Luận án tiến sĩ công nghệ sinh học nghiên cứu tác động của nano bạc và nano sắt lên chất lượng cây giống in vitro ở một số cây trồng có giá trị kinh tế

Luận án tiến sĩ nghiên cứu công nghệ sinh học nghiên cứu tác động của nano bạc và nano sắt lên chất lượng cây giống in vitro ở, phát triển phương pháp mới, đánh giá hiệu quả ứng

• Tác giả: Đỗ Mạnh Cường
• Người hướng dẫn: GS. Dương Tấn Nhựt
• Trường học: Đại học Khoa học, Đại học Huế
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Thực vật
• Đề tài: Nghiên cứu tác động của nano bạc và nano sắt lên chất lượng cây giống in vitro ở một số cây trồng có giá trị kinh tế
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Lâm Đồng

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• MỤC LỤC
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.2. Vi nhân giống. Khái niệm vi nhân giống. Các giai đoạn trong vi nhân giống thực vật
• 1.2.1. Khử trùng bề mặt
• 1.2.2. Phát sinh hình thái
• 1.2.3. Cây hoàn chỉnh và thích nghi vườn ươm. Một số hạn chế trong vi nhân giống thực vật
• 1.2.4. Tích luỹ khí ethylene
• 1.2.5. Hoá nâu mẫu cấy
• 1.3. Nano kim loại
• 1.3.1. Giới thiệu chung
• 1.3.2. Ứng dụng nano kim loại trong vi nhân giống thực vật
• 1.3.3. AgNPs và FeNPs trong vi nhân giống thực vật
• 1.3.3.1. AgNPs trong vi nhân giống thực vật
• 1.3.3.2. FeNPs trong vi nhân giống thực vật
• 1.3.4. Hấp thu, vận chuyển và chuyển hóa nano kim loại trong cây
• 1.3.5. Tính an toàn sinh học của các nano kim loại
• 1.4. Sơ lược về các đối tượng cây trồng sử dụng trong nghiên cứu
• 1.4.1. Sâm Ngọc Linh
• 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu thực vật
• 2.2. Dung dịch nano
• 2.3. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất
• 2.4. Nội dung nghiên cứu
• 2.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu cấy
• 2.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên sự phát sinh hình thái các loại mẫu trong nuôi cấy in vitro
• 2.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi trong nuôi cấy in vitro
• 2.4.4. Nghiên cứu khả năng sinh trưởng tiếp theo của cây con in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
• 2.5.2. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu cấy
• 2.5.3. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên sự phát sinh hình thái các loại mẫu trong nuôi cấy in vitro
• 2.5.4. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi trong nuôi cấy in vitro
• 2.5.5. Thí nghiệm 4: Theo dõi khả năng thích nghi, sinh trưởng, phát triển và tích luỹ hoạt chất của cây con in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro
• 2.5.6. Phương pháp theo dõi các chỉ tiêu
• 2.5.6.1. Phương pháp quan sát bề mặt mô sẹo
• 2.5.6.2. Phương pháp giải phẫu thực vật
• 2.5.6.3. Phương pháp quan sát và đếm số lượng tế bào
• 2.5.6.4. Phương pháp xác định hàm lượng khí ethylene
• 2.5.6.5. Phương pháp xác định hàm lượng AgNPs hấp thụ
• 2.5.6.6. Phương pháp phân tích định lượng saponin (G-Rg1, M-R2, G-Rb1)
• 2.6. Điều kiện nuôi cấy
• 2.7. Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm
• 2.8. Phương pháp xử lý thống kê
• 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu cấy
• 3.1.1. Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây salem
• 3.1.2. Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây dâu tây
• 3.1.3. Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây sâm Ngọc Linh
• 3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên sự phát sinh hình thái các loại mẫu trong nuôi cấy in vitro
• 3.2.1. Ảnh hưởng của AgNPs lên sự gia tăng số lượng tế bào từ mô sẹo cây salem nuôi cấy in vitro
• 3.2.2. Ảnh hưởng của AgNPs lên sự tái sinh chồi từ huyền phù tế bào cây salem nuôi cấy in vitro
• 3.2.3. Ảnh hưởng của AgNPs lên quá trình phát sinh và tăng sinh phôi từ mô sẹo sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro
• 3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi nuôi cấy in vitro
• 3.3.1. Ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi cây salem nuôi cấy in vitro
• 3.3.2. Ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi cây dâu tây nuôi cấy in vitro
• 3.3.3. Ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro
• 3.4. Khả năng sinh trưởng tiếp theo của cây con in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro
• 3.4.1. Khả năng sinh trưởng tiếp theo của cây salem in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro
• 3.4.2. Khả năng sinh trưởng tiếp theo của cây dâu tây in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro
• 3.4.3. Khả năng sinh trưởng tiếp theo của cây sâm Ngọc Linh in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Giới thiệu về nghiên cứu

Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá tác động của nano bạc (AgNPs) và nano sắt (FeNPs) lên chất lượng cây giống in vitro ở các loại cây trồng có giá trị kinh tế như salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh. Công nghệ nano đã được ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp, đặc biệt là trong vi nhân giống, nhằm cải thiện chất lượng nông sản và tăng năng suất cây trồng. Nghiên cứu này nhằm mục đích khám phá tiềm năng của nano bạc và nano sắt trong việc nâng cao hiệu quả của hệ thống in vitro và cải thiện giống cây.

1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của nghiên cứu là đánh giá tác động của AgNPs và FeNPs lên các giai đoạn khác nhau của vi nhân giống, bao gồm khử trùng bề mặt, phát sinh hình thái, và tạo cây hoàn chỉnh. Nghiên cứu cũng nhằm xác định ảnh hưởng của các hạt nano lên chất lượng cây giống và khả năng thích nghi của cây ở giai đoạn ex vitro.

