Nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm của rễ củ Tam Thất (Panax notoginseng) trồng ở Việt Nam

Rễ củ Tam Thất (Panax notoginseng) là một trong những dược liệu quý hiếm, được biết đến với nhiều… 216 trang · Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội · 2022.

• Tác giả: Bùi Thị Thu Hà
• Người hướng dẫn: PGS. Vũ Mạnh Hùng
• Trường học: Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược lý – Dược lâm sàng
• Đề tài: Nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm của rễ củ Tam Thất trồng ở Việt Nam
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN VỀ BỆNH UNG THƯ VÀ TAM THẤT
• 2.1. Tổng quan về bệnh ung thư
• 2.2. Tổng quan về Tam thất
• 2.2.1. Tổng quan thực vật
• 2.2.2. Hóa thực vật rễ củ Tam thất
• 2.2.3. Các tác dụng dược lý của Tam thất
• 2.2.3.1. Tác dụng chống ung thư
• 2.2.3.2. Tác dụng tăng cường miễn dịch
• 2.2.3.3. Tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ tế bào gan
• 2.3. Tổng quan về các mô hình thực nghiệm đánh giá tác dụng kháng u
• 2.3.1. Các mô hình nghiên cứu in vitro
• 2.3.2. Các mô hình nghiên cứu in vivo
• 3. CHƯƠNG 3: CHẤT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Chất liệu và đối tượng nghiên cứu
• 3.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
• 3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp chế biến đến hàm lượng saponin của rễ củ Tam thất
• 4.2. Kết quả chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các saponin chính có trong các mẫu Tam thất hấp và không hấp
• 4.3. Kết quả nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm của các dạng cao định lượng và một số saponin phân lập từ rễ củ Tam thất
• 4.4. Đánh giá độc tính cấp, độc tính bán trường diễn của cao định lượng NP(H)
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về tác dụng kháng u của rễ củ Tam Thất ở Việt Nam

Rễ củ Tam Thất (Panax notoginseng) là một trong những dược liệu quý hiếm, được biết đến với nhiều tác dụng dược lý, đặc biệt là tác dụng kháng u. Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng các hoạt chất trong rễ củ Tam Thất có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, đồng thời tăng cường hệ miễn dịch. Việc nghiên cứu tác dụng kháng u của rễ củ Tam Thất trồng ở Việt Nam không chỉ giúp nâng cao giá trị dược liệu mà còn mở ra hướng đi mới trong điều trị ung thư.

1.1. Tác dụng kháng u của rễ củ Tam Thất và các hoạt chất chính

Rễ củ Tam Thất chứa nhiều hoạt chất quý như saponin, flavonoid, và polysaccharide. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng saponin trong Tam Thất có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, làm giảm kích thước khối u và tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể.

1.2. Tình hình nghiên cứu tác dụng kháng u của Tam Thất tại Việt Nam

Tại Việt Nam, nghiên cứu về tác dụng kháng u của rễ củ Tam Thất còn hạn chế. Tuy nhiên, một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng việc chế biến rễ củ Tam Thất có thể làm tăng hoạt tính kháng u, mở ra cơ hội cho việc phát triển dược liệu này trong điều trị ung thư.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu tác dụng kháng u của Tam Thất

Mặc dù rễ củ Tam Thất có nhiều tiềm năng trong điều trị ung thư, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc nghiên cứu và ứng dụng. Các vấn đề như thiếu thông tin về liều lượng, phương pháp chế biến và tác dụng phụ cần được giải quyết để đảm bảo hiệu quả và an toàn cho người sử dụng.

2.1. Thiếu thông tin về liều lượng sử dụng Tam Thất

Hiện tại, chưa có hướng dẫn cụ thể về liều lượng sử dụng rễ củ Tam Thất trong điều trị ung thư. Việc xác định liều lượng phù hợp là rất quan trọng để đảm bảo hiệu quả điều trị và giảm thiểu tác dụng phụ.

2.2. Thách thức trong việc chế biến và bảo quản Tam Thất

Phương pháp chế biến rễ củ Tam Thất ảnh hưởng lớn đến hàm lượng hoạt chất và tác dụng kháng u. Cần nghiên cứu kỹ lưỡng các phương pháp chế biến để tối ưu hóa hoạt tính của dược liệu này.

III. Phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng u của rễ củ Tam Thất

Nghiên cứu tác dụng kháng u của rễ củ Tam Thất được thực hiện thông qua các phương pháp in vitro và in vivo. Các mô hình nghiên cứu này giúp đánh giá hiệu quả của các hoạt chất trong việc ức chế sự phát triển của tế bào ung thư.

3.1. Mô hình nghiên cứu in vitro đánh giá tác dụng kháng u

Mô hình in vitro cho phép nghiên cứu tác dụng của các hoạt chất trong rễ củ Tam Thất trên các dòng tế bào ung thư. Kết quả cho thấy các saponin trong Tam Thất có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư một cách hiệu quả.

3.2. Mô hình nghiên cứu in vivo trên động vật

Mô hình in vivo được sử dụng để đánh giá tác dụng kháng u của rễ củ Tam Thất trên chuột mang khối u. Kết quả cho thấy việc sử dụng cao định lượng từ rễ củ Tam Thất giúp giảm kích thước khối u và kéo dài thời gian sống của chuột.

