Nghiên Cứu Quy Trình Ra Ngôi Sau In Vitro Cho Cây Lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume)

Nghiên cứu quy trình ra ngôi sau in vitro cho cây lan kim tuyến Anoectochilus staceus Blume, góp phần bảo tồn và phát triển loài quý hiếm.

• Tác giả: Mai Thị Ngọc Châm
• Người hướng dẫn: PGS. Trần Thị Thu Hà
• Trường học: Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Nông lâm kết hợp
• Đề tài: Nghiên Cứu Quy Trình Ra Ngôi Sau In Vitro Cho Cây Lan Kim Tuyến
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục đích nghiên cứu
• 1.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.3. Ý nghĩa nghiên cứu
• 1.3.1. Ý nghĩa trong học tập và nghiên cứu khoa học
• 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Cơ sở khoa học về quy trình ra ngôi cây Lan Kim Tuyến giai đoạn sau in-vitro
• 2.2. Thành tựu nuôi cấy mô trên thế giới và Việt Nam
• 2.2.1. Trên thế giới
• 2.2.2. Ở Việt Nam
• 2.3. Giới thiệu chung về hoa lan
• 2.3.1. Hình thái
• 2.3.1.1. Thân giả
• 2.3.1.2. Lá
• 2.3.1.3. Cấu tạo hoa
• 3. PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu
• 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.1.2. Phạm vi nghiên cứu
• 3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.3. Nội dung nghiên cứu
• 3.4. Phương pháp nghiên cứu
• 3.4.1. Điều kiện thí nghiệm
• 3.4.2. Tiến hành thí nghiệm
• 3.4.3. Chỉ tiêu theo dõi và phương pháp thu thập
• 3.4.4. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian cảm ứng ngoài ánh sáng tự nhiên của cây con trước khi ra ngôi
• 4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến sự phát triển của cây con giai đoạn sau in vitro
• 4.3. Nghiên cứu tác dụng của một số thuốc nấm đến cây con giai đoạn sau in vitro sau 20 ngày
• 4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của dinh dưỡng tới sự phát triển của cây con giai đoạn sau in vitro sau 20 ngày
• 4.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của chu kỳ bón phân đến sự sinh trưởng, phát triển của cây con giai đoạn sau in vitro sau 30 ngày
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC 1

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Quy Trình Ra Ngôi Lan Kim Tuyến In Vitro

Lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) là loài dược liệu quý hiếm, có giá trị kinh tế cao. Tuy nhiên, do khai thác quá mức và mất môi trường sống, loài lan này đang bị đe dọa. Nhân giống in vitro là giải pháp hiệu quả để bảo tồn và phát triển lan Kim Tuyến. Nghiên cứu này tập trung vào quy trình ra ngôi sau in vitro, một giai đoạn quan trọng để tạo ra cây lan hoàn chỉnh. Mục tiêu là tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây con, từ đó hoàn thiện quy trình nhân giống và góp phần bảo tồn loài lan quý này. Theo nghiên cứu của Mai Thị Ngọc Châm (2015), việc hoàn thiện quy trình nhân giống lan Kim Tuyến bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật là rất cần thiết.

1.1. Giới Thiệu Về Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Kim Tuyến

Nhân giống in vitro là phương pháp nhân giống vô tính trong điều kiện vô trùng, tạo ra số lượng lớn cây con đồng nhất về mặt di truyền. Phương pháp này đặc biệt hữu ích cho các loài lan quý hiếm, khó nhân giống bằng phương pháp truyền thống. Nuôi cấy mô lan Kim Tuyến cho phép tạo ra cây giống sạch bệnh, chất lượng cao, đáp ứng nhu cầu thị trường và bảo tồn nguồn gen. Kiet Van Nguyen (2004) đã thành công trong việc nhân giống in vitro loài lan kim tuyến – Anoectochilus formosanus, mở ra hướng đi mới cho việc bảo tồn và phát triển loài lan này.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Giai Đoạn Ra Ngôi Trong Quy Trình

Giai đoạn ra ngôi là quá trình chuyển cây con từ môi trường in vitro sang điều kiện ngoại cảnh. Đây là giai đoạn quan trọng, quyết định sự thành công của quy trình nhân giống. Cây con cần thích nghi với sự thay đổi về độ ẩm, ánh sáng, dinh dưỡng và các yếu tố môi trường khác. Việc tối ưu hóa các yếu tố này sẽ giúp tăng tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây con, đảm bảo hiệu quả của quy trình nhân giống in vitro.

