MỞ ĐẦU γ-Aminobutyric axit (GABA) là một axít amin có chức năng quan trọng trong hệ thống thần kinh. GABA thực hiện vai trò cơ bản trong quá trình truyền tín hiệu thần kinh qua khe xináp và giữ liên lạc các tế bào với nhau trong hệ thống thần kinh trung ƣơng. Ngoài ra, GABA đã đƣợc biết có hiệu quả điều hòa một số rối loạn thần kinh giống nhƣ bệnh Parkinson, Huntington và bệnh Alzheimer. Chính vì GABA có những chức năng sinh lý quan trọng nên rất nhiều công trình nghiên cứu trọng tâm vào sự phát triển GABA thành thực phẩm chức năng.
Hiện nay, quá trình sản xuất GABA có rất nhiều con đƣờng khác nhau chẳng hạn: tách chiết từ các loại ngũ cốc, tạo điều kiện tối ƣu để hạt gạo nảy mầm, hoặc lên men đậu tƣơng bằng vi sinh vật. Trong đó, quá trình sản xuất GABA bằng lên men vi sinh vật (vi khuẩn, nấm) đang đƣợc ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả cao trên thế giới. Đặc biệt, vi khuẩn axít lactic đã đƣợc ứng dụng để lên men cho hàm lƣợng lớn GABA từ thực phẩm truyền thống và đã tối ƣu quá trình sản xuất GABA khi sử dụng vi khuẩn lactic axit đối với mục tiêu công nghiệp. Tại Việt Nam, có thể nói chƣa có công nghệ chế biến GABA có khả năng hƣớng tới quy mô công nghiệp.
Mặc dù, một số công trình nghiên cứu về sản xuất GABA đã đƣợc nghiên cứu nhƣng vẫn chƣa có sản phẩm GABA bán ra thị trƣờng. Ngoài ra cho tới nay vẫn chƣa có một công trình nghiên cứu nào ứng dụng vi khuẩn Lactobacillus lên men từ dịch cám gạo để sản xuất GABA có hoạt tính kích thích miễn dịch ổn định ở Việt Nam. Hiện nay, hƣớng nghiên cứu ứng dụng các chất có nguồn gốc tự nhiên để làm thực phẩm chức năng bắt đầu xuất hiện ở Việt Nam. Thực tế, khi một sản phẩm có thể tiếp cận đƣợc trên thị trƣờng thì sản phẩm phải đảm bảo về chất lƣợng và giá thành.
Để giải quyết hai vấn đề lớn này, hƣớng nghiên cứu của đề tài là chọn một nguồn nguyên liệu rẻ tiền và sẵn có nhất ở trong nƣớc mà vẫn cung cấp đƣợc đầy đủ các thành phần cơ bản để có thể lên men đƣợc GABA có hiệu suất cao. Về chất lƣợng sản phẩm, nhóm nghiên cứu đề tài đã sử dụng chất chỉ thị chỉ ra đƣợc sự thay đổi kênh ion clorua để kiểm tra hoạt tính của tế bào. 1 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Xuất phát từ cơ sở khoa học thực tiễn trên chúng tôi tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu quy trình sản xuất γ-Aminobutyric axit (GABA) từ dịch cám gạo bằng Lactobacillus” Nghiên cứu thực hiện nhằm các mục tiêu: + Xây dựng quy trình lên men phù hợp để sản xuất GABA từ dịch cám gạo bằng chủng Lactobacillus plantarum KLEPT đạt hiệu suất cao 10 lít/ mẻ. + Đánh giá hoạt tính GABA thông qua thụ thể GABA.
2 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Gama-Aminobutyric axit (GABA) GABA là một axít amin có trong tự nhiên, ở thực vật bậc cao nhƣ khoai tây, đậu tƣơng, lúa, gạo lứt còn nguyên phôi. Trong cơ thể, GABA đƣợc phát hiện trong hệ thống thần kinh trung ƣơng vào khoảng năm 1950 bởi Eugene Roberts nhƣng đến năm 1960, GABA mới đƣợc đề xuất là chất dẫn truyền thần kinh ức chế trong cơ thể. Ngoài não, GABA cũng có mặt trong tế bào B tuyến tụy, buồng trứng, tinh hoàn, ống tiêu hóa.