IV. Kết quả nghiên cứu tác dụng kháng u của rễ củ Tam Thất

Kết quả nghiên cứu cho thấy rễ củ Tam Thất có tác dụng kháng u rõ rệt. Các dạng cao định lượng từ rễ củ Tam Thất đã được chứng minh là có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư và tăng cường hệ miễn dịch.

4.1. Tác dụng kháng u của các dạng cao định lượng

Các dạng cao định lượng từ rễ củ Tam Thất đã được thử nghiệm trên nhiều dòng tế bào ung thư, cho thấy hiệu quả ức chế sự phát triển của tế bào ung thư lên đến 70%.

4.2. Đánh giá tác dụng lên hệ miễn dịch

Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng rễ củ Tam Thất có khả năng kích thích sản xuất các cytokine, giúp tăng cường hệ miễn dịch và hỗ trợ cơ thể trong việc chống lại ung thư.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu Tam Thất

Nghiên cứu tác dụng kháng u của rễ củ Tam Thất mở ra nhiều triển vọng trong việc phát triển dược liệu này trong điều trị ung thư. Cần tiếp tục nghiên cứu để xác định rõ hơn về liều lượng, phương pháp chế biến và tác dụng phụ của dược liệu này.

5.1. Triển vọng phát triển dược liệu Tam Thất

Với những kết quả tích cực từ nghiên cứu, rễ củ Tam Thất có thể trở thành một lựa chọn hiệu quả trong điều trị ung thư, góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân.

5.2. Nhu cầu nghiên cứu sâu hơn về Tam Thất

Cần có thêm nhiều nghiên cứu bài bản để xác định rõ hơn về cơ chế tác dụng, liều lượng và phương pháp chế biến tối ưu cho rễ củ Tam Thất, nhằm phát huy tối đa hiệu quả của dược liệu này.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Gánh nặng bệnh tật do ung thư trên toàn cầu và tại Việt Nam gia tăng liên tục qua các thập kỷ. Theo thống kê của Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) năm 2020, toàn thế giới ghi nhận khoảng 19,3 triệu ca mắc mới và gần 10 triệu ca tử vong do ung thư. Tại Việt Nam, số ca mắc mới ước tính là 182.563 ca (chiếm 0,19% dân số) và số ca tử vong là 122.690 ca (chiếm 0,13% dân số), với gánh nặng ung thư tăng gấp ba lần trong vòng 30 năm qua. Các phương pháp điều trị thông thường như hóa trị và xạ trị thường đi kèm nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng, suy giảm miễn dịch, tổn thương gan do stress oxy hóa và chi phí điều trị cao.

Tam thất (Panax notoginseng (Burk.) F.H. Chen, họ Nhân sâm Araliaceae) là cây thuốc quý đã được di thực về trồng tại các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam (Hà Giang, Cao Bằng, Sa Pa, Si Ma Cai thuộc tỉnh Lào Cai) từ năm 1964. Các công trình khoa học quốc tế ghi nhận quá trình chế biến bằng hấp nhiệt làm thay đổi thành phần hóa học của Tam thất, chuyển đổi các saponin nguyên thủy thành các saponin thứ cấp có hoạt tính sinh học cao hơn, đặc biệt là hoạt tính kháng u và tăng cường miễn dịch. Tuy nhiên, trước thời điểm luận án được thực hiện, chưa có nghiên cứu bài bản, có hệ thống về sự biến đổi hàm lượng saponin theo các điều kiện nhiệt độ - thời gian hấp nhiệt và đánh giá toàn diện tác dụng kháng u thực nghiệm của Tam thất trồng tại Việt Nam.

Luận án tiến sĩ dược học của nghiên cứu sinh Bùi Thị Thu Hà với đề tài "Nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm của rễ củ Tam thất (Panax notoginseng (Burk.) F.H. Chen, Araliaceae) trồng ở Việt Nam trước và sau chế biến", chuyên ngành Dược lý – Dược lâm sàng (Mã số: 972.05), thực hiện tại Viện Dược liệu dưới sự hướng dẫn của PGS. Vũ Mạnh Hùng và GS. Nguyễn Thanh Hải, bảo vệ năm 2022, giải quyết khoảng trống nghiên cứu trên.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm 3 nội dung:

1. Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp chế biến hấp nhiệt đến hàm lượng saponin của rễ củ Tam thất.
2. Nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm của các dạng cao định lượng và một số saponin phân lập từ rễ củ Tam thất.
3. Đánh giá độc tính cấp, độc tính bán trường diễn của cao định lượng sau hấp nhiệt.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Rễ củ 4 năm tuổi của cây Tam thất trồng tại huyện Si Ma Cai, tỉnh Lào Cai (mẫu tiêu bản số HTV2-072015 lưu giữ tại Khoa Hóa thực vật - Viện Dược liệu); các phân đoạn saponin phân lập; hai dạng cao chiết định lượng gồm cao Tam thất không hấp ký hiệu là NP(O) và cao Tam thất hấp nhiệt ký hiệu là NP(H); các dòng tế bào ung thư người, dòng tế bào ung thư mô liên kết chuột sarcoma TG180; động vật thực nghiệm gồm chuột nhắt trắng Swiss mang khối u rắn sarcoma TG180 và chuột cống trắng Wistar.
• Không gian và thời gian: Nghiên cứu được thực hiện tại Viện Dược liệu và Bộ môn Dược lý - Học viện Quân y trong giai đoạn 2015–2022.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế xoay quanh ba trục nội dung chính: bệnh sinh ung thư liên quan đến đáp ứng miễn dịch và stress oxy hóa; đặc điểm hóa thực vật và dược lý của Tam thất; và các mô hình thực nghiệm đánh giá tác dụng kháng u.

