ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG VI SINH VẬT CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT BÁN TỔNG HỢP TỪ EUGENOL

Nghiên cứu tác dụng kháng vi sinh vật của hợp chất bán tổng hợp từ Eugenol. Khám phá tiềm năng ứng dụng dược phẩm mới. Tìm hiểu chi tiết tại đây!

• Tác giả: Lê Thanh Huyền
• Người hướng dẫn: Ts. Nguyễn Khắc Tiệp
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Đánh Giá Tác Dụng Kháng Vi Sinh Vật Của Một Số Hợp Chất Bán Tổng Hợp Từ Eugenol
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1.1. Hợp chất bán tổng hợp có tác dụng kháng vi sinh vật
• 1.1.1. Đại cương về hợp chất bán tổng hợp
• 1.2. Hoạt tính kháng vi sinh vật của các hợp chất bán tổng hợp từ thành phần của thực vật
• 1.3. Hoạt tính kháng biofilm của các hợp chất bán tổng hợp từ thành phần của thực vật
• 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu và nguyên vật liệu
• 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.1.2. Nguyên vật liệu
• 2.2. Nội dung nghiên cứu
• 2.2.1. Nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh vật ở dạng tự do của một số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol
• 2.2.2. Nghiên cứu hoạt tính kháng biofilm Staphylococcus aureus của một số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Chuẩn bị môi trường và hoạt hóa chủng
• 2.3.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật ở dạng tự do
• 2.3.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng biofilm S.
• 2.3.4. Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật bằng phương pháp cấy đếm trên đĩa thạch
• 2.3.5. Phương pháp đánh giá độc tính qua ly giải tế bào hồng cầu
• 2.3.6. Phương pháp xây dựng đường cong – nồng độ đáp ứng
• 2.3.7. Phương pháp thống kê – xử lý số liệu
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật ở dạng tự do của một số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol
• 3.1.1. Kết quả MIC
• 3.1.2. Kết quả MBC
• 3.1.3. Kết quả diệt vi sinh vật ở dạng tự do theo nồng độ của mẫu LT4
• 3.1.4. Kết quả diệt vi sinh vật ở dạng tự do theo thời gian của mẫu LT4
• 3.2. Hoạt tính kháng biofilm S.aureus của một số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol
• 3.2.1. Khảo sát hoạt tính kháng biofilm S.aureus của eugenol và một số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol
• 3.2.2. Hoạt tính kháng biofilm S.aureus của mẫu LT4 đa nồng độ
• 3.2.3. Hoạt tính kháng biofilm S.aureus của mẫu LT4 theo thời gian
• 3.3. Thử độc tính đánh giá qua ly giải tế bào hồng cầu
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Eugenol Hợp Chất Bán Tổng Hợp Tiềm Năng Kháng Khuẩn

Thời đại kháng sinh vàng đã qua, nhường chỗ cho nỗi lo kháng kháng sinh. Theo ước tính năm 2019, tình trạng kháng thuốc gây ra 1.27 triệu ca tử vong trên toàn cầu. Do đó, tìm kiếm các giải pháp thay thế kháng sinh trở nên cấp thiết. Các hợp chất tự nhiên, đặc biệt là Eugenol, mở ra hướng đi đầy hứa hẹn. Eugenol, một phenylpropanoid, có mặt trong nhiều loại tinh dầu. Nó thể hiện nhiều hoạt tính sinh học tiềm năng, nổi bật nhất là kháng vi sinh vật. Nghiên cứu hợp chất bán tổng hợp Eugenol nhằm tạo ra các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn mạnh mẽ hơn. Đề tài "Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của một số hợp chất bán tổng hợp từ Eugenol" được thực hiện để khai thác tiềm năng này. Mục tiêu là đánh giá khả năng kháng vi sinh vật và kháng biofilm của các hợp chất bán tổng hợp từ Eugenol.

1.1. Eugenol Khám phá nguồn gốc và đặc tính sinh học

Eugenol, thành phần chính trong tinh dầu đinh hương, hương nhu trắng và trầu không, được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm và mỹ phẩm. Gần đây, nhiều nghiên cứu chứng minh hoạt tính sinh học đa dạng của Eugenol, bao gồm kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa và chống ung thư. Trong số đó, khả năng kháng vi sinh vật của Eugenol là nổi bật, khiến nó trở thành một hợp chất tự nhiên đáng chú ý. Nghiên cứu của Lê Thanh Huyền (2024) tập trung vào đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật của một số hợp chất bán tổng hợp từ Eugenol, mở ra tiềm năng ứng dụng dược phẩm đầy hứa hẹn.

1.2. Hợp chất bán tổng hợp Phương pháp tạo ra hoạt tính vượt trội

Bán tổng hợp là phương pháp tổng hợp hóa học sử dụng sản phẩm tự nhiên làm nguyên liệu ban đầu. Phương pháp này có thể chọn lọc các hợp chất có hoạt tính mạnh hơn chất ban đầu. Từ năm 1940 đến năm 2019, có 286 hợp chất có nguồn gốc tự nhiên được phê duyệt là sản phẩm bán tổng hợp, chủ yếu là thuốc kháng vi sinh vật và chống ung thư. Aspirin là một ví dụ điển hình cho thành công của phương pháp này. Việc sử dụng nguyên liệu tự nhiên giúp giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường so với tổng hợp hữu cơ truyền thống.

II. Tổng Quan Thách Thức Tình Trạng Kháng Kháng Sinh Hiện Nay

Tình trạng kháng thuốc ngày càng trở nên nghiêm trọng, gây ra nhiều thách thức cho ngành y tế. Các biện pháp, chiến lược đã và đang được triển khai, trong đó sàng lọc và tổng hợp thuốc từ nguồn nguyên liệu tự nhiên cho thấy nhiều dấu hiệu tích cực. Theo Lê Thanh Huyền (2024), nhiều biện pháp, chiến lược đã và đang được triển khai, trong đó sàng lọc và tổng hợp thuốc từ nguồn nguyên liệu tự nhiên cho thấy nhiều dấu hiệu tích cực. Hợp chất bán tổng hợp có tiềm năng vượt trội so với kháng sinh truyền thống do có cơ chế tác dụng khác biệt và khả năng khắc phục tình trạng kháng thuốc.

