) đã cấy trộn vi khuẩn đạt mật độ $10^6\text{ cfu/ml}$ (chuẩn hóa từ dung dịch gốc tương đương McFarland 3, $9\times 10^8\text{ cfu/ml}$). Giếng thạch được đục bằng ống đồng vô trùng đường kính $d = 10\text{ mm}$, mỗi giếng nạp $100\ \mu\text{l}$ dịch chiết. Đĩa thạch được giữ lạnh ở $15^\circ\text{C}$ trong 3 giờ để dịch chiết khuếch tán đều vào thạch trước khi chuyển sang tủ ấm $37^\circ\text{C}$ nuôi cấy trong 24 giờ. Đường kính vòng vô khuẩn được xác định bằng máy đo Haloes Caliper - Zone Reader theo công thức: $\text{Đường kính vòng vô khuẩn} = D - d$ (trong đó $D$ là đường kính vùng ức chế tổng, $d = 10\text{ mm}$). Thử nghiệm tinh dầu được thực hiện song song theo hai kỹ thuật: phương pháp xông hơi (đặt đĩa giấy lọc 10 mm tẩm $50\ \mu\text{l}$ tinh dầu vào tâm nắp đĩa Petri, dán kín mép bằng Parafilm) và phương pháp khuếch tán giếng thạch có nắp đậy kín chuyên dụng để loại trừ sai số do bay hơi. DMSO và ethyl acetate được sử dụng làm mẫu đối chứng âm tương ứng.
• Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số: Thực hiện theo quy trình của Suda và cộng sự, sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteu trong môi trường kiềm $\text{Na}_2\text{CO}_3\ 10%$. Phản ứng ủ 60 phút ở nhiệt độ phòng và đo độ hấp thụ quang học (OD) tại bước sóng $\lambda = 750\text{ nm}$ trên máy quang phổ so màu 722. Hàm lượng polyphenol được quy đổi theo đường chuẩn chất đối chiếu acid chlorogenic (Merck) và biểu thị bằng mg acid chlorogenic/100 mg dược liệu khô.
• Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa: Thực hiện theo phương pháp khử gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) của Masuda và cộng sự. Độ giảm mật độ quang của dung dịch DPPH được đo ở bước sóng $\lambda = 515\text{ nm}$. Hoạt tính ức chế gốc tự do được tính theo công thức: $$AA% = \frac{A_c - (A_s - A_b)}{A_c} \times 100$$ (với $A_c$ là OD của ống đối chứng, $A_s$ là OD của ống mẫu, $A_b$ là OD của ống đối chứng âm). Giá trị được quy đổi tương đương sang hàm lượng Vitamin E chuẩn ($\alpha$-Tocopherol, Merck) trên 100 mg dược liệu khô.
• Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê sinh học trên phần mềm Microsoft Excel.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Chương này tập trung tổng thuật các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về dược liệu và hoạt chất sinh học. Tác giả phân tích tình trạng kháng kháng sinh trong y học và chăn nuôi, qua đó nhấn mạnh tiềm năng của thảo dược tự nhiên. Nội dung trình bày chi tiết hình thái thực vật, vùng phân bố, vị trí phân loại học và các nhóm hợp chất hóa thực vật chính của Ngưu Tất (Achyranthes bidentata) và Hoa Ngũ Sắc (Ageratum conyzoides). Các nghiên cứu được trích dẫn làm rõ thành phần hóa học phân bố ở các cơ quan khác nhau của Hoa Ngũ Sắc (Bảng 2.1 trong văn bản cho thấy alkaloid, flavonoid, tannin tập trung hàm lượng cao ở lá, thân, hoa; trong khi saponin, coumarin, terpenoid phân bố phân tán).

