Lê thiên bảo long tổng hợp và đánh giá tác dụng ức chế acetylcholinesterase của một số dẫn chất thơm mới mang khung 2 5 pyridin2 yl 1h tetrazol 1 ylacetamid

Nghiên cứu tổng hợp, đánh giá tác dụng ức chế acetylcholinesterase của dẫn chất thơm mới chứa khung tetrazol. Tiềm năng ứng dụng trong điều trị bệnh Alzheimer.

• Tác giả: Lê Thiên Bảo Long
• Người hướng dẫn: PGS. Trần Phương Thảo
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Tổng Hợp Và Đánh Giá Tác Dụng Ức Chế Acetylcholinesterase Của Một Số Dẫn Chất Thơm Mới Mang Khung 2-(5-(Pyridin- 2-Yl)-1H-Tetrazol-1-Yl)Acetamid
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Bệnh Alzheimer và giả thuyết cholinergic trong bệnh Alzheimer
• 1.1.1. Giới thiệu về bệnh Alzheimer
• 1.1.2. Giả thuyết cholinergic trong bệnh Alzheimer
• 1.1.2.1. Acetylcholin và hệ dẫn truyền cholinergic
• 1.2. Tổng quan về acetylcholinesterase (AChE)
• 1.2.1. Giới thiệu về acetylcholinesterase
• 1.2.2. Cấu trúc của acetylcholinesterase
• 1.3. Nguyên liệu, thiết bị, nội dung và phương pháp nghiên cứu
• 1.3.1. Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu
• 1.3.2. Nội dung nghiên cứu
• 1.3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 1.4. Thực nghiệm và kết quả nghiên cứu
• 1.4.1. Tổng hợp hóa học
• 1.4.2. Thử độ tinh khiết
• 1.4.3. Khẳng định cấu trúc
• 1.4.4. Hoạt tính sinh học
• 1.5. Kết luận và kiến nghị
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Alzheimer Tổng Quan Bệnh Tác Dụng AChE 55 ký tự

Bệnh Alzheimer (AD) là một bệnh thoái hóa thần kinh mãn tính, không hồi phục, gây ra các triệu chứng như mất trí nhớ, rối loạn nhận thức và hành vi. Đây là nguyên nhân hàng đầu gây ra hội chứng sa sút trí tuệ, chiếm khoảng 60-80% tổng số trường hợp. Theo báo cáo năm 2023 của ADI, số người mắc sa sút trí tuệ trên toàn cầu năm 2019 là hơn 55 triệu người và dự kiến sẽ tăng lên 139 triệu vào năm 2050 do tình trạng già hóa dân số. Chi phí liên quan đến điều trị cũng dự kiến tăng gấp đôi từ 1300 tỷ đô năm 2019 lên 2800 tỷ đô vào năm 2030. Tại Việt Nam, ước tính có khoảng 660,000 người mắc bệnh sa sút trí tuệ vào năm 2015, và dự kiến tăng lên 1,2 triệu người vào năm 2030. Cơ chế bệnh sinh của Alzheimer hiện vẫn còn là một ẩn số, gây khó khăn cho việc phòng ngừa và điều trị.

1.1. Alzheimer Dấu ấn sinh học và cơ chế bệnh sinh

Hai dấu ấn sinh học quan trọng của AD là sự tích lũy peptid amyloid beta (Aβ) trong các mảng bám và sự tăng phosphoryl hóa của protein tau trong đám rối sợi thần kinh (NFTs). Bên cạnh đó, AD còn đặc trưng bởi nồng độ thấp các chất dẫn truyền thần kinh acetylcholin (ACh), sự mất các sợi cholinergic, nhiễm độc thần kinh, tăng các yếu tố stress oxy hóa, viêm thần kinh mãn tính, rối loạn cân bằng kim loại. Các giả thuyết về cơ chế bệnh sinh bao gồm: giả thuyết cholinergic, giả thuyết mảng bám amyloid, giả thuyết ion kim loại, giả thuyết tau, giả thuyết lysosome. Các nhà khoa học đã cố gắng tìm hiểu và phát triển nhằm tìm kiếm các phương pháp tiềm năng để can thiệp, ngăn chặn và điều trị hiệu quả AD.

1.2. Acetylcholinesterase AChE trong bệnh Alzheimer

Sự suy giảm khả năng học tập và trí nhớ trong AD chủ yếu do giảm chất dẫn truyền thần kinh acetylcholin và rối loạn dẫn truyền hệ cholinergic. Do đó, nhiều chiến lược điều trị đã được nghiên cứu nhằm làm chậm sự tiến triển các triệu chứng của AD đồng thời khôi phục nồng độ ACh trong khe synap và dẫn truyền cholinergic. Trong đó, AChE thường được chọn làm mục tiêu của các phương pháp trị liệu với mục đích ức chế hoạt động của AChE. Theo tài liệu, cơ chế hoạt động của các chất ức chế AChE đặc biệt hiệu quả do chúng làm tăng nồng độ ACh và cải thiện dẫn truyền cholinergic, từ đó góp phần phục hồi chức năng nhận thức ở bệnh nhân Alzheimer.

II. Giả Thuyết Cholinergic Cơ Sở Điều Trị Alzheimer 58 ký tự

Giả thuyết cholinergic là một trong những giả thuyết lâu đời nhất trong quá trình nghiên cứu về AD. Các nghiên cứu đầu tiên cho thấy bệnh nhân Alzheimer có tình trạng giảm sút đáng kể cholin acetyl transferase (ChAT) - enzym tổng hợp ACh ở vùng vỏ não. Hai dấu ấn quan trọng khác của AD theo giả thuyết cholinergic là sự giảm khử cực dẫn đến giảm giải phóng ACh vào khe synap và giảm thu hồi cholin ở khe synap cần thiết cho quá trình tổng hợp ACh. Từ đó dẫn tới suy giảm của chất dẫn truyền thần kinh quan trọng trong quá trình bệnh sinh của AD là ACh. Như vậy, điều này cho thấy sự thoái hóa của các tế bào thần kinh và sự mất dẫn truyền thần kinh cholinergic ở vỏ não và thần kinh trung ương đã góp phần gây ra bệnh, làm suy giảm đáng kể chức năng nhận thức ở bệnh nhân Alzheimer.