Các nghiên cứu quốc tế đã làm sáng tỏ cơ sở biến đổi hóa học của Tam thất dưới tác động của nhiệt độ và độ ẩm:

• Nhóm tác giả Wang và cộng sự (2012), Sun và cộng sự (2010), Toh và cộng sự (2011) chứng minh quá trình hấp nhiệt gây ra phản ứng thủy phân liên kết glycosyl tại vị trí C-6 (chuyển notoginsenosid R1 và ginsenosid Re thành ginsenosid Rg1), thủy phân liên kết glucosyl tại vị trí C-20 (chuyển ginsenosid Rb1 thành Rd, tiếp tục chuyển thành Rg3; chuyển Rg1 thành Rh1), sau đó là phản ứng khử nước tại C-20 tạo thành các saponin thứ cấp hiếm gặp như Rh4, Rk3, Rg5, Rk1.
• Sun và cộng sự (2010) công bố cao chiết rễ Tam thất hấp ở 120°C ức chế tăng sinh tế bào ung thư đại trực tràng SW-480 ở người mạnh hơn mẫu không hấp, với giá trị IC50 sau các mốc hấp 1, 2, 4, 6 giờ lần lượt là 259,2; 131,4; 123,7 và 127,1 µg/ml; tỷ lệ cảm ứng tế bào chết theo chương trình (apoptosis) đạt 56,3% và 64,4% ở nồng độ 150,0 và 200,0 µg/ml.
• Toh và cộng sự (2011) ghi nhận Tam thất hấp làm tăng khả năng ức chế tăng sinh các dòng tế bào ung thư biểu mô tế bào gan người (SNU449, SNU182, HepG2).
• Về hoạt tính miễn dịch và chống oxy hóa, các công trình của Sun H.X. và cộng sự (2003), Bosung Kim và cộng sự (2018), Zejun Zhang và cộng sự (2020) chỉ ra saponin và polysaccharid của Tam thất kích thích tế bào lympho T, tăng nồng độ kháng thể IgG, kích hoạt phân cực đại thực bào M1, giảm tổn thương oxy hóa gan và điều hòa các cytokine miễn dịch.

Tại Việt Nam, các nghiên cứu trước đây chủ yếu tập trung vào việc di thực, kỹ thuật nhân giống, trồng trọt và định lượng sơ bộ hàm lượng saponin toàn phần. Một số nghiên cứu bước đầu đánh giá tác dụng chống ung thư vú thực nghiệm của saponin Tam thất trên chuột cống (2014) nhưng chưa khảo sát có hệ thống ảnh hưởng của các thông số chế biến nhiệt (dạng tươi/khô, nhiệt độ 100°C/120°C, thời gian hấp 4–24 giờ) đến sự chuyển hóa hoạt chất và mối tương quan với hoạt tính sinh học in vitro, in vivo.

Vị trí của luận án: Luận án là công trình thực nghiệm đầu tiên tại Việt Nam thiết lập hệ thống dữ liệu toàn diện về sự biến đổi saponin của rễ củ Tam thất trồng tại Lào Cai qua chế biến nhiệt; chuẩn hóa hai dạng cao định lượng NP(O) và NP(H); đồng thời chứng minh tác dụng kháng u đa cơ chế (gây độc tế bào, cảm ứng apoptosis, ức chế thể tích u in vivo, tăng cường miễn dịch, chống oxy hóa bảo vệ mô gan, kéo dài thời gian sống) và xác định độ an toàn tiền lâm sàng của cao Tam thất chế biến nhiệt.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án kết hợp phương pháp nghiên cứu hóa thực vật, phân tích hóa lý và dược lý thực nghiệm (in vitro, in vivo, độc học tiền lâm sàng).

Khung lý thuyết và phân tích

• Lý thuyết chuyển hóa nhiệt các hợp chất saponin nhóm dammaran: Sự cắt đứt liên kết đường (deglycosylation) và phản ứng mất nước (dehydration) tại các vị trí bất đối C-20 của phân tử saponin triterpen tetracyclic thuộc hai nhóm aglycon 20(S)-protopanaxadiol (PPD) và 20(S)-protopanaxatriol (PPT), làm giảm độ phân cực, tạo các đồng phân quang học và hình học mới có khả năng thấm qua màng tế bào ung thư tốt hơn.
• Khung phân tích dược lý học ung thư: Tiếp cận đa cơ chế, bao gồm tác động ức chế tế bào ung thư trực tiếp (đo tỷ lệ sống sót qua thử nghiệm SRB/MTT, đo apoptosis bằng kỹ thuật Flow Cytometry với nhuộm kép Annexin V-FITC/Propidium Iodide); tác động kháng u trên cơ thể mang u (đo thể tích khối u, tính tỷ lệ ức chế u theo thang phân loại H. Itokawa); tác động điều hòa miễn dịch (số lượng và công thức bạch cầu, nồng độ cytokine IL-2 và TNF-α bằng kỹ thuật ELISA, cân nặng cơ quan miễn dịch lách và tuyến ức); và tác động chống oxy hóa bảo vệ gan (đo hàm lượng MDA, GSH, hoạt độ enzym SOD, CAT, men gan ALT, AST và đánh giá vi thể mô gan nhuộm HE).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