Chương 2 cũng hệ thống hóa cơ sở hóa sinh về phân loại polyphenol, cấu trúc khung $C_6-C_3-C_6$ của flavonoid, lý thuyết về các dạng gốc tự do nội sinh/ngoại sinh gây stress oxy hóa và các phản ứng dập tắt gốc tự do (HAT, SET-PT, SPLET). Phần vi sinh học cung cấp đặc điểm sinh học của 6 chủng vi khuẩn khảo nghiệm. Tác giả đối chiếu các nghiên cứu trước đây: nghiên cứu của Janovska và cs. (2003) ghi nhận dịch chiết ethanol của Ngưu Tất không kháng khuẩn, trong khi Ye-seul Lee và cs. chỉ ra phân đoạn hexan và ethyl acetate của Ngưu Tất ức chế được 5/6 chủng vi khuẩn (vòng kháng khuẩn 8–11 mm); nghiên cứu của Choudhury Neelabh và cs. (2017) và Kouame và cs. (2018) ghi nhận dịch chiết methanol và tinh dầu Hoa Ngũ Sắc có hoạt tính trên vi khuẩn Gram dương như S. aureus.

Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 3 trình bày chi tiết phương tiện, vật liệu và thiết kế thực nghiệm tại phòng thí nghiệm Bộ môn Nội - Chẩn - Dược - Độc chất, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Văn bản quy định rõ nguồn gốc nguyên liệu thực vật thu mua từ làng dược liệu Nghĩa Trai (Hưng Yên) và các chủng vi khuẩn ATCC từ Viện Công nghệ sinh học. Các thông số kỹ thuật của trang thiết bị nghiên cứu được liệt kê đầy đủ, bao gồm máy cô quay chân không RE-501, máy so màu quang phổ UV-Vis 722, máy đo vòng vô khuẩn Haloes Caliper, máy ly tâm, máy lắc nhiệt và nồi hấp autoclave.

Chương này mô tả tường tận quy trình công nghệ 8 bước chiết xuất cao dược liệu với 6 hệ dung môi (nước nóng, ethanol, methanol, hexan, acetone, ethyl acetate) và quy trình chưng cất tinh dầu lôi cuốn hơi nước có bổ sung NaCl 30%. Các kỹ thuật vi sinh được chuẩn hóa tỉ mỉ: quy trình pha loãng mẫu bằng dung môi trơ DMSO, phương pháp trộn khuẩn trong thạch MHA nguội ở 45°C để đạt mật độ $10^6\text{ cfu/ml}$, thời gian ủ lạnh 3 giờ ở 15°C giúp hoạt chất khuếch tán đồng đều trước khi nuôi ủ ở 37°C. Đặc biệt, tác giả cải tiến kỹ thuật thử tinh dầu: cố định giấy tẩm tinh dầu ở tâm nắp đĩa Petri để tạo vùng ức chế tròn đồng tâm trong phương pháp xông hơi, đồng thời dùng ống khâu có nắp đậy chuyên dụng trong phương pháp khuếch tán để loại trừ hoàn toàn ảnh hưởng của sự bay hơi tinh dầu lên mặt thạch. Hai quy trình trắc quang định lượng polyphenol (thuốc thử Folin-Ciocalteu, bước sóng 750 nm, chất chuẩn acid chlorogenic) và đánh giá hoạt tính chống oxy hóa (thuốc thử DPPH, bước sóng 515 nm, chất chuẩn Vitamin E) cũng được văn bản hóa cụ thể với công thức tính toán và số lần lặp lại thí nghiệm.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương 4 công bố toàn bộ dữ liệu thực nghiệm thu được từ các thử nghiệm sinh học và hóa phân tích. Kết quả thử nghiệm kháng khuẩn khẳng định dung môi DMSO và ethyl acetate ở lô đối chứng âm hoàn toàn không tạo vòng vô khuẩn và không làm ức chế vi khuẩn (thử nghiệm DMSO ở các giá trị pH từ 3 đến 13 đều cho thấy vi khuẩn E. coli ATCC 35218 phát triển bình thường quanh giếng), chứng minh hoạt tính quan sát được hoàn toàn xuất phát từ dược liệu.

Dịch chiết Ngưu Tất thể hiện hoạt tính kháng khuẩn phân hóa mạnh theo dung môi và chủng vi sinh vật: dịch chiết methanol ở nồng độ 2000 mg/ml cho đường kính vòng vô khuẩn lớn nhất đạt 14 mm trên vi khuẩn ưa nhiệt Geobacillus stearothermophilus ATCC 7953; các dịch chiết methanol và ethanol cũng ghi nhận vòng ức chế rõ nét trên Bacillus subtilis và Salmonella ATCC 13311. Đối với dược liệu Hoa Ngũ Sắc, dịch chiết ethanol ở nồng độ 2000 mg/ml thể hiện khả năng ức chế mạnh nhất trên tụ cầu vàng Staphylococcus aureus ATCC 25923 với đường kính vòng vô khuẩn đo được là 6 mm; ngoài ra phân đoạn methanol và hexan cũng tạo vòng ức chế trên B. subtilis.