2.1. Vai trò của Acetylcholin ACh trong hệ thần kinh

Acetylcholin (ACh) là chất dẫn truyền thần kinh được sử dụng bởi tất cả các tế bào thần kinh cholinergic và đóng vai trò rất quan trọng trong hệ thần kinh trung ương và ngoại biên. Trong hệ thần kinh trung ương, các tế bào thần kinh cholinergic cùng chất dẫn truyền thần kinh ACh chịu trách nhiệm chủ chốt trong việc điều hòa các chức năng và hoạt động sinh lý của hệ thống thần kinh bao gồm: sự tập trung, ghi nhớ, đáp ứng với stress, chu kỳ giấc ngủ và tiếp nhận thông tin từ các giác quan. ACh được tổng hợp ở trong các nơron tiền synap từ cholin và acetyl-coenzym A (acetyl-CoA) bởi enzym cholin acetyltransferase (ChAT).

2.2. Ảnh hưởng của sự thiếu hụt ACh trong Alzheimer

Việc thiếu hụt ACh làm giảm hoạt hóa của thụ thể muscarinic M1 dẫn tới bất hoạt protein kinase C và enzym α-secretase, từ đó dẫn tới hoạt hóa enzym glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β) và enzym BACE-1 trong não bệnh nhân Alzheimer.Việc giảm hoạt động α-secretase và tăng hoạt tính của BACE-1 làm thay đổi con đường chuyển hóa Aβ protein dẫn tới hình thành mảng bám amyloid beta. Hơn nữa, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc hoạt hóa quá mức glycogen synthase kinase (GSK) có nhiệm vụ phosphoryl hoá protein tau dẫn tới hình thành đám rối sợi thần kinh và nồng độ cao các oligome Aβ gây độc. Điều này chỉ ra mối quan hệ phức tạp giữa giả thuyết cholinergic và các giả thuyết khác cũng như các đặc điểm bệnh lý đa dạng trong AD.

III. Dẫn Chất Tetrazol Giải Pháp Ức Chế AChE Mới 54 ký tự

Tetrazol là một dị vòng thơm 5 cạnh chứa 4 nguyên tử nitơ, 1 nguyên tử carbon và 2 nguyên tử hydro. Các dẫn chất của tetrazol cho thấy nhiều hoạt tính sinh học tiềm năng như kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, kháng ung thư, chống đái tháo đường và chống đông máu. Nhiều nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng, các dẫn chất mang khung tetrazol có khả năng tương tác với một số đích phân tử tiềm năng trong điều trị Alzheimer, trong đó hướng ức chế enzym acetylcholinesterase đã và đang nhận được nhiều sự quan tâm. Với mục đích tìm kiếm và sàng lọc những hợp chất có khả năng ức chế AChE tốt, đồng thời làm giàu cơ sở dữ liệu về những hợp chất ức chế AChE mang khung tetrazol, nhóm nghiên cứu tiến hành thực hiện đề tài này.

3.1. Tiềm năng dược lý của dẫn chất Tetrazol

Các dẫn chất tetrazol không chỉ có tiềm năng trong điều trị Alzheimer mà còn thể hiện hoạt tính trong nhiều lĩnh vực khác. Điều này mở ra hướng nghiên cứu đa dạng, kết hợp nhiều phương pháp để đạt được hiệu quả điều trị tối ưu. Theo tài liệu, các dẫn chất tetrazol cho thấy nhiều hoạt tính sinh học tiềm năng như kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, kháng ung thư, chống đái tháo đường và chống đông máu.

3.2. Cơ chế tác dụng của dẫn chất Tetrazol trong ức chế AChE

Nhiều nghiên cứu cho thấy, các dẫn chất tetrazol có khả năng tương tác với vị trí hoạt động của enzym AChE, từ đó ức chế hoạt động của enzym này. Cơ chế tương tác có thể bao gồm liên kết hydro, tương tác kỵ nước và tương tác tĩnh điện. Sự hiểu biết sâu sắc về cơ chế này sẽ giúp các nhà khoa học thiết kế và tổng hợp các dẫn chất tetrazol có hoạt tính ức chế AChE mạnh mẽ hơn. Các dẫn chất mang khung tetrazol có khả năng tương tác với một số đích phân tử tiềm năng trong điều trị Alzheimer, trong đó hướng ức chế enzym acetylcholinesterase đã và đang nhận được nhiều sự quan tâm.

IV. Nghiên Cứu Tổng Hợp Đánh Giá Tác Dụng Ức Chế AChE 59 ký tự

Nghiên cứu này tập trung vào việc tổng hợp các dẫn chất thơm mới mang khung 2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetamid và đánh giá tác dụng ức chế AChE của chúng. Các dẫn chất được tổng hợp qua nhiều giai đoạn phản ứng hóa học, bao gồm phản ứng cộng đóng vòng [3+2], phản ứng N-alkyl hóa, phản ứng thủy phân este và phản ứng amid hóa. Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng các phương pháp phổ nghiệm như phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (13C-NMR).

4.1. Phương pháp tổng hợp các dẫn chất Tetrazol mới

Quy trình tổng hợp bao gồm các bước chính: (1) Phản ứng cộng đóng vòng [3+2] để tạo khung tetrazol, (2) Phản ứng N-alkyl hóa để gắn nhóm alkyl vào khung tetrazol, (3) Phản ứng thủy phân este để loại bỏ nhóm bảo vệ este, và (4) Phản ứng amid hóa để tạo thành các dẫn chất acetamid. Các điều kiện phản ứng như nhiệt độ, thời gian và xúc tác được tối ưu hóa để đạt hiệu suất cao nhất.

