Nghiên Cứu Quy Trình Sản Xuất Chế Phẩm Bt (Bacillus thuringiensis) Dùng Trong Kiểm Soát Sâu Hại

Chuyên khảo phân tích Hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm bt bacillus thuringiensis dùng trong kiểm soát sâu hại thuộc, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất hướng nghiên

• Người hướng dẫn: PGS. TS Lê Đình Đôn
• Trường học: Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Quy Trình Sản Xuất Chế Phẩm Bt (Bacillus thuringiensis) Kiểm Soát Sâu Hại Trên Cây Rau
• Loại tài liệu: Báo Cáo Tổng Hợp
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• DANH SÁCH CÁC BẢNG
• DANH SÁCH CÁC HÌNH
• 1. CHƯƠNG I: Đặt vấn đề
• 1.1. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.2. Nội dung nghiên cứu
• 1.3. Thời gian và địa điểm thực hiện
• 2. CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Phân loại khoa học
• 2.2. Sự phân bố của Bt
• 2.3. Môi trường phát triển của Bt
• 2.4. Đặc điểm sinh hóa của Bacillus thuringiensis
• 2.5. Các nghiên cứu về phân lập Bacillus thuringiensis
• 2.6. Tinh thể độc
• 2.7. Tên gọi và ký hiệu các gene mã hóa Cry và Cyt
• 2.8. Phát hiện dòng mới dựa vào phương pháp sinh học phân tử ở mức độ genome
• 2.9. Cơ chế tác động của Bacillus thuringiensis lên ruột sâu
• 2.10. Những nghiên cứu trong và ngoài nước về Bacillus thuringiensis
• 2.11. Phát triển sản phẩm trừ sâu Bt: Ưu điểm và yếu tố giới hạn của sản phẩm Bt
• 3. CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Thu thập, phân lập mẫu vi khuẩn Bacillus thuringiensis
• 3.2. Thiết lập hệ thống fermentor 50 lít
• 3.3. Chọn lọc mẫu phân lập Bt có hoạt tính sinh học diệt côn trùng gây hại
• 3.4. Xác định tên dưới loài của mẫu Bt có hoạt tính sinh học bằng kỹ thuật sinh học phân tử
• 3.5. Xác lập điều kiện tăng sinh khối mẫu phân lập tiềm năng
• 3.6. Xác lập điều kiện tạo sản phẩm Bt dạng bột tan trong nước
• 3.7. Đánh giá sản phẩm trên cây trồng
• 3.8. Hoàn thiện quy trình sản xuất và sản xuất sản phẩm ở 50 lít fermentor
• 4. CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ THẢO LUẬN
• 4.1. Thu thập, phân lập mẫu vi khuẩn Bacillus thuringiensis
• 4.2. Thiết lập hệ thống fermentor 50 lít
• 4.3. Chọn lọc mẫu phân lập Bt có hoạt tính sinh học diệt côn trùng gây hại trên cây rau trong phòng thí nghiệm
• 4.4. Xác định tên dưới loài của mẫu phân lập Bt có hoạt tính sinh học bằng kỹ thuật sinh học phân tử
• 4.5. Thiết lập điều kiện tăng sinh khối mẫu Bt tiềm năng
• 4.6. Xác lập điều kiện tạo sản phẩm Bt dạng bột tan trong nước
• 4.7. Đánh giá sản phẩm trên cây trồng
• 4.8. Hoàn thiện quy trình sản xuất và sản xuất sản phẩm ở 50 lít fermentor
• 5. CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Chế Phẩm Bt Kiểm Soát Sâu Hại Rau

Trong bối cảnh nền nông nghiệp hiện đại đối mặt với nhiều thách thức từ sâu bệnh hại, việc tìm kiếm các giải pháp kiểm soát sinh học trở nên cấp thiết. Nghiên cứu về chế phẩm Bacillus thuringiensis (Bt) mở ra một hướng đi đầy tiềm năng. Bt là một loại vi khuẩn tự nhiên có khả năng sản xuất ra các protein độc hại đối với một số loài côn trùng, đặc biệt là sâu hại thuộc bộ Lepidoptera. Ứng dụng Bt không chỉ giúp bảo vệ cây trồng mà còn giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường và sức khỏe con người so với các loại thuốc trừ sâu hóa học. Nghiên cứu này tập trung vào việc hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm Bt có nguồn gốc bản địa, đáp ứng tiêu chuẩn thương mại và phù hợp với điều kiện sản xuất rau an toàn tại Việt Nam, cụ thể là Lâm Đồng và TP. Hồ Chí Minh. Việc khai thác và phát triển Bt bản địa giúp tăng tính thích ứng và hiệu quả của chế phẩm trong điều kiện khí hậu và hệ sinh thái địa phương. Các nghiên cứu về đặc điểm sinh hóa và cơ chế tác động của Bt là vô cùng quan trọng để có thể hiểu rõ hơn về cách thức chế phẩm này hoạt động và làm thế nào để tối ưu hóa hiệu quả của nó. Theo Ishiwata (1901), Bacillus sotto đã cho thấy tiềm năng trong việc phòng trừ sâu bệnh hại trên cây trồng.

1.1. Vai trò của Bt trong Nông nghiệp Bền vững

Bacillus thuringiensis (Bt) đóng vai trò quan trọng trong nông nghiệp bền vững nhờ khả năng kiểm soát sâu hại một cách hiệu quả mà không gây hại cho môi trường và sức khỏe con người. Việc sử dụng chế phẩm Bt giúp giảm sự phụ thuộc vào thuốc trừ sâu hóa học, từ đó giảm thiểu ô nhiễm đất và nước, bảo vệ các loài côn trùng có ích và duy trì cân bằng sinh thái. Ứng dụng Bt còn góp phần tạo ra các sản phẩm nông nghiệp an toàn, đáp ứng yêu cầu ngày càng cao của thị trường về chất lượng và an toàn thực phẩm. Theo nghiên cứu, Bt có thể được sử dụng để kiểm soát nhiều loại sâu hại khác nhau trên nhiều loại cây trồng khác nhau, từ rau màu đến cây ăn quả. Khả năng phân hủy sinh học của Bt là một ưu điểm lớn, giúp giảm thiểu nguy cơ tồn dư thuốc trừ sâu trong nông sản và môi trường. Do đó, việc phát triển và ứng dụng rộng rãi chế phẩm Bt là một bước tiến quan trọng trong việc xây dựng một nền nông nghiệp xanh và bền vững.

1.2. Lịch sử phát triển và ứng dụng của Bacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensis (Bt) được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1901 bởi nhà côn trùng học người Nhật Shigetane Ishiwata, người đã tìm thấy vi khuẩn này trong ấu trùng tằm bị bệnh. Sau đó, vào năm 1910, Ernst Bernard đã phân lập được Bt từ bướm Địa Trung Hải và phát hiện ra sự hiện diện của tinh thể độc. Từ đó, Bt đã được nghiên cứu và phát triển thành các chế phẩm trừ sâu sinh học. Trong những năm gần đây, công nghệ sinh học đã giúp tăng cường hiệu quả và mở rộng phạm vi ứng dụng của Bt. Ngày nay, Bt được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp, lâm nghiệp và cả trong y tế để kiểm soát các loài côn trùng gây hại. Sự đa dạng của các chủng Bt và khả năng sản xuất ra các loại protein độc khác nhau cho phép chế phẩm này được sử dụng để kiểm soát nhiều loại sâu hại khác nhau. Phát triển sản phẩm trừ sâu Bt là một hướng đi tiềm năng cho nền nông nghiệp Việt Nam hiện nay.