Đối với thử nghiệm tinh dầu Hoa Ngũ Sắc: khảo sát ở dải nồng độ pha loãng từ 1/2 đến 1/80 trên cả hai phương pháp xông hơi và khuếch tán giếng thạch đều ghi nhận kết quả âm tính, tinh dầu không tạo vòng vô khuẩn trên các chủng vi khuẩn kiểm định. Kết quả định lượng polyphenol và bắt gốc tự do DPPH cho thấy tất cả các phân đoạn dịch chiết của hai dược liệu đều chứa polyphenol và có năng lực chống oxy hóa; trong đó, phân đoạn dung môi hexan ở cả Ngưu Tất và Hoa Ngũ Sắc đều cho hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa thấp nhất trong số 6 hệ dung môi khảo sát.

---

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã thu thập và xử lý hệ thống số liệu thực nghiệm về hoạt tính sinh học và thành phần hóa thực vật của hai loại dược liệu trong 6 hệ dung môi trích ly:

Tiêu chí / Chỉ số thực nghiệm	Dược liệu Ngưu Tất (Achyranthes bidentata)	Dược liệu Hoa Ngũ Sắc (Ageratum conyzoides)
Chủng vi khuẩn nhạy cảm nhất	Geobacillus stearothermophilus ATCC 7953	Staphylococcus aureus ATCC 25923
Dung môi chiết tối ưu cho kháng khuẩn	Methanol	Ethanol
Đường kính vòng vô khuẩn cực đại	14 mm (ở nồng độ cao 2000 mg/ml trong dung môi methanol)	6 mm (ở nồng độ cao 2000 mg/ml trong dung môi ethanol)
Các chủng vi khuẩn bị ức chế khác	Bacillus subtilis, Salmonella ATCC 13311	Bacillus subtilis (ở dịch chiết methanol và hexan)
Hiệu lực kháng khuẩn của tinh dầu	Không khảo sát tinh dầu	Không thể hiện hoạt tính ức chế ở các nồng độ từ 1/2 đến 1/80 (cả xông hơi và khuếch tán)
Dung môi cho hàm lượng polyphenol & DPPH thấp nhất	Dung môi hexan	Dung môi hexan
Chất chuẩn định lượng	Acid chlorogenic (polyphenol) và Vitamin E / $\alpha$-Tocopherol (DPPH)	Acid chlorogenic (polyphenol) và Vitamin E / $\alpha$-Tocopherol (DPPH)

Từ các kết quả thực nghiệm, tác giả đề xuất các kiến nghị:

• Khuyến nghị lựa chọn các hệ dung môi phân cực như ethanol, methanol hoặc nước sôi trong quy trình chiết xuất hoạt chất từ Ngưu Tất và Hoa Ngũ Sắc nhằm thu nhận tối đa hàm lượng hợp chất polyphenol và bảo tồn năng lực chống oxy hóa, tránh sử dụng dung môi không phân cực như hexan.
• Cần mở rộng khảo sát tinh dầu Hoa Ngũ Sắc ở trạng thái đậm đặc nguyên chất hoặc ở các hệ chất mang nhũ hóa khác nhau trước khi đưa ra kết luận toàn diện về độc tính sinh học của tinh dầu đối với vi sinh vật.
• Ứng dụng các phân đoạn dịch chiết có hoạt tính kháng khuẩn cao làm cơ sở khoa học để nghiên cứu sản xuất các chế phẩm bổ sung thảo dược phòng trị bệnh nhiễm khuẩn đường ruột và nhiễm khuẩn ngoài da trong chăn nuôi thú y, hướng tới giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh công nghiệp.