2.1. Biofilm Rào cản trong điều trị nhiễm trùng vi sinh vật

Vi khuẩn không chỉ tồn tại ở dạng tự do mà còn có thể tồn tại dưới dạng biofilm, một cộng đồng vi sinh vật nằm trong chất nền ngoại bào. Biofilm có vai trò trong lây truyền và hình thành các chủng kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh. Biofilm Staphylococcus aureus là một nguyên nhân chính gây nhiễm trùng bệnh viện. Nghiên cứu hoạt tính kháng biofilm của các hợp chất bán tổng hợp là rất quan trọng.

2.2. Cơ chế kháng thuốc của vi sinh vật trong Biofilm

Vi khuẩn trong biofilm có sức đề kháng với điều kiện ngoại cảnh cao hơn so với vi khuẩn ở dạng tự do. Chất nền ngoại bào của biofilm cản trở sự khuếch tán của kháng sinh. Môi trường thay đổi trong biofilm có thể dẫn đến sự hiện diện của các vi khuẩn dai dẳng. Các vi sinh vật trong biofilm có xu hướng chuyển sang kiểu hình “dai dẳng” hoặc “dung nạp”, đặc trưng cho một phần hoặc tất cả quần thể vi khuẩn không đáp ứng với điều trị bằng kháng sinh.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Tác Dụng Kháng Vi Sinh Vật Eugenol

Nghiên cứu của Lê Thanh Huyền (2024) tập trung vào đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật của Eugenol và các hợp chất bán tổng hợp. Các phương pháp nghiên cứu in vitro được sử dụng để xác định MIC (Nồng độ ức chế tối thiểu) và MBC (Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu). Hoạt tính kháng biofilm cũng được đánh giá trên Staphylococcus aureus. Thử nghiệm độc tính được thực hiện để đánh giá tính an toàn của các hợp chất.

3.1. Xác định MIC và MBC Tiêu chuẩn đánh giá hoạt tính kháng khuẩn

MIC (Nồng độ ức chế tối thiểu) và MBC (Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu) là các chỉ số quan trọng để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một chất. MIC là nồng độ thấp nhất của chất có thể ức chế sự phát triển của vi sinh vật. MBC là nồng độ thấp nhất của chất có thể diệt vi sinh vật. Các phương pháp xác định MIC và MBC được chuẩn hóa để đảm bảo tính chính xác và so sánh giữa các nghiên cứu.

3.2. Đánh giá hoạt tính kháng biofilm Nghiên cứu trên Staphylococcus aureus

Nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng biofilm của Eugenol và các hợp chất bán tổng hợp trên Staphylococcus aureus, một loại vi khuẩn gây nhiễm trùng phổ biến. Phương pháp nhuộm tinh thể tím (Crystal Violet) được sử dụng để đo lường tổng sinh khối biofilm. Phương pháp đo huỳnh quang được sử dụng để đánh giá hoạt tính trao đổi chất của vi khuẩn trong biofilm.

3.3. Thử nghiệm độc tính Đảm bảo an toàn khi ứng dụng dược phẩm

Thử nghiệm độc tính đánh giá qua ly giải tế bào hồng cầu. Mục đích là đánh giá tác động của các hợp chất lên tế bào máu. Kết quả thử nghiệm độc tính là quan trọng để xác định liều lượng an toàn khi ứng dụng dược phẩm của các hợp chất.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Hợp Chất LT4 Tiềm Năng Kháng Khuẩn Mạnh

Nghiên cứu của Lê Thanh Huyền (2024) cho thấy một số hợp chất bán tổng hợp từ Eugenol có hoạt tính kháng vi sinh vật đáng kể. Đặc biệt, hợp chất LT4 cho thấy tiềm năng kháng khuẩn mạnh mẽ trên nhiều loại vi khuẩn và nấm. LT4 cũng có hoạt tính kháng biofilm trên Staphylococcus aureus. Kết quả nghiên cứu mở ra triển vọng ứng dụng LT4 trong dược phẩm.

4.1. Hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng của hợp chất LT4

Kết quả MIC và MBC cho thấy hợp chất LT4 có hoạt tính kháng khuẩn trên nhiều loại vi khuẩn Gram dương và Gram âm. LT4 cũng có hoạt tính kháng nấm trên Candida albicans. Phổ kháng khuẩn rộng của LT4 là một ưu điểm quan trọng.

4.2. LT4 Tiềm năng ức chế và loại bỏ biofilm Staphylococcus aureus

LT4 cho thấy khả năng ức chế sự hình thành biofilm Staphylococcus aureus. LT4 cũng có khả năng phá vỡ biofilm đã hình thành. Hoạt tính kháng biofilm của LT4 có thể giúp giải quyết vấn đề nhiễm trùng mạn tính do vi khuẩn biofilm.

V. Ứng Dụng Dược Phẩm Hướng Phát Triển Eugenol Bán Tổng Hợp

Các hợp chất bán tổng hợp từ Eugenol, đặc biệt là LT4, có tiềm năng lớn trong ứng dụng dược phẩm. Chúng có thể được sử dụng để phát triển các loại thuốc mới điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn và nấm. Ngoài ra, chúng có thể được sử dụng làm chất bảo quản tự nhiên trong thực phẩm và mỹ phẩm. Nghiên cứu cần được tiếp tục để đánh giá độc tính và hiệu quả in vivo của các hợp chất.

5.1. Phát triển thuốc kháng khuẩn mới từ hợp chất bán tổng hợp Eugenol

Các hợp chất bán tổng hợp từ Eugenol có thể được sử dụng để phát triển các loại thuốc mới điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn và nấm kháng kháng sinh. Chúng có thể được sử dụng trong điều trị nhiễm trùng da, nhiễm trùng đường hô hấp và các loại nhiễm trùng khác.

5.2. Eugenol Giải pháp tự nhiên thay thế chất bảo quản hóa học

Eugenol và các hợp chất bán tổng hợp có thể được sử dụng làm chất bảo quản tự nhiên trong thực phẩm và mỹ phẩm. Chúng có thể giúp kéo dài thời hạn sử dụng của sản phẩm và giảm thiểu việc sử dụng các chất bảo quản hóa học.

