Đặt vấn đề Họ lan (Orchidaceae) là họ thực vật đa dạng nhất Việt Nam, với tổng số 865 loài thuộc 154 chi, được phân bố rộng ở khắp các tỉnh của Việt Nam. Chi lan Kim Tuyến Anoectochilus ở Việt Nam hiện thống kê được 12 loài. Thông thường lan được sử dụng làm cảnh nhưng trong y học, lan Kim Tuyến được sử dụng làm thuốc trị lao phổi, ho do phế nhiệt, phong thấp, đau nhức khớp xương, chấn thương, viêm dạ dày mãn tính, viêm khí quản, viêm gan mãn tính, suy nhược thần kinh, giúp tăng cường sức khoẻ, làm khí huyết lưu thông, có tính kháng khuẩn, có khả năng chữa trị các bệnh về tim mạch, bồi bổ sức khỏe cho phụ nữ sau khi sinh, có khả năng tiêu diệt được các khối u… Lan kim tuyến thuộc một trong mười loại dược liệu quý nhất Trung Quốc và có giá trị kinh tế rất cao. Vì vậy lan Kim Tuyến đang bị thu hái nhiều đến mức cạn kiệt ngoài tự nhiên nhưng không chú ý tới bảo vệ và tái sinh cộng với việc khai thác rừng bừa bãi nên hiện nay lan Kim Tuyến được cấp báo thuộc nhóm IA của Nghị định 32/2006/CP, nghiêm cấm khai thác vì mục đích thương mại và thuộc nhóm thực vật rừng đang nguy cấp EN A1a,c,d, trong sách đỏ Việt Nam (Bộ Học và Công Nghệ, 2007) [2].
Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật việc ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống đã trở nên phổ biến. Nuôi cấy mô tế bào sẽ tạo ra hàng loạt cây giống sạch bệnh, chất lượng tốt, độ đồng đều cao, hệ số nhân lớn và giữ được đặc tính di truyền của cây mẹ. Góp phần bảo tồn các cây quý hiếm cũng như cung cấp đủ nguồn giống cây cho thị trường. Đây cũng chính là giải pháp để bảo tồn cũng như phát triển giống Lan kim tuyến quý hiếm này.
Hiện tại, Viện Nghiên cứu và phát triển Lâm nghiệp - Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên đã nghiên cứu thành công quy trình nhân giống Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume ) ở giai đoạn in vitro. Để 2 hoàn thiện được quy trình nhân giống cây lan Kim Tuyến thì vấn đề ra ngôi cây con giai đoạn sau nuôi cấy in vitro là rất quan trọng. Trên cơ sở đó tôi được tiến hành đề tài: ―Nghiên cứu quy trình ra ngôi sau in vitro cho cây Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume ) ở giai đoạn vƣờn ƣơm”. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình ra ngôi giai đoạn sau in vitro tạo cây lan Kim Tuyến hoàn chỉnh.
Mục tiêu nghiên cứu + Xác định được thời gian cảm ứng ánh sáng tự nhiên sau giai đoạn in vitro để khi ra ngôi cho tỷ lệ cây sống cao và sinh trưởng tốt. + Xác định giá thể thích hợp cho cây con sau giai đoạn in vitro cho tỉ lệ cây sống cao và sinh trưởng tốt. + Xác định chế độ dinh dưỡng khoáng thích hợp cho cây con sau in vitro. + Xác định loại thuốc trừ nấm thích hợp cho cây Lan kim tuyến giai đoạn sau in vitro.
+ Xác định chu kỳ bón phân thích hợp cho cây ở giai đoạn sau in vitro. Ý nghĩa nghiên cứu 1. Ý nghĩa trong học tập và nghiên cứu khoa học - Kết quả nghiên cứu của đề tài đưa ra sẽ giúp hoàn thiện được quy trình nhân giống Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. - Giúp sinh viên củng cố lại những kiến thức đã học , có điều kiện ứng dụng các kiến thức đã học vào làm quen với thực tiễn sản xuất.
Từ đó giúp sinh viên trau dồ i, tích lũy đươ ̣c kiế n thức thông qua thực tiễn. - Biết được phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý, phân tích số liệu, trình bày một bài báo cáo khoa học. Ý nghĩa thực tiễn Đề suất được quy trình ra ngôi cây lan Kim Tuyến sau in vitro, để cung cấp, bảo tồn và phát triển loài lan kim Tuyến quý hiếm. 4 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.