1.2. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu bao gồm AgNPs và FeNPs với các nồng độ khác nhau, được sử dụng trên các loại cây trồng như salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh. Phạm vi nghiên cứu tập trung vào việc đánh giá tác động của các hạt nano lên các giai đoạn khử trùng, phát sinh hình thái, và tạo cây hoàn chỉnh trong hệ thống in vitro.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện thông qua các thí nghiệm được thiết kế chặt chẽ để đánh giá tác động của AgNPs và FeNPs lên các giai đoạn khác nhau của vi nhân giống. Các phương pháp bao gồm khử trùng bề mặt, phát sinh hình thái, và tạo cây hoàn chỉnh. Dữ liệu được thu thập và phân tích để đánh giá hiệu quả của các hạt nano trong việc cải thiện chất lượng cây giống.

2.1. Khử trùng bề mặt

Nghiên cứu đánh giá hiệu quả của AgNPs trong việc khử trùng bề mặt mẫu lá của các loại cây trồng như salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh. Kết quả được so sánh với các chất khử trùng truyền thống như calcium hypochlorite và chlorua thủy ngân.

2.2. Phát sinh hình thái

Nghiên cứu tập trung vào ảnh hưởng của AgNPs lên quá trình phát sinh hình thái, bao gồm phát sinh phôi, tái sinh chồi, và gia tăng số lượng tế bào. Các kết quả được ghi nhận và phân tích để đánh giá hiệu quả của AgNPs trong việc cải thiện chất lượng cây giống.

III. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy AgNPs và FeNPs có tác động tích cực lên các giai đoạn khử trùng, phát sinh hình thái, và tạo cây hoàn chỉnh. AgNPs đặc biệt hiệu quả trong việc khử trùng bề mặt và thúc đẩy phát sinh hình thái. FeNPs cũng cho thấy tiềm năng trong việc thay thế Fe-EDTA trong môi trường nuôi cấy, giúp cải thiện chất lượng cây giống.

3.1. Tác động của AgNPs

AgNPs cho thấy hiệu quả cao trong việc khử trùng bề mặt và thúc đẩy phát sinh hình thái. Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng AgNPs có thể thay thế các chất khử trùng truyền thống, đồng thời cải thiện chất lượng cây giống trong hệ thống in vitro.

3.2. Tác động của FeNPs

FeNPs được chứng minh là có hiệu quả trong việc thay thế Fe-EDTA trong môi trường nuôi cấy. Nghiên cứu cho thấy FeNPs giúp cải thiện chất lượng cây giống và tăng khả năng thích nghi của cây ở giai đoạn ex vitro.

IV. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu đã chứng minh tác động tích cực của AgNPs và FeNPs lên chất lượng cây giống in vitro. Công nghệ nano có tiềm năng lớn trong việc cải thiện vi nhân giống và phát triển cây trồng. Các kết quả nghiên cứu mở ra hướng ứng dụng mới trong nông nghiệp, đặc biệt là trong việc cải thiện giống cây và tăng năng suất cây trồng.

4.1. Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu cung cấp các dẫn liệu khoa học mới về tác động của nano kim loại lên vi nhân giống. Kết quả nghiên cứu có giá trị trong việc phát triển các phương pháp mới để cải thiện giống cây và tăng năng suất cây trồng.

4.2. Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu có ý nghĩa thực tiễn cao trong việc ứng dụng công nghệ nano vào nông nghiệp. Các kết quả nghiên cứu có thể được áp dụng để cải thiện chất lượng nông sản và tăng năng suất cây trồng, đặc biệt là ở các loại cây trồng có giá trị kinh tế cao.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt là kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào và cơ quan thực vật trên môi trường dinh dưỡng được kiểm soát, cho phép nhân nhanh các giống cây trồng đồng nhất về mặt di truyền, tạo nguồn giống sạch bệnh và bảo tồn nguồn gen quý. Tuy nhiên, quy trình vi nhân giống truyền thống còn gặp nhiều hạn chế: tỷ lệ nhiễm vi sinh vật trong giai đoạn khử trùng bề mặt còn cao; hiệu quả cảm ứng mô sẹo, phát sinh phôi và tái sinh chồi chưa tối ưu; hiện tượng tích lũy khí ethylene và hóa nâu mẫu cấy gây suy giảm chất lượng cây in vitro; tỷ lệ sống sót khi chuyển cây con ra vườn ươm (giai đoạn ex vitro) bị hao hụt từ 10% đến 40% hoặc cao hơn. Nhằm khắc phục các tồn tại này, luận án tập trung ứng dụng vật liệu nano kim loại gồm nano bạc (AgNPs) và nano sắt (FeNPs) vào các giai đoạn nhân giống in vitro và đánh giá khả năng sinh trưởng ex vitro.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định như sau:

1. Đánh giá ảnh hưởng của AgNPs lên hiệu quả khử trùng bề mặt mẫu lá cây salem (Limonium sinuatum), dâu tây (Fragaria × ananassa) và sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), so sánh với các chất khử trùng truyền thống là calcium hypochlorite [$\text{Ca(ClO)}_2$] và chlorua thủy ngân ($\text{HgCl}_2$).
2. Đánh giá ảnh hưởng của AgNPs lên sự phát sinh hình thái (tăng sinh số lượng tế bào, tái sinh chồi từ huyền phù tế bào, phát sinh và tăng sinh phôi vô tính) ở cây salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh.
3. Đánh giá ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi nuôi cấy in vitro ở ba loài cây nghiên cứu.
4. Đánh giá ảnh hưởng của AgNPs được hấp thu đến sự biến động hàm lượng khí ethylene tích lũy trong quá trình hình thành rễ cây in vitro.
5. Đánh giá khả năng thích nghi, sinh trưởng và phát triển của cây con ở giai đoạn ex vitro (vườn ươm và nhà kính) có nguồn gốc từ các nghiệm thức AgNPs và FeNPs tối ưu in vitro, bao gồm việc định lượng hoạt chất saponin ở củ sâm Ngọc Linh.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng: Hạt nano bạc (AgNPs) dùng khử trùng bề mặt và bổ sung vào môi trường nuôi cấy; hạt nano sắt (FeNPs) dùng thay thế $\text{Fe-EDTA}$ trong môi trường khoáng; ba loài thực vật gồm hoa salem (Limonium sinuatum), dâu tây (Fragaria × ananassa) và sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.).
• Phạm vi: Toàn bộ quy trình nhân giống từ khử trùng mẫu lá, cảm ứng mô sẹo, huyền phù tế bào, phát sinh phôi soma, tạo cây hoàn chỉnh in vitro đến giai đoạn thuần hóa ngoài vườn ươm và trồng trong nhà kính tại Lâm Đồng (Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã tổng hợp có hệ thống các nghiên cứu trong nước và quốc tế về các giai đoạn vi nhân giống và ứng dụng hạt nano kim loại:

• Về khử trùng bề mặt: Điểm lại công trình của Street (1974) về nồng độ và thời gian xử lý của các chất khử trùng [$\text{Ca(ClO)}_2$, $\text{HgCl}_2$, $\text{NaOCl}$, $\text{H}_2\text{O}_2$, $\text{Br}_2$, chất kháng sinh], nghiên cứu của Hussanin và cộng sự (1994) về $\text{HgCl}_2$, các công trình khử trùng trên salem [83] và dâu tây [79], [111], [122], [21].
• Về phát sinh hình thái và tạo cây hoàn chỉnh: Điểm lại các nghiên cứu về cảm ứng mô sẹo [70], [20], huyền phù tế bào [156], [7], phát sinh phôi vô tính [19], [10], [163]; các nghiên cứu nhân giống trên salem [83], [78], [59], [93], trên dâu tây [111], [82], [112], [123], và trên sâm Ngọc Linh [119], [118], [116].
• Về các hạn chế trong vi nhân giống: Phân tích cơ chế tích lũy khí ethylene theo mô hình của Houben và Van de Poel (2019) [76] và Azhar và cộng sự (2019) [28]; hiện tượng hóa nâu do giải phóng hợp chất phenolic [164], [40].
• Về ứng dụng nano kim loại: Tổng hợp các nghiên cứu trên thế giới về AgNPs, $\text{TiO}_2\text{NPs}$, $\text{ZnONPs}$, $\text{AuNPs}$, $\text{CoNPs}$ trên nhiều loài thực vật [22], [58], [161], [102], [138], [107], [27], [132], [134], [103], [74], [149], [68], [24], [57], [64], [142], [170], [91]; cùng các nghiên cứu tại Việt Nam của Dương Tấn Nhựt và cộng sự trên hoa cúc (Chrysanthemum spp.), hoa chuông (Saintpaulia ionantha), chanh lạc (Passiflora edulis), hoa hồng (Rosa hybrida), đồng tiền (Gerbera jamesonii) và rễ tơ sâm Ngọc Linh [12], [3], [14], [18], [97], [160], [6], [8], [9], [13].

Hướng nghiên cứu	Tác giả & Năm công bố	Đối tượng / Hóa chất	Phát hiện chính
Khử trùng truyền thống	Street (1974)	$\text{Ca(ClO)}_2$, $\text{HgCl}_2$, $\text{NaOCl}$, kháng sinh	Xác lập bảng nồng độ và thời gian khử trùng chuẩn cho mẫu cấy
Con đường ethylene	Houben & Van de Poel (2019)	Methionine, SAM, ACC, ACS, ACO	Mô tả chu trình sinh hóa tổng hợp khí ethylene ở thực vật
Truyền tín hiệu ethylene	Azhar và cộng sự (2019)	ETR1, CTR1, EIN2, EIN3, ERF1	Làm rõ cơ chế tiếp nhận tín hiệu ethylene qua thụ thể màng
Cơ chế hấp thu Fe	Romheld và cộng sự (1986)	Cơ chế 1 (khử Fe) & Cơ chế 2 (phytosiderophores)	Phân tích cơ chế hấp thu sắt phụ thuộc pH và dịch tiết rễ
AgNPs khử trùng mẫu	Safavi và cộng sự (2011) [161]	Fragaria × ananassa	Khử trùng bề mặt bằng 200 mg/L AgNPs trong 20 phút
FeNPs trong thủy canh	Almeelbi & Bezbaruah (2012) [25]	Spinacia oleracea	FeNPs làm tăng gấp đôi hàm lượng Fe trong mô lá và rễ

Khoảng trống nghiên cứu được luận án lựa chọn giải quyết là: Việc sử dụng AgNPs để thay thế hoàn toàn $\text{HgCl}_2$ (chất khử trùng độc hại) trong xử lý mẫu cấy; làm sáng tỏ vai trò của AgNPs trong việc ức chế tích lũy khí ethylene ở giai đoạn phát sinh hình thái và ra rễ; khả năng sử dụng FeNPs thay thế phức chelate $\text{Fe-EDTA}$ truyền thống; đánh giá đồng bộ chu trình từ in vitro đến sinh trưởng và tích lũy hoạt chất ex vitro trên salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên các cơ sở lý thuyết sinh lý thực vật và hóa lý vật liệu nano:

• Lý thuyết về con đường sinh tổng hợp ethylene: Methionine chuyển hóa thành S-adenosyl-L-methionine (SAM) nhờ enzyme ACC synthase (ACS), SAM chuyển thành 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) và cuối cùng thành ethylene nhờ ACC oxidase (ACO). Thụ thể ETR1 liên kết ethylene thông qua cofactor là ion đồng ($\text{Cu}^+$). Ion $\text{Ag}^+$ từ AgNPs thay thế vị trí của $\text{Cu}^+$, ngăn chặn thụ thể liên kết ethylene và chuyển hướng tiền chất SAM sang con đường sinh tổng hợp polyamine thúc đẩy phân chia tế bào.
• Lý thuyết về hấp thu sắt: Cơ chế 1 (khử $\text{Fe}^{3+}$ thành $\text{Fe}^{2+}$ tại bề mặt rễ nhờ bơm proton $\text{H}^+\text{-ATPase}$) và Cơ chế 2 (giải phóng phytosiderophores tạo chelate sắt). FeNPs cung cấp nguồn sắt linh động, tăng cường hoạt tính enzyme cofactor trong quang hợp và tổng hợp diệp lục.
• Động học hấp thu nano: Hạt nano kích thước dưới 50 nm có thể thâm nhập qua lỗ vách tế bào (kích thước 5–20 nm) hoặc tạo lỗ mới, di chuyển theo con đường apoplast, symplast qua xylem và phloem.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm:

• Bố trí thí nghiệm: Các thí nghiệm được thiết kế theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh, lặp lại nhiều lần. Thí nghiệm 1 khảo sát nồng độ AgNPs (0,05; 0,1; 0,2; 0,5 g/L) và thời gian (5, 10, 15, 20, 30 phút) so với đối chứng 1 g/L $\text{HgCl}_2$ (5 phút), mỗi nghiệm thức gồm 30 bình (100 mL chứa 15 mL môi trường, 1 mẫu/bình). Thí nghiệm 2, 3 và 4 khảo sát phát sinh hình thái, ra rễ hoàn chỉnh và sinh trưởng ex vitro.
• Thiết bị và công cụ phân tích: Kính hiển vi điện tử quét FE SEM S4800 quan sát vi cấu trúc mô; hệ thống sắc ký khí GC-CP 3380 xác định hàm lượng ethylene; máy quang phổ hấp phụ nguyên tử AAS-6650 đo hàm lượng Ag tích lũy; máy đo diệp lục SPAD-502; sắc ký lỏng phân tích định lượng saponin (G-Rg1, M-R2, G-Rb1); kính hiển vi quang học soi nổi C-BD230 và CH30RF200.
• Xử lý số liệu: Số liệu được thu thập và phân tích thống kê bằng phần mềm SPSS.
• Nguồn vật liệu: Mẫu lá non cây salem (3 tháng tuổi), dâu tây (3 tháng tuổi), sâm Ngọc Linh (3 năm tuổi). Dung dịch AgNPs (kích thước 20–25 nm, khử bằng $\text{NaBH}_4$, chất ổn định chitosan) và FeNPs (kích thước 20–60 nm, khử bằng $\text{NaBH}_4$, chất ổn định carboxymethyl cellulose) nồng độ 1000 ppm được chế tạo bởi Viện Công nghệ Môi trường (VAST). Môi trường dinh dưỡng cơ bản gồm MS và SH.

Nội dung chính theo từng chương

Tổng quan tài liệu

Chương này hệ thống hóa các kiến thức nền tảng về công nghệ vi nhân giống, làm rõ các giai đoạn khử trùng bề mặt, cảm ứng mô sẹo, nuôi cấy huyền phù, phát sinh phôi soma và tạo cây con hoàn chỉnh. Phân tích chi tiết hai trở ngại lớn trong nuôi cấy in vitro là sự tích lũy ethylene gây rụng lá, thủy tinh thể và hiện tượng hóa nâu do oxy hóa hợp chất phenolic. Tác giả tổng quan cấu trúc nano core-shell, cơ chế kháng khuẩn của ion $\text{Ag}^+$ thông qua việc phá vỡ peptidoglycan thành tế bào, tương tác với nhóm sulfhydryl (-SH) của enzyme hô hấp và gắn kết base DNA. Tổng quan về vai trò của Fe trong chu trình quang hợp, hai cơ chế hấp thu Fe của thực vật và khả năng thay thế $\text{Fe-EDTA}$ bằng FeNPs. Cung cấp thông tin thực vật học, giá trị thương mại và tình hình sản xuất của hoa salem tại Đà Lạt, cây dâu tây và dược liệu quý sâm Ngọc Linh.

Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết nguồn gốc vật liệu thực vật từ vườn ươm của Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, thông số kỹ thuật của dung dịch AgNPs (20–25 nm) và FeNPs (20–60 nm). Thiết kế 4 nội dung nghiên cứu lớn:

1. Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây salem, dâu tây, sâm Ngọc Linh.
2. Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên sự phát sinh hình thái (tăng sinh số lượng tế bào mô sẹo salem, tái sinh chồi từ huyền phù salem, phát sinh phôi mô sẹo sâm Ngọc Linh).
3. Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây hoàn chỉnh từ chồi nuôi cấy in vitro.
4. Nghiên cứu khả năng sinh trưởng ex vitro trong vỉ xốp, chậu nhựa, rổ nhựa và nhà kính. Trình bày chi tiết các quy trình giải phẫu thực vật, đếm số lượng tế bào, xác định ethylene bằng máy GC, đo Ag bằng máy AAS và phân tích hàm lượng saponin đặc trưng (G-Rg1, M-R2, G-Rb1).