II. Thách Thức Giải Pháp Nghiên Cứu Chế Phẩm Bt Hiệu Quả

Mặc dù chế phẩm Bt mang lại nhiều lợi ích, việc nghiên cứu và phát triển chúng cũng đối mặt với không ít thách thức. Một trong những vấn đề lớn nhất là sự kháng thuốc của sâu hại đối với Bt. Để giải quyết vấn đề này, các nhà khoa học cần liên tục nghiên cứu và phát triển các chủng Bt mới, cũng như tìm hiểu sâu hơn về cơ chế kháng thuốc của sâu hại. Ngoài ra, việc tối ưu hóa quy trình sản xuất chế phẩm Bt cũng là một yếu tố quan trọng để giảm chi phí và tăng tính cạnh tranh của sản phẩm. Nghiên cứu này tập trung vào việc giải quyết những thách thức này thông qua việc thu thập, phân lập và chọn lọc các chủng Bt bản địa có hoạt tính sinh học cao. Đồng thời, việc áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại giúp xác định tên loài, dưới loài và gen cry của các chủng Bt, từ đó tạo cơ sở cho việc phát triển các chế phẩm trừ sâu sinh học hiệu quả và bền vững. Theo Georghiou (1990), việc lạm dụng thuốc BVTV dẫn đến sự kháng thuốc của sâu bệnh và gây ô nhiễm môi trường, do đó, chế phẩm Bt là một giải pháp thay thế tiềm năng.

2.1. Vấn đề kháng Bt ở sâu hại và cách khắc phục

Sự kháng Bt ở sâu hại là một thách thức lớn trong việc sử dụng chế phẩm này để kiểm soát sâu bệnh. Sâu hại có thể phát triển khả năng kháng Bt thông qua nhiều cơ chế khác nhau, bao gồm thay đổi cấu trúc protein mục tiêu, tăng cường khả năng phân giải protein độc và giảm hấp thụ protein độc vào cơ thể. Để khắc phục vấn đề này, cần áp dụng các biện pháp quản lý kháng thuốc như luân phiên sử dụng các loại thuốc trừ sâu khác nhau, sử dụng hỗn hợp Bt với các chất khác để tăng hiệu quả, và duy trì quần thể sâu hại nhạy cảm với Bt trong môi trường. Nghiên cứu về cơ chế kháng thuốc của sâu hại là rất quan trọng để phát triển các chiến lược quản lý kháng thuốc hiệu quả. Theo nghiên cứu, việc sử dụng các chủng Bt khác nhau hoặc kết hợp Bt với các biện pháp kiểm soát sinh học khác có thể giúp làm chậm quá trình phát triển kháng thuốc của sâu hại. Ngoài ra, việc giám sát sự phát triển kháng thuốc của sâu hại cũng là cần thiết để đưa ra các quyết định quản lý phù hợp.

2.2. Tối ưu hóa quy trình sản xuất chế phẩm Bt để giảm chi phí

Việc tối ưu hóa quy trình sản xuất chế phẩm Bt là rất quan trọng để giảm chi phí và tăng tính cạnh tranh của sản phẩm. Các yếu tố cần được xem xét bao gồm lựa chọn môi trường nuôi cấy phù hợp, tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, pH, độ ẩm), và sử dụng các kỹ thuật lên men hiệu quả. Ngoài ra, việc sử dụng các nguồn nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm cũng có thể giúp giảm chi phí sản xuất. Nghiên cứu về các yếu tố ảnh hưởng đến sự tăng sinh khối của Bt là rất quan trọng để tối ưu hóa quy trình sản xuất. Theo nghiên cứu, việc sử dụng các phụ gia thích hợp và điều chỉnh điều kiện nuôi cấy có thể giúp tăng năng suất và chất lượng của chế phẩm Bt. Cuối cùng, việc áp dụng các công nghệ tiên tiến trong sản xuất chế phẩm Bt có thể giúp giảm chi phí và tăng hiệu quả.

III. Cách Chọn Lọc Phân Lập Chủng Bt Bản Địa Hiệu Quả Nhất

Việc chọn lọc và phân lập các chủng Bt bản địa có hoạt tính sinh học cao là một bước quan trọng trong việc phát triển các chế phẩm trừ sâu sinh học phù hợp với điều kiện địa phương. Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp truyền thống kết hợp với các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại để thu thập, phân lập và xác định các chủng Bt tiềm năng. Quá trình này bao gồm việc thu thập mẫu từ nhiều nguồn khác nhau, phân lập vi khuẩn Bt trên môi trường chọn lọc, xác định các đặc điểm sinh hóa và hình thái của vi khuẩn, và thử nghiệm hoạt tính sinh học của vi khuẩn đối với các loài sâu hại mục tiêu. Kỹ thuật PCR và giải trình tự DNA được sử dụng để xác định tên loài, dưới loài và gen cry của các chủng Bt, từ đó đánh giá tiềm năng của chúng trong việc kiểm soát sâu hại. Theo Travers và ctv (1987), Bt chiếm khoảng 0,005 – 0,5% Bacillus spp. phân lập trong đất, do đó, việc chọn lọc trên môi trường đặc hiệu là vô cùng quan trọng.

3.1. Quy trình thu thập và phân lập mẫu vi khuẩn Bacillus thuringiensis

Quy trình thu thập và phân lập mẫu vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) bao gồm các bước sau: Thu thập mẫu đất, lá cây, hoặc xác côn trùng từ các vùng trồng rau khác nhau. Pha loãng mẫu và cấy lên môi trường chọn lọc để phân lập vi khuẩn Bt. Chọn các khuẩn lạc có đặc điểm hình thái điển hình của Bt. Phân lập lại các khuẩn lạc đã chọn trên môi trường thuần khiết. Kiểm tra đặc điểm sinh hóa của các khuẩn lạc để xác định chúng là Bt. Thử nghiệm hoạt tính sinh học của các khuẩn lạc đối với các loài sâu hại mục tiêu. Mục tiêu của quy trình này là thu được các chủng Bt có hoạt tính sinh học cao và phù hợp với điều kiện địa phương. Theo nghiên cứu, việc thu thập mẫu từ nhiều nguồn khác nhau và sử dụng các phương pháp phân lập khác nhau có thể giúp tăng khả năng tìm thấy các chủng Bt mới và có tiềm năng. Các bước trên cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo tính chính xác và tin cậy của kết quả.

3.2. Xác định đặc điểm sinh hóa và hình thái của vi khuẩn Bt

Việc xác định đặc điểm sinh hóa và hình thái của vi khuẩn Bt là rất quan trọng để phân biệt chúng với các loài vi khuẩn khác và đánh giá tiềm năng của chúng trong việc kiểm soát sâu hại. Các đặc điểm sinh hóa thường được sử dụng bao gồm khả năng thủy phân tinh bột, phản ứng catalase, và khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau. Các đặc điểm hình thái thường được sử dụng bao gồm hình dạng tế bào, kích thước tế bào, và sự hiện diện của tinh thể độc. Việc sử dụng các kỹ thuật nhuộm cũng có thể giúp xác định các đặc điểm hình thái của vi khuẩn Bt. Theo bảng phân loại Bergey (1994), Bacillus thuringiensis có khả năng thủy phân tinh bột, dương tính với phản ứng catalase. Thông tin này có thể được sử dụng để xác định tên loài và dưới loài của vi khuẩn Bt, cũng như để đánh giá tiềm năng của chúng trong việc kiểm soát sâu hại.

3.3. Ứng dụng kỹ thuật PCR trong xác định gen Cry của vi khuẩn

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là một công cụ mạnh mẽ trong việc xác định gen Cry của vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt). Gen Cry mã hóa cho các protein độc tố (Cry proteins) có khả năng diệt côn trùng, và sự hiện diện của các gen Cry cụ thể có thể giúp xác định loại côn trùng mà chủng Bt đó có hiệu quả nhất. Quy trình bao gồm chiết xuất DNA từ vi khuẩn, thiết kế các cặp mồi (primers) đặc hiệu cho các gen Cry khác nhau, thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại các gen Cry mục tiêu, và phân tích sản phẩm PCR để xác định sự hiện diện của các gen Cry. Sử dụng PCR giúp sàng lọc nhanh chóng các chủng Bt với các đặc tính diệt côn trùng mong muốn. Kết quả PCR cho phép xác định loại và số lượng gen Cry trong mỗi chủng Bt, từ đó đánh giá tiềm năng của chủng đó trong việc kiểm soát sâu hại. Việc phân tích này cung cấp thông tin quan trọng cho việc phát triển các chế phẩm Bt hiệu quả và có mục tiêu.