VI. Kết Luận Tương Lai Nghiên Cứu Hợp Chất Bán Tổng Hợp Eugenol

Nghiên cứu của Lê Thanh Huyền (2024) đã cung cấp bằng chứng về tiềm năng của Eugenol và các hợp chất bán tổng hợp trong việc chống lại vi khuẩn và nấm. Cần có thêm nghiên cứu để hiểu rõ hơn về cơ chế tác dụng và độc tính của các hợp chất. Việc phát triển các sản phẩm dựa trên Eugenol và các hợp chất bán tổng hợp có thể đóng góp vào cuộc chiến chống lại tình trạng kháng kháng sinh.

6.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo Đánh giá độc tính và hiệu quả in vivo

Nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào đánh giá độc tính và hiệu quả in vivo của hợp chất LT4. Các nghiên cứu in vivo sẽ giúp xác định liều lượng an toàn và hiệu quả của LT4 trong điều trị nhiễm trùng. Ngoài ra, cần nghiên cứu cơ chế tác dụng của LT4 để tối ưu hóa hiệu quả kháng khuẩn.

6.2. Tiềm năng thương mại hóa Phát triển sản phẩm từ Eugenol

Việc phát triển các sản phẩm dựa trên Eugenol và các hợp chất bán tổng hợp, đặc biệt là LT4, có tiềm năng thương mại hóa lớn. Các sản phẩm này có thể bao gồm thuốc điều trị nhiễm trùng, chất bảo quản thực phẩm và mỹ phẩm.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Kháng kháng sinh hiện là một trong những thách thức y tế toàn cầu nghiêm trọng nhất. Theo thống kê năm 2019, tình trạng kháng thuốc do vi khuẩn là nguyên nhân trực tiếp dẫn đến khoảng 1,27 triệu ca tử vong trên toàn cầu, trong đó khu vực Đông Nam Á và Đông Á ghi nhận khoảng 254.000 ca tử vong. Trong khi các chương trình sàng lọc hóa học tổ hợp nhắm vào các mục tiêu sinh học truyền thống đạt hiệu quả hạn chế và phụ thuộc nhiều vào nguồn nguyên liệu dầu mỏ không tái tạo, việc khai thác các hợp chất tự nhiên từ thực vật thông qua phương pháp bán tổng hợp đang mở ra hướng phát triển các hoạt chất kháng khuẩn mới có cấu trúc đa dạng và cơ chế tác dụng chuyên biệt.

Eugenol (4-allyl-2-methoxyphenol) là một hợp chất phenylpropanoid tự nhiên có hàm lượng cao trong tinh dầu của một số loài thực vật như đinh hương (Syzygium aromaticum, chiếm 82,4%), trầu không (Piper betle, chiếm 77,24%) và hương nhu trắng (Ocimum gratissimum, chiếm 54,42%). Mặc dù eugenol đã được chứng minh có hoạt tính sinh học đa dạng (kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa, giảm đau, sát trùng nha khoa), hoạt chất này tồn tại nhiều nhược điểm về hóa lý và dược động học: độ hòa tan trong nước thấp (khoảng 2460 mg/L ở 25°C), dễ bay hơi, độ ổn định hóa học kém, nhạy cảm với quá trình oxy hóa, bị hấp thu và chuyển hóa nhanh qua gan dẫn đến sinh khả dụng thấp. Do đó, việc ứng dụng phản ứng bán tổng hợp để biến đổi cấu trúc eugenol thành các dẫn chất mới nhằm tối ưu hóa hoạt tính kháng khuẩn và cải thiện đặc tính dược học là yêu cầu thực tiễn cần thiết.

Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ của tác giả Lê Thanh Huyền (Trường Đại học Dược Hà Nội, năm 2024) thực hiện đề tài "Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của một số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol" nhằm giải quyết hai mục tiêu cụ thể:

1. Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật ở dạng tự do của một số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol.
2. Đánh giá hoạt tính kháng biofilm Staphylococcus aureus ATCC 33591 của một số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng mẫu thử: 03 chất gồm Eugenol (Eu) và 02 hợp chất bán tổng hợp từ eugenol là Isoeugenol (Iso) và Licarin A (ký hiệu LT4, cấu trúc dehydrodiisoeugenol, công thức phân tử $\text{C}{20}\text{H}{22}\text{O}_4$).
• Đối tượng vi sinh vật thử nghiệm: 08 chủng vi sinh vật chuẩn ATCC gồm 01 chủng vi nấm (Candida albicans ATCC 10231/ATCC 20132), 02 chủng vi khuẩn Gram (+) (Staphylococcus aureus ATCC 33591 kháng methicillin - MRSA, Staphylococcus aureus ATCC 25923 nhạy methicillin - MSSA, Bacillus subtilis ATCC 6633) và 04 chủng vi khuẩn Gram (-) (Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella enterica ATCC 35664, Klebsiella pneumoniae ATCC 2146, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853).
• Kháng sinh đối chứng tham chiếu: Moxifloxacin, Meropenem, Itraconazole.
• Phạm vi và địa điểm thực hiện: Nghiên cứu thực nghiệm in vitro tại Bộ môn Công nghệ sinh học Dược (Trường Đại học Dược Hà Nội), sử dụng các dẫn chất bán tổng hợp được tổng hợp và kiểm định cấu trúc từ Phòng thí nghiệm Hóa học Vật liệu, Khoa Hóa học (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Nghiên cứu được xây dựng trên cơ sở lý thuyết về hóa dược học hợp chất thiên nhiên, cơ chế tác dụng của các hợp chất phenolic trên màng vi khuẩn và sinh lý học của cấu trúc biofilm. Biofilm vi khuẩn là quần thể tế bào vi sinh vật gắn kết trên bề mặt sống hoặc nhân tạo và được bao bọc bởi chất nền ngoại bào gồm polysaccharide bám dính, ADN ngoại bào (eDNA), protein bề mặt (SasG, Bap) và lipid. Cấu trúc này làm giảm mức độ khuếch tán kháng sinh và thúc đẩy vi khuẩn chuyển sang trạng thái "dai dẳng" hoặc "dung nạp", khiến vi khuẩn trong biofilm có khả năng đề kháng cao hơn từ 10 đến 1000 lần so với vi khuẩn ở dạng tự do phù du.