Cơ sở khoa học về quy trình ra ngôi cây Lan Kim Tuyến giai đoạn sau in-vitro * Kỹ thuật cảm ứng và xử lý cây con in vitro Bình lan Kim Tuyến ra rễ đủ điều kiện để đưa xuống nhà lưới và cảm ứng ánh sáng từ 1 đến 2 tuần. Sau một tuần cảm ứng tiến hành mở hé nắp bình để cây lan Kim Tuyến thích nghi với độ ẩm không khí. Sau 2 – 3 ngày tiến hành mở hẳn nắp bình và cấy cây con ra bầu đất. * Thời điểm ra ngôi Tiến hành ra ngôi vào những ngày râm mát thời tiết đẹp.
Những ngày nắng gây gắt, nhưng ngày ưa ẩm ướt kéo dài, nhiều gió và lạnh không được ra ngôi. * Xử lý cây in vitro trƣớc khi ra ngôi Cây con sau khi lấy ra khỏi bình được rửa sạch môi trường, xếp gọn gàng trên rổ có lót báo ẩm để tránh cho cây bị gãy hỏng và mất nước. Gía thể sử dụng ra ngôi lan lan Kim Tuyến là thảm sơ dừa hoặc thảm rêu rừng, mùn cưa. Yêu cầu giá thể thông thoáng cung cấp đầy đủ nước cho cây, khả năng thoát nước tốt sạch nấm bệnh và vi khuẩn.
Kỹ thuật ra ngôi * Cấy cây: Trồng cây sao cho bộ rễ của cây được phủ kín trong giá thể nhưng vừa đủ ngập cổ rễ giúp cây sinh trưởng phát triển tốt. Nên trồng cây vào buổi 5 chiều để cây có thời gian phục hồi tốt sau 1 đêm, sau khi trồng tưới phun sương đẫm nước cho cây, làm vòm và phủ kín nilon thảm luống để tránh tình trạng cây con bị mất nước. * Chế độ chăm sóc. - Chăm sóc sau khi ra ngôi: + Cây lan Kim Tuyến mới ra ngôi cần được che phủ nilon và giữ độ ẩm đều ở 70% + Chế độ tưới nước là 1 ngày tưới 2 lần vào sáng và chiều, nếu thời tiết nắng nóng cần che phủ lưới đen để cản ánh sáng.
+ Phủ nilon liên tục trong hai tuần đầu sau khi ra ngôi. - Chăm sóc cây sau 2 tuần tuổi và cảm ứng cây con - Chế độ tưới nước: Tưới phun sương ngày 2 lần vào sáng sớm và chiều muộn giữ ẩm độ đều 70%. - Bắt đầu từ tuần thứ 3 mở phủ nilon từ 20 – 40% để cây quen với nhiệt độ và độ ẩm bên ngoài, mở phủ nilon vào thời điểm thời tiết mát không nắng gắt và ban đêm phủ nilon vào. - Khi cây đạt 4 tuần tuổi phun thêm phân bón lá với nồng độ nhẹ 20ml/1 bình161.
Mở phủ nilon từ 50- 70%,và tăng thêm thời gian mở nilon từ 4 – 5 giờ/ngày và ban đêm phủ nilon.Tưới nước bằng hệ thống phun sương lần/ngày đả bảo độ ẩm cho cây. - Khi cây đạt 5 tuần tuổi tiến hành mở phủ nilon từ 70 – 100%, tưới bằng hệ thống phun sương lần/ngày đảm bảo độ ẩm cho cây. - Tuần 6: Khi cây đã cảm ứng và thích nghi với điều kiện thời tiết bên ngoài tiến hành bỏ phủ nilon hoàn toàn và tưới bằng hệ thống phun mưa hoặc tưới bằng ozoa. Tiến hành phun phân bón lá với nồng độ 40ml/bình 161.
