đặt vấn đề thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số yếu tốảnh hưởng tới quy trình tạo chế phẩm giàu canthaxanthin từ vi khuẩnưa mặn” để nghiên cứu. Đối tƣợng nghiên cứu Sinh khối thu đƣợc sau lên men chủng vi khuẩn ƣa mặn sinh canthaxanthin ParacoccuscarotinifaciensVTP 20181. Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng quy trình công nghệ chiết tách làm giàu và phân lập hợp chất canthaxanthin từ Sinh khối thu đƣợc sau lên men chủng vi khuẩn ƣa mặn sinh canthaxanthin ParacoccuscarotinifaciensVTP 20181. 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.
Giới thiệu chung về canthaxanthin Cantaxanthin (hay canthaxanthin)(β,β-Carotene-4,4'-dione) là sắc tố có màu đỏ thuộc nhóm carotenoids, có công thức phân tử: C40H52O2 , khối lƣợng phân tử M=564,82g, nhiệt độ nóng chảy: 211 - 212ºC (kèm phân hủy), hấp phụ cực đại λmax: 482 nm (CHCl3); 474 nm (C2H5OH); 466 nm (ete dầu hỏa). Tƣơng tự nhƣ các carotenoid khác, cantaxanthin là chất chống oxi hóa mạnh, dễ bị phân hủy khi để trong không khí, hoà tan tốt trong các dung môi kém phân cực Hình 1. Công thức cấu tạo của cantaxanthin (β,β-Carotene-4,4'-dione) Cantaxanthin tồn tại tƣơng đối phổ biến trong tự nhiên, đƣợc phân lập đầu tiên từ loài nấm ăn đƣợc Cinnabarinus cantharellus vào năm 1950 bởi Haxo và cs. Cantaxanthin cũng đƣợc tạo ra ở một số loài tảo xanh ở giai đoạn cuối của chu kỳ sinh trƣởng cùng với một số các caroten khác [32].
Ngoài ra, nó còn đƣợc phát hiện ở các loài vi khuẩn [44], động vật giáp xác [46] và ở nhiều loài cá nhƣ cá chép [38], cá đối vàng, cá tráp biển. Cantaxanthin không đƣợc tìm thấy ở loài cá hồi hoang dã Đại Tây Dƣơng nhƣng đƣợc tìm thấy ở loài cá hồi hoang dã Thái Bình Dƣơng và một số loài cá hồi khác. Cantaxanthin đƣợc sử dụng nhƣ một loại phụ gia, chất tạo màu cho thực phẩm (E-161) và thuốc nhuộm trong mỹ phẩm. Ngoài ra nó cũng đƣợc phép cho thêm vào thức ăn cho gia cầm và thuỷ sản.Hiện nay, trên thị trƣờng cantaxanthin thƣơng mại thƣờng có hàm lƣợng 10%, giá bán trung bình khoảng 1 triệu VNĐ/kg.
Vai trò của canthaxanthin trong nuôi cá hồi Cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss) có nguồn gốc từ vùng biển Thái Bình Dƣơng khu vực Bắc Mỹ, đƣợc di nhập vào nuôi ở nhiều nƣớc châu Âu từ những năm 1890. Tổng sản lƣợng cá hồi vân trên thế giới năm 2014 đạt 812.940 tấn, đem lại giá trị kinh tế cao 3. Cá hồi bao gồm một số nhóm có đặc điểm sinh sống khác nhau. Có nhóm thƣờng sinh trƣởng và phát triển ở các thuỷ vực nƣớc ngọt sông hồ, có nhóm sống ngoài biển.
Nhóm đƣợc gia hoá và nuôi thành công sớm nhất trong các thủy vực nƣớc ngọt có tên là cá hồi vân “Rainbow trout”. Cá này có tên khoa học là Oncorhynchus mykiss, thuộc bộ Salmoniformes; Họ Salmonidae; Giống Oncorhynchus; Loài O. Cá Hồi Vân Chiều dài trung bình thân cá từ 30-45 cm, tuy nhiên có thể có những cá thể đạt trên 120 cm và nặng trên 25kg. Cá hồi vân trên mình có các chấm màu đen hình cánh sao.
Khi thành thục trên lƣờn cá xuất hiện các vân màu hồng, đặc trƣng ở những cá đực khi đến mùa sinh sản. Màu sắc cá thay đổi theo tập quán, kích thƣớc và điều kiện sinh sản. Cá hồi vân có giá trị thƣơng phẩm cao. Đó là do cá hồi, ngoài cung cấp dinh dƣỡng nhƣ nguồn protein ƣa thích, còn là nguồn cung cấp n-3 axit béo.
Ăn cá hồi có thể giúp giảm nguy cơ bệnh tim mạch. Tuy nhiên giá trị cá hồi lại phụ thuộc vào chất lƣợng, nên chất lƣợng của cá hồi vân rất đƣợc ngƣời tiêu dùng quan tâm. Ngoài những chỉ tiêu chất lƣợng thông thƣờng nhƣ khối lƣợng, chiều 4 dài, thành phần dinh dƣỡng, thì màu sắc cá hồi là một tiêu chí đƣợc quan tâm hàng đầu. Màu sắc của cá là thông tin cảm quan hấp dẫn dễ nhận thấy nhất đồng thời phản ánh độ tƣơi và độ an toàn của cá.