Danh mục bảng số liệu trong luận án	Nội dung theo dõi thực nghiệm
Bảng 1. Khử trùng salem	Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá salem sau 4 tuần
Bảng 2. Khử trùng dâu tây	Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá dâu tây sau 6 tuần
Bảng 3. Khử trùng sâm Ngọc Linh	Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá sâm Ngọc Linh sau 6 tuần
Bảng 4. Tái sinh chồi salem	Ảnh hưởng của AgNPs lên tái sinh, sinh trưởng chồi từ huyền phù tế bào salem sau 4 tuần
Bảng 5. Tăng sinh phôi sâm Ngọc Linh	Ảnh hưởng của AgNPs lên nhân nhanh phôi và tái sinh chồi từ phôi vô tính sau 6 tuần
Bảng 6. Cây hoàn chỉnh salem	Ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi salem sau 4 tuần
Bảng 7. Cây hoàn chỉnh dâu tây	Ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi dâu tây sau 4 tuần
Bảng 8. Cây hoàn chỉnh sâm Ngọc Linh	Ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên tạo cây con từ chồi sâm Ngọc Linh sau 12 tuần
Bảng 9. Thích nghi ex vitro salem	Khả năng thích nghi và sinh trưởng của cây salem trong vỉ xốp sau 4 tuần
Bảng 10. Phát triển ex vitro salem	Sinh trưởng và phát triển của cây salem trong chậu nhựa sau 12 tuần
Bảng 11. Thích nghi ex vitro dâu tây	Khả năng thích nghi và sinh trưởng của cây dâu tây trong vỉ xốp sau 4 tuần
Bảng 12. Phát triển ex vitro dâu tây	Sinh trưởng và phát triển của cây dâu tây trong chậu nhựa sau 12 tuần
Bảng 13. Thích nghi ex vitro sâm	Sinh trưởng của cây sâm Ngọc Linh trong vỉ xốp sau 6 tháng nuôi trồng
Bảng 14. Phát triển ex vitro sâm	Sinh trưởng và phát triển của cây sâm Ngọc Linh trong rổ nhựa sau 12 tháng

Kết quả và bàn luận

Chương này trình bày các phát hiện thực nghiệm trên ba đối tượng:

• Giai đoạn khử trùng bề mặt: Khẳng định AgNPs có khả năng thay thế hoàn toàn $\text{HgCl}_2$. Mẫu lá khử trùng bằng AgNPs không những đạt tỷ lệ vô trùng cao mà còn giảm tỷ lệ tổn thương tế bào, cảm ứng hình thành mô sẹo và chồi tốt hơn so với đối chứng sử dụng $\text{HgCl}_2$ sau 4 đến 6 tuần nuôi cấy.
• Giai đoạn phát sinh hình thái: Bổ sung AgNPs ở nồng độ thích hợp làm tăng sinh khối và số lượng tế bào trong nuôi cấy huyền phù tế bào cây salem; thúc đẩy tái sinh chồi từ dịch huyền phù sau 4 tuần; tăng cường phát sinh phôi soma và tái sinh chồi từ phôi sâm Ngọc Linh sau 6 và 14 tuần nuôi cấy.
• Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh và điều hòa ethylene: Nghiệm thức kết hợp AgNPs và thay thế $\text{Fe-EDTA}$ bằng FeNPs giúp cải thiện tỷ lệ ra rễ, chiều cao cây, số lá, hàm lượng chlorophyll và độ bền cơ học của rễ ở cả ba loài. Số liệu phân tích từ máy GC cho thấy hàm lượng AgNPs hấp thu vào mô tỷ lệ nghịch với lượng khí ethylene tích lũy trong bình nuôi cấy, làm giảm hiện tượng úng nước và rụng lá in vitro.
• Giai đoạn sinh trưởng ex vitro: Cây con có nguồn gốc từ nghiệm thức AgNPs và FeNPs đạt tỷ lệ sống sót cao trong vỉ xốp (4 tuần đối với salem, dâu tây; 6 tháng đối với sâm Ngọc Linh); sinh trưởng mạnh trong chậu nhựa (12 tuần) và rổ nhựa (12 tháng). Phân tích củ sâm Ngọc Linh sau 2 năm trồng trong nhà kính ghi nhận sự gia tăng khối lượng tươi và hàm lượng các saponin chính (G-Rg1, M-R2, G-Rb1).

Kết luận và kiến nghị

Tóm tắt các kết quả đạt được về quy trình vi nhân giống có bổ sung AgNPs và FeNPs cho hoa salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh. Đưa ra các đề xuất về việc chuẩn hóa quy trình ứng dụng nano kim loại vào sản xuất giống thương phẩm và tiếp tục theo dõi các chỉ tiêu năng suất, chất lượng khi đưa ra canh tác ngoài đồng ruộng.

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới của luận án được tác giả công bố bao gồm:

1. Đây là công trình đầu tiên tại Việt Nam nghiên cứu ứng dụng nano kim loại (AgNPs, FeNPs) trong toàn bộ quy trình vi nhân giống ba loài cây có giá trị kinh tế: cây hoa salem, cây dâu tây và cây dược liệu sâm Ngọc Linh.
2. Đánh giá và xác định rõ vai trò của AgNPs trong việc ức chế tích lũy khí ethylene, giúp nâng cao chất lượng cây giống in vitro (tăng tích lũy chlorophyll, rễ khỏe, hạn chế rụng lá và hiện tượng thủy tinh thể).
3. Chứng minh hiệu quả của FeNPs trong việc thay thế nguồn vi lượng $\text{Fe-EDTA}$ truyền thống trong môi trường nuôi cấy mô.
4. Bổ sung nano kim loại vào môi trường in vitro đã giúp nâng cao khả năng thích nghi và tỷ lệ sống sót của cây giống ở giai đoạn vườn ươm ex vitro.
5. Xây dựng hoàn chỉnh quy trình nhân giống in vitro có ứng dụng AgNPs và FeNPs cho ba đối tượng nghiên cứu (salem, dâu tây, sâm Ngọc Linh).