1. Phương pháp hóa thực vật và phân tích:

   • Xử lý mẫu: Khảo sát mẫu Tam thất tươi và khô tại hai mức nhiệt độ 100°C và 120°C, thu mẫu sau mỗi 4 giờ (4, 8, 12, 16, 20, 24 giờ).
   • Chiết xuất cao định lượng: Chiết hồi lưu bột Tam thất với ethanol 70% (tỷ lệ dung môi/dược liệu 10/1, chiết 3 lần, mỗi lần 3 giờ), cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm tạo cao đặc NP(O) (không hấp) và NP(H) (hấp nhiệt tối ưu).
   • Phân lập và xác định cấu trúc: Sử dụng sắc ký cột (CC) pha thuận silica gel, pha đảo RP-18; xác định cấu trúc bằng điểm nóng chảy (MP), phổ khối phun mù điện tử (ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR) và phổ tương tác dị hạt nhân khoảng cách xa (HMBC).
   • Định lượng HPLC: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, pha tĩnh RP C-18, pha động gradient acetonitril - nước, đầu dò UV/ELSD để định lượng đồng thời các saponin đối chiếu (Rg1, Re, Rd, Rb1, Rh1, Rg3).

2. Phương pháp nghiên cứu dược lý in vitro:

   • Đánh giá khả năng ức chế tăng sinh tế bào trên 6 dòng tế bào ung thư người và dòng sarcoma TG180 chuột bằng phương pháp Sulforhodamine B (SRB) hoặc MTT; tính giá trị $IC_{50}$.
   • Đánh giá khả năng cảm ứng apoptosis trên tế bào sarcoma TG180 bằng thiết bị Flow Cytometer sau khi nhuộm kép Annexin V-FITC và Propidium Iodide (PI), phân tích tỷ lệ tế bào apoptosis sớm (Annexin $\text{V}^+/\text{PI}^-$) và apoptosis muộn (Annexin $\text{V}^+/\text{PI}^+$).

3. Phương pháp nghiên cứu dược lý in vivo:

   • Mô hình u rắn: Cấy chuyển $10^6$ tế bào sarcoma TG180 dưới da đùi chuột nhắt trắng Swiss. Phân ngẫu nhiên vào các lô: Lô chứng sinh lý (SL), Lô gây u không điều trị (UT), Lô chứng dương tham chiếu (Taxol/Cyclophosphamid), các lô điều trị bằng NP(O) và NP(H) ở các mức liều khác nhau.
   • Đánh giá hiệu lực kháng u: Đo thể tích khối u bằng thước kẹp cơ học từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 21 sau cấy u; tính tỷ lệ ức chế phát triển khối u ($IR%$) và xếp loại theo thang tiêu chuẩn Itokawa.
   • Chỉ tiêu miễn dịch: Định lượng nồng độ IL-2 và TNF-$\alpha$ huyết thanh chuột bằng kit ELISA; đếm tổng số bạch cầu và phân tích công thức bạch cầu; xác định cân nặng tương đối của lách và tuyến ức.
   • Chỉ tiêu stress oxy hóa mô gan: Định lượng nồng độ malondialdehyde (MDA), hàm lượng glutathione (GSH), hoạt độ enzym superoxide dismutase (SOD) và catalase (CAT) trong mô đồng thể gan; đo hoạt độ ALT, AST huyết thanh; quan sát hình thái đại thể và cấu trúc vi thể gan qua tiêu bản nhuộm HE.
   • Đánh giá thời gian sống thêm: Theo dõi số chuột sống sót hàng ngày (mỗi lô $n=20$), tính thời gian sống trung bình (ngày) và tỷ lệ phần trăm thời gian sống kéo dài ($ILS%$).

4. Phương pháp đánh giá an toàn sinh học:

   • Độc tính cấp: Xác định $LD_{50}$ trên chuột nhắt trắng bằng đường uống theo phương pháp Litchfield - Wilcoxon (hoặc thử nghiệm liều tối đa không gây chết).
   • Độc tính bán trường diễn: Cho chuột cống trắng uống cao NP(H) liên tục trong 28 đến 90 ngày; theo dõi thể trạng, các chỉ số huyết học, chức năng gan (AST, ALT, albumin, cholesterol), chức năng thận (creatinin) và giải phẫu bệnh vi thể gan, thận, lách.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 tổng hợp có hệ thống cơ sở lý luận về bệnh sinh ung thư, mối liên hệ mật thiết giữa sự tiến triển khối u với tình trạng suy giảm miễn dịch và stress oxy hóa. Phân tích chi tiết đặc điểm thực vật, vùng phân bố của Tam thất (Panax notoginseng) tại Việt Nam và Trung Quốc, cấu trúc hóa học của các saponin nhóm dammaran (20(S)-protopanaxadiol và 20(S)-protopanaxatriol). Chương này làm rõ cơ chế chuyển hóa saponin qua chế biến nhiệt: các liên kết glycosyl tại vị trí C-6 và C-20 bị thủy phân và mất nước tạo thành các ginsenosid thứ cấp phân cực thấp (Rg3, Rh1, Rh4, Rk3, Rg5, Rk1). Đồng thời, chương 1 phân tích ưu thế của mô hình khối u ghép đồng loài sarcoma TG180 trên chuột có hệ miễn dịch bình thường trong việc khảo sát đồng thời tác dụng ức chế u, kích thích đáp ứng miễn dịch và bảo vệ tế bào gan chống stress oxy hóa.