Đối với các loài thủy hải sản đặc sản nhƣ cá hồi giá trị kinh tế của chúng phụ thuộc rất nhiều vào màu sắc cơ thể, đặc biệt màu sắc hấp dẫn của cá hồi khi chế biến. Trong tự nhiên, cá hồi có thể ăn ấu trùng, động vật phù du, tôm, giáp xác có chứa carotenoid tạo màu cho thịt cá. Trong điều kiện nuôi nhân tạo, để cá có màu đỏ tƣơi cần phải cung cấp một lƣợng carotenoid (astaxanthin, cantaxanthin, beta-caroten) vào khẩu phẩn thức ăn của cá (FAO, 2005). Nguồn canthaxanthin Cantaxanthin đƣợc tổng hợp từ 2 nguồn là sinh tổng hợp và hóa tổng hợp.
Sản phẩm sinh tổng hợp và hóa tổng hợp đƣợc hầu hết các quốc gia trên thế giới, bao gồm cả Mỹ và EU (ngoại trừ Úc và New Zealand) cho phép sử dụng trong nuôi trồng thủy sản và chăn nuôi. Canthaxanthin hóa tổng hợp Cantaxanthin đƣợc tổng hợp lần đầu tiên vào năm 1956 thông qua phản ứng oxi hóa β – caroten bởi nhóm nghiên cứu của Zechmeister.Phản ứng oxi hóa β – caroten Tuy nhiên, việc sử dụng β – caroten có nguồn gốc thiên nhiên để tổng hợp cantaxanthin không có ý nghĩa về kinh tế. Isler và các cộng sự của mình đã phát triển các phƣơng pháp tổng hợp toàn phần các caroten khi đi từ những nguyên liệu có nguồn gốc dầu mỏ. Các phƣơng pháp này tiếp tục đƣợc nhiều nhóm 5 nghiên cứu trên thế giới phát triển và ứng dụng để sản xuất cantaxanthin, cantaxanthin đƣợc sản xuất theo phƣơng pháp hóa tổng hợp trên quy mô công nghiệp từ năm 1962 (W.
Quy trình tổng hợp canthaxanthin theo phương pháp Rosenberg Hiện nay, cantaxanthin thƣơng mại có nguồn gốc hóa tổng hợp chiếm phần lớn, với hàm lƣợng cantaxanthin khoảng 10%, giá bán vào khoảng 50 – 100USD tùy theo nhà cung cấp và lƣợng tiêu thụ. Canthaxanthin sinh tổng hợp Trong tự nhiên một số vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp astaxanthin nhƣ: vi tảo nƣớc ngọt Haematococcus pluvialis [14], vi khuẩn biển Paracoccus sp., nấm men Saccharomyces cerevisiae, vi khuẩn Escherichia coli[29]. Trong đó, vi khuẩnEscherichia coli có thể sản xuất đến 170 mg/l cantaxanthin trong điều kiện phòng thí nghiệm. Các vi khuẩn khác cũng có khả năng tổng hợp cantaxanthin nhƣ: Micrococcus roseus[6], Brevibacterium sp.
KY-4313, 6 Bradyrhizobium sp. ORS278, Dietzia natronolimnaea HS-1, Sporidiobolus salmonicolor (CBS 2636), Paracoccus schoinia NBRC 100637T [23] ngoài ra còn có Phaffia sp., xạ khuẩn Corynebacterium michiganense, tảo lục Chlorella, … Tuy nhiên, việc sử dụng tảo cho sản xuất quy mô công nghiệp bị hạn chế, nguyên nhân chính là do tảo có tốc độ sinh trƣởng chậm và chu kỳ sống phức tạp. Vi tảo sinh trƣởng thành hai pha khác nhau: Pha màu xanh, tế bào đƣợc cung cấp đầy đủ dƣỡng chất để phát triển tế bào. Pha màu đỏ, tế bào bị thiếu dinh dƣỡng và bị ánh sáng mặt trời cƣờng độ cao gây nên sự đóng kén, trong thời gian đó tế bào tạo ra một lƣợng lớn cantaxanthin nhƣ một cơ chế bảo vệ chống lại stress môi trƣờng.
Thời gian chuyển pha mất khoảng vài tuần dƣới điều kiện quang tự dƣỡng. Vì vậy, nó đòi hỏi một số kỹ thuật phức tạp gây stress nhân tạo để có hàm lƣợng cantaxanthin cao. Hơn nữa, cantaxanthin từ tảo Haematococcus và nấm men Phaffia là khó hấp thụ vì cantaxanthin nằm trong nội bào. Muốn nâng cao hiệu quả sử dụng phải phá vỡ màng tế bào.