Kiến nghị của luận án tập trung vào việc áp dụng AgNPs thay thế $\text{HgCl}_2$ trong khử trùng mẫu cấy nhằm giảm thiểu độc hại cho người thao tác và môi trường phòng thí nghiệm; ứng dụng AgNPs và FeNPs trong nhân giống quy mô công nghiệp để hạ giá thành cây giống và tăng hiệu quả kinh tế.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Văn bản luận án chỉ ra một số hạn chế và hướng nghiên cứu mở rộng:

• Cơ chế thâm nhập chi tiết qua vành đai caspary và các con đường biến đổi sinh học của hạt nano kim loại bên trong mô thực vật vẫn chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn do giới hạn của các kỹ thuật phân tích hiện tại.
• Tác động tiêu cực và độc tính tế bào của AgNPs và FeNPs khi xử lý ở nồng độ cao hoặc trong thời gian dài đối với vách tế bào thực vật cần tiếp tục được khảo sát chi tiết.
• Các hướng nghiên cứu tiếp theo cần mở rộng theo dõi sự tích lũy sinh khối củ và hàm lượng hoạt chất của sâm Ngọc Linh ở các năm tuổi tiếp theo ngoài điều kiện tự nhiên dưới tán rừng; đồng thời đánh giá dư lượng và độ an toàn sinh học của hạt nano trên sản phẩm thu hoạch thương mại.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo cho các đối tượng và lĩnh vực sau:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Công nghệ Sinh học Thực vật, Nông học, Sinh lý học Thực vật và Hóa học Vật liệu Nano.
• Các phòng thí nghiệm và doanh nghiệp sản xuất giống cây trồng thương mại bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào (đặc biệt là các đơn vị nhân giống hoa salem tại Đà Lạt, giống dâu tây sạch bệnh và bảo tồn, phát triển nguồn giống sâm Ngọc Linh).
• Giảng viên tham khảo làm tài liệu giảng dạy các học phần Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Công nghệ sinh học nông nghiệp và Ứng dụng vật liệu mới trong nông nghiệp.
• Các phần có giá trị tham khảo cao: Quy trình khử trùng bề mặt không dùng $\text{HgCl}_2$; công thức bổ sung AgNPs kiểm soát ethylene trong nuôi cấy huyền phù và phát sinh phôi soma; kỹ thuật thay thế $\text{Fe-EDTA}$ bằng FeNPs; quy trình định lượng khí ethylene bằng sắc ký khí (GC) và xác định saponin bằng sắc ký lỏng.

Câu hỏi thường gặp

1. Kích thước và phương pháp chế tạo hai loại hạt nano sử dụng trong luận án là gì?
   Dung dịch AgNPs và FeNPs hóa trị 0 nồng độ 1000 ppm do Viện Công nghệ Môi trường (VAST) chế tạo bằng phương pháp khử hóa học trong dung dịch nước sử dụng chất khử $\text{NaBH}_4$. AgNPs có kích thước 20–25 nm, sử dụng chất ổn định chitosan. FeNPs có kích thước 20–60 nm, sử dụng chất ổn định carboxymethyl cellulose (CMC).

2. Cơ chế nào giúp AgNPs ức chế tác động tiêu cực của khí ethylene trong bình nuôi cấy in vitro?
   AgNPs giải phóng ion $\text{Ag}^+$, ion này có kích thước và trạng thái oxy hóa tương tự ion $\text{Cu}^+$ tại trung tâm hoạt động của thụ thể ETR1. $\text{Ag}^+$ thay thế vị trí của $\text{Cu}^+$, ngăn chặn ethylene gắn vào thụ thể và làm vô hiệu hóa con đường truyền tín hiệu ethylene. Đồng thời, việc ức chế tổng hợp ethylene chuyển hướng tiền chất chung SAM sang con đường sinh tổng hợp polyamine, kích thích phân chia tế bào.

3. Cây trồng hấp thu sắt qua những cơ chế nào và FeNPs đóng vai trò gì?
   Thực vật hấp thu sắt qua hai cơ chế: Cơ chế 1 (khử $\text{Fe}^{3+}$ thành $\text{Fe}^{2+}$ nhờ enzyme khử tại màng tế bào rễ kết hợp bơm proton $\text{H}^+\text{-ATPase}$) và Cơ chế 2 (tiết phytosiderophores tạo chelate hòa tan với $\text{Fe}^{3+}$). FeNPs với độ phân tán cao và kích thước nhỏ cung cấp nguồn sắt dễ hấp thu, giúp thay thế $\text{Fe-EDTA}$ mà không phụ thuộc vào sự phân hủy chelate ở pH cao.

4. Các thiết bị và phương pháp phân tích nào được dùng để xác định các chỉ tiêu trong luận án?
   Luận án sử dụng kính hiển vi điện tử quét FE SEM S4800 để quan sát vi cấu trúc mô sẹo; máy sắc ký khí GC-CP 3380 để định lượng nồng độ khí ethylene; máy quang phổ hấp phụ nguyên tử AAS-6650 để đo hàm lượng Ag hấp thu; máy đo SPAD-502 xác định chỉ số diệp lục; và phương pháp sắc ký để định lượng 3 hợp chất saponin (G-Rg1, M-R2, G-Rb1) trong củ sâm Ngọc Linh.