- Khi cây đạt 4- 5 cặp lá và đã bén rễ,cứng cây thì tùy thuộc vào điều kiện thực tế và có chế độ chăm sóc bổ sung. 6 * Một số loại bệnh và sâu thƣờng gặp sau khi ra ngôi lan Kim Tuyến - Về sâu bệnh. + Sâu xám hại cây: phun thuốc phòng trừ sâu xám hại cây dùng thuốc đơn TP – pentin 18EC, basudin 50EC, sheepain 36EC,… các loại thuốc này hòa với nước để phun. + Dế mèn ăn cây con: Giữ gìn vườn ươm sạch sẽ gọn gàng, thường xuyên vệ sinh.
Nếu có quá nhiều dế thì ta phun thuốc sâu xung quanh luống cây con. + Sâu róm ăn lá hoặc ngọn non: Giữ gìn vườn sạch sẽ, nhặt hết các loại cỏ cho sạch sẽ. Nếu phát hiện sớm có thể bắt bằng tay hoặc phun thuốc sâu. - Về bệnh hại: + Bệnh thối cây: sử dụng Ridominl liều lượng 200g/100l nước hoặc daconil với liều lượng 250g/100l nước, định kỳ 7 ngày phun 1 lần.
Thành tựu nuôi cấy mô trên thế giới và Việt Nam 2. Trên thế giới Nuôi cấy mô trên thế giới đã có từ rất lâu đời và đến nay đã có các thành tựu rất đáng kể như: Melchers (1978) lai tạo thành công cây lai giữa Khoai tây và Cà chua bằng dung hợp tế bào chất. Vasil và cộng sự (1990), tái sinh cây lúa mì hoàn chỉnh từ nuôi cấy tế bào trần. Vasil và cộng sự (1991), báo cáo về tạo cây lúa mì chuyển gen bằng súng bắn gen vào các phôi non; hay như năm 1994, cây cà chua Favr-savr chuyển gen được chấp nhận cho buôn bán ở Hoa Kỳ.
Lazarus Agus Sukamto và cs (2011) [19], đã so sánh sự khác nhau gữa Anoectochilus formosanus và Anoectochilusformosanus khi sử dụngThidiazuron (TDZ) trong nuôi cấy in-vitro, họ đã tìm ra môi trường nuôi cấy A. setaceus tốt 7 nhất với TDZ là 0,1 mg/l, A. formosanus với TDZ là 0,5 mg/l. Số lá cao nhất của A.setacesu với TDZ 0,001 mg/l, còn A.
formosanus với hàm lượng TDZ là 0,005 mg/l. Số chồi được tạo ra trên TDZ đối với loài A. setacesu là 0,001mg/l còn với A. formosanus là 0,05 mg/l.
Số rễ cao nhất của A. setaceus trên TDZ là 0,001 mg/l trong khi của A. formosanus là 0,005 mg/l. Kiet Van Nguyen (2004) [18], cũng đã đưa ra quy trình nhân giống in- vitrothành công cho loài lan kim tuyến – Anoectochilus formosanus với vật liệu ban đầu là từ chồi đỉnh tại Đại Học chungbuk, Hàn Quốc.
Môi trường tạo vật liệu ban đầu là H3 (Hyponex: 6,5N-4,5P-19K1g/l + 20N-20P-20K1g/l + peptone 2g/l). Môi trường nhân nhanh là: H3 + BAP 1mg/l (hoặc 1-2mg/l TDZ) + than hoạt tính 1%. Ở Việt Nam Nuôi cấy mô và tế bào thực vật được phát triển ở Việt Nam ngay sau khi chiến tranh kết thúc (1975). Phòng nuôi cấy mô và tế bào thực vật đầu tiên được xây dựng tại viện sinh học, Viện khoa học Việt Nam do tiến sĩ Lê Thị Muội đứng đầu.
Bước đầu chỉ nghiên cứu sự phát triển của túi phấn, mô sẹo và protoplast, nhưng sự thành công thì chỉ có ở cây là lúa và khoai tây. Tiến đến những năm 80 trở lại đây thì nuôi cấy mô phát triển khá mạnh mẽ và kết quả khích lệ đã đạt được ở các giống: chuối, dứa, mía, hồng, cúc, phong lan,…(Nguyễn Đức Thành, 2000) [11]. Như kỹ thuật tạo cây lan Cymbidium giống sạch bệnh bằng xử lý nhiệt và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng của Nguyễn Văn Uyển và cs (1984) [14].