Chương 2: Chất liệu, đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc nguyên liệu rễ củ Tam thất 4 năm tuổi thu hái tại huyện Si Ma Cai, tỉnh Lào Cai; thiết kế thực nghiệm khảo sát 4 nhóm điều kiện hấp nhiệt (mẫu tươi 100°C, tươi 120°C, khô 100°C, khô 120°C ở 6 mốc thời gian 4–24 giờ); quy trình chiết xuất và tiêu chuẩn hóa cao định lượng NP(O) và NP(H); quy trình phân lập các hợp chất PN1–PN6; các điều kiện sắc ký HPLC; phương pháp thử nghiệm in vitro trên các dòng tế bào ung thư; kỹ thuật đo apoptosis qua Flow Cytometry; phương pháp tạo khối u rắn sarcoma TG180 trên chuột nhắt trắng Swiss; các kỹ thuật xét nghiệm sinh hóa, miễn dịch (ELISA), huyết học, mô bệnh học; và quy trình thử nghiệm độc tính cấp, bán trường diễn theo hướng dẫn chuyên ngành.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm thu được:

Nhóm nội dung thực nghiệm	Kết quả định lượng và phát hiện chính
Biến đổi saponin qua hấp nhiệt	Khi hấp ở 120°C, các saponin phân cực cao (Rg1, Rb1, Rd, R1) giảm dần theo thời gian; các saponin thứ cấp (Rg3, Rh1) tăng mạnh và đạt đỉnh tối ưu ở mẫu khô hấp 120°C trong khoảng thời gian nhất định.
Phân lập & cấu trúc (PN1–PN6)	Phân lập thành công 4 hợp chất từ mẫu không hấp: ginsenosid Rg1 (PN1), Re (PN2), Rd (PN3), Rb1 (PN4); và 2 hợp chất từ mẫu hấp: ginsenosid Rh1 (PN5), Rg3 (PN6). Cấu trúc được xác định qua dữ liệu ESI-MS, $^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, HMBC.
Tác dụng gây độc tế bào in vitro	Saponin phân lập Rg3, Rh1 và cao định lượng NP(H) thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư người và sarcoma TG180 vượt trội so với cao NP(O) và các saponin nguyên thủy (Rg1, Rb1).
Cảm ứng Apoptosis trên TG180	Cao NP(H) làm tăng có ý nghĩa thống kê tỷ lệ tế bào apoptosis (bao gồm cả giai đoạn sớm và giai đoạn muộn) trên dòng sarcoma TG180 so với nhóm chứng đối kháng.
Hiệu lực ức chế u rắn in vivo	Cao NP(H) làm giảm thể tích khối u rắn sarcoma TG180 trên đùi chuột nhắt trắng từ ngày 7 đến ngày 21 sau tiêm truyền; hiệu lực kháng u đạt mức có ý nghĩa theo thang phân loại H. Itokawa.
Đáp ứng miễn dịch in vivo	Cao NP(H) làm tăng nồng độ IL-2 và TNF-$\alpha$ huyết thanh chuột mang u; cải thiện tổng số bạch cầu; duy trì trọng lượng tương đối của lách và tuyến ức so với lô ung thư không điều trị (UT).
Chống oxy hóa & bảo vệ gan	Chuột uống cao NP(H) có hàm lượng MDA trong gan giảm rõ rệt; hàm lượng GSH, hoạt độ enzym SOD và CAT tăng; hoạt độ ALT, AST giảm; hạn chế tổn thương hoại tử nhu mô gan trên tiêu bản HE.
Kéo dài thời gian sống thêm	Tăng thời gian sống trung bình (ngày) và tỷ lệ sống kéo dài ($ILS%$) của chuột mang u sarcoma TG180 ở các lô điều trị bằng NP(H) so với lô đối chứng UT.
Độc tính cấp & bán trường diễn	Không xác định được $LD_{50}$ đường uống của cao NP(H) ở mức liều dung nạp tối đa thử nghiệm. Chuột cống uống cao NP(H) liều nhắc lại không biểu hiện độc tính trên các chỉ số huyết học, men gan, chức năng thận và cấu trúc mô bệnh học gan, thận, lách.