Về mặt đóng góp khoa học, đề tài là công trình nghiên cứu thực nghiệm đầu tiên trong nước tiến hành khảo sát và so sánh có hệ thống hiệu quả chiết xuất của 6 dung môi có độ phân cực khác nhau lên hàm lượng polyphenol tổng số và hoạt tính chống oxy hóa của rễ Ngưu Tất. Đồng thời, nghiên cứu đã đề xuất giải pháp kỹ thuật cải tiến trong phương pháp thử hoạt tính sinh học của tinh dầu: việc định vị chính xác giấy tẩm tinh dầu tại tâm nắp đĩa Petri giúp tạo vùng ức chế hình tròn đồng tâm xác định được kích thước, khắc phục nhược điểm vùng ức chế biến dạng không đo được trong công bố của Edwards-Jones và cộng sự (2004); việc ứng dụng ống khâu có nắp đậy chuyên dụng trong phương pháp khuếch tán thạch giúp cách ly hoàn toàn pha hơi, đảm bảo độ chính xác cho phép đo khuếch tán bề mặt.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận còn tồn tại một số hạn chế nhất định phản ánh qua phạm vi thực nghiệm:

• Nghiên cứu mới dừng lại ở bước khảo sát định tính và bán định lượng hoạt tính kháng khuẩn thông qua đường kính vòng vô khuẩn trên đĩa thạch; chưa xác định được giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của các phân đoạn dịch chiết bằng phương pháp vi pha loãng (microdilution).
• Khóa luận chưa thực hiện phân lập sâu, sắc ký tinh chế và xác định cấu trúc hóa học cụ thể của các hợp chất đơn lẻ chịu trách nhiệm chính về tính kháng khuẩn hay hoạt tính chống oxy hóa trong từng phân đoạn cao chiết.
• Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu Hoa Ngũ Sắc mới chỉ thực hiện trên các nồng độ pha loãng trong ethyl acetate (từ 1/2 đến 1/80), chưa khảo sát trên tinh dầu nguyên chất 100%.

Hướng nghiên cứu tiếp theo được đề xuất từ phạm vi của đề tài:

• Mở rộng phân đoạn sắc ký cột để phân lập và nhận diện các hợp chất polyphenol, flavonoid tinh khiết từ các dịch chiết methanol của Ngưu Tất và ethanol của Hoa Ngũ Sắc.
• Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC và MBC trên các chủng vi khuẩn lâm sàng phân lập từ gia súc, gia cầm.
• Tiến hành các thử nghiệm in vivo trên động vật nhằm đánh giá độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và kiểm chứng hiệu quả bảo vệ chống stress oxy hóa cũng như khả năng thay thế kháng sinh kích thích sinh trưởng trong điều kiện chăn nuôi thực tế.

---

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo chuyên môn thiết thực đối với:

• Sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Dược học, Thú y, Hóa học các hợp chất thiên nhiên và Chăn nuôi.
• Những người thực hiện các đề tài nghiên cứu về sàng lọc hoạt tính sinh học, chiết xuất hợp chất tự nhiên và phát triển chế phẩm thảo dược thú y.

Các nội dung và dữ liệu cụ thể có giá trị tham khảo cao trong văn bản bao gồm:

• Quy trình chuẩn bị mẫu, xử lý chiết xuất phân đoạn với 6 dung môi phân cực khác nhau và quy trình cô quay thu hồi dung môi ở nhiệt độ an toàn ($\le 45^\circ\text{C}$).
• Kỹ thuật hòa tan cao dược liệu phân cực kém bằng dung môi trơ DMSO và minh chứng thực nghiệm về tính trung tính của DMSO đối với sự sinh trưởng của vi khuẩn ở dải pH rộng (pH từ 3 đến 13).
• Cải tiến thực nghiệm trong kỹ thuật đánh giá hoạt tính kháng sinh của các hợp chất dễ bay hơi (tinh dầu) bằng phương pháp xông hơi tâm đĩa và phương pháp khuếch tán giếng thạch có nắp đậy chuyên dụng.
• Dữ liệu xây dựng đường chuẩn định lượng polyphenol bằng acid chlorogenic và đường chuẩn hoạt tính chống oxy hóa DPPH quy đổi tương đương theo Vitamin E ($\alpha$-Tocopherol).