4.2. Đánh giá hoạt tính ức chế AChE của các dẫn chất

Hoạt tính ức chế AChE của các dẫn chất được đánh giá bằng phương pháp Ellman, dựa trên sự hình thành sản phẩm màu vàng khi AChE thủy phân acetylthiocholin. Nồng độ ức chế 50% (IC50) được xác định để so sánh hoạt tính của các dẫn chất khác nhau. Theo tài liệu, với mục đích tìm kiếm và sàng lọc những hợp chất có khả năng ức chế AChE tốt, đồng thời làm giàu cơ sở dữ liệu về những hợp chất ức chế AChE mang khung tetrazol, nhóm nghiên cứu tiến hành thực hiện đề tài này.

V. Kết Quả Thảo Luận Tiềm Năng Ứng Dụng Tetrazol 55 ký tự

Kết quả nghiên cứu cho thấy một số dẫn chất thơm mang khung 2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetamid có hoạt tính ức chế AChE đáng kể. Cấu trúc của các dẫn chất này có thể được tối ưu hóa để tăng cường hoạt tính ức chế AChE và giảm độc tính. Những phát hiện này mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc phát triển thuốc điều trị Alzheimer dựa trên khung tetrazol.

5.1. So sánh hoạt tính ức chế AChE của các dẫn chất

Hoạt tính ức chế AChE của các dẫn chất được so sánh với các thuốc điều trị Alzheimer hiện có, như Donepezil và Galantamine. Một số dẫn chất cho thấy hoạt tính tương đương hoặc thậm chí cao hơn so với các thuốc này. Điều này cho thấy tiềm năng lớn của các dẫn chất tetrazol trong việc phát triển thuốc mới.

5.2. Ứng dụng tiềm năng và hướng nghiên cứu tiếp theo

Các dẫn chất tetrazol có hoạt tính ức chế AChE có thể được phát triển thành thuốc điều trị Alzheimer. Nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc đánh giá độc tính, dược động học và dược lực học của các dẫn chất này. Thử nghiệm lâm sàng cũng cần được thực hiện để xác định hiệu quả và an toàn của thuốc trên bệnh nhân Alzheimer. Theo tài liệu, trên cơ sở đó, với mục đích tìm kiếm và sàng lọc những hợp chất có khả năng ức chế AChE tốt, đồng thời làm giàu cơ sở dữ liệu về những hợp chất ức chế AChE mang khung tetrazol, nhóm nghiên cứu tiến hành thực hiện đề tài.

VI. Kết Luận Hướng Đi Mới Trong Điều Trị Alzheimer 55 ký tự

Nghiên cứu này đã thành công trong việc tổng hợp và đánh giá hoạt tính ức chế AChE của một số dẫn chất tetrazol mới. Kết quả cho thấy các dẫn chất này có tiềm năng lớn trong việc phát triển thuốc điều trị Alzheimer. Tuy nhiên, cần có thêm nhiều nghiên cứu để đánh giá đầy đủ các khía cạnh dược lý và an toàn của các dẫn chất này trước khi có thể đưa vào ứng dụng lâm sàng.

6.1. Tóm tắt các kết quả chính của nghiên cứu

Nghiên cứu đã tổng hợp thành công các dẫn chất thơm mới mang khung 2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetamid và chứng minh hoạt tính ức chế AChE của chúng. Một số dẫn chất cho thấy hoạt tính tương đương hoặc cao hơn so với các thuốc điều trị Alzheimer hiện có. Điều này cung cấp bằng chứng ban đầu về tiềm năng của các dẫn chất tetrazol trong điều trị Alzheimer.

6.2. Hướng phát triển và ứng dụng trong tương lai

Trong tương lai, các nghiên cứu nên tập trung vào việc tối ưu hóa cấu trúc của các dẫn chất tetrazol để tăng cường hoạt tính ức chế AChE và giảm độc tính. Nghiên cứu dược động học và dược lực học cũng cần được thực hiện để hiểu rõ hơn về cách các dẫn chất này hoạt động trong cơ thể. Thử nghiệm lâm sàng là bước cuối cùng để xác định hiệu quả và an toàn của thuốc trên bệnh nhân Alzheimer. Các nhà khoa học, dược sĩ cần có thêm nhiều cố gắng trong công cuộc nghiên cứu, phòng ngừa, điều trị bệnh Alzheimer.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Bệnh Alzheimer (AD) là bệnh lý thoái hóa thần kinh mạn tính và không hồi phục, đặc trưng lâm sàng bởi sự suy giảm tiến triển về trí nhớ, rối loạn chức năng nhận thức, biến đổi hành vi và dẫn đến mất khả năng tự chủ trong sinh hoạt hàng ngày. Báo cáo năm 2023 của Liên đoàn bệnh Alzheimer Quốc tế (ADI) xác định AD là nguyên nhân hàng đầu gây ra hội chứng sa sút trí tuệ, chiếm khoảng 60% đến 80% tổng số ca bệnh. Theo thống kê của tổ chức này, toàn cầu có hơn 55 triệu người mắc sa sút trí tuệ vào năm 2019 và dự kiến tăng lên 139 triệu người vào năm 2050 do xu hướng già hóa dân số. Chi phí y tế và chăm sóc xã hội liên quan được dự báo tăng từ 1.300 tỷ USD (năm 2019) lên 2.800 tỷ USD vào năm 2030. Tại Việt Nam, số liệu thống kê năm 2015 ghi nhận khoảng 660.000 người mắc sa sút trí tuệ và ước tính sẽ đạt khoảng 1,2 triệu người vào năm 2030, tạo áp lực lớn lên hệ thống an sinh và y tế.