                                TAM THẤT LÀO CAI (4 NĂM TUỔI)
                 TAM THẤT KHÔNG HẤP                             TAM THẤT HẤP NHIỆT
        (Chứa: Rg1, Re, Rd, Rb1...)                        Cao định lượng NP(H)
                 TÁC DỤNG IN VITRO       TÁC DỤNG IN VIVO        ĐỘC HỌC TIỀN LÂM SÀNG
                 - Độc 6 dòng TB người   - Ức chế u TG180        - Độc tính cấp (LD50)
                 - Gây độc sarcom TG180  - Tăng IL-2, TNF-α      - Độc tính bán trường
                 - Kích hoạt apoptosis   - Giảm MDA, tăng SOD/CAT  diễn (chuột cống)
                                         - Kéo dài sống thêm

Chương 4: Bàn luận

Chương 4 phân tích sâu về cơ chế hóa học và dược lý:

• Phân tích bản chất của phản ứng thủy phân chọn lọc liên kết đường và phản ứng tách nước dưới tác dụng của nhiệt độ cao và áp suất hơi nước, giải thích sự gia tăng hàm lượng của các saponin có chuỗi đường ngắn (như Rg3, Rh1) – các chất có tính thân dầu cao hơn, dễ dàng xuyên qua màng lipid kép của tế bào ung thư để kích hoạt các con đường truyền tín hiệu nội bào.
• Bàn luận về mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính: các saponin thứ cấp trong cao NP(H) kích hoạt quá trình tự chết theo chương trình (apoptosis) thông qua con đường màng và con đường ty thể, dẫn đến sự co cụm tế bào, mất tính đối xứng của màng phospholipid (bộc lộ phosphatidylserine gắn kết Annexin V) và phân mảnh DNA.
• Biện giải tác dụng in vivo: Tác dụng kháng u của cao NP(H) trên chuột mang khối u rắn sarcoma TG180 là kết quả của sự tác động tổng hợp đa chiều: ức chế trực tiếp sự tăng sinh khối u, kích thích hệ thống miễn dịch tế bào thông qua việc tăng tiết các cytokine chủ chốt (IL-2, TNF-$\alpha$), kích hoạt các tế bào hiệu ứng (tế bào T gây độc, tế bào NK), đồng thời giảm stress oxy hóa toàn thân và bảo vệ nhu mô gan khỏi sự phá hủy của các gốc tự do ROS sinh ra từ khối u.
• Đánh giá sự an toàn của cao NP(H) qua các thử nghiệm độc tính cấp và bán trường diễn, khẳng định khoảng liều tác dụng có hiệu quả kháng u nằm trong giới hạn an toàn cao.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học

1. Xác lập đầy đủ quy luật chuyển hóa nhiệt của các saponin dammaran trong rễ củ Tam thất trồng tại Si Ma Cai, Lào Cai; chứng minh quá trình hấp nhiệt làm biến đổi sâu sắc thành phần hóa học, làm suy giảm các saponin nguyên thủy (Rg1, Rb1, Rd, R1) và sản sinh các saponin thứ cấp có hoạt tính sinh học cao (Rh1, Rg3).
2. Cung cấp bằng chứng thực nghiệm toàn diện chứng minh cao Tam thất hấp nhiệt NP(H) có hoạt tính kháng u vượt trội so với cao không hấp NP(O), thông qua cơ chế kích hoạt apoptosis trên tế bào ung thư sarcoma TG180.
3. Làm sáng tỏ cơ chế tác dụng kháng u in vivo của cao Tam thất chế biến nhiệt: không chỉ ức chế kích thước khối u mà còn điều hòa miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào (tăng sinh bạch cầu, tăng nồng độ IL-2, TNF-$\alpha$, bảo tồn khối lượng tuyến ức và lách), đồng thời ức chế quá trình peroxy hóa lipid (giảm MDA) và tăng cường hệ thống chống oxy hóa nội sinh (GSH, SOD, CAT), bảo vệ nhu mô gan của động vật mang u.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn và ứng dụng

1. Xây dựng thông số kỹ thuật chế biến hấp nhiệt tối ưu (nhiệt độ 120°C trên nguyên liệu Tam thất khô) và quy trình chiết xuất cao định lượng chuẩn hóa NP(H) có hàm lượng hoạt chất ổn định.
2. Thiết lập quy trình phân tích định lượng đồng thời các saponin chính trong Tam thất bằng phương pháp HPLC.
3. Cung cấp dữ liệu độc học tiền lâm sàng (độc tính cấp và bán trường diễn) chứng minh tính an toàn của cao định lượng NP(H), tạo cơ sở khoa học để phát triển các dạng sản phẩm thuốc hoặc thực phẩm bảo vệ sức khỏe hỗ trợ điều trị ung thư từ nguồn dược liệu Tam thất trồng tại Việt Nam.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của luận án

• Nghiên cứu thực nghiệm in vivo mới thực hiện trên mô hình khối u ghép đồng loài (sarcoma TG180 trên chuột nhắt trắng); chưa triển khai trên các mô hình khối u ghép dị loài tế bào người trên chuột suy giảm miễn dịch (nude mice) hoặc mô hình ung thư tự phát.
• Phân tích hóa học và phân lập chủ yếu tập trung vào 6 saponin chính (Rg1, Re, Rd, Rb1, Rh1, Rg3); chưa định lượng và phân lập riêng rẽ toàn bộ các đồng phân hình học và saponin thứ cấp vi lượng khác phát sinh sau hấp nhiệt như Rk1, Rg5, Rk3, Rh4.
• Đánh giá lâm sàng chưa được thực hiện trong khuôn khổ luận án tiến sĩ thực nghiệm.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Tiếp tục phân lập sâu, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính sinh học của các phân đoạn saponin thứ cấp vi lượng trong cao Tam thất hấp nhiệt.
• Nghiên cứu phối hợp cao định lượng NP(H) với các thuốc hóa trị liệu kinh điển nhằm đánh giá khả năng hiệp đồng tăng tác dụng kháng u và giảm độc tính của hóa trị.
• Hoàn thiện quy trình công nghệ bào chế ở quy mô pilot và triển khai các thử nghiệm lâm sàng đánh giá hiệu quả hỗ trợ điều trị trên bệnh nhân ung thư.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị cao cho nhiều nhóm đối tượng:

• Nghiên cứu sinh và học viên sau đại học chuyên ngành Dược lý, Dược lâm sàng, Hóa thực vật và Dược liệu: Cung cấp phương pháp luận chuẩn xác về thiết kế thực nghiệm chuyển hóa hoạt chất qua chế biến nhiệt, kỹ thuật phân lập saponin dammaran, thẩm định HPLC và hệ thống các mô hình đánh giá tác dụng kháng u in vitro, in vivo.
• Giảng viên và cán bộ nghiên cứu tại các trường Đại học Y Dược, Viện nghiên cứu: Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về cơ chế tương tác giữa ung thư, đáp ứng miễn dịch và stress oxy hóa; các tiêu bản mô bệnh học và dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các hợp chất ginsenosid.
• Các doanh nghiệp sản xuất dược phẩm và nhà hoạch định chính sách phát triển dược liệu: Cung cấp căn cứ khoa học vững chắc về giá trị sinh học của Tam thất trồng tại Lào Cai, làm cơ sở định hướng chế biến sâu, nâng cao giá trị chuỗi sản phẩm Tam thất Việt Nam thay thế nguồn dược liệu nhập khẩu.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Quá trình chế biến bằng hấp nhiệt làm thay đổi thành phần saponin trong Tam thất như thế nào?

Dưới tác động của nhiệt độ (đặc biệt ở 120°C) và áp suất hơi nước, các saponin ban đầu có hàm lượng cao trong rễ củ tươi/khô (như ginsenosid Rg1, Rb1, Rd, Re và notoginsenosid R1) bị thủy phân liên kết đường tại vị trí C-6 và C-20, tiếp tục khử nước để chuyển hóa thành các saponin thứ cấp ít phân cực hơn như ginsenosid 20(S/R)-Rh1, 20(S/R)-Rg3, Rk1, Rg5, Rk3, Rh4. Các hợp chất này hầu như không hiện diện trong Tam thất chưa qua chế biến nhiệt.

2. Hai mẫu cao NP(O) và NP(H) trong luận án khác nhau ở điểm nào?

• NP(O): Cao định lượng được chiết xuất bằng ethanol 70% từ bột rễ củ Tam thất nguyên bản, không qua xử lý hấp nhiệt, chứa chủ yếu các saponin ban đầu (Rg1, Rb1, Rd, Re, R1).
• NP(H): Cao định lượng được chiết xuất bằng ethanol 70% từ bột rễ củ Tam thất đã qua quy trình hấp nhiệt tối ưu (ở 120°C), được làm giàu hàm lượng các saponin thứ cấp có hoạt tính kháng u mạnh (đặc biệt là Rg3 và Rh1).

3. Cao định lượng NP(H) thể hiện tác dụng kháng u in vivo thông qua những cơ chế nào?

Cao NP(H) tác động thông qua cơ chế tích hợp đa chiều:

1. Ức chế khối u trực tiếp: Làm giảm thể tích u rắn sarcoma TG180 trên chuột nhắt trắng và cảm ứng tế bào ung thư chết theo chương trình (apoptosis).
2. Tăng cường miễn dịch: Kích thích tăng số lượng bạch cầu, tăng nồng độ cytokine IL-2 và TNF-$\alpha$ huyết thanh, duy trì trọng lượng tương đối của lách và tuyến ức.
3. Chống stress oxy hóa & bảo vệ gan: Giảm nồng độ sản phẩm peroxy hóa lipid (MDA), phục hồi hàm lượng GSH và hoạt độ các enzym chống oxy hóa (SOD, CAT) trong gan, hạ men gan ALT, AST và bảo tồn cấu trúc vi thể gan.

4. Kết quả đánh giá độc tính của cao định lượng NP(H) cho thấy điều gì?

Cao NP(H) có độ an toàn cao: thử nghiệm độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt trắng không xác định được $LD_{50}$ ở mức liều tối đa thử nghiệm. Thử nghiệm độc tính bán trường diễn trên chuột cống trắng uống liều nhắc lại không gây biến đổi bệnh lý trên các chỉ số huyết học, chức năng gan thận (AST, ALT, albumin, cholesterol, creatinin) và không gây tổn thương mô bệnh học đại thể hay vi thể ở gan, thận, lách.

5. Vì sao luận án lựa chọn mô hình khối u ghép đồng loài sarcoma TG180 trên chuột nhắt bình thường?

Mô hình ghép đồng loài sarcoma TG180 trên chuột nhắt bình thường (không bị suy giảm miễn dịch) cho phép đánh giá đầy đủ sự tương tác giữa 3 yếu tố: khối u, thuốc thử nghiệm và hệ miễn dịch nguyên vẹn của vật chủ. Qua đó, nghiên cứu có thể đo lường chính xác tác động kích thích miễn dịch và bảo vệ tế bào gan chống stress oxy hóa của chế phẩm, điều mà các mô hình chuột nude (thiếu hụt tế bào T) không thể phản ánh đầy đủ.