---

Câu hỏi thường gặp

1. Vì sao tác giả sử dụng dung môi DMSO để hòa tan cao dược liệu trước khi thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn?
Cao dược liệu sau khi cô quay chân không rất khó hòa tan hoàn toàn trong nước cất. Tác giả chọn Dimethyl Sulfoxide (DMSO) vì đây là dung môi hữu cơ có khả năng hòa tan tốt các hợp chất phân cực và kém phân cực, đồng thời thực nghiệm đối chứng đã chứng minh DMSO không gây độc, không tạo vòng vô khuẩn và không làm ức chế sự phát triển của vi khuẩn thử nghiệm ngay cả khi thay đổi độ pH từ 3 đến 13. Điều này đảm bảo vòng ức chế sinh ra hoàn toàn do hoạt chất của dược liệu.

2. Tinh dầu Hoa Ngũ Sắc có thể hiện hoạt tính kháng khuẩn trong các thử nghiệm của khóa luận không?
Không. Trong các thử nghiệm được thực hiện ở dải nồng độ pha loãng 1/2, 1/4, 1/8, 1/10, 1/20, 1/40 và 1/80 trong dung môi ethyl acetate, tinh dầu Hoa Ngũ Sắc hoàn toàn không tạo vòng vô khuẩn trên các chủng vi khuẩn kiểm định theo cả phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch lẫn phương pháp xông hơi.

3. Trong 6 hệ dung môi khảo sát, dung môi nào cho hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa thấp nhất ở cả hai dược liệu?
Dung môi hexan cho hàm lượng polyphenol tổng số và hoạt tính chống oxy hóa khử gốc tự do DPPH thấp nhất ở cả hai loại dược liệu Ngưu Tất và Hoa Ngũ Sắc. Nguyên nhân do hexan là dung môi không phân cực, kém hiệu quả trong việc trích ly các hợp chất polyphenol và flavonoid vốn có tính phân cực cao.

4. Dịch chiết nào của Ngưu Tất cho đường kính vòng vô khuẩn lớn nhất và trên chủng vi khuẩn nào?
Dịch chiết Ngưu Tất trong dung môi methanol ở nồng độ 2000 mg/ml tạo ra đường kính vòng vô khuẩn lớn nhất đạt 14 mm trên chủng vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus ATCC 7953.

5. Tác giả đã cải tiến điểm gì trong phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu so với công bố của Edwards-Jones và cộng sự (2004)?
Tác giả đã khắc phục hiện tượng vùng ức chế biến dạng không đo được đường kính trong nghiên cứu của Edwards-Jones và cs. bằng cách cố định miếng giấy tẩm tinh dầu chính xác tại tâm nắp đĩa Petri, tạo ra vùng ức chế hình tròn đồng tâm đo lường được bằng thước kẹp; đồng thời trong phương pháp khuếch tán thạch, tác giả sử dụng nắp đậy chuyên dụng bịt kín miệng ống khâu chứa tinh dầu để loại trừ triệt để ảnh hưởng của hơi tinh dầu bay lan tỏa trên bề mặt đĩa nuôi cấy.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Phạm Thị Thoan đã cung cấp dữ liệu thực nghiệm toàn diện về hiệu quả trích ly của 6 hệ dung môi đối với hoạt tính kháng khuẩn, hàm lượng polyphenol và khả năng chống oxy hóa của hai dược liệu Ngưu Tất và Hoa Ngũ Sắc. Kết quả nghiên cứu xác định dịch chiết methanol của Ngưu Tất và dịch chiết ethanol của Hoa Ngũ Sắc có hoạt tính ức chế vi khuẩn vượt trội, đồng thời chứng minh các dung môi phân cực cho hiệu suất thu hồi polyphenol và hoạt tính dập tắt gốc tự do cao hơn hẳn dung môi hexan. Những cải tiến về mặt kỹ thuật đo lường hoạt tính tinh dầu cùng các phát hiện hóa thực vật trong văn bản là nguồn dữ liệu khoa học tin cậy cho các nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học thay thế kháng sinh trong y học và chăn nuôi.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ VI KHUẨN VÀ ĐÁNH GIÁ HÀM LƢỢNG POLYPHENOL, HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HÓA CỦA DƢỢC LIỆU NGƢU TẤT, HOA NGŨ SẮC Ngƣời thực hiện : Phạm Thị Thoan Mã sinh viên : 637077 Lớp : K63CNSHA Khoa : Công nghệ sinh học Ngƣời hƣớng dẫn : PGS. Nguyễn Thanh Hải : TS. Nguyễn Thị Thanh Hà HÀ NỘI - 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu, hình ảnh và kết quả trong báo cáo này là trung thực, khách quan và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ một công trình khoa học nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận tốt nghiệp đã đƣợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn, tài liệu tham khảo đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc trong danh mục tài liệu tham khảo của khóa luận.