IV. Tối Ưu Điều Kiện Lên Men Chế Phẩm Bt Dạng Bột Hòa Tan

Để sản xuất chế phẩm Bt dạng bột hòa tan có chất lượng cao, việc tối ưu hóa điều kiện lên men là vô cùng quan trọng. Nghiên cứu này tập trung vào việc khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men, bao gồm loại cơ chất, thành phần môi trường, pH, độ ẩm, nhiệt độ và thời gian. Mục tiêu là tìm ra các điều kiện tối ưu để tăng sinh khối Bt và sản xuất ra các protein độc có hoạt tính cao. Ngoài ra, việc bổ sung các phụ gia kháng UV cũng được xem xét để tăng thời gian tồn lưu của sản phẩm. Việc chuyển đổi sinh khối Bt sang dạng bột hòa tan đòi hỏi các kỹ thuật sấy và bảo quản phù hợp để đảm bảo hoạt tính của sản phẩm. Theo kết quả nghiên cứu, việc kết hợp các yếu tố môi trường và dinh dưỡng tối ưu có thể giúp tăng hiệu quả lên men và cải thiện chất lượng chế phẩm Bt.

4.1. Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sinh khối Bt

Các yếu tố môi trường như nhiệt độ, pH, độ ẩm và thời gian nuôi cấy có ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển và sinh khối của Bacillus thuringiensis (Bt). Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của Bt thường nằm trong khoảng 25-30°C. pH tối ưu thường là trung tính hoặc hơi kiềm (pH 7-8). Độ ẩm cũng cần được kiểm soát để đảm bảo sự phát triển tốt của vi khuẩn. Thời gian nuôi cấy cũng cần được điều chỉnh để đạt được sinh khối tối đa. Nghiên cứu về các yếu tố này giúp tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để tăng năng suất chế phẩm Bt. Theo nghiên cứu, việc điều chỉnh các yếu tố môi trường có thể giúp tăng sinh khối Bt lên đáng kể. Việc kiểm soát chặt chẽ các yếu tố môi trường là rất quan trọng để đảm bảo chất lượng và hiệu quả của chế phẩm Bt.

4.2. Lựa chọn phụ gia kháng UV để kéo dài thời gian tồn trữ

Phụ gia kháng UV đóng vai trò quan trọng trong việc kéo dài thời gian tồn trữ của chế phẩm Bt, đặc biệt là khi sử dụng ngoài đồng ruộng, nơi tiếp xúc trực tiếp với ánh nắng mặt trời. Ánh sáng UV có thể làm giảm hoạt tính của protein độc trong Bt, do đó, việc bổ sung các phụ gia kháng UV giúp bảo vệ protein độc và duy trì hiệu quả của chế phẩm. Các phụ gia kháng UV thường được sử dụng bao gồm các chất hấp thụ UV, các chất phản xạ UV, và các chất ổn định UV. Việc lựa chọn phụ gia kháng UV phù hợp cần dựa trên tính tương thích với Bt, khả năng bảo vệ protein độc, và tính an toàn đối với môi trường và sức khỏe con người. Theo kết quả nghiên cứu, việc sử dụng các phụ gia kháng UV có thể giúp kéo dài thời gian tồn trữ của chế phẩm Bt lên đáng kể. Thử nghiệm đánh giá thời gian tồn lưu rất cần thiết để lựa chọn ra phụ gia kháng UV phù hợp.

4.3. Khảo sát loại cơ chất lên men và thành phần môi trường

Việc lựa chọn loại cơ chất lên men và thành phần môi trường đóng vai trò quan trọng trong quá trình sản xuất chế phẩm Bt. Các loại cơ chất khác nhau có thể ảnh hưởng đến sinh khối, hoạt tính của protein độc và chi phí sản xuất. Các loại cơ chất thường được sử dụng bao gồm cám gạo, bột đậu nành, bột ngô, và rỉ đường. Thành phần môi trường cần cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của Bt, bao gồm carbon, nitrogen, các khoáng chất và vitamin. Việc tối ưu hóa thành phần môi trường có thể giúp tăng sinh khối Bt và cải thiện chất lượng sản phẩm. Theo nghiên cứu, việc sử dụng các nguồn nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm có thể giúp giảm chi phí sản xuất. Thử nghiệm các loại cơ chất khác nhau là rất quan trọng để lựa chọn ra loại cơ chất phù hợp.

V. Đánh Giá Hiệu Quả Chế Phẩm Bt Trên Cây Rau Thực Tế

Sau khi hoàn thiện quy trình sản xuất, việc đánh giá hiệu quả của chế phẩm Bt trên cây rau thực tế là bước không thể thiếu. Nghiên cứu này tiến hành các thử nghiệm đồng ruộng tại Lâm Đồng và TP. Hồ Chí Minh để đánh giá khả năng phòng trừ sâu hại của chế phẩm Bt trên các loại rau khác nhau. Các chỉ tiêu đánh giá bao gồm mật độ sâu hại, tỷ lệ lá bị hại, năng suất và chất lượng rau. Đồng thời, việc so sánh hiệu quả của chế phẩm Bt với các loại thuốc trừ sâu hóa học cũng được thực hiện để đánh giá tính cạnh tranh của sản phẩm. Kết quả thử nghiệm đồng ruộng cung cấp thông tin quan trọng về hiệu quả thực tế của chế phẩm Bt và giúp điều chỉnh quy trình sản xuất để đạt được hiệu quả cao nhất. Theo kết quả nghiên cứu, chế phẩm Bt có thể kiểm soát hiệu quả nhiều loại sâu hại trên rau và mang lại năng suất tương đương hoặc cao hơn so với việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học.

5.1. Thiết kế thí nghiệm đánh giá hiệu quả chế phẩm Bt trên rau

Thiết kế thí nghiệm đánh giá hiệu quả chế phẩm Bt trên rau cần đảm bảo tính khoa học và khách quan. Các yếu tố cần được xem xét bao gồm lựa chọn loại rau, lựa chọn sâu hại mục tiêu, bố trí thí nghiệm, và các chỉ tiêu đánh giá. Thí nghiệm thường được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên hoặc khối ngẫu nhiên đầy đủ, với các nghiệm thức khác nhau bao gồm đối chứng không xử lý, đối chứng xử lý bằng thuốc trừ sâu hóa học, và các nghiệm thức xử lý bằng chế phẩm Bt với các liều lượng khác nhau. Các chỉ tiêu đánh giá thường bao gồm mật độ sâu hại, tỷ lệ lá bị hại, năng suất rau, và chất lượng rau. Việc thu thập dữ liệu cần được thực hiện thường xuyên và chính xác để đảm bảo tính tin cậy của kết quả. Theo nghiên cứu, việc sử dụng nhiều địa điểm thí nghiệm và nhiều vụ trồng có thể giúp tăng tính tổng quát của kết quả.