Các phương pháp thực nghiệm được triển khai đồng bộ:

• Chuẩn bị giống và môi trường: Các chủng vi sinh vật được lưu trữ ở -80°C, hoạt hóa định kỳ trên thạch TSA (đối với vi khuẩn) hoặc SDA (đối với C. albicans), ủ ở 37°C. Môi trường lỏng gồm MHB, TSB, TGN (TSB bổ sung 1% glucose và 2% NaCl); môi trường đệm PBS pH 7,2.
• Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC): Thực hiện bằng kỹ thuật vi pha loãng trong môi trường lỏng trên đĩa vi thể 96 giếng theo chuẩn CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute). Mật độ tế bào ban đầu đạt $1,5 \times 10^6\text{ CFU/mL}$ với vi khuẩn và $1,5 \times 10^4\text{ tế bào/mL}$ với vi nấm. Sử dụng natri resazurin ($0,1\text{ }\mu\text{g/mL}$) làm chất chỉ thị trao đổi chất để phát hiện tế bào sống qua sự chuyển màu và đo huỳnh quang resorufin (kích thích 560 nm, phát xạ 590 nm trên máy Varioskan Lux).
• Phương pháp xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC): Cấy dịch từ các giếng không đục trên đĩa MIC lên thạch TSA/SDA, ủ 24 giờ ở 37°C; nồng độ MBC là nồng độ thấp nhất tiêu diệt $\ge 99,9%$ lượng vi khuẩn ban đầu ($\ge 3\log_{10}\text{ CFU/mL}$).
• Đánh giá khả năng diệt khuẩn theo nồng độ và theo thời gian (Time-kill kinetics): Khảo sát tại các dải nồng độ từ $1\text{MIC}$ đến $16\text{MIC}$ và các mốc thời gian 1, 3, 5, 7, 24 giờ trên chủng S. aureus ATCC 33591; xác định mật độ vi khuẩn sống qua phương pháp cấy đếm CFU trên đĩa thạch.
• Mô hình đánh giá hoạt tính kháng biofilm S. aureus ATCC 33591: Nuôi cấy tạo biofilm trong môi trường TGN trên đĩa 96 giếng trong 24 giờ ở 37°C. Khảo sát hoạt tính mẫu thử qua 3 chỉ tiêu:
  1. Lượng vi sinh vật sống trong biofilm bằng phương pháp trực tiếp (tách vi khuẩn bằng cơ học/siêu âm, cấy đếm CFU trên thạch TSA).
  2. Lượng vi sinh vật sống bằng phương pháp gián tiếp (đo cường độ huỳnh quang Resorufin - %RF).
  3. Tổng sinh khối biofilm (nhuộm Crystal Violet - %CV $50\text{ mg/L}$, hòa tan bằng acid acetic 66%, đo độ hấp thụ tại bước sóng 570 nm).
• Phương pháp đánh giá độc tính tế bào thông qua ly giải tế bào hồng cầu (in vitro hemolysis assay): Sử dụng huyền dịch hồng cầu chuột 1% trong NaCl 0,9%, tiếp xúc với mẫu thử ở các nồng độ 30, 100, 300, 1000 mg/L; đo quang phổ hấp thụ giải phóng hemoglobin tại bước sóng 405 nm (chứng dương: Triton X-100 1%, chứng âm: NaCl 0,9%).
• Xử lý số liệu và phân tích thống kê: Sử dụng phần mềm GraphPad Prism 4 và Microsoft Excel để tính toán phương trình hồi quy phi tuyến Hill-Langmuir, xác định các giá trị $E_{\max}$, $\text{EC}{50}$, $\text{HC}{10}$, $\text{HC}_{50}$. Đánh giá sự khác biệt có ý nghĩa thống kê bằng phân tích phương sai One-way ANOVA ($p < 0,05$).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này hệ thống hóa các dữ liệu khoa học về tình trạng kháng thuốc, cơ chế hình thành và đề kháng của màng biofilm, đặc biệt là biofilm của tụ cầu vàng Staphylococcus aureus. Tác giả tổng hợp nguồn gốc, tính chất lý hóa, hoạt tính sinh học và hạn chế dược động học của eugenol tự nhiên. Tiếp đó, chương phân tích các hướng chuyển hóa bán tổng hợp eugenol trên thế giới và tại Việt Nam: phản ứng đồng phân hóa tạo isoeugenol và phản ứng oxy hóa ghép đôi tạo licarin A (xúc tác thanh nano CuO ở 50°C trong ethanol). Đồng thời, tác giả tổng thuật các nghiên cứu quốc tế về hoạt tính kháng khuẩn, kháng lao (Mycobacterium tuberculosis MDR với $\text{MIC} = 3,12\text{ - }12,5\text{ }\mu\text{g/mL}$), kháng ký sinh trùng (Trypanosoma cruzi, Leishmania major) và các thông số phân bố mô, thời gian bán thải ($t_{1/2\alpha} = 26,8\text{ phút}$, $t_{1/2\beta} = 389,1\text{ phút}$) của licarin A.

Chương 2: Nguyên vật liệu, thiết bị, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc và tiêu chuẩn của 3 hợp chất nghiên cứu (Eugenol, Isoeugenol, Licarin A), 8 chủng vi sinh vật chuẩn ATCC, 3 kháng sinh đối chứng (Moxifloxacin, Meropenem, Itraconazole) cùng danh mục trang thiết bị chuyên dụng (hệ thống đọc vi đĩa huỳnh quang Varioskan Lux, máy quang phổ UV-VIS Hitachi U5100, tủ an toàn sinh học BioAir). Toàn bộ quy trình thực nghiệm được chuẩn hóa thành 7 quy trình thao tác: chuẩn bị môi trường, vi pha loãng xác định MIC/MBC, cấy đếm CFU xác định động học diệt khuẩn theo nồng độ và thời gian, mô hình nuôi cấy và phá hủy biofilm S. aureus, định lượng sinh khối bằng tím tinh thể, thử nghiệm gây tan máu trên hồng cầu chuột và phương pháp xử lý số liệu toán học.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu và bàn luận

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm thu được từ các thử nghiệm vi sinh và độc tính:

• Hoạt tính trên vi sinh vật dạng tự do: Eugenol và isoeugenol thể hiện hoạt tính kháng khuẩn yếu trên cả 8 chủng thử nghiệm với MIC dao động lần lượt từ 2540 đến 10160 mg/L và từ 537 đến 8594 mg/L. Ngược lại, dẫn chất bán tổng hợp LT4 (licarin A) thể hiện hoạt tính kháng khuẩn vượt trội trên 7/8 chủng vi khuẩn kiểm định với MIC rất thấp từ 0,03 đến 2 mg/L (ngoại trừ K. pneumoniae có $\text{MIC} = 256\text{ mg/L}$ và nấm men C. albicans có $\text{MIC} > 256\text{ mg/L}$).
• Giá trị MBC của LT4 đạt từ 0,03 đến 1 mg/L trên các chủng Gram (+) và 0,03 đến 8 mg/L trên các chủng Gram (-). Tỷ lệ $\text{MBC}/\text{MIC} \le 4$ ở 6/7 chủng vi khuẩn khẳng định LT4 có tác dụng diệt khuẩn thực sự (bactericidal).
• Khảo sát động học: Khả năng diệt khuẩn của LT4 phụ thuộc vào cả nồng độ và thời gian. Ở nồng độ $2\text{MIC}$, LT4 làm giảm $> 3\log_{10}\text{ CFU/mL}$ ($> 99,9%$) lượng vi khuẩn tự do. Tại nồng độ $4\text{MIC}$ và $8\text{MIC}$, LT4 tiêu diệt hoàn toàn $> 6\log_{10}\text{ CFU/mL}$ S. aureus ATCC 33591 sau 7 giờ tiếp xúc.
• Hoạt tính kháng biofilm S. aureus ATCC 33591: Tại nồng độ 100 mg/L và 1000 mg/L, LT4 làm giảm lượng vi khuẩn sống trong màng biofilm lần lượt là $> 1,5\log_{10}\text{ CFU/mL}$ ($> 90%$) và $\approx 2,5\log_{10}\text{ CFU/mL}$ ($> 99%$), vượt trội hoàn toàn so với eugenol và isoeugenol (giảm $< 1\log_{10}\text{ CFU/mL}$). Đường cong nồng độ - đáp ứng của LT4 trên biofilm xác định $\text{EC}{50}$ theo CFU là $115,90 \pm 1,42\text{ mg/L}$ và $E{\max}$ đạt $-2,982 \pm 0,2789\log_{10}\text{ CFU/mL}$; $\text{EC}{50}$ theo huỳnh quang %RF là $121,40 \pm 1,62\text{ mg/L}$ và $E{\max}$ đạt $96,421 \pm 17,460%$. Tuy nhiên, thử nghiệm nhuộm tím tinh thể cho thấy LT4 không làm giảm tổng sinh khối chất nền biofilm ($E_{\max} = 3,16 \pm 0,7287%$).
• Đánh giá theo thời gian: Ở nồng độ 1000 mg/L, hoạt tính diệt khuẩn trong biofilm của LT4 khởi phát từ 6 giờ (giảm $1\log_{10}\text{ CFU/mL}$, giảm 25% RF), đạt mức giảm $> 2,5\log_{10}\text{ CFU/mL}$ ở 24 giờ và duy trì ổn định đến 72 giờ (giảm $> 3\log_{10}\text{ CFU/mL}$, giảm 75% RF), tương đương hiệu lực của kháng sinh tham chiếu Moxifloxacin.
• Độc tính tế bào: Cả 3 mẫu thử đều không gây tan máu đáng kể trên hồng cầu chuột ở dải nồng độ từ 30 đến 1000 mg/L (tỷ lệ tan máu của isoeugenol $\approx 0%$, eugenol $\approx 6%$, licarin A từ 6% đến 10%, đều nằm dưới ngưỡng an toàn 10%).

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã cung cấp bộ dữ liệu thực nghiệm so sánh định lượng giữa hoạt chất tự nhiên eugenol và các dẫn chất bán tổng hợp. Kết quả chính được tổng hợp tại bảng số liệu sau:

Đối tượng vi sinh vật	MIC Eugenol (mg/L)	MIC Isoeugenol (mg/L)	MIC LT4 (Licarin A) (mg/L)	MIC Moxifloxacin (mg/L)	MIC Meropenem (mg/L)
S. aureus ATCC 33591 (MRSA)	2540	1074	0,03	0,06	16
S. aureus ATCC 25923 (MSSA)	2540	1074	0,25	0,06	0,03
B. subtilis ATCC 6633	5080	1074	0,03	0,12	0,06
E. coli ATCC 25922	5080	2148	0,03	0,03	0,03
P. aeruginosa ATCC 27853	5080	2148	0,03	0,5	0,25
S. enterica ATCC 35664	5080	8594	2	0,25	0,03
K. pneumoniae ATCC 2146	10160	4297	256	0,06	0,03
C. albicans ATCC 20132	5080	537	> 256	-	-

Hiệu lực của hợp chất bán tổng hợp LT4 trên mô hình biofilm S. aureus ATCC 33591:

• Hiệu lực diệt khuẩn tối đa ($E_{\max}$): $-2,982 \pm 0,2789\log_{10}\text{ CFU/mL}$ (làm giảm gần 99,9% lượng vi khuẩn sống trong màng).
• Nồng độ tạo 50% đáp ứng ($\text{EC}_{50}$): $115,90 \pm 1,42\text{ mg/L}$ (theo cấy đếm CFU) và $121,40 \pm 1,62\text{ mg/L}$ (theo chuyển hóa huỳnh quang Resazurin).
• Tác động lên tổng sinh khối ($E_{\max}\text{ CV}$): $3,16 \pm 0,7287%$ (không làm tiêu biến chất nền màng).

Đóng góp khoa học của nghiên cứu:

• Chứng minh phương pháp bán tổng hợp từ eugenol tự nhiên thành neolignan licarin A (LT4) đã làm tăng hoạt tính kháng khuẩn lên hàng ngàn lần so với chất gốc, đạt mức nồng độ ức chế tối thiểu tương đương với các kháng sinh nhóm fluoroquinolone (Moxifloxacin) và carbapenem (Meropenem) trên nhiều chủng vi khuẩn Gram (+) và Gram (-).
• Xác định hoạt tính của licarin A bán tổng hợp trên chủng S. aureus MRSA đạt $\text{MIC} = 0,03\text{ mg/L}$, vượt trội hơn chủng phân lập tự nhiên trong các công bố quốc tế trước đây ($\text{MIC} = 256\text{ mg/L}$ theo Chuan-Yun Xiao và cộng sự, 2021).
• Chứng minh khả năng tiêu diệt vi khuẩn S. aureus ẩn náu bên trong cấu trúc biofilm phức tạp của licarin A với hiệu lực tương đương Moxifloxacin ở nồng độ 1000 mg/L sau 72 giờ, trong khi vẫn duy trì độ an toàn tế bào qua thử nghiệm tan máu ($\le 10%$).