II. Thách Thức Trong Quy Trình Ra Ngôi Lan Kim Tuyến In Vitro

Quá trình ra ngôi cho lan Kim Tuyến sau in vitro đối mặt với nhiều thách thức. Cây con thường yếu ớt, dễ bị tổn thương và nhiễm bệnh. Sự thay đổi đột ngột về môi trường có thể gây sốc cho cây, dẫn đến tỷ lệ sống thấp. Việc lựa chọn giá thể, chế độ dinh dưỡng và biện pháp phòng trừ bệnh phù hợp là rất quan trọng. Nghiên cứu cần tập trung vào giải quyết những thách thức này để nâng cao hiệu quả của quy trình nhân giống.

2.1. Vấn Đề Thích Nghi Môi Trường Của Cây Con Sau In Vitro

Cây con in vitro được nuôi dưỡng trong điều kiện tối ưu, ít chịu tác động của môi trường bên ngoài. Khi chuyển ra môi trường vườn ươm, cây phải đối mặt với sự thay đổi lớn về độ ẩm, ánh sáng, nhiệt độ và dinh dưỡng. Quá trình thích nghi môi trường đòi hỏi cây phải có khả năng tự điều chỉnh và phát triển hệ rễ mới để hấp thụ dinh dưỡng. Việc tạo điều kiện thích nghi tốt sẽ giúp cây con vượt qua giai đoạn khó khăn này.

2.2. Nguy Cơ Nhiễm Bệnh Và Tác Động Của Thuốc Bảo Vệ Thực Vật

Cây con sau ra ngôi rất dễ bị nhiễm bệnh, đặc biệt là các bệnh do nấm gây ra. Việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật có thể giúp phòng trừ bệnh, nhưng cũng có thể gây hại cho cây nếu sử dụng không đúng cách. Nghiên cứu cần tìm ra các loại thuốc an toàn và hiệu quả, cũng như các biện pháp phòng bệnh sinh học để giảm thiểu tác động tiêu cực đến cây con.

III. Phương Pháp Cảm Ứng Ánh Sáng Tối Ưu Cho Lan Kim Tuyến Ra Ngôi

Thời gian cảm ứng ánh sáng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển của cây con sau ra ngôi. Việc điều chỉnh thời gian cảm ứng ánh sáng phù hợp giúp cây thích nghi dần với điều kiện ngoại cảnh, tăng cường khả năng quang hợp và phát triển hệ rễ. Nghiên cứu cần xác định thời gian cảm ứng ánh sáng tối ưu để đạt được tỷ lệ sống và sinh trưởng cao nhất cho cây con.

3.1. Ảnh Hưởng Của Thời Gian Cảm Ứng Ánh Sáng Đến Tỷ Lệ Sống

Thời gian cảm ứng ánh sáng quá ngắn có thể khiến cây con bị sốc do tiếp xúc đột ngột với ánh sáng mạnh. Ngược lại, thời gian cảm ứng ánh sáng quá dài có thể làm chậm quá trình phát triển của cây. Nghiên cứu của Mai Thị Ngọc Châm (2015) cho thấy, việc xác định thời gian cảm ứng ánh sáng phù hợp là yếu tố then chốt để nâng cao tỷ lệ sống của cây con sau ra ngôi.