5.2. So sánh hiệu quả chế phẩm Bt và thuốc trừ sâu hóa học

Việc so sánh hiệu quả của chế phẩm Bt với thuốc trừ sâu hóa học là rất quan trọng để đánh giá tính cạnh tranh của sản phẩm. Các chỉ tiêu so sánh thường bao gồm khả năng kiểm soát sâu hại, tác động đến môi trường, và chi phí sử dụng. Chế phẩm Bt thường có ưu điểm là an toàn hơn đối với môi trường và sức khỏe con người so với thuốc trừ sâu hóa học. Tuy nhiên, chế phẩm Bt có thể có hiệu quả chậm hơn và phạm vi kiểm soát hẹp hơn so với thuốc trừ sâu hóa học. Việc đánh giá chi phí của việc sử dụng chế phẩm Bt so với thuốc trừ sâu hóa học cũng là rất quan trọng để đánh giá tính kinh tế của sản phẩm. Theo kết quả nghiên cứu, chế phẩm Bt có thể có chi phí tương đương hoặc thấp hơn so với thuốc trừ sâu hóa học, đặc biệt là khi tính đến các chi phí liên quan đến tác động tiêu cực của thuốc trừ sâu hóa học đến môi trường và sức khỏe con người. Đánh giá cần dựa trên nhiều yếu tố để đưa ra kết luận chính xác.

VI. Kết Luận Đề Xuất Phát Triển Chế Phẩm Bt Bền Vững

Nghiên cứu về quy trình sản xuất chế phẩm Bt kiểm soát sâu hại trên cây rau đã đạt được những kết quả đáng khích lệ. Việc hoàn thiện quy trình sản xuất, từ khâu chọn lọc chủng Bt đến khâu thử nghiệm đồng ruộng, đã tạo ra một sản phẩm có tiềm năng lớn trong việc thay thế thuốc trừ sâu hóa học. Tuy nhiên, để phát triển chế phẩm Bt một cách bền vững, cần tiếp tục nghiên cứu và giải quyết các vấn đề còn tồn tại, như sự kháng thuốc của sâu hại và tối ưu hóa quy trình sản xuất. Đồng thời, cần có sự phối hợp chặt chẽ giữa các nhà khoa học, nhà sản xuất và người nông dân để đưa sản phẩm đến tay người tiêu dùng một cách hiệu quả. Việc ứng dụng công nghệ sinh học và các phương pháp quản lý dịch hại tổng hợp là chìa khóa để phát triển chế phẩm Bt một cách bền vững. Theo kết luận của Hội đồng nghiệm thu, việc nghiên cứu và phát triển chế phẩm Bt là một hướng đi đúng đắn và cần được khuyến khích.

6.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo để cải thiện chế phẩm Bt

Để tiếp tục cải thiện chế phẩm Bt, cần tập trung vào các hướng nghiên cứu sau: Nghiên cứu về cơ chế kháng Bt của sâu hại và phát triển các chủng Bt mới có khả năng vượt qua sự kháng thuốc. Tối ưu hóa quy trình sản xuất để giảm chi phí và tăng năng suất. Nghiên cứu về tác động của chế phẩm Bt đến hệ sinh thái và các loài côn trùng có ích. Phát triển các phương pháp phối hợp chế phẩm Bt với các biện pháp kiểm soát sinh học khác để tăng hiệu quả. Việc kết hợp các hướng nghiên cứu này có thể giúp tạo ra các chế phẩm Bt hiệu quả hơn và bền vững hơn. Theo nghiên cứu, việc sử dụng công nghệ sinh học có thể giúp tạo ra các chủng Bt mới với các đặc tính mong muốn. Sự hợp tác giữa các nhà khoa học là vô cùng cần thiết.

6.2. Chính sách hỗ trợ phát triển và ứng dụng chế phẩm Bt

Để thúc đẩy sự phát triển và ứng dụng chế phẩm Bt, cần có các chính sách hỗ trợ từ phía nhà nước. Các chính sách này có thể bao gồm: Hỗ trợ kinh phí cho các nghiên cứu về chế phẩm Bt. Khuyến khích các doanh nghiệp đầu tư vào sản xuất chế phẩm Bt. Tổ chức các chương trình đào tạo và tập huấn cho nông dân về sử dụng chế phẩm Bt. Xây dựng các tiêu chuẩn chất lượng và quy trình kiểm soát chất lượng cho chế phẩm Bt. Việc thực hiện các chính sách này có thể giúp tạo ra một môi trường thuận lợi cho sự phát triển và ứng dụng chế phẩm Bt. Theo kinh nghiệm của các nước phát triển, sự hỗ trợ từ phía nhà nước đóng vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sự phát triển của các sản phẩm sinh học. Chính sách cần hướng đến mục tiêu phát triển nông nghiệp bền vững.

Nội dung chính

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC BACILLUS THURINGIENSIS (Bt) PHÒNG TRỪ SÂU HẠI CÁNH VẢY TRÊN RAU AN TOÀN

---

Tóm tắt nghiên cứu (Research Summary)

• Câu hỏi nghiên cứu chính: Làm thế nào để phân lập các chủng vi khuẩn bản địa Bacillus thuringiensis (Bt) có hoạt lực cao, đồng thời xây dựng và hoàn thiện quy trình công nghệ lên men quy mô pilot (fermentor 50 lít) nhằm tạo ra chế phẩm sinh học dạng bột hòa tan trong nước (WP) kháng tia UV, phục vụ kiểm soát bền vững sâu hại bộ Cánh vảy (Lepidoptera) trên cây rau tại TP. Hồ Chí Minh và Lâm Đồng?
• Phương pháp tiếp cận: Nghiên cứu thu thập 3.000 mẫu đất/trầm tích trên cả nước; phân lập chọn lọc bằng sốc nhiệt và sodium acetate; sàng lọc độc tính sinh học (bioassay) trên sâu tơ (Plutella xylostella), sâu khoang (Spodoptera litura), sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) và tuyến trùng (Meloidogyne incognita); định danh phân tử gen cry1, cry2, vip3A và phân tích điện di protein tinh thể SDS-PAGE; tối ưu hóa điều kiện lên men lỏng (hệ thống pilot 50L) và lên men bán rắn; phối trộn phụ gia kháng quang hóa UV; kiểm tra an toàn trên chuột nhắt trắng (Swiss albino) và khảo nghiệm thực tế đồng ruộng qua 2 vụ liên tiếp.
• Phát hiện chính: Tuyển chọn được các chủng Bt bản địa có phổ độc tính cao mang đồng thời các gen độc tố cry1, cry2 và vip3A. Tối ưu hóa thành công quy trình lên men sinh khối lỏng ở hệ thống fermentor 50L đạt mật số > $10^9$ CFU/ml, sản xuất thành công chế phẩm dạng bột tan trong nước có bổ sung phụ gia kháng UV ($TiO_2$, cao lanh, bột talc), đạt hiệu lực phòng trừ sâu hại ngoài đồng ruộng trên 70–85%, tương đương chế phẩm thương mại đối chứng và tuyệt đối an toàn cho động vật có vú ($LC_{50}$ > $2 \times 10^9$ CFU/kg).
• Ý nghĩa thực tiễn: Tạo ra quy trình công nghệ tự chủ trong nước để sản xuất thuốc bảo vệ thực vật sinh học chất lượng cao, giảm thiểu sự phụ thuộc vào nguồn nhập khẩu, giải quyết bài toán tồn dư hóa chất độc hại và thúc đẩy chuỗi giá trị rau an toàn đạt chuẩn VietGAP/GlobalGAP.

---

Bối cảnh và tầm quan trọng (Context & Significance)

Sản xuất nông nghiệp tại Việt Nam, đặc biệt là phân khúc rau màu ngắn ngày, đang đối mặt với thách thức nghiêm trọng từ áp lực sâu bệnh hại bộ Cánh vảy (Lepidoptera) như sâu tơ, sâu khoang, sâu xanh da láng. Nhằm bảo vệ năng suất, tập quán canh tác truyền thống lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) hóa học với tần suất phun dày đặc (từ 7 đến 20 lần/vụ), thời gian cách ly không bảo đảm dẫn đến dư lượng hoạt chất độc hại (như Chlorpyrifos ethyl) vượt ngưỡng cho phép hàng chục đến hàng trăm lần. Hệ quả trực tiếp là đất đai thoái hóa, thiên địch bị tiêu diệt, sâu hại kháng thuốc nhanh chóng, cùng nguy cơ ngộ độc cấp và mạn tính đe dọa sức khỏe cộng đồng và làm suy giảm giá trị xuất khẩu nông sản.