Kiến nghị của tác giả:

1. Mở rộng thử nghiệm đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật của LT4 trên các chủng vi khuẩn phân lập trực tiếp từ lâm sàng.
2. Nghiên cứu phối hợp tác dụng kháng vi sinh vật giữa LT4 với các kháng sinh thương mại hoặc các hợp chất tự nhiên khác nhằm tìm kiếm hiệu ứng hiệp đồng.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận chỉ ra một số giới hạn thực nghiệm:

• Phạm vi chủng thử nghiệm mới dừng lại ở các chủng chuẩn quốc tế (ATCC) nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm tiêu chuẩn, chưa tiến hành trên các chủng phân lập từ bệnh phẩm lâm sàng có mức độ đề kháng phức tạp.
• Chưa khảo sát phối hợp thuốc (checkerboard assay) để đánh giá chỉ số nồng độ ức chế phân đoạn (FICI) giữa LT4 và các kháng sinh đang dùng trong điều trị.
• Cơ chế tác dụng của LT4 làm giảm mạnh lượng vi khuẩn sống trong biofilm nhưng không làm giảm tổng sinh khối màng (chất nền polysaccharide và protein ngoại bào) cần được phân tích sâu hơn qua các kỹ thuật hiển vi điện tử quét (SEM) hoặc sinh học phân tử.

Hướng nghiên cứu tiếp theo tập trung vào việc thử nghiệm phổ tác dụng trên các chủng vi khuẩn lâm sàng đa kháng thuốc (MDR, XDR), khảo sát hiệu ứng hiệp đồng khi kết hợp kháng sinh, giải thích cơ chế tương tác màng ở mức độ phân tử và đánh giá độc tính toàn thân, dược động học trên mô hình động vật sống (in vivo).

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên khảo dành cho:

• Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh thuộc các chuyên ngành Dược học, Hóa dược, Công nghệ sinh học Dược, Vi sinh y học.
• Cán bộ nghiên cứu đang thực hiện các đề tài về bán tổng hợp hợp chất thiên nhiên từ tinh dầu (eugenol, citral, limonene) và phát triển thuốc kháng vi sinh vật mới.
• Các nhà nghiên cứu cần tham khảo quy trình chuẩn hóa về phương pháp vi pha loãng đĩa 96 giếng kết hợp chỉ thị huỳnh quang Resazurin, kỹ thuật đánh giá biofilm vi khuẩn bằng cả phương pháp trực tiếp (CFU) và gián tiếp (Resazurin, Crystal Violet), cũng như quy trình thử độc tính ly giải hồng cầu động vật.

Câu hỏi thường gặp

1. Hợp chất bán tổng hợp nào trong nghiên cứu thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất và mạnh hơn eugenol như thế nào?
Hợp chất LT4 (Licarin A) thể hiện hoạt tính mạnh nhất. Trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm như S. aureus ATCC 33591, B. subtilis ATCC 6633, E. coli ATCC 25922 và P. aeruginosa ATCC 27853, LT4 đạt giá trị $\text{MIC} = 0,03\text{ mg/L}$, trong khi eugenol cần nồng độ từ 2540 đến 5080 mg/L để đạt hiệu quả ức chế tương đương.

2. Licarin A (LT4) có tác dụng trên vi nấm Candida albicans không?
Không. Thử nghiệm vi pha loãng cho thấy LT4 không ức chế được vi nấm Candida albicans ATCC 20132 ở nồng độ thử nghiệm cao nhất ($\text{MIC} > 256\text{ mg/L}$ và $\text{MBC} > 256\text{ mg/L}$). Ngược lại, isoeugenol lại thể hiện tác dụng ức chế tốt nhất trên chủng nấm này với $\text{MIC} = \text{MBC} = 537\text{ mg/L}$.

3. Licarin A tác động lên biofilm của Staphylococcus aureus theo cơ chế nào?
Licarin A tác động trực tiếp tiêu diệt các tế bào vi khuẩn S. aureus nằm bên trong cấu trúc biofilm (làm giảm $\approx 2,5\log_{10}\text{ CFU/mL}$ vi khuẩn ở nồng độ 1000 mg/L sau 24 giờ và giảm $> 3\log_{10}\text{ CFU/mL}$ sau 72 giờ), nhưng không làm phân hủy hay làm giảm tổng sinh khối chất nền ngoại bào của biofilm (thể hiện qua kết quả nhuộm tím tinh thể $E_{\max} = 3,16%$).

4. Dẫn chất Licarin A có gây độc tế bào hồng cầu hay không?
Không gây độc đáng kể. Ở dải nồng độ thử nghiệm từ 30 đến 1000 mg/L, tỷ lệ ly giải tế bào hồng cầu chuột của LT4 dao động từ 6% đến 10% (dưới ngưỡng độc tính 10%), chứng minh tính an toàn in vitro tại các nồng độ có hoạt tính diệt khuẩn.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Lê Thanh Huyền đã hoàn thành việc đánh giá thực nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật và kháng biofilm của các dẫn chất bán tổng hợp từ eugenol. Nghiên cứu đã chứng minh licarin A (LT4) là dẫn chất có hoạt tính diệt khuẩn vượt trội trên cả vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) tự do, đồng thời có khả năng tiêu diệt vi khuẩn Staphylococcus aureus trong màng biofilm tương đương kháng sinh Moxifloxacin mà không gây độc tính tan máu. Đây là bằng chứng thực nghiệm quan trọng, khẳng định tiềm năng phát triển các hợp chất neolignan bán tổng hợp từ nguồn tinh dầu thực vật trong nước thành các tác nhân kháng khuẩn mới nhằm đối phó với tình trạng kháng thuốc.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Thời kỳ “kỷ nguyên vàng của kháng sinh” bắt đầu khi hàng loạt kháng sinh được phát hiện từ những năm 1940 và kết thúc khá đột ngột vào những năm 1960 khi tình trạng kháng thuốc bắt đầu được tích lũy [42]. Tình trạng kháng thuốc ngày càng trầm trọng để lại nhiều thách thức, gánh nặng cho y tế. Năm 2019, ước tính kháng kháng sinh do vi khuẩn là nguyên nhân trực tiếp gây ra 1,27 triệu ca tử vong trên toàn cầu, trong đó có 254 nghìn ca tại Đông Nam Á và Đông Á [7]. Nhiều biện pháp, chiến lược đã và đang được triển khai, trong đó sàng lọc và tổng hợp thuốc từ nguồn nguyên liệu tự nhiên cho thấy nhiều dấu hiệu tích cực.