Mặc dù cơ chế bệnh sinh của Alzheimer còn nhiều điểm chưa sáng tỏ, các can thiệp dược lý được phê duyệt hiện vẫn rất hạn chế. Trong nhiều năm, Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) và Cơ quan Dược phẩm Châu Âu (EMA) chỉ cấp phép lưu hành 4 thuốc điều trị triệu chứng, bao gồm 3 chất ức chế enzym acetylcholinesterase (AChEI: donepezil, galantamin, rivastigmin) và 1 chất đối kháng thụ thể NMDA (memantin). Hai kháng thể đơn dòng kháng amyloid beta được FDA cấp phép gần đây là aducanumab (năm 2021) và lecanemab (năm 2023) có chi phí điều trị cao và tiềm ẩn nguy cơ tác dụng không mong muốn. Do đó, việc nghiên cứu các phân tử nhỏ mới tác động lên hệ cholinergic vẫn là hướng tiếp cận cần thiết.

Khung dị vòng tetrazol (vòng thơm 5 cạnh chứa 4 nguyên tử nitơ và 1 nguyên tử carbon) được xem là cấu đẳng sinh học (bioisostere) của nhóm acid carboxylic, sở hữu độ bền chuyển hóa cao và khả năng hình thành liên kết phối trí hoặc liên kết hydro với các đích sinh học. Từ các cơ sở trên, đề tài được thực hiện với 2 nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

1. Tổng hợp được khoảng 3-5 dẫn chất thơm mới mang khung 2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetamid.
2. Bước đầu đánh giá tác dụng ức chế acetylcholinesterase (AChE) của các dẫn chất tổng hợp được.

Đối tượng nghiên cứu là các dẫn chất thơm mang khung 2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetamid và enzym acetylcholinesterase từ loài lươn điện (Electrophorus electricus - eeAChE). Nghiên cứu được thực hiện tại Bộ môn Hóa dược, Khoa Công nghệ Hóa dược, Trường Đại học Dược Hà Nội; các phân tích phổ được phối hợp đo tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội và Viện Hóa Sinh Biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; hoàn thành vào tháng 6 năm 2024.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng giả thuyết cholinergic và cấu trúc không gian ba chiều của enzym acetylcholinesterase (AChE). AChE là enzym thuộc họ carboxylesterase, chịu trách nhiệm thủy phân chất dẫn truyền thần kinh acetylcholin (ACh) tại khe synap. Về mặt cấu trúc, AChE có một lòng kênh hẹp dài khoảng 20 Å và rộng khoảng 5 Å, liên kết hai vị trí chức năng quan trọng:

• Vùng trung tâm hoạt động (CAS): nằm ở đáy lòng kênh, chứa bộ ba acid amin xúc tác esteratic (Ser203, His447, Glu334 trên hAChE) và phân vùng anionic (với Trp86 đóng vai trò tạo tương tác cation-π với nhóm amoni bậc 4 của cholin).
• Vùng ngoại biên (PAS): nằm ở miệng kênh, chứa các acid amin thơm (Trp286, Tyr72, Tyr124, Tyr341) có chức năng bắt giữ tạm thời cơ chất và tham gia vào quá trình lắng đọng hình thành mảng bám amyloid.

Mô hình thiết kế chất ức chế AChE hướng tới các phối tử kép (dual-binding site inhibitors), gồm hai hợp phần thơm liên kết đồng thời với CAS và PAS thông qua một cầu nối có chiều dài và độ linh động thích hợp.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm bao gồm:

• Phương pháp tổng hợp hóa học: Thực hiện chuỗi phản ứng 4 giai đoạn gồm: phản ứng cộng đóng vòng [3+2] giữa pyridin-2-carbonitril và natri azid (NaN3) tạo vòng tetrazol; phản ứng N-alkyl hóa với ethyl 2-cloroacetat; phản ứng thủy phân ester trong môi trường kiềm (NaOH/MeOH) tạo acid carboxylic; và phản ứng amid hóa tạo dẫn chất đích với các anilin/amin thơm sử dụng hệ tác nhân ghép cặp carbodiimid (EDC.HCl, HOBt, base TEA).
• Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết: Sắc ký lớp mỏng (TLC) trên bản mỏng silica gel 60 F254 hoạt hóa ở 110 °C, soi dưới đèn tử ngoại bước sóng 254 nm; xác định khoảng nhiệt độ nóng chảy bằng thiết bị đo nhiệt điện Electrothermal digital.
• Phương pháp khẳng định cấu trúc: Phổ hồng ngoại (FTIR, kỹ thuật ép viên KBr, dải quét 4000-400 cm⁻¹); Phổ khối lượng phân giải cao (HRMS, phương pháp ion hóa phun mù điện tử ESI(+) trên hệ Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF LC/MS); Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton và carbon (¹H-NMR 500 MHz và ¹³C-NMR 125 MHz trên thiết bị Bruker AC-500 MHz, chuẩn nội TMS).
• Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học: Phương pháp so màu Ellman trên đĩa 96 giếng. Nguyên tắc dựa trên phản ứng thủy phân acetylthiocholin iodid (ATCI) bởi eeAChE giải phóng thiocholin; thiocholin phản ứng với thuốc thử DTNB (acid 5,5-dithiobis-2-nitrobenzoic) sinh ra acid 5-thio-2-nitrobenzoic có màu vàng, đo mật độ quang ở bước sóng 412 nm trên máy đọc VarioskanLux. Chất đối chứng dương là galantamin hydrobromid. Thử nghiệm tiến hành ở hai mức nồng độ 75 µM và 256 µM, lặp lại 3 lần.