Hà Nội, ngày … tháng … năm 2021 Sinh viên Phạm Thị Thoan i LỜI CẢM ƠN Quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp và một trong những giai đoạn quan trọng và ý nghĩa nhất của thời sinh viên. Trong quá trình hoàn thành luận văn tốt nghiệp của mình em đã đƣợc tiếp thu những kỹ năng nghiên cứu và những kiến thức quý báu trƣớc khi lập nghiệp. Để đạt đƣợc kết quả này, em xin phép đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến mọi ngƣời đã giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập tại trƣờng. Em xin phép gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới Ban giám đốc, các phòng ban của Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Khoa Công nghệ sinh học, các thầy cô đã tận tình giảng dạy và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn tốt nghiệp.

Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý thầy cô hƣớng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thanh Hải và TS Nguyễn Thị Thanh Hà, ngƣời đã truyền đạt những vốn kiến thức quý báu, tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ em trong thời gian nghiên cứu và hoàn thành khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn bạn bè, các anh chị cũng nhƣ gia đình đã động viên, quan tâm, giúp đỡ hỗ trợ và tạo mọi điều kiện để em hoàn thành khóa luận tốt nhất. Vì kiến thức, kinh nghiệm cũng nhƣ trình độ lý luận của em còn hạn chế nên bài luận án tốt nghiệp không tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận đƣợc những ý kiến đóng góp của quý thầy cô để em học hỏi nhiều hơn về những kiến thức chuyên môn và hoàn thiện bài báo cáo khóa luận sắp tới. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Phạm Thị Thoan ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN.

ii MỤC LỤC. iii DANH MỤC BẢNG. v DANH MỤC HÌNH ẢNH. vii DANH MỤC ĐỒ THỊ.

x TÓM TẮT KHÓA LUẬN. Mục đích và yêu cầu. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Nghiên cứu và phát triển thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên.

Thành phần hóa học của cây Ngƣu Tất. Công dụng của cây và dịch chiết Ngƣu Tất. Hoa Ngũ Sắc. Đặc điểm thực vật của Hoa Ngũ Sắc.

Thành phần hóa học trong cây hoa Ngũ Sắc. Công dụng của cây Hoa Ngũ Sắc. Tổng quan về polyphenol. Phân loại polyphenol.

Vai trò của polyphenol. Hoạt tính chống oxy hóa. Sơ lƣợc về gốc tự do. Tổng quan về hoạt tính chống oxi hoá.

Một số quá trình chống oxi hoá của hợp chất polyphenol. Tổng quan về các chủng vi khuẩn sử dụng. Một số nghiên cứu về Hoa Ngũ Sắc và Ngƣu Tất trên thế giới và trong nƣớc. Một số nghiên cứu về Ngƣu Tất.

Một số nghiên cứu về dƣợc liệu Hoa Ngũ Sắc. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Vật liệu nghiên cứu. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.

Đối tƣợng nghiên cứu. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị. Nội dung nghiên cứu. Phƣơng pháp nghiên cứu.

Phƣơng pháp chiết xuất dƣợc liệu. Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết dƣợc liệu trên vi khuẩn. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng polyphenol. Phƣơng pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa.

Phƣơng pháp xử lý số liệu. 37 IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. Xác định đƣờng kính vòng vô khuẩn của các dịch chiết dƣợc liệu Hoa Ngũ Sắc và Ngƣu Tất theo phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Xác định đƣờng kính vòng vô khuẩn của các dịch chiết dƣợc liệu Ngƣu Tất theo phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch.