Các hợp chất tự nhiên thường sở hữu cấu trúc hoá học độc đáo và đa dạng, tạo nền tảng cho việc phát triển các loại thuốc mới với cơ chế tác dụng khác biệt. Phương pháp bán tổng hợp có thể được áp dụng để chọn lọc được các hợp chất có hoạt tính mạnh hơn chất ban đầu. Từ đó, các sản phẩm này sẽ mở ra cơ hội lớn cho nghiên cứu, phát triển thuốc mới trong tương lai [59]. Eugenol là một phenylpropanoid, có trong tinh dầu của một số loài thực vật thuộc họ Lamiaceae, Lauraceae, Myrtaceae và Myristicaceae.

Eugenol là thành phần chính của một số tinh dầu có thể kể đến như tinh dầu hương nhu trắng, tinh dầu trầu không, tinh dầu đinh hương và được sử dụng chủ yếu trong cả thực phẩm và mỹ phẩm như một chất tạo hương vị [47]. Những năm gần đây, eugenol được nghiên cứu và chứng minh hoạt tính sinh học đa dạng như kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa, chống ung thư,…. Trong một loạt những tác dụng sinh học tiềm năng, hoạt tính sinh học nổi bật có thể kể đến của eugenol là khả năng kháng vi sinh vật. Từ đó, eugenol trở thành một trong những hợp chất tự nhiên đáng chú ý trong chuyển hóa hữu cơ để tạo ra các hợp chất mới có hoạt tính kháng vi sinh vật vượt trội và tối ưu hơn [10, 17].

Nhằm khai thác ứng dụng tiềm năng này, nghiên cứu đánh giá một số dẫn chất bán tổng hợp từ eugenol được thực hiện để tìm kiếm các hợp chất mới có khả năng kháng vi sinh vật hiệu quả. Đề tài “Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của một số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol” được thực hiện với hai mục tiêu: 1. Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật ở dạng tự do của một số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol 2. Đánh giá tính kháng biofilm Staphylococcus aureus ATCC 33591 của một số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol.

Hợp chất bán tổng hợp có tác dụng kháng vi sinh vật 1. Đại cương về hợp chất bán tổng hợp Bán tổng hợp là phương pháp tổng hợp hóa học sử dụng sản phẩm tự nhiên làm nguyên liệu để tạo ra các hợp chất mới.Với nguyên liệu ban đầu là các hợp chất tự nhiên, thông qua quá trình biến đổi hóa học để tạo ra các phân tử có cấu trúc và đặc tính mong muốn [18]. Hướng đi này đã được khai phá sâu rộng hơn trong những thập kỉ gần đây bởi triển vọng đầy hứa hẹn của chúng trong ứng dụng hóa dược, sinh học phân tử và khoa học dược phẩm. Từ năm 1940 đến năm 2019, có 363 thuốc có nguồn gốc tự nhiên được phê duyệt, trong đó 286 hợp chất là sản phẩm bán tổng hợp từ tự nhiên.

Nhóm các hợp chất này tập trung vào các thuốc kháng vi sinh vật và chống ung thư với 54% các thuốc kháng khuẩn được cấp phép là các thuốc có nguồn gốc từ tự nhiên, con số này đối với thuốc chống ký sinh trùng là 45% và chống ung thư là 25% [42]. Có thể thấy các hợp chất tự nhiên đóng vai trò quan trọng trong dược phẩm và vẫn là những lựa chọn tiềm năng, lý tưởng để phát triển thuốc mới, đặc biệt là thuốc kháng khuẩn. Với số lượng phong phú, đa dạng với nhiều cách sắp xếp cấu trúc các nhóm chức khác nhau, số lượng trung tâm lập thể nhiều, tỷ lệ dị nguyên tử khác nhau, khung cấu trúc vòng lõi đa dạng, có khả năng ứng dụng cao trong thiết kế và bán tổng hợp chất tương tự với đặc tính dược lý và hoạt tính sinh học đáng chú ý [45]. Aspirin nguyên chất bán tổng hợp đầu tiên, dựa trên một hợp chất tự nhiên salicin được phân lập từ Salix alba, được Bayer công bố vào năm 1899.

Trong những thập kỷ gần đây, nhiều thuốc bán tổng hợp từ nguyên liệu tự nhiên cũng được nghiên cứu và ứng dụng: nitisinone có nguồn gốc từ sản phẩm tự nhiên leptospermone (Callistemon citrinus) được sử dụng trong điều trị bệnh chống huyết khối, apomorphine là một hợp chất bán tổng hợp có nguồn gốc từ morphine (Papaver somniferum) được sử dụng trong bệnh Parkinson [64]. Không thể phủ nhận vai trò của tổng hợp hữu cơ trong nghiên cứu phát triển thuốc. Hóa học tổ hợp được chứng minh là khá thành công trong nhiều lĩnh vực khác nhau, tuy nhiên, đối với kháng sinh, các chiến dịch sàng lọc rất lớn nhằm vào hàng chục mục tiêu đã không mang lại kết quả khả quan [42]. Bên cạnh đó, các hợp chất hầu hết các nguyên liệu ban đầu được sử dụng trong tổng hợp hữu cơ đều có nguồn gốc từ dầu mỏ, các nguyên liệu không thể tái tạo, độc hại, dễ cháy, tiềm ẩn rủi ro cho sức khỏe con người và môi trường.