Nguồn dữ liệu bao gồm số liệu thực nghiệm hóa lý (nhiệt độ nóng chảy, hệ số lưu giữ Rf, hiệu suất tổng hợp), các giá trị dịch chuyển hóa học/độ bội vạch phổ và phần trăm ức chế enzym thu được trực tiếp tại phòng thí nghiệm.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa cơ sở bệnh sinh của bệnh Alzheimer, tập trung vào hệ thống dẫn truyền thần kinh cholinergic và vai trò của AChE. Nội dung tổng quan phân tích chi tiết cấu trúc tinh thể học của AChE (từ TcAChE, hAChE), chỉ rõ cấu trúc lòng kênh hẹp chứa 14 acid amin thơm được bảo tồn, cơ chế mở "cửa sau" (thông qua sự chuyển dịch của Trp86 và cấu trúc Ω-loop) và "cửa bên" giải phóng sản phẩm thủy phân cholin và acid acetic. Chương này cũng phân loại các nhóm chất ức chế AChE (thuận nghịch và không thuận nghịch), phân tích các dẫn chất đối chứng và dẫn chất nghiên cứu trước đó mang cấu trúc tương tác kép (như KL1-KL7, dẫn chất isochromanon, carbazol). Đồng thời, tác giả tổng hợp dữ liệu về hoạt tính sinh học của dị vòng tetrazol, các công trình đi trước phát triển chất ức chế AChE mang khung tetrazol (như các dẫn chất của Ali Dişli, Niels V. Heise) và phân tích các phương pháp hóa học tổng hợp khung tetrazol qua phản ứng cộng đóng vòng [3+2] giữa hợp chất nitril và dẫn xuất azid có sử dụng xúc tác muối kẽm hoặc chiếu xạ vi sóng.

Chương 2: Nguyên liệu, thiết bị, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 liệt kê chi tiết danh mục 29 loại hóa chất, dung môi (xuất xứ từ Đức, Mỹ, Nhật Bản, Trung Quốc, Ấn Độ) và hệ thống trang thiết bị phân tích. Nội dung chương trình bày cụ thể quy trình thao tác chuẩn:

• Thiết kế quy trình tổng hợp 5 dẫn chất thơm IVa-e qua các hợp chất trung gian ethyl 2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetat (II) và acid 2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetic (III).
• Thông số kỹ thuật của các hệ dung môi khai triển sắc ký (hệ EA:n-hexan tỷ lệ 1:1, 2:1 và DCM:MeOH tỷ lệ 24:1).
• Quy chuẩn pha chế mẫu thử và nồng độ hóa chất trong thử nghiệm Ellman: 20 µL dung dịch thử, 20 µL DTNB 19,2 mM, 20 µL ATCI 19,2 mM, 20 µL eeAChE 0,25 IU/mL và bổ sung đệm phosphat pH 8,0 vừa đủ thể tích 100 µL; thời gian ủ 30 phút ở 25 °C; công thức toán học tính phần trăm ức chế enzym dựa trên độ hấp thụ của mẫu thử, mẫu kiểm chứng (control) và mẫu trắng (blank).

Chương 3: Thực nghiệm và kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được từ quá trình tổng hợp hóa học, kiểm tra độ tinh khiết, phân tích phổ khẳng định cấu trúc và đo hoạt tính ức chế sinh học:

• Tổng hợp chất trung gian II: Thực hiện theo phương pháp one-pot kết hợp phản ứng cộng đóng vòng [3+2] giữa pyridin-2-carbonitril (5 mmol), NaN3 (7,5 mmol) với xúc tác ZnCl2 (0,5 mmol) trong DMF ở 120 °C trong 3 giờ, sau đó hạ nhiệt độ xuống 60 °C và thêm ethyl 2-cloroacetat (7,5 mmol), phản ứng trong 3 giờ. Khảo sát cho thấy việc sử dụng 1,5 đương lượng NaN3 giúp phản ứng diễn ra hoàn toàn và nhanh nhất. Do phản ứng N-alkyl hóa tạo ra 2 đồng phân vị trí (N1 và N2), sản phẩm được phân tách qua sắc ký cột silica gel để thu lấy đồng phân N1 phân cực hơn (chất II) với hiệu suất 60% (699 mg), Rf = 0,4 (EA:n-hexan 1:1).
• Tổng hợp chất trung gian III: Thủy phân chất II (10 mmol) bằng dung dịch NaOH (20 mmol, 2,0 đương lượng) trong dung môi MeOH ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, acid hóa bằng HCl đặc về pH 1-2, loại bỏ muối vô cơ NaCl bằng hỗn hợp dung môi MeOH:DCM (2:1). Hiệu suất thu nhận acid III đạt 90% (1,85 g), Rf = 0,3 (DCM:MeOH 15:1).
• Tổng hợp dãy chất mục tiêu IVa-e: Thực hiện phản ứng ghép amid giữa acid III (0,5 mmol) với 5 amin thơm khác nhau (0,6 mmol, 1,2 đương lượng) sử dụng EDC.HCl (1,0 đương lượng), HOBt (1,0 đương lượng) và TEA (2,0 đương lượng) trong hỗn hợp DCM:DMF ở nhiệt độ phòng trong 4 giờ. Việc bổ sung HOBt giúp hạn chế sản phẩm phụ N-acylurea từ quá trình chuyển vị của chất trung gian O-acylurea, đồng thời TEA đóng vai trò trung hòa lượng HCl giải phóng từ EDC.HCl. Hiệu suất tổng hợp các chất nằm trong khoảng 56% đến 68%.
• Dữ liệu độ tinh khiết và phổ học: Tất cả các chất IVa-e đều cho một vết tròn gọn trên sắc ký lớp mỏng và có khoảng nóng chảy hẹp (chênh lệch 1-2 °C). Phổ IR ghi nhận đầy đủ các dao động đặc trưng: dải hấp thụ N-H amid (3232-3333 cm⁻¹), C=O amid (1673-1719 cm⁻¹), C=N (1577-1677 cm⁻¹), và liên kết C-X halogen (734-736 cm⁻¹). Khối phổ phân giải cao HRMS xác nhận các pic ion phân tử giả [M+H]⁺ hoàn toàn trùng khớp với khối lượng tính toán lý thuyết. Phổ ¹H-NMR chỉ rõ tín hiệu mũi đơn của nhóm methylen (-CH2-CO-) ở vùng 5,76-5,89 ppm, proton -NH- amid ở vùng trường thấp 9,82-11,19 ppm cùng các vân tách tương ứng của khung pyridin và vòng thơm thế. Phổ ¹³C-NMR xác nhận tín hiệu carbon carbonyl (C=O) cố định ở 164,7 ppm, carbon vòng tetrazol (N=C-N) ở 162,8-164,3 ppm, carbon nhóm methylen ở 55,6-56,0 ppm.
• Thử nghiệm hoạt tính ức chế AChE: Ở nồng độ 75 µM, các chất IVa, IVc, IVd không biểu hiện tác dụng ức chế (N/E); chất IVb và IVe ức chế yếu với tỷ lệ lần lượt là 15,2% và 15,6%. Khi nâng nồng độ lên 256 µM, toàn bộ 5 chất đều thể hiện tác dụng ức chế trong khoảng từ 20,0% đến 50,8%, trong đó chất IVe đạt giá trị cao nhất (50,8%).