Quá trình sản xuất cantaxanthin đòi hỏi kỹ thuật cao để làm vỡ hơn 95% các vách tế bào để tạo ra cantaxanthin có tính khả dụng sinh học tối đa. Nguồn sản xuất canthaxanthin từ vi khuẩn ƣa mặn Hiện nay, phần lớn cantaxanthin sử dụng trên thị trƣờng đƣợc sản xuất bằng con đƣờng tổng hợp hóa học mặc dù chi phí cho sản phẩm này là rẻ hơn so với con đƣờng tổng hợp sinh học, nhƣng nhƣợc điểm lớn nhất của phƣơng pháp này là hóa chất tổng hợp cantaxanthin đòi hỏi đƣợc kiểm soát ở mức độ cao và có thể tạo ra các hợp chất có tác dụng phụ không mong muốn cho vật nuôi và ngƣời tiêu dùng. Do đó, theo quan điểm là sản phẩm tạo ra phải an toàn, sản xuất cantaxanthin từ nguồn tự nhiên đã đƣợc chấp nhận và nghiên cứu để tạo ra sản phẩm an toàn và có giá trị kinh tế cao. Đối với sản xuất công nghiệp của carotenoid, vi sinh vật đƣợc ƣu tiên hơn các nguồn tự nhiên khác, chẳng hạn nhƣ từ thực vật, phụ thuộc rất nhiều về vấn 7 đề khí hậu và địa lý trong sản xuất.
Ngoài ra, sản xuất cantaxanthin từ vi sinh vật có giá trị kinh tế rất lớn, tiết kiệm đƣợc chi phí do giá thành của của nguyên liệu thêm vào đó là chi phí xử lý chất thải sau khi đã tổng hợp cantaxanthin[18]. Ở vi khuẩn, cantaxanthin đƣợc sinh tổng hợp theo con đƣờng vô cùng phức tạp, thông qua con đƣờng axit mevalonic (MEV) và con đƣờng methylerythritol phosphate (MEP) nhƣ đƣợc mô tả sơ bộ trên Hình 1. Sơ đồ con đường sinh tổng hợp cantaxanthin ở vi khuẩn Nguồn các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cantaxanthin khá đa dạng, bao gồm cả nấm, nấm mốc, vi khuẩn, và vi tảo lục đƣợc tổng hợp và tóm tắt trong Bảng 1. Nguồn vi sinh vật cho sản xuất cantaxanthin Nguồn vi sinh vật Quy mô Sản lƣợng cantaxanthin Nấm Cantharelluscinnabarinus Bình tam giác 0,9 mg/g sinh khối khô Nấm sợi Aspergilluscarbonarius Lên men theo mẻ 206 mg/g chất khô hòa tan trích ly đƣợc Vi khuẩn BradyrhizobiumstrainORS371 - 0,26mg/gsinh khối khô B.strainORS278 - 1,43mg/gsinh khối khô Brevibacteriumsp.KY-4313 Lên men theo mẻ 7,20mg/L DietzianatronolimnaeaHS-1 Bình tam giác 5,32mg/L D.natronolimnaeaHS-1 Lên men theo mẻ 2,87mg/L D.natronolimnaeaHS-1 Lên men theo mẻ 4,28mg/L D.natronolimnaeaHS- Lên men theo mẻ 7,10mg/L 1mutant Lên men bổ sung 13,17mg/L D.natronolimnaeaHS-1 Lên men bổ sung 8,92mg/L D.natronolimnaeaHS-1 Bình tam giác 2,25mg/gsinh khối khô Gordoniajacobaeamutants Bình tam giác 0,2mg/gsinh khối khô G.
Bình tam giác 0,013mg/mL G.jacobaeaMV-26 Bình tam giác 0,7mg/gsinh khối khô Halophilicbacteria Bình tam giác - Micrococcusroseus Bình tam giác 0,0134mg/mL Rhodococcusmaris Vi tảo lục Chlorococcumsp.strain MA-1 Lên men bổ sung - Chlorellaemersonii - - C.zofingiensis Lên men theo mẻ 8,5 mg/g sinh khối khô Dictyococcuscinnabarinus Bình tam giác 1,1 mg/g sinh khối khô 9 Nhƣ vậy có thể thấy, nguồn vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cantaxanthin chủ yếu xuất hiện trên đối với vi khuẩn, trong đó chủng DietzianatronolimnaeaHS-1 cho hàm lƣợng cantaxanthin cao nhất vào khoảng 13,17mg/L canh trƣờng. Trong số các vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp cantaxanthin thì vi khuẩn ƣa mặn cũng là nhóm đông nhất xuất hiện khả năng này. Vi khuẩn ƣa mặn thƣờng đƣợc phân lập từ đất của những cánh đồng muối. Asker và Ohta (1999) đã phân lập 31 chủng vi khuẩn rất ƣa mặn Halobacterium từ cánh đồng muối vùng Alexandria, Ai Cập.
Nghiên cứu của họ cho thấy các chủng này có khả năng chịu đƣợc nồng độ muối cao và chúng tạo ra màu hồng và màu đỏ trong môi trƣờng (Asker and Ohta, 1999). Các chủng ƣa mặn này yêu cầu nồng độ muối ít nhất là 1,5 M (9%, w/v) và phát triển tốt ở nồng độ muối cao khoảng 25 %.