                  THỰC TRẠNG CANH TÁC CŨ
                        GIẢI PHÁP TỪ ĐỀ TÀI
                      NÔNG NGHIỆP BỀN VỮNG / VIETGAP

Trước tình hình đó, việc ứng dụng đấu tranh sinh học bằng vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) được xem là giải pháp then chốt. Bt là trực khuẩn Gram dương sinh bào tử, có khả năng tổng hợp tinh thể protein độc tố ($\delta$-endotoxin bao gồm các protein Cry, Cyt) và ngoại độc tố (Vip) gây tổn thương đặc hiệu biểu mô ruột giữa của sâu non mà không gây hại cho người, động vật máu nóng hay môi trường.

Tuy nhiên, khoảng trống công nghệ lớn tại Việt Nam là hơn 90% chế phẩm sinh học thương phẩm trên thị trường phải nhập khẩu từ nước ngoài (chủ yếu từ Trung Quốc, Ấn Độ). Các chế phẩm trong nước trước đây thường gặp rào cản về công nghệ duy trì chất lượng: chế phẩm dạng lỏng nhanh suy giảm hoạt lực, trong khi dạng bột dễ bị quang hóa, mất hoạt tính dưới tác động của tia cực tím (UV) nhiệt đới và nhiệt độ cao. Do đó, việc nghiên cứu khai thác nguồn gen Bt bản địa phong phú, làm chủ công nghệ lên men quy mô pilot 50 lít và hoàn thiện công thức bột hòa tan kháng UV là nhiệm vụ cấp thiết, mang tính thời sự cao nhằm thúc đẩy nền nông nghiệp hữu cơ bền vững.

---

Phương pháp nghiên cứu (Methodology & Approach)

Đề tài được thiết kế theo hướng tiếp cận đa tầng, kết hợp từ nghiên cứu cơ bản trong phòng thí nghiệm đến thử nghiệm công nghệ pilot và khảo nghiệm diện rộng ngoài đồng ruộng:

  [3.000 Mẫu đất/Trầm tích]
  [Phân lập & Định danh hình thái/sinh hóa]
  [Sàng lọc Bioassay (Sâu tơ, sâu khoang, sâu xanh, tuyến trùng)]
  [Sinh học phân tử: PCR gen Cry1/Cry2/Vip3A & SDS-PAGE]
  [Tối ưu hóa Lên men Lỏng Fermentor 50L & Lên men Bán rắn]
  [Phối chế Bột WP + Phụ gia kháng UV (TiO2, Kaolin)]
  [Kiểm tra An toàn Độc tính Chuột (LC50) & Khảo nghiệm Đồng ruộng 2 vụ]

1. Thu thập mẫu và phân lập chọn lọc

• Nguồn mẫu: Thu thập 3.000 mẫu đất, trầm tích sông, hồ, cát ven biển, đất rừng bảo tồn và đất canh tác nông nghiệp trên toàn quốc, định vị tọa độ GPS chính xác.
• Kỹ thuật phân lập: Sử dụng phương pháp sốc nhiệt ($80^\circ\text{C}$ trong 12–20 phút) kết hợp dung dịch chọn lọc sodium acetate ($0,25 - 0,3\text{ M}$, $\text{pH } 6,8$) nhằm ức chế sự nảy mầm của các vi sinh vật không sinh bào tử, tạo điều kiện cho bào tử Bt phát triển trên môi trường thạch T3.

2. Định danh hình thái, sinh hóa và sinh học phân tử

• Hình thái & Sinh hóa: Nhuộm Gram (dung dịch $\text{KOH } 3%$, Crystal violet), nhuộm nội bào tử bằng lục Malachite, quan sát cấu trúc tinh thể protein dưới kính hiển vi quang học và kính hiển vi phản pha; kiểm tra hoạt tính Catalase, phản ứng Voges–Proskauer (V-P), phản ứng thủy phân tinh bột và casein.
• Sinh học phân tử: Ly trích DNA tổng số bằng bộ kit chuẩn Wizard Genomic; thực hiện kỹ thuật PCR khuếch đại các phân đoạn gen độc tố chuyên biệt (cry1, cry2, vip3A) với các cặp mồi đặc hiệu (Un1-F/Un1-R, Un2-F/Un2-R, Vip3A-Fw/Rv); phân tích trọng lượng phân tử protein tinh thể độc qua điện di gel polyacrylamide biến tính (SDS-PAGE); giải trình tự DNA và đối chiếu dữ liệu GenBank qua BLAST.

3. Đánh giá hoạt tính sinh học (Bioassay)

• Nhân nuôi côn trùng chuẩn: Thiết lập hệ thống nhân nuôi nhân tạo liên tục các đối tượng dịch hại gồm sâu tơ (Plutella xylostella), sâu khoang (Spodoptera litura), sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) và tuyến trùng nốt sưng rễ (Meloidogyne incognita) để đảm bảo nguồn ấu trùng đồng nhất về tuổi và thể trạng.
• Thử nghiệm độc lực: Đánh giá hiệu lực gây chết ở các dải nồng độ vi khuẩn từ $10^7$ đến $10^9\text{ CFU/ml}$ bằng phương pháp nhúng ngập lá thức ăn; tính toán tỷ lệ chết hiệu chỉnh theo công thức Abbott sau 1, 2, 3, 5 và 7 ngày xử lý.

4. Công nghệ lên men và bào chế chế phẩm

• Quy mô Fermentor 50L: Vận hành hệ thống 2 thùng lên men 50 lít có vỏ áo gia nhiệt bán tự động; tối ưu hóa các thông số môi trường dinh dưỡng (tinh bột, bột đậu nành, glucose, pepton, muối khoáng), nhiệt độ ($28 - 32^\circ\text{C}$), pH ($6,8 - 7,2$), tốc độ khuấy đảo và thông khí bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (CCD).
• Lên men bán rắn & Bào chế: Nuôi cấy trên cơ chất giá thể (bột gạo, bột bắp, cám, khoáng vi lượng); thu hồi sinh khối bào tử và tinh thể protein. Phối trộn chất mang và phụ gia hấp thụ tia cực tím ($TiO_2$, bột talc, cao lanh) theo các tỷ lệ thử nghiệm ($10% - 50%$) nhằm gia tăng độ bền quang hóa.

5. Đánh giá an toàn và khảo nghiệm đồng ruộng

• Độc tính động vật có vú: Thử nghiệm độc tính cấp đường miệng ($LC_{50}$) trên chuột nhắt trắng Swiss albino bằng phương pháp bơm dạ dày dung dịch Bt nồng độ cao ($1 \times 10^{10}\text{ CFU/ml}$, liều $2 \times 10^9\text{ CFU/kg}$ thể trọng), theo dõi hành vi và tỷ lệ sống chết liên tục trong 72 giờ qua camera hồng ngoại.
• Khảo nghiệm thực địa: Bố trí khối hoàn toàn ngẫu nhiên (RCBD) qua 2 vụ liên tiếp trên các vùng chuyên canh rau tại TP. Hồ Chí Minh (Củ Chi, Hóc Môn) và Lâm Đồng (Đà Lạt, Đơn Dương) theo quy chuẩn quốc gia QCVN 01-38:2010/BNNPTNT.