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã tổng hợp thành công 5 dẫn chất thơm mới mang khung 2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetamid ký hiệu từ IVa đến IVe với cấu trúc được xác minh qua các dữ liệu hóa lý và phổ nghiệm.

Bảng tổng hợp đặc tính hóa lý, hiệu suất và hoạt tính sinh học của các dẫn chất tổng hợp được:

Ký hiệu	Tên hóa học / Nhóm thế thơm	Công thức phân tử	Khối lượng phân tử (g/mol)	Hiệu suất tổng hợp (%)	Nhiệt độ nóng chảy (°C)	% Ức chế AChE (75 µM)	% Ức chế AChE (256 µM)
IVa	N-(4-bromophenyl)	C₁₄H₁₁BrN₆O	359,19	63	241,7 - 243,0	N/E	39,1
IVb	N-(2-fluoro-4-iodophenyl)	C₁₄H₁₀FIN₆O	424,18	60	206,8 - 208,2	15,2	42,8
IVc	N-(4-methoxyphenyl)	C₁₅H₁₄N₆O₂	310,32	66	195,1 - 196,4	N/E	28,6
IVd	N-(2,4-dimethoxyphenyl)	C₁₆H₁₆N₆O₃	340,34	56	193,5 - 194,6	N/E	20,0
IVe	N-(pyridin-2-yl)	C₁₃H₁₁N₇O	281,28	68	198,6 - 199,2	15,6	50,8

(Ghi chú: N/E: non-effective - không thể hiện hoạt tính ở nồng độ thử nghiệm. Chất đối chứng dương Galantamin hydrobromid có IC₅₀ = 2,5 ± 0,2 µM).

Phân tích mối liên quan giữa cấu trúc hóa học và tác dụng sinh học (SAR) từ kết quả thực nghiệm chỉ ra:

• Bản chất của vòng thơm liên kết qua nhóm chức amid ảnh hưởng rõ rệt đến hoạt tính ức chế enzym: Việc thay thế nhân phenyl bằng dị vòng thơm pyridin-2-yl (dẫn chất IVe) mang lại khả năng ức chế AChE cao nhất trong dãy nghiên cứu ở cả hai mức nồng độ (15,6% ở 75 µM và 50,8% ở 256 µM).
• Ảnh hưởng của nhóm thế trên vòng benzen: Dẫn chất mang các nhóm thế halogen hút điện tử (2-F, 4-I ở chất IVb) cho hoạt tính ức chế (42,8% ở 256 µM) tốt hơn so với dẫn chất mang nhóm 4-Br đơn lẻ (IVa, 39,1%). Ngược lại, sự xuất hiện của các nhóm thế methoxy (-OCH3) đẩy điện tử trên nhân thơm (chất IVc với 4-OCH3 và chất IVd với 2,4-(OCH3)2) làm giảm khả năng ức chế enzym (lần lượt đạt 28,6% và 20,0% ở 256 µM).

Về mặt đóng góp khoa học, nghiên cứu đã xây dựng quy trình thực nghiệm one-pot thuận tiện để tạo khung este tetrazol trung gian, chuẩn hóa điều kiện phản ứng ghép nối amid êm dịu cho khung phân tử này, đồng thời cung cấp bộ dữ liệu phổ đầy đủ và số liệu sàng lọc ban đầu làm giàu cơ sở dữ liệu về các phân tử ức chế acetylcholinesterase mang khung tetrazol.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận ghi nhận một số giới hạn thực nghiệm:

• Số lượng dẫn chất được thiết kế và tổng hợp còn hạn chế (5 chất), cấu trúc chỉ tập trung biến đổi nhóm thế trên vòng anilin hoặc thay bằng pyridin-2-amin mà chưa khảo sát biến đổi chiều dài và tính linh động của cầu nối alkyl/acetamid.
• Hoạt tính ức chế AChE của dãy chất mới chỉ dừng ở mức trung bình đến yếu, chưa xác định được giá trị nồng độ ức chế bán tối đa IC50 dạng micromol thấp do tỷ lệ ức chế ở 256 µM dao động từ 20,0% đến 50,8% (chỉ có IVe đạt trên 50%), còn khoảng cách lớn so với chất chuẩn galantamin (IC50 = 2,5 µM).
• Đánh giá sinh học mới tiến hành trên enzym acetylcholinesterase nguồn gốc lươn điện (eeAChE) tại 2 mức nồng độ sàng lọc cố định (75 µM và 256 µM), chưa thử nghiệm trên enzym người (hAChE), chưa đánh giá tính chọn lọc với butyrylcholinesterase (BuChE) cũng như độc tính tế bào in vitro.