3.2. Hướng Dẫn Chi Tiết Quy Trình Cảm Ứng Ánh Sáng Cho Cây Con

Quy trình cảm ứng ánh sáng nên bắt đầu bằng việc che chắn cây con bằng lưới đen hoặc vật liệu che phủ khác để giảm cường độ ánh sáng. Sau đó, từ từ tăng thời gian tiếp xúc với ánh sáng tự nhiên mỗi ngày. Cần theo dõi sát sao tình trạng của cây để điều chỉnh thời gian cảm ứng ánh sáng phù hợp. Theo kinh nghiệm, việc cảm ứng ánh sáng từ 1 đến 2 tuần trước khi ra ngôi sẽ giúp cây con thích nghi tốt hơn.

IV. Lựa Chọn Giá Thể Thích Hợp Cho Lan Kim Tuyến Sau In Vitro

Giá thể đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp nước, dinh dưỡng và hỗ trợ sự phát triển của hệ rễ. Việc lựa chọn giá thể phù hợp là yếu tố then chốt để đảm bảo sự sinh trưởng và phát triển của cây con sau ra ngôi. Giá thể cần đảm bảo độ thông thoáng, khả năng giữ ẩm tốt và không chứa mầm bệnh. Các loại giá thể thường được sử dụng bao gồm xơ dừa, rêu rừng, mùn cưa.

4.1. So Sánh Các Loại Giá Thể Phổ Biến Cho Lan Kim Tuyến

Xơ dừa có ưu điểm là giá rẻ, dễ kiếm và có khả năng giữ ẩm tốt. Rêu rừng có độ thông thoáng cao, cung cấp dinh dưỡng tự nhiên cho cây. Mùn cưa có khả năng thoát nước tốt, nhưng cần được xử lý để loại bỏ các chất độc hại. Việc so sánh các loại giá thể giúp lựa chọn loại phù hợp nhất với điều kiện và mục tiêu sản xuất.

4.2. Bí Quyết Chuẩn Bị Giá Thể Để Tối Ưu Hóa Sinh Trưởng Cây Con

Giá thể cần được xử lý để loại bỏ mầm bệnh và các chất độc hại. Xơ dừa cần được ngâm nước để giảm độ mặn. Rêu rừng cần được rửa sạch và khử trùng. Mùn cưa cần được ủ hoai mục trước khi sử dụng. Việc chuẩn bị giá thể kỹ lưỡng sẽ giúp tạo môi trường tốt nhất cho sự phát triển của cây con.

V. Dinh Dưỡng Và Phòng Bệnh Cho Lan Kim Tuyến Sau Ra Ngôi

Chế độ dinh dưỡng hợp lý và biện pháp phòng bệnh hiệu quả là yếu tố quan trọng để đảm bảo sự sinh trưởng và phát triển khỏe mạnh của cây con sau ra ngôi. Cần cung cấp đầy đủ các nguyên tố dinh dưỡng cần thiết cho cây, đồng thời phòng ngừa các bệnh thường gặp như thối rễ, đốm lá. Việc sử dụng phân bón lá và thuốc trừ nấm cần tuân thủ đúng liều lượng và hướng dẫn.

5.1. Xác Định Chế Độ Dinh Dưỡng Khoáng Thích Hợp Cho Cây Con

Cây con cần được cung cấp đầy đủ các nguyên tố đa lượng (N, P, K) và vi lượng (Fe, Mn, Zn, Cu, Mo, B). Tỷ lệ các nguyên tố dinh dưỡng cần được điều chỉnh phù hợp với giai đoạn phát triển của cây. Việc sử dụng phân bón lá với nồng độ thích hợp sẽ giúp cây hấp thụ dinh dưỡng nhanh chóng và hiệu quả.

5.2. Các Loại Thuốc Trừ Nấm An Toàn Và Hiệu Quả Cho Lan Kim Tuyến

Các loại thuốc trừ nấm gốc đồng (Copper Hydroxide, Copper Oxychloride) có hiệu quả trong việc phòng trừ các bệnh do nấm gây ra. Tuy nhiên, cần sử dụng đúng liều lượng và tuân thủ thời gian cách ly để đảm bảo an toàn cho cây và người sử dụng. Các biện pháp phòng bệnh sinh học như sử dụng chế phẩm Bacillus subtilis cũng có thể giúp kiểm soát bệnh hiệu quả.