---

Phát hiện chính (Key Findings)

Hạng mục nghiên cứu	Kết quả đạt được	Ý nghĩa khoa học / Công nghệ
Nguồn gen & Phân lập	Phân lập thành công các dòng Bt bản địa từ 3.000 mẫu đất; đa dạng dạng tinh thể độc (hình thoi, hình tháp, hình khối).	Khẳng định tính phong phú của bộ sưu tập nguồn gen Bt bản địa Việt Nam.
Hồ sơ sinh học phân tử	Phát hiện các chủng mang tổ hợp đa gen: cry1 (~277 bp), cry2 (~701 bp) và vip3A; xuất hiện các băng protein đặc hiệu 60–135 kDa trên SDS-PAGE.	Cung cấp phổ tác động rộng, hạn chế tối đa nguy cơ hình thành tính kháng thuốc của sâu hại.
Hoạt tính sinh học (Bioassay)	Mật độ $10^8 - 10^9\text{ CFU/ml}$ làm chết 80–95% sâu tơ, sâu khoang, sâu xanh da láng sau 3–5 ngày; gây ức chế và bất động tuyến trùng Meloidogyne spp.	Độc lực tương đương hoặc cao hơn các chủng chuẩn quốc tế đối chứng.
Quy trình Lên men 50L	Tối ưu hóa thành công cơ chất rẻ tiền (bột gạo, đậu nành); đạt mật số > $10^9\text{ CFU/ml}$ trong 40–48 giờ; hơn 90% tế bào tạo bào tử và tinh thể độc.	Làm chủ hoàn toàn thiết bị và quy trình sản xuất quy mô bán công nghiệp.
Công thức bột WP kháng UV	Bổ sung $TiO_2$ và Kaolin giúp kéo dài thời gian bán hủy ngoài đồng ruộng, tăng độ bám dính và duy trì hoạt lực > 80% sau 6 tháng bảo quản.	Khắc phục triệt để nhược điểm dễ bị phân hủy quang hóa của chế phẩm Bt truyền thống.
An toàn sinh học & Đồng ruộng	Không gây chết hay biến đổi hành vi trên chuột ($LC_{50} > 2 \times 10^9\text{ CFU/kg}$); hiệu lực ngoài đồng ruộng đạt 70–85% trên bắp cải, bông cải, cải thảo.	Đủ tiêu chuẩn thương mại hóa và ứng dụng rộng rãi trong các vùng sản xuất rau an toàn.

                       HIỆU LỰC DIỆT SÂU THEO THỜI GIAN
    40% 
               Ngày 1         Ngày 2         Ngày 3         Ngày 5

---

Đóng góp khoa học và giá trị thực tiễn (Scientific & Practical Contributions)

1. Đóng góp về mặt lý thuyết và học thuật

• Bổ sung dữ liệu khoa học toàn diện về sự phân bố sinh thái, đặc tính sinh hóa và cấu trúc di truyền của các chủng Bacillus thuringiensis bản địa tại nhiều vùng địa lý sinh thái khác nhau của Việt Nam.
• Làm sáng tỏ mối tương quan giữa sự hiện diện đồng thời của các nhóm gen độc tố (cry1, cry2, vip3A) với phổ ký chủ và cơ chế gây độc hiệp đồng lên màng biểu mô ruột non của nhiều loài sâu hại ăn lá bộ Cánh vảy.

2. Đổi mới về phương pháp luận và công nghệ

• Hoàn thiện chuỗi quy trình đồng bộ từ khâu phân lập mẫu ròng, thiết lập hệ thống nuôi sinh khối sâu kiểm định chuẩn hóa, đến kiểm tra kiểu gen nhanh bằng multiplex-PCR.
• Thiết kế thành công công thức phối chế phụ gia quang học bền vững, giải quyết điểm nghẽn kỹ thuật kinh điển của các chế phẩm sinh học vi sinh nhiệt đới là sự mất hoạt tính nhanh chóng dưới tác động của bức xạ mặt trời.

3. Ứng dụng thực tiễn và tác động chính sách

• Chuyển giao quy trình công nghệ lên men lỏng trên hệ thống pilot 50 lít cho các đơn vị sản xuất chế phẩm sinh học trong nước với chi phí cơ chất thấp, tính khả thi cao.
• Cung cấp sản phẩm thay thế thuốc trừ sâu hóa học đạt chuẩn, làm nền tảng kỹ thuật vững chắc để các địa phương xây dựng vùng sản xuất rau chuyên canh chất lượng cao, phục vụ tiêu chuẩn VietGAP, GlobalGAP, nâng cao năng lực cạnh tranh cho nông sản Việt Nam.

---

Đối tượng quan tâm và lợi ích ứng dụng (Target Audience & Benefits)

• Các nhà khoa học và viện nghiên cứu công nghệ sinh học: Kế thừa cơ sở dữ liệu về nguồn gen Bt bản địa, quy trình nuôi cấy vi sinh vật và phương pháp sàng lọc gen độc tính phục vụ các nghiên cứu biểu hiện tái tổ hợp gen hoặc phát triển chủng mới.
• Doanh nghiệp sản xuất thuốc BVTV và chế phẩm sinh học: Tiếp nhận chuyển giao công nghệ lên men quy mô pilot 50L và công thức bào chế bột hòa tan (WP) kháng UV có tính thương mại hóa cao, tối ưu chi phí vận hành và giá thành sản xuất.
• Cơ quan quản lý nông nghiệp và khuyến nông (Sở Nông nghiệp & PTNT, Chi cục Trồng trọt & BVTV): Có thêm căn cứ kỹ thuật để định hướng chuyển đổi cơ cấu sử dụng thuốc BVTV, xây dựng các gói kỹ thuật quản lý dịch hại tổng hợp (IPM) trên cây rau màu tại các đô thị và vùng nông nghiệp trọng điểm.
• Hợp tác xã và nông dân chuyên canh rau sạch: Tiếp cận sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học an toàn, không lo ngại vấn đề thời gian cách ly, bảo vệ sức khỏe người sản xuất trực tiếp và nâng cao giá trị thương phẩm của nông sản.

---

Câu hỏi thường gặp (Frequently Asked Questions - FAQ)

1. Điểm đột phá lớn nhất của công trình nghiên cứu này là gì?

Điểm đột phá là nghiên cứu đã tuyển chọn thành công các chủng Bt bản địa mang phức hợp đa gen độc tố (cry1, cry2, vip3A), đồng thời làm chủ hoàn toàn quy trình công nghệ lên men sinh khối trên hệ thống fermentor 50L và phát triển công thức bột hòa tan bổ sung phụ gia kháng tia UV, giúp chế phẩm có độ bền ngoài đồng ruộng cao hơn hẳn các dòng sản phẩm Bt thông thường.

2. Tinh thể độc của vi khuẩn Bt diệt sâu bằng cơ chế sinh học nào?

Khi sâu non ăn phải lá cây có dính chế phẩm Bt, trong môi trường kiềm ($\text{pH } 9 - 12$) của đường ruột sâu, tinh thể protein Cry bị hòa tan và giải phóng thành các tiền độc tố. Dưới tác động của enzyme protease trong dịch ruột, tiền độc tố bị cắt thành các phân tử độc tố hoạt tính (60–65 kDa), gắn kết đặc hiệu vào thụ thể trên màng tế bào nhung mao ruột giữa, tạo ra các lỗ thủng làm rối loạn áp suất thẩm thấu. Nước tràn vào làm tế bào trương phình, vỡ tung, khiến sâu bị liệt ruột, ngừng ăn và chết khô sau 2–5 ngày.

3. Hiệu lực thực tế của chế phẩm trên đồng ruộng tại TP.HCM và Lâm Đồng có ổn định không?

Kết quả khảo nghiệm qua 2 vụ liên tiếp trên các loại cây trồng (bắp cải, bông cải, cải thảo, đậu phộng) tại 2 vùng sinh thái đối lập (vùng nóng ẩm TP.HCM và vùng cao nguyên mát mẻ Lâm Đồng) đều ghi nhận hiệu lực phòng trừ sâu tơ, sâu khoang và sâu xanh da láng đạt từ 70% đến 85%, tương đương và ổn định so với chế phẩm thương phẩm đối chứng Vi-Bt 32000 WP.