Hướng nghiên cứu tiếp theo được đề xuất:

• Mở rộng thư viện dẫn chất bằng cách biến đổi độ dài chuỗi liên kết giữa dị vòng tetrazol và nhóm chức amid, khảo sát thêm các nhóm thế thơm hoặc dị vòng khác nhau.
• Tiến hành đo hoạt tính ở dải nồng độ mở rộng để xây dựng đường cong ức chế và tính toán giá trị IC50 thực nghiệm cho các chất tiềm năng như IVe và IVb.
• Thực hiện các mô phỏng gắn kết phân tử (molecular docking) để giải thích cơ chế tương tác không gian chi tiết giữa các dẫn chất với vùng CAS và PAS của enzym AChE, làm cơ sở tối ưu hóa cấu trúc.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu chuyên ngành Hóa dược, Hóa học các hợp chất thiên nhiên và Hóa hữu cơ tổng hợp:

• Cung cấp quy trình chi tiết về phản ứng one-pot tổng hợp dẫn xuất tetrazol từ hợp chất nitril và natri azid với xúc tác ZnCl2, cùng giải pháp xử lý phân tách hỗn hợp đồng phân vị trí N1 và N2 trên cột silica gel.
• Cung cấp phương pháp ghép amid sử dụng hệ tác nhân EDC.HCl/HOBt/TEA ở điều kiện nhiệt độ phòng, áp dụng hiệu quả cho các cơ chất chứa dị vòng có tính base hoặc acid carboxylic kém hoạt động mà không cần dùng đến thionyl clorid.
• Bộ thông số phổ hoàn chỉnh (IR, HRMS, ¹H-NMR, ¹³C-NMR có gán tín hiệu cụ thể) đóng vai trò làm dữ liệu đối sánh cấu trúc cho các nghiên cứu tổng hợp dị vòng 5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol.
• Quy trình chuẩn bị hóa chất và thực hiện thử nghiệm sinh học ức chế AChE theo phương pháp Ellman trên đĩa 96 giếng là tài liệu thực hành hữu ích cho các phòng thí nghiệm sàng lọc hoạt tính sinh học in vitro.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao phản ứng tổng hợp chất trung gian II cần tiến hành theo phương pháp one-pot và lượng tác nhân ethyl 2-cloroacetat phải dùng ở tỷ lệ 1,5 đương lượng?
Phương pháp one-pot được lựa chọn vì muối natri tetrazoat trung gian sinh ra sau phản ứng cộng đóng vòng rất tan trong nước, gây khó khăn cho việc chiết xuất và cô lập riêng lẻ để thực hiện bước alkyl hóa tiếp theo. Lượng ethyl 2-cloroacetat phải nâng lên 1,5 đương lượng nhằm bù trừ lượng tác nhân bị tiêu hao do phản ứng phụ với lượng natri azid (NaN3) còn dư từ giai đoạn đóng vòng trước đó, đảm bảo phản ứng alkyl hóa đạt hiệu suất tối ưu.

2. Phản ứng alkyl hóa muối tetrazoat tạo ra những đồng phân nào và tác giả lựa chọn đồng phân nào để đi tiếp?
Muối tetrazoat có hai dạng hỗ biến nên phản ứng N-alkyl hóa tạo ra hai đồng phân vị trí ở nguyên tử nitơ N1 và N2 của vòng tetrazol. Tác giả đã tiến hành tách hai đồng phân này bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi ethyl acetat:n-hexan (1:1). Đồng phân thế tại vị trí N1 (phân cực hơn, Rf = 0,4) được thu nhận để tiếp tục các phản ứng thủy phân và amid hóa tiếp theo; đồng phân N2 kém phân cực hơn bị loại bỏ.

3. Vai trò của HOBt và TEA trong phản ứng amid hóa tạo dãy chất IVa-e là gì?
Trong phản ứng ghép amid, acid III phản ứng với EDC tạo chất trung gian O-acylurea. Chất này dễ bị chuyển vị nội phân tử thành sản phẩm phụ N-acylurea không hoạt động. Sự có mặt của HOBt giúp chuyển hóa nhanh O-acylurea thành ester hoạt hóa HOBt (E1), ngăn ngừa chuyển vị và tạo điều kiện thuận lợi cho amin thơm tấn công ái nhân. Triethylamin (TEA) được thêm vào với tỷ lệ 2,0 đương lượng để trung hòa ion Cl⁻ và phân tử HCl sinh ra từ muối EDC.HCl, tránh việc HCl phản ứng tạo muối amoni với amin thơm làm mất hoạt tính ái nhân của tác nhân này.

4. Dẫn chất nào thể hiện hoạt tính ức chế acetylcholinesterase cao nhất và số liệu cụ thể là bao nhiêu?
Dẫn chất thể hiện hoạt tính ức chế tốt nhất trong nghiên cứu là chất IVe (N-(pyridin-2-yl)-2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetamid). Ở nồng độ 75 µM, IVe có tỷ lệ ức chế là 15,6% (trong khi các chất IVa, IVc, IVd không biểu hiện tác dụng); ở nồng độ 256 µM, IVe đạt tỷ lệ ức chế là 50,8%, là chất duy nhất trong dãy đạt mức ức chế trên 50% ở nồng độ này.

5. Hoạt tính ức chế của các chất tổng hợp được so với chất đối chứng galantamin như thế nào?
Hoạt tính ức chế AChE của cả 5 dẫn chất IVa-e đều thấp hơn đáng kể so với chất đối chứng dương galantamin hydrobromid. Galantamin thể hiện tác dụng ức chế mạnh ở thang nồng độ micromol thấp với giá trị IC50 xác định được là 2,5 ± 0,2 µM, trong khi các dẫn chất IVa-e chỉ biểu hiện ức chế từ 20,0% đến 50,8% khi ở nồng độ rất cao là 256 µM.