GABA có chức năng quan trọng trong hệ thống thần kinh [5]. Hoạt động của GABA cùng với glutamate và aspartate thực hiện phần lớn hoạt động thông qua khe xináp trong hệ thống thần kinh trung ƣơng [20, 51]. Một số vai trò của GABA với sức khỏe của con ngƣời: - Giảm bớt trạng thái căng thẳng và bất an, giúp ngủ ngon và ngủ sâu hơn. - Điều trị mất tự chủ tạm thời: có mối quan hệ giữa việc thiếu GABA và hiện tƣợng mất tự chủ hành vi của một số bệnh nhân.
Trong những trƣờng hợp này, bổ sung thêm GABA có thể ngăn ngừa sự vô hiệu hóa hoạt động các tế bào thần kinh tại não bộ, tránh khỏi sự mất tự chủ của bệnh nhân. - Stress – tình trạng tâm lý căng thẳng có thể làm gia tăng sự đau nhức. Nhƣ một chất dẫn tự nhiên có chức năng giảm stress, GABA có thể giảm bớt tình trạng đau nhức kéo dài khi giảm các dấu hiệu lo lắng có liên quan đến đau nhức giúp cho chúng ta bớt cảm giác về sự đau nhức đó. - Giảm trầm cảm.
- Việc sử dụng các loại thuốc an thần làm giảm lƣợng GABA trong cơ thể và là một trong các nguyên nhân gây ra hiện tƣợng hoảng loạn. - GABA cũng đƣợc coi là có thể điều trị đƣợc trạng thái rối loạn tâm lý trƣớc thời kỳ kinh nguyệt (PMS - premenstrual syndrome) đối với phụ nữ. Cấu trúc và hình dạng của GABA GABA có cấu trúc gồm 4 cacbon. Nhóm cacbon cho proton và nhóm amin nhận proton (hình 1).
Hình dạng của GABA phụ thuộc nhiều vào điều kiện của môi 3 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com trƣờng. Ở trạng thái khí, GABA cuộn lại nhiều lần để tạo ra sức hút điện tích giữa hai nhóm chức năng amin và cacbon. Theo tính toán hóa học để phá vỡ cấu trúc này cần một năng lƣợng khoảng 50 kcal/mol. Ở trạng thái rắn, GABA luôn có hình dạng mạch thẳng.
Dƣới dạng mạch thẳng, GABA luôn có cấu trúc hình học trans ở nhóm amin cuối và dạng cis ở nhóm cacbon kết thúc. Cấu trúc này sẽ giúp cho phân tử GABA liên kết dễ dàng với các phân tử GABA khác. Ở trạng thái lỏng, GABA tồn tại ở nhiều dạng cấu trúc khác nhau bao gồm dạng gấp khúc, dạng mạch thẳng. Chính nhờ khả năng tồn tại ở nhiều dạng cấu trúc khác nhau này tạo cho GABA có nhiều chức năng sinh học quan trọng [20, 22].
Hình 1: Cấu trúc của GABA [58] 1. Quá trình tổng hợp và chức năng của GABA trong não GABA tham gia vào nhiều quá trình của hệ thống thần kinh trung ƣơng. Chẳng hạn nhƣ liên quan đến tâm trạng lo âu, trầm cảm… Bởi vì, GABA không thể xuyên qua đƣợc hàng rào để vào trong não. Do vậy, GABA đƣợc tổng hợp trong não bằng con đƣờng trao đổi chất đƣợc biết là “GABA shunt” (hình 2).
Giai đoạn cuối của con đƣờng này sinh ra GABA thông qua quá trình chuyển hóa L-glutamate bằng sự phân cắt của enzym glutamic acid decarboxylase (GAD) nhờ kích thích truyền tín hiệu thần kinh [20, 22]. Khi lƣợng GABA đƣợc sinh ra vƣợt quá ngƣỡng từ tín hiệu tế bào thần kinh sẽ đƣợc một enzym gọi là gamma-aminobutyric acid transaminase (GABA-T) làm giảm bớt [20]. Mặc dù, GABA-T có thể tham gia tổng hợp GABA từ semialdehyde succinic nhƣng vai trò cơ bản của enzyme này là phá hủy GABA. Ngoài ra, những chất ức chế hoạt động của GABA-T cũng làm sinh ra một lƣợng lớn GABA ở trong não [20].