Xác định đƣờng kính vòng vô khuẩn của các dịch chiết dƣợc liệu Hoa Ngũ Sắc theo phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Kết quả xác định đƣờng kính vòng vô khuẩn của tinh dầu Hoa Ngũ Sắc theo phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch và phƣơng pháp xông hơi. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các dƣợc liệu. Xác định hàm lƣợng polyphenol của các dƣợc liệu.

TÀI LIỆU THAM KHẢO. 59 v DANH MỤC BẢNG Bảng 2. 1: Các thành phần hóa học trong lá, thân, rễ và Hoa Ngũ Sắc. 1: Kết quả xác định đƣờng kính vòng vô khuẩn(mm)của các dịch chiết Ngƣu Tất trên 6 chủng vi khuẩn.

Kết quả xác định đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm) của các dịch chiết dƣợc liệu Hoa Ngũ Sắc trên 3 chủng vi khuẩn. 3: Hoạt tính chống oxi hoá của chất chuẩn VTME xác định theo phƣơng pháp DPPH tạo các nồng độ khác nhau ( AA%). 4: Hoạt tính chống oxi hoá quy đổi về VTME (mg) của dƣợc liệu Hoa Ngũ Sắc và Ngƣu Tất. 5: Sự thay đổi giá trị OD Values theo nồng độ chất chuẩn acid chlorogenic (mg/ml).

6: Hàm lƣợng polyphenol tổng số quy đổi theo mg acid chlorogenic/ 100mg dƣợc liệu khô của dƣợc liệu Ngƣu Tất và Hoa Ngũ Sắc. 51 vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2. 1: Hình ảnh Ngƣu Tất. 2: Cấu trúc hóa học Niuxixinsterone D.3: Cây hoa ngũ sắc.

4: Cấu trúc của Flavnoid. 5: Phân loại các hợp chất polyphenol. 6:Công thức cấu tạo của hai axit axit hydroxybenzoic và hydroxycinnamic. 7: Hình ảnh mô phỏng quá trình hình thành gốc tự đo.

8: Sơ đồ các cơ chế chống oxy hóa. 1: Hình ảnh dƣợc liệu đã đƣợc nghiền thành bột mịn. Hình A là hình ảnh bột mịn của dƣợc liệu Ngƣu Tất. Hình B là hình ảnh bột mịn của dƣợc liệu hoa Ngũ Sắc.

2: Quá trình chuyển dƣợc liệu vào ống falcon 15ml. 3: Máy cô quay chân không RE-501 Rotary evaporator. 4: Dƣợc liệu sau khi cô cao và pha loãng trong ống eppendorf 1,5ml bảo quản trong tủ lạnh. 5: Tinh dầu hoa Ngũ Sắc thu đƣợc sau phân ly.

6: Sơ đồ mô tả phƣơng pháp trộn khuẩn. 7: Đƣờng kính vòng vô khuẩn tạo ra bởi dịch chiết dƣợc liệu trên sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trƣờng thạch Muller Hinton. 8: Dụng cụ đục lỗ có đƣờng kính 10mm. 9: Máy đo đƣờng kính vòng vô khuẩn.

10: Vùng ức chế có đƣờng kính không xác định của Edwards-Jones và cộng sự (2004). 11: Hình đĩa khuẩn sau 24h nuôi cấy ở nhiệt độ 37°C bằng phƣơng pháp xông hơi của tinh dầu hoa Ngũ Sắc. 12: Hình ảnh đĩa khuẩn sau 24h nuôi cấy ở nhiệt độ 37°C bằng phƣơng pháp khuếch tán của tinh dầu hoa Ngũ Sắc. 13: Cơ chế của phản ứng chuyển màu trong xác định hàm lƣợng polyphenol tổng số, sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteu's phenol reagent.

15: Cơ chế phản ứng của DPPH với chất chống oxy hóa. 1: Hình ảnh đối chứng là DMSO không tạo vòng vô khuẩn trên đĩa thạch chứng minh khả năng không độc và không ảnh hƣởng đến sự phát triển của vi khuẩn ( A). Nhỏ dung dịch DMSO có độ pH lần lƣợt 3, 4, 5, 12, 13; vi khuẩn E. coli ATCC 35218 vẫn mọc bình thƣờng quanh giếng nhỏ DMSO (B).