VI. Kết Luận Và Hướng Phát Triển Nghiên Cứu Lan Kim Tuyến In Vitro

Nghiên cứu về quy trình ra ngôi sau in vitro cho lan Kim Tuyến đã đạt được những kết quả quan trọng, góp phần hoàn thiện quy trình nhân giống và bảo tồn loài lan quý này. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều vấn đề cần được nghiên cứu sâu hơn, như tối ưu hóa môi trường nuôi cấy mô, phát triển các biện pháp phòng bệnh sinh học và đánh giá hiệu quả kinh tế của quy trình nhân giống.

6.1. Tổng Kết Các Kết Quả Nghiên Cứu Về Quy Trình Ra Ngôi

Nghiên cứu đã xác định được thời gian cảm ứng ánh sáng tối ưu, loại giá thể phù hợp và chế độ dinh dưỡng hợp lý cho cây con sau ra ngôi. Các kết quả này có thể được áp dụng vào thực tế sản xuất để nâng cao hiệu quả của quy trình nhân giống.

6.2. Đề Xuất Các Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về Lan Kim Tuyến

Các hướng nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc cải thiện chất lượng cây giống in vitro, phát triển các biện pháp phòng bệnh sinh học và đánh giá khả năng thích nghi môi trường của cây con sau ra ngôi. Ngoài ra, cần nghiên cứu về giá trị dược liệu và ứng dụng của lan Kim Tuyến để nâng cao giá trị kinh tế của loài lan này.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) là loài thực vật thuộc họ Phong lan (Orchidaceae) — họ thực vật có mức độ đa dạng cao tại Việt Nam với 865 loài thuộc 154 chi, riêng chi Anoectochilus đã ghi nhận 12 loài. Trong y học cổ truyền và dược liệu học, lan Kim Tuyến chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học quý như axit 4-hydroxycinnamic, β-sitosterol, β-D-glucopyranoside, butanoic acid 3-glucosides, kinsenoside cùng các nguyên tố vi lượng (Fe, Co, Cu, Mn, Zn, Cr) và chuỗi polysaccharide giúp hỗ trợ điều trị các bệnh về gan, phổi, huyết áp, tim mạch, chống viêm, kháng khối u và tăng cường miễn dịch. Do giá trị kinh tế cao (200–300 USD/kg cây tươi, 3.200 USD/kg cây khô trên thị trường quốc tế và 2,5–3 triệu đồng/kg thương phẩm trong nước), loài thực vật này bị khai thác quá mức ngoài tự nhiên dẫn đến nguy cơ tuyệt chủng. Lan Kim Tuyến đã được xếp vào nhóm IA theo Nghị định số 32/2006/NĐ-CP (nghiêm cấm khai thác vì mục đích thương mại) và xếp ở phân hạng nguy cấp EN A1a,c,d trong Sách đỏ Việt Nam (Bộ Khoa học và Công nghệ, 2007).

Phương pháp nhân giống vi nhân giống (in vitro) đã được Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp thuộc Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên làm chủ, tạo ra nguồn cây con sạch bệnh và đồng đều về mặt di truyền. Tuy nhiên, giai đoạn chuyển cây con từ môi trường nuôi cấy nhân tạo sang vườn ươm (ra ngôi) gặp trở ngại lớn do cây in vitro thích nghi trong điều kiện ẩm độ cao, lớp sáp bảo vệ mỏng, khí khổng đóng mở kém, lục lạp và hệ enzyme quang hợp chưa hoàn thiện, liên kết mạch dẫn giữa rễ phụ và thân còn yếu. Nếu không có quy trình kỹ thuật tôi luyện và chăm sóc phù hợp, tỷ lệ cây chết sau khi ra ngôi sẽ rất cao. Khóa luận tập trung giải quyết vấn đề kỹ thuật này nhằm hoàn thiện chuỗi nhân giống loài lan Kim Tuyến tại vườn ươm.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể được xác định gồm 5 nội dung:

1. Xác định thời gian cảm ứng ngoài ánh sáng tự nhiên thích hợp cho cây con trước khi ra ngôi nhằm đạt tỷ lệ sống và khả năng sinh trưởng cao.
2. Xác định loại giá thể tối ưu cho cây con ở giai đoạn vườn ươm sau nuôi cấy in vitro.
3. Xác định loại thuốc trừ nấm phù hợp nhằm hạn chế nấm bệnh hại cây con sau khi đưa ra môi trường tự nhiên.
4. Xác định chế độ dinh dưỡng khoáng thích hợp cung cấp cho cây con giai đoạn sau in vitro.
5. Xác định chu kỳ bón phân thích hợp cho cây con trong điều kiện vườn ươm.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Cây lan Kim Tuyến con sinh ra từ giai đoạn nhân giống in vitro tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp, đạt tiêu chuẩn chiều cao 4–6 cm, có từ 5–6 lá và 4–6 rễ.
• Phạm vi không gian: Nghiên cứu được thực hiện tại hệ thống nhà lưới của Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp – Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Thái Nguyên (địa bàn xã Quyết Thắng, thành phố Thái Nguyên).
• Phạm vi thời gian: Đề tài tiến hành thu thập số liệu và theo dõi thực nghiệm từ tháng 12/2014 đến tháng 05/2015.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận dựa trên cơ sở khoa học về sinh lý cây con giai đoạn sau in vitro (Nguyễn Văn Uyển, 1993) và nguyên lý trồng cây không dùng đất (soilless culture) bao gồm kỹ thuật giá thể. Về mặt sinh lý, cây nuôi cấy mô chuyển đổi từ trạng thái sống dị dưỡng/bán tự dưỡng sang trạng thái tự dưỡng hoàn toàn phải đối mặt với nguy cơ mất nước nhanh do lớp sáp mỏng, cơ chế khí khổng chưa hoàn chỉnh, hàm lượng chlorophyll thấp, hoạt tính enzyme RuBisCO yếu và cần thời gian từ 7 đến 14 ngày mới đạt cân bằng trao đổi khí và cố định CO2. Rễ in vitro thường hình thành từ mô sẹo (callus) nên liên kết mô dẫn sơ cấp kém bền vững, đòi hỏi môi trường giá thể vườn ươm phải có độ thoáng khí cao, giữ ẩm tốt nhưng không đọng nước gây thối cổ rễ.

Tác giả tổng quan và kế thừa các nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến nhân giống chi Anoectochilus:

• Nghiên cứu của Lazarus Agus Sukamto và cs (2011) về vai trò của Thidiazuron (TDZ) trên Anoectochilus setaceus và A. formosanus.
• Nghiên cứu của Kiet Van Nguyen (2004), Shu-Fen Cheng và Chang (2007, 2009) về nhân giống và sử dụng nấm cộng sinh rễ (Ceratobasidium, Rhizoctonia solani).
• Các công trình nhân giống lan Kim Tuyến tại Việt Nam của Phùng Văn Phê và cs (2008, 2010), Nguyễn Quang Thạch và cs (2012).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được thiết kế theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với 3 lần lặp lại, mỗi công thức theo dõi 50 cây/lần lặp (tổng số 150 cây cho mỗi công thức thí nghiệm):