Kết luận

Khóa luận đã hoàn thành việc tổng hợp, tinh chế và xác định cấu trúc của 5 dẫn chất thơm mới mang khung 2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetamid (IVa-e) cùng 2 hợp chất trung gian với hiệu suất phản ứng đạt mức khá (56% đến 90%). Đánh giá hoạt tính sinh học in vitro theo phương pháp Ellman cho thấy các hợp chất thể hiện tác dụng ức chế AChE ở nồng độ 256 µM (từ 20,0% đến 50,8%), trong đó dẫn chất mang dị vòng pyridin-2-yl (IVe) đạt hiệu quả ức chế cao nhất (50,8%). Mặc dù hoạt tính sinh học chưa đạt mức tối ưu so với thuốc đối chứng galantamin, công trình đã đóng góp quy trình thực nghiệm tổng hợp tin cậy và bổ sung dữ liệu cấu trúc - tác dụng bước đầu cho các nghiên cứu phát triển chất ức chế acetylcholinesterase mang dị vòng tetrazol.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Bệnh Alzheimer và giả thuyết cholinergic trong bệnh Alzheimer 1. Giới thiệu về bệnh Alzheimer Bệnh Alzheimer (AD) là nguyên nhân phổ biến nhất gây chứng mất trí nhớ, đặc biệt ở người già trên 65 tuổi và cho đến nay chưa có phương pháp điều trị hiệu quả cho căn bệnh này [43]. AD được tổ chức Y tế Thế giới định nghĩa là bệnh thoái hóa thần kinh không rõ nguyên căn, đặc trưng bởi sự suy giảm trí nhớ và nhận thức [29, 43].

AD được Alois Alzheimer mô tả lần đầu tiên vào năm 1906 sau khi ông gặp một phụ nữ 51 tuổi tên Auguste Deter có các triệu chứng như rối loạn nhận thức, phương hướng, ảo tưởng và thay đổi hành vi [48]. Alois Alzheimer tập trung vào các giai đoạn suy giảm chức năng của Auguste bao gồm: đầu tiên là suy giảm trí nhớ; sau đó là ảo tưởng và rối loạn giấc ngủ; và cuối cùng là suy giảm nhận thức và ý thức. Qua kết quả đánh giá bệnh học thần kinh, Alois nhận thấy bệnh nhân có tình trạng teo não lan tỏa cùng với những mảng bám bất thường ở tế bào vỏ não [37, 48]. Mặc dù đã được mô tả định tính vào năm 1906 bởi Alois, tận tới giữa những năm 1980, các nhà khoa học mới xác định được hai dấu ấn sinh học quan trọng của AD bao gồm sự tích lũy của peptid amyloid beta (Aβ) trong các mảng bám và sự tăng phosphoryl hóa của protein tau trong đám rối sợi thần kinh (NFTs) [37].

Từ những phát hiện ban đầu này, các nghiên cứu bệnh lý thần kinh của AD đã tiếp tục phát triển và đóng góp vào việc phát hiện các triệu chứng lâm sàng của AD cũng như bệnh sa sút trí tuệ [37, 39]. Bên cạnh hai dấu ấn sinh học bao gồm sự tích lũy peptid Aβ và sự tăng phosphoryl hóa của protein tau trong đám rối thần kinh ở não bệnh nhân, AD còn đặc trưng bởi nồng độ thấp các chất dẫn truyền thần kinh acetylcholin (ACh), sự mất các sợi cholinergic, nhiễm độc thần kinh, giảm dẫn truyền thần kinh, tăng các yếu tố stress oxy hóa, viêm thần kinh mãn tính, rối loạn cân bằng kim loại và các rối loạn liên quan khác [51]. Từ đó, nhiều giả thuyết về cơ chế bệnh sinh của AD đã được tìm hiểu và phát triển nhằm tìm kiếm các phương pháp tiềm năng để can thiệp, ngăn chặn và điều trị hiệu quả AD. Các giả thuyết bao gồm: giả thuyết cholinergic, giả thuyết mảng bám amyloid, giả thuyết ion kim loại, giả thuyết tau, giả thuyết lysosome,… [39, 47].

Giả thuyết cholinergic trong bệnh Alzheimer 1. Acetylcholin và hệ dẫn truyền cholinergic Acetylcholin (ACh) là chất dẫn truyền thần kinh được sử dụng bởi tất cả các tế bào thần kinh cholinergic và đóng vai trò rất quan trọng trong hệ thần kinh trung ương và ngoại biên. Trong hệ thần kinh trung ương, các tế bào thần kinh cholinergic cùng chất dẫn truyền thần kinh ACh chịu trách nhiệm chủ chốt trong việc điều hòa các chức năng và hoạt động sinh lý của hệ thống thần kinh bao gồm: sự tập trung, ghi nhớ, đáp ứng với stress, chu kỳ giấc ngủ và tiếp nhận thông tin từ các giác quan [13, 25]. 3 ACh được tổng hợp ở trong các nơron tiền synap từ cholin và acetyl-coenzym A (acetyl-CoA) bởi enzym cholin acetyltransferase (ChAT), sau đó ACh được chuyển vào trong túi dự trữ của synap (synaptic vesicle) qua kênh vận chuyển acetylcholin.

Quá trình khử cực ở tiền synap thúc đẩy quá trình giải phóng acetylcholin từ bọc synap vào khe synap. Tại đây, ACh có thể gắn với các thụ thể nicotinic hoặc muscarinic dẫn đến phản ứng kích thích hay ức chế dẫn truyền thần kinh. Bên cạnh đó, ACh có thể nhanh chóng bị thủy phân và bất hoạt bởi AChE tạo acetat và cholin.