4. Chế phẩm Bt này có gây độc cho người, gia súc và môi trường không?

Hoàn toàn không. Kết quả thử nghiệm an toàn sinh học trên chuột nhắt trắng Swiss albino với liều lượng rất cao ($2 \times 10^9\text{ CFU/kg}$ thể trọng) qua đường bơm dạ dày trực tiếp không gây bất kỳ triệu chứng ngộ độc hay ca tử vong nào. Tinh thể độc của Bt chỉ phát huy tác dụng trong môi trường ruột kiềm đặc trưng của côn trùng và hoàn toàn bất hoạt trong môi trường dạ dày axit của người và động vật có vú.

5. Hướng phát triển tiếp theo của nghiên cứu là gì?

Nhóm nghiên cứu hướng tới việc mở rộng quy mô lên men công nghiệp từ 500 đến 1.000 lít, hoàn thiện hồ sơ đăng ký lưu hành thuốc BVTV sinh học chính thức, đồng thời nghiên cứu tích hợp thêm các hoạt tính diệt tuyến trùng và sâu hại rễ để mở rộng phổ ứng dụng cho các nhóm cây trồng có giá trị cao khác.

---

Kết luận (Conclusion)

Nhiệm vụ nghiên cứu khoa học và công nghệ do PGS. TS Lê Đình Đôn chủ nhiệm đã hoàn thành xuất sắc mục tiêu đề ra: từ việc phân lập, định danh nguồn gen bản địa Bacillus thuringiensis mang đặc tính ưu việt, đến việc làm chủ công nghệ lên men quy mô pilot 50 lít và hoàn thiện công thức chế phẩm bột tan trong nước có khả năng kháng tia cực tím.

Kết quả đề tài không chỉ đóng góp giá trị học thuật quan trọng cho ngành công nghệ sinh học nông nghiệp Việt Nam mà còn mang lại giải pháp công nghệ mang tính ứng dụng cao, mở đường cho việc tự chủ nguồn thuốc BVTV sinh học chất lượng cao. Đề tài mở ra cơ hội hợp tác chuyển giao công nghệ cho các doanh nghiệp sản xuất thuốc BVTV, góp phần đẩy lùi vấn nạn lạm dụng hóa chất độc hại và kiến tạo nền nông nghiệp xanh, sạch, an toàn cho cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Những năm gần đây, bùng nổ dân số và đô thị hóa nhanh đang là vấn đề gây nhiều ảnh hưởng xấu đến mọi mặt đời sống xã hội, trong đó có nông nghiệp. Để đáp ứng nhu cầu lương thực trong nước và xuất khẩu nền nông nghiệp nước ta đang áp dụng các biện pháp thâm canh cao, với việc sử dụng ngày càng nhiều phân bón, thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) có nguồn gốc hóa học nhằm tăng năng suất và chất lượng nông phẩm. Tuy nhiên, sự thâm canh trong nông nghiệp đã làm cho đất đai ngày càng thoái hóa, mất cân bằng dinh dưỡng, hệ vi sinh vật trong đất bị tiêu diệt, tồn dư các chất độc hại trong đất ngày càng cao, nguồn bệnh tích lũy trong đất càng nhiều dẫn đến phát sinh một số dịch hại không dự báo trước. Để bảo vệ cây trồng, con người đã sử dụng thuốc hóa học trong sản xuất nông nghiệp.

Với những ưu điểm như mang lại hiệu quả nhanh chóng, tiện lợi và dễ dàng sử dụng; Thêm vào đó nếu dùng thuốc đúng kỹ thuật (theo qui tắc bốn đúng) sẽ bảo vệ được cây trồng, tăng năng suất và phẩm chất. Tuy nhiên, do tình hình sâu bệnh hại diễn biến ngày một phức tạp và việc lạm dụng thuốc BVTV của một bộ phận không nhỏ nông dân đã dẫn đến những mối nguy hại như: tăng chi phí sản xuất, sự kháng thuốc của sâu bệnh, một số thuốc trừ sâu chậm phân hủy và lưu tồn rất lâu trong đất dẫn tới ô nhiễm môi trường, mất cân bằng sinh thái. Nguy hiểm hơn là việc sử dụng tùy tiện liều lượng và thời gian phun dẫn đến dư lượng thuốc BVTV trong nông sản ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người tiêu dùng, làm giảm khả năng tiêu thụ cũng như xuất khẩu nông sản qua các thị trường nước ngoài (Georghiou, 1990). Chính vì vậy, xu hướng quay trở lại nền nông nghiệp hữu cơ với việc tăng cường ứng dụng đấu tranh sinh học trong sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam đang ngày càng được chú ý.

Trong tự nhiên, có hơn 90 loại vi khuẩn chuyên biệt diệt côn trùng đã được phân lập từ côn trùng, cây cối và trong đất. Tuy nhiên cho đến nay chỉ một vài loài được nghiên cứu kĩ và nổi bật là Bacillus thuringiensis. Mục tiêu nghiên cứu a. Mục tiêu tổng quát: Ứng dụng công nghệ lên men để hoàn thiện qui trình sản xuất chế phẩm Bt (Bacillus thuringiensis) có nguồn gốc bản địa đạt tiêu chuẩn thương mại dạng bột hòa nước, sử dụng cho sản xuất rau an toàn tại Lâm Đồng và Tp.

Hồ Chí Minh b. Mục tiêu cụ thể. (Đề tài dự kiến sẽ giải-quyết-được-vấn-đề-cụ-thể nào?)  Xác định tên loài, dưới loài, gen cry, và độc tính của các mẫu Bacillus thuringiensis phân lập tại Việt Nam.  Hoàn thiện quy trình sản xuất sản phẩm thuốc bảo vệ thực vật sinh học chứa Bacillus thuringiensis có hiệu lực diệt sâu hại ăn lá thuộc bộ Lepidoptera trên cây rau.

 Sản xuất và thương mại thử nghiệm sản phẩm Bt nhằm phát triển sản phẩm ở quy mô lớn. Nội dung nghiên cứu 3.1 Thu thập, phân lập mẫu vi khuẩn Bacillus thuringiensis 3.2 Thiết lập hệ thống fermentor 50 lít 3.3 Chọn lọc mẫu phân lập Bt có hoạt tính sinh học diệt côn trùng gây hại, tập trung côn trùng thuộc bộ Lepidoptera, và tuyến trùng Meloidogyne spp.4 Xác định tên dưới loài của mẫu phân lập Bt có hoạt tính sinh học bằng kỹ thuật sinh học (dựa vào kết quả nội dung 2) 3.5 Xác lập điều kiện tăng sinh khối mẫu phân lập tiềm năng 3.6 Xác lập điều kiện tạo sản phẩm Bt dạng bột tan trong nước 3.7 Đánh giá sản phẩm trên cây trồng (2 vụ liên tục) 3.8 Hoàn thiện quy trình sản xuất và sản xuất sản phẩm ở 50 lít fermentor 3. Thời gian và địa điểm thực hiện Từ tháng 12 năm 2014 đến tháng 5 năm 2017, tại bộ môn Công nghệ sinh học, bộ môn Bảo vệ thực vật, Phòng vi sinh thuộc Viện nghiên cứu công nghệ sinh học và môi trường, Trường Đại học Nông lâm thành phố Hồ Chí Minh. Chi cục Bảo vệ thực vật Tp.HCM 2 CHƯƠNG II.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Bacillus thuringiensis (Bt) Năm 1901, nhà côn trùng học người Nhật Shigetane Ishiwata phát hiện ra ấu trùng tằm (Bombyx mori) chết, đặt tên là Bacillus sotto. Đến năm 1910, nhà vi khuẩn học người Đức Ernst Bernard đã phân lập được vi khuẩn từ bướm Địa Trung Hải, Angasta kaenniella và phát hiện sự hiện diện của tinh thể độc. Nhưng đến năm 1915, vi khuẩn này mang tên là Bacillus thuringiensis.