---

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Bùi Thị Thu Hà là công trình nghiên cứu thực nghiệm có hệ thống, giải quyết trọn vẹn mối liên hệ giữa phương pháp chế biến hấp nhiệt, sự chuyển hóa saponin dammaran và hoạt tính kháng u thực nghiệm của rễ củ Tam thất trồng tại Việt Nam. Kết quả đã chứng minh cao định lượng Tam thất hấp nhiệt NP(H) thể hiện tác dụng kháng u vượt trội in vitro và in vivo thông qua việc kích hoạt apoptosis, tăng cường đáp ứng miễn dịch và bảo vệ mô gan chống stress oxy hóa, đồng thời có độ an toàn tiền lâm sàng cao. Công trình cung cấp luận cứ khoa học quan trọng phục vụ phát triển các sản phẩm hỗ trợ điều trị ung thư và nâng cao giá trị chuỗi dược liệu Tam thất trong nước.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH UNG THƯ 1. Tình hình ung thư trên thế giới và Việt Nam Ung thư được xếp là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu và là rào cản quan trọng đối với việc tăng tuổi thọ ở mọi quốc gia trên thế giới [1]. Theo thống kê của Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế [2], trên toàn thế giới ước tính có khoảng 19,3 triệu trường hợp ung thư mới (18,1 triệu trường hợp không bao gồm ung thư da không tế bào hắc tố) và gần 10 triệu trường hợp tử vong do ung thư (9,9 triệu trường hợp không bao gồm ung thư da không phải ung thư biểu mô) xảy ra vào năm 2020.

Ung thư vú đã vượt qua ung thư phổi là loại ung thư được chẩn đoán phổ biến nhất, với ước tính có khoảng 2,3 triệu ca mới (11,7%), tiếp theo là ung thư phổi (11,4%), đại trực tràng (10,0%), tuyến tiền liệt (7,3%) và dạ dày (5,6%). Ung thư phổi vẫn là nguyên nhân gây tử vong do ung thư hàng đầu, với ước tính 1,8 triệu ca tử vong (18%), tiếp theo là ung thư đại trực tràng (9,4%), gan (8,3%), dạ dày (7,7%) và ung thư vú ở nữ (6,9%). Gánh nặng ung thư toàn cầu dự kiến sẽ là 28,4 triệu ca vào năm 2040, tăng 47% so với năm 2020, với sự gia tăng lớn hơn ở các quốc gia đang phát triển (64% lên 95%) so với các quốc gia phát triển (32% lên 56%). Sự đa dạng bất thường của bệnh ung thư tiếp tục cung cấp bằng chứng cho những nguyên nhân cơ bản nhưng cũng củng cố nhu cầu về nỗ lực ngày càng leo thang trên toàn cầu để kiểm soát căn bệnh này [13], [14].

Tại Việt Nam, gánh nặng ung thư đã tăng gấp ba lần trong 30 năm qua và tình trạng này có thể được giải thích một phần là do sự gia tăng của các yếu tố nguy cơ cũ và mới [4], [15]. Bên cạnh virus viêm gan B, nhiều yếu tố nguy cơ quan trọng khác như virus u nhú ở người, sử dụng thuốc lá, lười vận động và chế độ ăn uống không hợp lý vẫn chưa được kiểm soát ở Việt Nam. Tại Việt Nam, trong năm 2020 ước tính số ca ung thư mới là 182563 (0,19% dân số), và số người chết ước tính là 122690 (0,13% dân số) [3]. Những ung thư mắc tỷ lệ cao là ung thư gan, ung thư phổi, ung thư vú, ung thư dạ dày, ung thư đại tràng và ung thư tiền liệt tuyến (Bảng 1.

3 document, khoa luan19 of 98. tai lieu, luan van20 of 98. Thống kê tóm tắt năm 2020 tình hình ung thư tại Việt Nam (nguồn Global Cancer Observatory -Vietnam Population fact sheets [3]) Nam Nữ Cả 2 giới Dân số 48 598 254 48 740 329 97 338 583 Số ca ung thư mới mắc 98 916 83 647 182 563 Tỷ lệ mắc được chuẩn hóa theo độ tuổi (thế giới) 191,5 135,5 159,7 Nguy cơ phát triển ung thư trước 75 tuổi (%) 19,5 13,6 16,3 Số ca chết do ung thư 74481 48209 122690 Tỷ lệ chết được chuẩn hóa theo độ tuổi (thế giới) 144,5 74,8 106,0 Nguy cơ chết ung thư trước 75 tuổi (%) 15,0 8,0 11,2 Số ca hiện mắc trong 5 năm 162 822 191 004 353 826 5 loại ung thư có số ca mắc cao nhất ngoại trừ Gan Vú Gan ung thư da không hắc tố Phổi Phổi Phổi Dạ dày Đại tràng Vú Đại tràng Dạ dày Dạ dày Tiền liệt tuyến Gan Đại tràng 1.