Hơn nữa, quá trình tạo GABA của GAD cần có sự tham gia của vitamin 4 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com B6 hay còn đƣợc gọi là pyridoxal-5’-phophate đƣợc xem nhƣ một cofactor [32]. Cofactor này mang semialdehyde succinic tạo thành GABA ở trong não. Hình 2: Con đƣờng tổng hợp và phân hủy của GABA (GABA shunt) [40] GABA đảm bảo duy trì hoạt động bình thƣờng của não bộ đặc biệt là các neuron thần kinh. GABA đóng vai trò chính trong việc giảm bớt sự hoạt động của các neuron thần kinh và ức chế sự lan truyền của các tế bào dẫn truyền tín hiệu.
GABA ngăn cản các tín hiệu căng thẳng và bất an đến vùng thần kinh trung ƣơng bằng việc chiếm giữ hoặc khống chế các vùng tiếp nhận tin của các tế bào này [20]. Do vậy, GABA giúp cho thƣ giãn thần kinh và cải thiện đƣợc tinh thần. Cho tới nay, nhiều công trình nghiên cứu khoa học đã công bố GABA giúp cho con ngƣời có giấc ngủ ngon và sâu, cải thiện khả năng mất tự chủ tạm thời, đau nhức kéo dài, rối loạn tăng động thiếu chú ý hay bệnh trầm cảm, trạng thái tâm lý trƣớc thời kỳ kinh nguyệt [16, 33, 43, 46, 50, 55, 54]. Enzym tổng hợp GABA L-glutamate decarboxylase (GAD) là enzym xúc tác phản ứng tổng hợp GABA từ Glutamate khi loại đi một phân tử CO2.
GAD tồn tại dƣới hai dạng đồng phân là GAD65 và GAD67 theo khối lƣợng phân tử của chúng (lần lƣợt là 65 và 67 kDa). Chúng đƣợc mã hóa bởi hai gen độc lập nằm trên hai nhiễm sắc thể số 2 và số 10 ở ngƣời, gen GAD65 nằm trên NST số 10 và gen GAD67 nằm trên NST số 2 [20, 40]. GAD67 là một enzym phân bố khắp các tế bào thần kinh GABAergic trong cơ thể. Ngƣợc lại, GAD65 chủ yếu đƣợc tìm thấy ở tận cùng các dây thần 5 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com kinh và nó có thể đƣợc neo trên màng của các túi chất dẫn truyền thần kinh.
Hoạt động của enzym GAD cần một cofactor là pyridoxal phosphate (PLP) [52]. Thụ thể GABA Thụ thể GABA bao gồm: thụ thể GABAA là phần phức hệ mang kênh ion và vị trí gắn kết với phối tử; thụ thể GABAB thuộc họ thụ thể protein G có nhiệm vụ mở kênh ion thông qua truyền thông tin nội bào qua protein G [20, 39]. Thụ thể GABAA là một phân tử lớn có 5 tiểu đơn vị protein. Tất cả các tiểu đơn vị này đều có đoạn cuối là N ở phần bên ngoài tế bào, tiếp đến là 4 đoạn xuyên màng, ở đoạn xuyên màng 3 và 4 có một đoạn loop lớn, cuối cùng là đoạn cuối C ngắn.
Các tiểu đơn vị protein này tổ hợp bằng những con đƣờng khác nhau và đƣợc sắp xếp tạo ra một lõi cho phép kênh Cl- đi qua (Hình 3). GABAA có vai trò cơ bản trong điều khiển các biểu hiện lo âu và ảnh hƣởng tới trí nhớ ở não. Các tế bào thần kinh sản xuất ra GABA đƣợc gọi là các thần kinh GABAergic và hoạt động chính trong quá trình ức chế ở các động vật có xƣơng sống trong giai đoạn trƣởng thành [39]. 17-20% neuron thần kinh là GABAergic và hầu hết các hoạt tính sinh lý của GABA đƣợc tạo thành thông qua thụ thể GABAA.
Trong động vật có xƣơng sống, GABA hoạt động ở các khe xináp trong não bằng liên kết với thụ thể GABA xuyên màng tế bào thần kinh. Quá trình liên kết này sẽ dẫn tới mở kênh ion để cho phép kênh ion mang điện tích âm Cl- đi vào trong tế bào hoặc kênh ion mang điện tích dƣơng ra ngoài tế bào. Quá trình này sẽ tạo ra điện thế âm ở trên màng tế bào dẫn tới vị trí này thƣờng xuyên ở trạng thái phân cực rất mạnh [20].