Phân loại khoa học Giới: Eubacteria Ngành: Firmicuter Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus Loài: thuringiensis Hình 2.1: Bacillus thuringiensis (https://www.com) Bacillus thuringiensis là trực khuẩn sinh bào tử hiếu khí không bắt buộc, Gram dương, kích thước từ 3 – 6 µm, tiêm mao phủ mỏng, tế bào đứng riêng rẽ, và xếp thành từng chuỗi, sinh tinh thể diệt côn trùng trong quá trình hình thành bào tử (Sanahuja, 2011). Mỗi tế bào Bt khi trưởng thành có khả năng sinh bào tử và tinh thể độc. Bào tử Bt dạng hình trụ hoặc hình oval, kích thước 1, 6 – 2 µm, hình thành trong điều kiện môi trường bất lợi như nhiệt độ cao, môi trường nghèo dinh dưỡng và nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng khi gặp điều kiện thuận lợi. Sự phân bố của Bt Bt sống trong nhiều môi trường khác nhau như đất, nước, côn trùng chết, lá khô, bụi, môi trường thủy canh, trầm tích biển và đất Nam Cực.

Bt phát triển ở những môi trường nhiều sâu bọ phát triển. 3 Trong đất, Bt tồn tại ở dạng bào tử, không nảy mầm hoặc nhân lên qua nhiều năm, nhiều Bt phân lập từ đất có thể không hoạt động độc tố chống lại côn trùng. Bt chiếm khoảng 0,005 – 0,5% Bacillus spp. phân lập trong đất (Travers và ctv, 1987).

Nồng độ của Bt trong các loại đất nhất định rất thấp. DeLucca và ctv (1981) phát hiện ra có thể tìm thấy được một Bt cho hai ngàn Bacillus spp. được phân lập. Gần đây, Rampersad và Ammons (2005) cho rằng chỉ có 79 Bt từ hơn mười ngàn khuẩn lạc tìm thấy.

Môi trường phát triển của Bt Bt phát triển được ở nhiều môi trường khác nhau, chỉ cần một ít chất dinh dưỡng có thể cho khuẩn lạc Bt xuất hiện. Khuẩn lạc của Bacillus thuringienis var kurtaki nuôi cấy trên môi trường MPA ở 30oC trong 72 giờ đa số có hình tròn, màu trắng sữa, có mép nhăn, đường kính có thể đạt tới 8 – 10mm.Trên môi trường pepton agar, khuẩn lạc màu trắng sữa, bề mặt phẳng, mép hơi có dạng phóng xạ (Hồ Bảo Quốc, 2010). Theo Talat và ctv (2011) thì khoảng 85% khuẩn lạc Bt khi phát triển trên môi trường Nutri Agar có màu trắng, tròn, phẳng và lượn sóng ở mép. Theo Travers (1987) hình thái khuẩn lạc trên môi trường T3 có đặc điểm: thô, màu trắng và lan nhanh trên đĩa.

Năm 2013, Nguyễn Thiện Phú và Trần Thanh Thủy cho rằng khuẩn lạc Bacillus thuringiensis có màu trắng kem, viền nhăn, núm nhỏ ở tâm, nhìn nghiêng bề mặt hơi sần sùi, đường kính khoảng 5 mm, tế bào có hình que, hai đầu hơi tù, xếp riêng rẽ, bào tử hình trứng, chính tâm. Đặc điểm sinh hóa của Bacillus thuringiensis Theo bảng phân loại Bergey (1994) Bacillus thuringiensis có khả năng thủy phân tinh bột, dương tính với phản ứng VP. Ngoài ra, Bt không lên men sinh acid trong môi trường arrabinorase, xylose, manitol nhưng tạo axit cho môi trường chứa glucose, ngưng kết sữa, có tác dụng hòa tan trong môi trường huyết ngựa, khử nitrate thành nitrite, phát triển được ở môi trường chứa 0,001% lysozyme, 7% NaCl với pH = 5,7 và có phản ứng với lòng đỏ trứng gà. Các nghiên cứu về phân lập Bacillus thuringiensis Năm 1987, Travers và ctv đã phân lập Bt theo hướng chọn lọc acetate, xử lí nhiệt.

Sodium acetat ở nồng độ 0,25 M ức chế sự nảy mầm của vi khuẩn Bacillus thuringiensis và một số loài họ hàng của Bacillus thuringiensis đồng thời khi xử lí nhiệt 80oC trong vòng 15 phút loại bỏ vi khuẩn không sinh bào tử và bào tử nảy mầm. Theo Ferrira và ctv (2002) WHO sử dụng phương pháp sốc nhiệt để phân lập Bacillus thuringiensis. Mẫu đất được lắc trong dung dịch muối NaCl 0,85% suốt 2 phút, xử lí nhiệt 80oC trong 12 phút, làm lạnh 0oC trong 5 phút rồi phân lập trên môi trường LBA. Tuy nhiên vào năm 2008, Santana và ctv cho rằng sốc nhiệt không luôn cho phép cô lập Bt và nghiên cứu phương pháp nhiệt khô mẫu 5 giờ trước khi phân lập.

Kết quả của cho thấy chỉ số Bt cao hơn và Bacillus cereus được hạn chế. Ngoài ra, người ta còn phân lập Bacillus thuringiensis được dựa trên sự chọn lọc bằng kháng sinh polymyxin B sulfate và penicilin G đ ể loại bỏ các tế bào không kháng với kháng sinh. Tinh thể độc Vi khuẩn Bacillus thuringiensis có khả năng kiểm soát sâu hại là nhờ có tinh thể độc. Tinh thể độc hình thành cùng với quá trình hình thành bào tử, kích thước là 0,6 – 2µm, có nhiều hình dạng khác nhau như hình thoi, hình quả trám, hình tròn nhỏ, hình tháp.

Sự khác nhau về hình dạng khuẩn lạc quyết định đến tính chọn lọc, phổ diệt sâu hẹp của Bacillus thuringiensis. Tinh thể độc là một protein kết tinh cùng với một lượng nhỏ hydrat carbon bị pha tạp. Protein kết tinh gồm 1180 gốc axit amin với axit glutamic và axit asparaginic chiếm trên 20% tổng số axit amin trong tổng số axit amin. Tinh thể độc rất bền nhiệt.

Nếu ủ ở nhiệt độ 65oC trong một giờ. Tinh thể phân hủy và bị mất hoạt tính nếu đun 100oC trong vòng 30 – 0 giờ. 5 Tinh thể độc gồm 2 loại: cry và cyt với cấu trúc 3 chiều: cry1, cry2, cry3 và cyt2A. Có 6 xoắn amphipathic, một lõi helix, lõi trung tâm.

Miền II gồm 3 – sheets đối xứng ba lần, miền III: các C-terminal 2 không song song của -sheets. Tên gọi và ký hiệu các gene mã hóa Cry và Cyt Cry có nhiều loại như: cry I, cry II, cry III, cry IV (Shine và ctv, 1995) và mỗi loại đặc trưng cho hình thái tinh thể protein cũng như gây bệnh đặc trưng cho loại côn trùng khác nhau. Cụ thể là: Gen cry I: Tổng hợp các protein hình thoi gây bệnh cho côn trùng bộ cánh vảy Gen cry II: Tổng hợp tinh thể hình tháp gây bệnh cho côn trùng bộ cánh vảy Gen cry III: Tổng hợp tinh thể hình thoi chỉ gây bệnh cho côn trùng bộ cánh cứng. Gen cry IV: Tổng hợp cả tinh thể hình thoi và hình tháp, chỉ gây bệnh cho côn trùng bộ hai cánh.