2: Kích thƣớc đƣờng kính vòng vô khuẩn của dƣợc liệu Ngƣu Tất trên 2 chủng vi khuẩn B. subtilis và Sal (Salmonella ATCC 13311). Hình bên trái là kết quả đƣờng kính vòng vô khuẩn của dịch chiết methanol trên chủng vi khuẩn B. subtilis ở 4 nồng độ 2g/ml, 1g/ml, 0.

Hình phải là kết quả đƣờng kính vòng vô khuẩn của dịch chiết ethanol trên chủng vi khuẩn Sal (Salmonella ATCC 13311) ở 4 nồng độ 2g/ml, 1g/ml, 0. 3: : Kết quả đƣờng kính vòng vô khuẩn Hoa Ngũ Sắc ở hai dịch chiết methanol và hexan trên vi khuẩn B.subtilis ở 4 nồng độ 2g/ml, 1g/ml, 0. 4: Hình ảnh đối chứng ethyl acetate không tạo vòng vô khuẩn trên đĩa thạch chứng minh khả năng không độc và không ảnh hƣởng đến sự phát triển của vi khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 25923 theo hai phƣơng pháp khuếch tán ( A) và xông hơi (B). 5: Các cuvet thể hiện sự thay đổi màu sắc của dung dịch DPPH tạo ra bởi hoạt tính chống oxi hóa của VTME (chất chuẩn) tại các nồng độ khác nhau (từ trái sang: Control, VTME 0,1 mg/ml; 0,15 mg/ml; 0,2 mg/ml; 0,25 mg/ml; 0,3 mg/ml; 0,35 mg/ml).

6: Các cuvet thể hiện sự thay đổi màu sắc của dung dịch DPPH tạo ra bởi dung môi dƣợc liệu Ngƣu Tất ở 4 dung môi tại nồng độ 40mg/ml. 7: Các cuvet cho thấy sự thay đổi màu sắc của dung dịch DPPH tạo ra bởi dung môi acetone, ethanol, hexan, ethyl acetate của dƣợc liệu Hoa Ngũ Sắc tại các nồng nồng độ khác nhau. 8: Hoạt tính chống oxi hoá tổng số của dƣợc liệu Ngƣu Tất và Hoa Ngũ Sắc quy đổi theo hàm lƣợng VTME (mg/100mg dƣợc liệu ). 9: So sánh hàm lƣợng polyphenol (quy đổi theo mg acid chlorogenic/ 100 mg dƣợc liệu) của dƣợc liệu Ngƣu Tất, Hoa Ngũ Sắc.

52 ix DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị 4. 1: Mối tƣơng quan của nồng độ của VTME (mg/ml) với mức độ gia tăng giá trị đo mật độ quang (OD value). 2: Mối tƣơng quan giữa hàm lƣợng chất chuẩn acid chlorogenic (mg/ml) với mức độ gia tăng giá trị đo mật độ quang (OD value). 50 x DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Viết đầy đủ ATCC American Type Culture Collection B.subtilis Bacillus subtilis DMSO Dimethyl Sulfoxide DPPH 1,1-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl E.coli Eschrichia Coli G.philus Geobacillus stearothermophilus P.seudo Pseudomonas aeruginosa S.aureus Staphylococcus aureus VTME Vitamin E Sal Salmonella ATCC 13311 NT Ngƣu Tất HNS Hoa Ngũ Sắc DW Nƣớc nóng xi TÓM TẮT KHÓA LUẬN - Sử dụng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch để xác định khả năng ức chế sự phát triển của các dịch chiết trên các chủng vi khuẩn: Escheria coli (E.

coli ATCC 35218; Staphylococcus aureus (S. aureus ATCC 25023; Pseudomonas aeruginosa (P. Aeruginosa) ATCC 9027; Bacillus subtilis (B. subtilis) ATCC 7953; Geobacillus stearothermophilus (G.

Stearothermophilus) ATCC 7953, Salmonella ATCC 13311. Qua nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của các dịch chiết dƣợc liệu Ngƣu Tất và Hoa Ngũ Sắc cho thấy đƣợc khả năng ức chế trên các chủng vi khuẩn: S. seudo ATCC 9027, Salmonella ATCC 13311. Ở dƣợc liệu Ngƣu Tất tại dung môi methanol trên vi khuẩn G.