Để hạn chế sử dụng các nguồn tài nguyên thiên 2 nhiên không thể tái tạo nhiều nhóm nghiên cứu về tổng hợp hữu cơ đã phải đối mặt với vấn đề tìm kiếm các giải pháp thay thế tự nhiên, dựa trên các nguồn sinh khối thay cho các nguồn thu được từ dầu mỏ. Một trong những hướng nghiên cứu phổ biến hiện nay, tiềm năng ứng dụng tinh dầu và các dẫn xuất của chúng được chú ý như là nguyên liệu ban đầu cho các hóa chất có hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa, kháng virus và chống ung thư [11, 36, 57]. Các thành phần dễ bay hơi của tinh dầu (như linalool, eugenol, limonen…) về cơ bản là các dẫn xuất terpen và phenolic có trọng lượng phân tử thấp, đồng thời sự có mặt của các liên kết không bão hòa, các nhóm chức (cacbonyl, hydroxyl, epoxid…) và cấu trúc đa dạng làm cho tinh dầu trở thành những nguyên liệu ban đầu tiềm năng để dẫn xuất hóa từ đó thu được các hợp chất kháng vi sinh vật bán tổng hợp có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như dược phẩm, y học, chất bảo quản thực phẩm [40]. Hoạt tính kháng vi sinh vật của các hợp chất bán tổng hợp từ thành phần của thực vật Từ lâu, hoạt tính kháng vi sinh vật các chất từ thực vật đã được biết đến và chứng minh qua các nghiên cứu.

Một số hợp chất quan trọng có thực vật thể hiện nhiều hoạt tính kháng khuẩn có thể kể đến như tanin, eugenol, piperin…[37]. Các hợp chất bán tổng hợp từ tinh dầu cũng thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật tốt và có thể vượt trội hơn chất gốc. Một số hợp chất bán tổng hợp từ flavonoid, citral, oleanolic.đã được chứng minh là có hoạt tính kháng khuẩn tốt: Karim Chouaïb và cộng sự (2015) đã tổng hợp dẫn xuất ester của oleanolic acid. Hoạt tính kháng khuẩn của dãy các dẫn xuất được đánh giá bằng kỹ thuật khuếch tán trên đĩa thạch cho thấy tác dụng chống lại 9 chủng vi sinh vật gây bệnh khác nhau ở người (05 chủng nấm men, 02 chủng vi khuẩn Gram (-) và 02 chủng vi khuẩn Gram (+)).

Tất cả các dẫn chất bán tổng hợp trong thử nghiệm đều bước đầu cho thấy hoạt tính kháng vi sinh vật, trong đó dẫn xuất (2a,3b)-2,3-Bis(pivaloyloxy)olean-12-en- 28-oic acid có hoạt tính mạnh nhất [14]. Goldbeck và cộng sự (2014) đã đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của 3-(p- chlorophenyl) thio citronellal tổng hợp từ citral. Kết quả chỉ ra rằng hợp chất 3-(p- chlorophenyk) thio citronellal là một chất kháng khuẩn mạnh và hiệu quả chống lại vi khuẩn gram (+) S. Kết quả cũng cho thấy tế bào vi sinh vật chết nhanh hơn khi được xử lý bằng chất tổng hợp 3-(p-chlorophenyl) thio citronellal [22].

Gontijo và cộng sự (2012) đã phân lập bioflavonoid tự nhiên morelloflavone từ trái cây dạng khô và dạng bột. Sau đó, nhóm nghiên cứu đã tổng hợp ba dẫn chất 3 từ bioflavonoid theo ba dãy phản ứng khác nhau. Ba dẫn chất này thể hiện các hoạt tính diệt Leishmanicidal amazonensi, chống phân giải protein và chống oxy hóa cũng như độc tính tế bào thấp. Ba dẫn xuất bán tổng hợp thể hiện hoạt tính diệt L.

amazonensi chống lại các chất kích thích của L. amazonensis cao hơn khi so sánh với hợp chất tự nhiên gốc, trong khi các hợp chất gốc lại cho thấy đặc tính chống oxy hóa cao hơn [23]. Hoạt tính kháng biofilm của các hợp chất bán tổng hợp từ thành phần của thực vật. Các xét nghiệm đánh giá kháng kháng sinh ban đầu được phát triển để kiểm tra tính kháng của vi sinh vật tự do [44].

Trên thực tế, vi khuẩn không chỉ tồn tại ở dạng phù du mà có thể tồn tại dưới nhiều kiểu hình, quần thể phức tạp. Đặc biệt, biofilm là một mô hình thường gặp, có vai trò trong lây truyền và hình thành các chủng kháng của vi khuẩn gây bệnh. Trên thực tế có 65-80 % các trường hợp nhiễm vi khuẩn ở các nước phát triển có liên quan đến biofilm [46]. Vậy nên, để đánh giá sâu hơn về hoạt tính kháng khuẩn, bên cạnh nghiên cứu hoạt tính của hợp chất trên vi sinh vật tự do, khảo sát trên các mô hình biofilm cũng được quan tâm, nghiên cứu.

Biofilm là cộng đồng vi sinh vật nằm trong chất nền ngoại bào gồm các hợp chất cao phân tử ngoại bào: polysaccharid, AND ngoại bào và protein, lipid. Những chất cao phân tử này được sắp xếp như một ma trận và được đánh giá là có khả năng bảo vệ vi khuẩn khỏi các tác nhân của môi trường như nhiệt, ẩm, miễn dịch của vật chủ cũng như các chất diệt khuẩn [19]. Vi khuẩn trong biofilm có sức đề kháng với điều kiện ngoại cảnh cao hơn so với vi khuẩn ở dạng tự do. Các vi khuẩn trong biofilm kém đáp ứng với kháng sinh được cho là liên quan chủ yếu đến hiệu ứng cản trở của chất nền ngoại bào biofilm, điều này giảm khả năng tiếp xúc của thuốc với các VSV trong biofilm [46].

Biofilm Staphylococcus aureus Tụ cầu vàng Staphyococcus aureus là nguyên nhân chính gây nhiễm trùng bệnh viện và nhiễm trùng mắc phải tại cộng đồng, đồng thời là gánh nặng đáng kể cho hệ thống chăm sóc sức khỏe. Tụ cầu vàng có khả năng sinh biofilm trên các bề mặt sinh học và bề mặt nhân tạo.