5. Nguồn gốc vật liệu thực vật sử dụng trong các thí nghiệm được thu thập từ đâu?
   Lá non của cây hoa salem (3 tháng tuổi), dâu tây (3 tháng tuổi) và sâm Ngọc Linh (3 năm tuổi) được thu thập tại vườn ươm thuộc Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo giống cây trồng, Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của nghiên cứu sinh Đỗ Mạnh Cường đã hoàn thành việc khảo sát toàn diện tác động của hạt nano bạc (AgNPs) và nano sắt (FeNPs) lên các giai đoạn vi nhân giống của ba loài cây có giá trị kinh tế cao gồm salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh. Các kết quả thực nghiệm chứng minh AgNPs có thể thay thế chất khử trùng độc hại $\text{HgCl}_2$, đồng thời đóng vai trò chất điều hòa sinh trưởng ức chế ethylene, tăng cường phát sinh phôi và tái sinh chồi. Việc thay thế $\text{Fe-EDTA}$ bằng FeNPs giúp cây con in vitro phát triển hoàn chỉnh hệ rễ và chồi, nâng cao tỷ lệ sống và tích lũy hoạt chất ở giai đoạn ex vitro. Đây là tài liệu khoa học có giá trị ứng dụng thực tiễn trong công nghệ nhân giống thực vật vô tính tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Lý do chọn đề tài Công nghệ sinh học thực vật - đặc biệt là phương pháp nuôi cấy tế bào, mô và cơ quan thực vật trên môi trường dinh dưỡng được kiểm soát - đã khắc phục được những khó khăn của phương pháp nhân giống truyền thống [101]. Ưu điểm của phương pháp này là tạo ra được số lượng lớn cây trồng đồng nhất về mặt di truyền, tạo ra nguồn giống sạch bệnh, bảo tồn và phát triển nguồn gene cũng như nghiên cứu các đặc tính sinh lý của thực vật. Nuôi cấy mô, tế bào và cơ quan thực vật bao gồm cảm ứng mô sẹo, nuôi cấy huyền phù tế bào, phát sinh phôi, tái sinh chồi, hình thành rễ,. Sự thành công của các phương pháp này phụ thuộc vào một số yếu tố như kiểu gene, loại mẫu cấy, phương pháp khử trùng bề mặt, thành phần môi trường nuôi cấy, chất điều hoà sinh trưởng thực vật, hệ thống nuôi cấy, quang chu kỳ,.

Tuy nhiên, bên cạnh những ưu điểm mang lại thì phương pháp này vẫn còn tồn tại một số hạn chế như quá trình khử trùng bề mặt mẫu cấy bị nhiễm vi sinh vật ảnh hưởng đến hiệu quả tái sinh, hiệu quả của các quá trình phát sinh hình thái không cao, sự tích luỹ khí ethylene ảnh hưởng đến hiệu quả nhân giống, chất lượng cây giống và tỷ lệ sống sót khi thuần hoá ở vườn ươm thấp, giá thành cây giống cao [84], [40]. Do đó việc ứng dụng các nguồn vật liệu mới cũng như cải tiến môi trường và điều kiện nuôi cấy nhằm nâng cao chất lượng cây giống vẫn luôn là một trong những mục tiêu của vi nhân giống thương mại. Chúng ta đang sống trong thời đại mà công nghệ nano được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như vật lý, hoá học, điện tử, môi trường, năng lượng, vật liệu, sinh học [108]. Trong những năm gần đây, tương tác giữa các vật liệu nano với thực vật đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới.

Rất nhiều các nghiên cứu về tác động của các loại hạt nano lên hệ thống thực vật đã được tiến hành. Các nhà nghiên cứu đã cho thấy thành phần, cấu trúc, nồng độ hạt nano có ảnh hưởng tích cực và tiêu cực khác nhau đến sinh trưởng, phát triển thực vật [85]. Tác động tích cực đáng kể của các hạt nano lên thực vật đã được chứng minh thông qua khả năng gia tăng tỷ lệ nảy mầm, tăng cường sinh trưởng và các hoạt động sinh lý, ngăn ngừa bệnh 1 hại, sự sản sinh ethylene và sự rụng các cơ quan sinh sản, tăng sản lượng và năng suất cây trồng cũng như tăng cường chuyển hóa các hợp chất thứ cấp có giá trị như dược phẩm, chất dinh dưỡng và hóa chất nông nghiệp [178], [135], [66]. Từ đó, một loạt các ứng dụng có thể thương mại hóa liên quan tới việc triển khai các hạt nano trong nông nghiệp đã được phát triển một cách nhanh chóng để cải thiện chất lượng cây trồng, hạn chế việc sử dụng dư thừa thuốc trừ sâu, phân bón hóa học.

Song song với việc sử dụng các hệ thống nuôi cấy tiên tiến trong nuôi cấy mô tế bào thực vật (hệ thống thoáng khí, bioreactor, vi thủy canh, hệ thống chiếu sáng đơn sắc,…) nhằm cải thiện điều kiện nuôi cấy để khắc phục một số hạn chế còn tồn tại trong vi nhân giống thường quy, các hạt nano cũng đã bắt đầu được đầu tư nghiên cứu và cho thấy tiềm năng ứng dụng cao trong việc kháng khuẩn và cải thiện chất lượng cây giống (khả năng hấp thu ánh sáng, tăng cường quang hợp, điều khiển sinh trưởng, phát triển thực vật) [155]. Chính vì vậy, để hiểu rõ vai trò và tiềm năng của nano trong việc khử trùng, bổ sung như một chất điều hoà sinh trưởng và thay thế dinh dưỡng khoáng nhằm cải thiện các nhược điểm trong hệ thống vi nhân giống, nâng cao chất lượng cây giống nuôi cấy mô, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu tác động của nano bạc và nano sắt lên chất lượng cây giống in vitro ở một số cây trồng có giá trị kinh tế”. Trong nghiên cứu này, các cây trồng được sử dụng làm đối tượng nghiên cứu là salem (Limonium sinuatum) - một loài hoa cắt cành phổ biến, dâu tây (Fragaria × ananassa) - cây ăn trái có giá trị kinh tế gắn liền với du lịch của thành phố Đà Lạt và sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) - loài cây dược liệu đặc hữu của Việt Nam. Mục tiêu đề tài Mục tiêu tổng quát Đề tài được thực hiện nhằm đánh giá tác động của các hạt nano bạc (AgNPs) - được sử dụng khử trùng bề mặt mẫu lá và bổ sung vào môi trường nuôi cấy, các hạt nano sắt (FeNPs) - được sử dụng thay thế sắt-Ethylenediamine Tetra Acetate (Fe- EDTA) trong quá trình vi nhân giống lên chất lượng cây giống trên một số loại cây trồng có giá trị kinh tế (salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh).

2 Mục tiêu cụ thể Đánh giá ảnh hưởng của AgNPs lên hiệu quả khử trùng bề mặt mẫu lá cây salem, dâu tây, sâm Ngọc Linh và so sánh với các chất khử trùng truyền thống [calcium hypochlorite [Ca(ClO)2], chlorua thủy ngân (HgCl2)]. Đánh giá ảnh hưởng của AgNPs lên sự phát sinh hình thái (phát sinh phôi, tái sinh chồi, gia tăng số lượng tế bào) cây salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh. Đánh giá ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình hình thành cây hoàn chỉnh cây salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh. Đánh giá ảnh hưởng của AgNPs được hấp thu đến sự biến động khí ethylene tích luỹ trong quá trình hình thành rễ cây salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh.

Đánh giá khả năng thích nghi và sinh trưởng cây salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh ở giai đoạn ex vitro có nguồn gốc từ nghiệm thức tốt nhất của AgNPs và FeNPs trong nuôi cấy in vitro. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu AgNPs (sử dụng làm chất khử trùng và bổ sung vào môi trường nuôi cấy), FeNPs (thay thế Fe-EDTA trong môi trường nuôi cấy) với các nồng độ khác nhau được sử dụng để nghiên cứu khả năng khử trùng, sự sinh trưởng, phát triển và nâng cao chất lượng cây giống cây salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro. Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên các giai đoạn khử trùng bề mặt, phát sinh hình thái trong vi nhân giống cây salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh. Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh trên ba đối tượng cây trồng (salem, dâu tây, sâm Ngọc Linh) nuôi cấy in vitro.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu Ý nghĩa khoa học của đề tài Kết quả nghiên cứu của luận án sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học mới có giá trị về vai trò của nano kim loại đến quá trình khử trùng bề mặt, sinh trưởng, phát triển, sự biến động khí ethylene và nâng cao chất lượng cây giống trong vi nhân giống cây hoa cảnh, cây ăn trái và cây dược liệu. 3 Luận án là nguồn tài liệu tham khảo có giá trị cho nghiên cứu và giảng dạy về lĩnh vực vi nhân giống thực vật. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Kết quả nghiên cứu của luận án có nhiều tiềm năng ứng dụng trong sản xuất cây giống thương mại. Những đóng góp mới của luận án Đây là công trình đầu tiên tại Việt Nam nghiên cứu ứng dụng nano kim loại (AgNPs, FeNPs) trong vi nhân giống cây salem, dâu tây, sâm Ngọc Linh.

Đề tài đã đánh giá được vai trò của AgNPs trong ức chế khí ethylene nhằm nâng cao chất lượng cây giống cây salem, dâu tây, sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro. Bổ sung nano kim loại vào môi trường nuôi cấy trong giai đoạn vi nhân giống đã giúp gia tăng khả năng thích nghi cũng như tỷ lệ sống của cây salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh ở giai đoạn vườn ươm. Xây dựng được quy trình nhân giống của ba loại cây trồng có giá trị kinh tế cao là cây salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh dưới ảnh hưởng của nano kim loại. TỔNG QUAN TÀI LIỆU VI NHÂN GIỐNG 1.

Khái niệm vi nhân giống Vi nhân giống là thuật ngữ mô tả các phương thức nuôi cấy các bộ phận khác nhau của thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, chất điều hoà sinh trưởng thực vật, đường và chất làm đông. Trong mấy thập kỷ qua, vi nhân giống đã phát triển mạnh mẽ ở nhiều quốc gia trên thế giới, được ứng dụng trong sản xuất thương mại, đồng thời có thể duy trì và bảo quản được nhiều giống cây quí hiếm hoặc phục tráng giống [19]. Các giai đoạn trong vi nhân giống thực vật 1. Khử trùng bề mặt Khử trùng mẫu cấy là giai đoạn có nhiều tác nhân cần được kiểm soát như địa điểm thu nhận, độ sạch, khối lượng trung bình, độ tuổi khai thác và tình trạng sinh trưởng của cây.

Mặc dù, khi đã kiểm soát được các tác nhân trên thì sự nhiễm nấm và khuẩn vẫn ảnh hưởng đến tỷ lệ thành công của giai đoạn này. Vì vậy, các phương pháp khác nhau đã được phát triển trong vài năm qua, có thể kể đến như cải tiến dụng cụ, hoặc sử dụng các hoá chất khử trùng. Street (1974) đã đưa ra các chất hoá học, nồng độ khử trùng và thời gian xử lý mẫu cấy để loại bỏ các yếu tố gây nhiễm được thể hiện trong Bảng 1. Như vậy, có thể thấy Ca(ClO)2, HgCl2 và kháng sinh là ba chất khử trùng được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô thực vật [150].

Ca(ClO)2 có tác dụng ức chế nấm mốc và vi khuẩn bằng cách ăn mòn thành tế bào hay tác động lên hệ enzyme của vi khuẩn. Vì vậy, nó được sử dụng như một chất để khử trùng khi đưa các nguồn mẫu ban đầu từ điều kiện ex vitro vào nuôi cấy in vitro. Mặt khác, các mô tế bào thực vật cũng bị tổn thương khi tiếp xúc với Ca(ClO)2; ngoài ra, sức khoẻ con người cũng bị ảnh hưởng khi nuốt hay hít phải Ca(ClO)2 [167]. HgCl2 là một dạng muối của thuỷ ngân, hiện được sử dụng phổ biến trong quy mô phòng thí nghiệm.

Trong lĩnh vực nuôi cấy mô, Hussanin và cộng sự (1994) đã thành công khi sử dụng HgCl2 như là một chất giúp chống lại các vi khuẩn và nấm 5 trong giai đoạn vào mẫu ban đầu [77]; nhưng muối thuỷ ngân này lại rất độc - có thể gây tổn thương não và gan khi con người tiếp xúc hay nuốt phải [167]. Về mặt lý thuyết, dường như tất cả các vấn đề nhiễm bẩn có thể được kiểm soát, nhưng sau một thời gian lại bùng phát trở lại.