• Điều kiện nhà lưới: Mái che bằng tấm lợp nhựa tổng hợp kết hợp lưới đen che sáng 50% ánh sáng tự nhiên, nhiệt độ dao động trong khoảng 28–33°C, ẩm độ không khí duy trì quanh mức 70% bằng hệ thống phun sương.
• Thí nghiệm 1: Cảm ứng ánh sáng tự nhiên với 4 công thức thời gian: 0 ngày (đối chứng), 5 ngày, 10 ngày, 15 ngày trong nhà lưới trước khi tách bình trồng vào khay cát; theo dõi sau 30 ngày.
• Thí nghiệm 2: Nghiên cứu 3 loại giá thể: CT1 (cát - đối chứng), CT2 (xơ dừa xử lý ngâm nước vôi loãng 6–8 ngày, 2 ngày thay nước một lần, xả sạch và phơi khô), CT3 (đất mục + phân ủ hoai + mùn cưa ủ hoai theo tỷ lệ thể tích 3:1:1); khay nhựa kích thước 200 x 220 cm, lớp giá thể dày 7–9 cm; theo dõi sau 20 ngày.
• Thí nghiệm 3: Nghiên cứu 3 công thức phòng trừ nấm: CT1 (đối chứng không phun thuốc), CT2 (phun Anvil 0,5 ml/lít nước), CT3 (phun Ridomil Gold liều lượng 50 g pha trong 8 lít nước cho 1 m² giá thể/ngày; kết hợp ngâm rễ cây con 5 phút trong Ridomil Gold nồng độ 3 g/lít trước khi trồng); theo dõi sau 20 ngày.
• Thí nghiệm 4: Nghiên cứu 4 công thức dinh dưỡng khoáng: CT1 (đối chứng không phun), CT2 (phân bón Đầu Trâu NPK tỷ lệ 1:1:2 gồm 12 mg/l NH4NO3 + 33 mg/l NH4H2PO4 + 87 mg/l KNO3 + 20 mg/l CaCl2 + 35 mg/l MgSO4), CT3 (phân bón lá A2), CT4 (dung dịch khoáng MS/2); liều lượng phun 1 lít/1 m² giá thể/ngày dưới dạng phun sương sau khi cây hồi xanh 14 ngày; theo dõi sau 20 ngày.
• Thí nghiệm 5: Nghiên cứu 4 chu kỳ bón phân Đầu Trâu NPK: CT1 (3–5 ngày/lần), CT2 (7–10 ngày/lần), CT3 (10–15 ngày/lần), CT4 (15–30 ngày/lần); liều lượng 1 lít/1 m² giá thể/ngày; theo dõi sau 30 ngày.

Chỉ tiêu theo dõi bao gồm: Tỷ lệ sống (%), mức tăng chiều cao thân (cm), mức tăng số lá mới (chiếc), mức tăng số rễ mới (chiếc). Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 theo phương pháp thống kê toán học ứng dụng trong lâm nghiệp.

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Mở đầu

Tác giả trình bày tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ giá trị y dược và thương mại của cây lan Kim Tuyến, đối chiếu với tình trạng khai thác cạn kiệt nguồn gen tự nhiên dẫn đến tình trạng nguy cấp được quy định trong Nghị định 32/2006/NĐ-CP và Sách đỏ Việt Nam năm 2007. Khóa luận xác định rõ việc Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp đã nhân giống thành công giai đoạn in vitro, do đó việc nghiên cứu quy trình ra ngôi giai đoạn sau in vitro tại vườn ươm là khâu then chốt mang tính thực tiễn để thương mại hóa và bảo tồn giống lan này. Phần mở đầu cũng xác định rõ 5 mục tiêu nghiên cứu và ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp có hệ thống các kiến thức về:

• Lịch sử nghiên cứu và phát triển kỹ thuật nhân giống hoa lan, phân loại thực vật học của loài lan Kim Tuyến (Plantae, Magnoliophyta, Liliopsida, Asparagales, Orchidaceae, Anoectochilus, Anoectochilus setaceus Blume).
• Đặc điểm hình thái học: thân thảo mọng nước, thân rễ bò ngang sát mặt đất dài trung bình 7,87 cm (biến động 5–12 cm), đường kính thân rễ trung bình 3,17 mm; rễ mọc từ mấu thân rễ, dài trung bình 3,82 cm, số rễ 3–10 rễ/cây (trung bình 5,4 rễ); phiến lá hình trứng dài 3–4 cm, rộng 2–3 cm, mặt trên màu nâu đỏ phủ lông nhung với 5 gân gốc màu hồng nổi rõ; cụm hoa dài 10–15 cm mang 4–10 hoa màu trắng.
• Giá trị dược liệu, thành phần hóa học và giá trị thương phẩm của loài.
• Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô lan Kim Tuyến trên thế giới và ở Việt Nam.
• Cơ sở khoa học về đặc điểm giải phẫu, sinh lý của cây in vitro khi chuyển ra vườn ươm và các phương pháp trồng cây trên giá thể không dùng đất (lịch sử từ Gericke năm 1930 đến các dạng giá thể vô cơ, hữu cơ).
• Tổng quan điều kiện tự nhiên tại khu vực nghiên cứu (xã Quyết Thắng, TP. Thái Nguyên): nhiệt độ trung bình 22–23°C, lượng mưa trung bình 1.500–2.000 mm/năm (mùa mưa từ tháng 4 đến tháng 10 chiếm 85% lượng mưa cả năm), đất feralit phát triển trên đá sa thạch có độ pH chua (tầng 1–10 cm có pH thấp, hàm lượng mùn 1,7%, nghèo N và P2O5).

Phần 3: Đối tượng, nội dung, phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết tiêu chuẩn vật liệu nghiên cứu (cây mầm in vitro khỏe mạnh, đồng đều), địa điểm, thời gian thực hiện (tháng 12/2014 – 05/2015). Mô tả cụ thể quy trình kỹ thuật chuẩn bị giá thể (phương pháp xử lý xơ dừa bằng nước vôi loại bỏ tanin), chế độ che phủ nilon điều tiết độ ẩm (tuần 1–2 phủ kín 100%, tuần 3 mở 20–40%, tuần 4 mở 50–70%, tuần 5 mở 70–100%, tuần 6 bỏ phủ hoàn toàn). Thiết kế chi tiết 5 công thức thí nghiệm độc lập và cách thức thu thập số liệu tỷ lệ sống, đo đếm các chỉ tiêu sinh trưởng định kỳ bằng thước đo và đếm trực quan.

Phần 4: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Nội dung chương trình bày toàn bộ số liệu thu thập được qua 5 bảng số liệu và 5 biểu đồ tương ứng:

• Đánh giá thời gian cảm ứng ánh sáng tự nhiên trước khi ra ngôi (thí nghiệm 1): Cây con không qua cảm ứng ánh sáng (CT1) chỉ đạt tỷ lệ sống 66%, trong khi cảm ứng 10 ngày (CT3) đạt tỷ lệ sống cao nhất là 91%, tăng trưởng chiều cao đạt 1,30 cm, tăng 0,9 lá và 0,89 rễ sau 30 ngày.
• Đánh giá ảnh hưởng của các loại giá thể (thí nghiệm 2): Giá thể xơ dừa (CT2) cho tỷ lệ sống đạt 88%, vượt trội so với hỗn hợp đất + phân ủ hoai + mùn cưa (79%) và giá thể cát (72%). Cây trồng trên xơ dừa có phiến lá to, dày, màu xanh đậm, thân mập, tăng 1,50 cm chiều cao, 0,93 lá và 0,15 rễ sau 20 ngày.
• Đánh giá hiệu lực của thuốc trừ nấm (thí nghiệm 3): Công thức xử lý và phun định kỳ thuốc trừ nấm Ridomil Gold (CT3) đạt tỷ lệ sống 88%, tăng chiều cao 1,64 cm, tăng 0,92 lá và 0,43 rễ sau 20 ngày, vượt trội so với thuốc Anvil (tỷ lệ sống 84%) và đối chứng không phun thuốc (tỷ lệ sống 77%).
• Đánh giá ảnh hưởng của chế độ dinh dưỡng khoáng (thí nghiệm 4): Bổ sung phân bón Đầu Trâu NPK tỷ lệ 1:1:2 (CT2) giúp cây đạt tỷ lệ sống 89%, mức tăng số lá đạt 1,16 chiếc/cây và tăng số rễ đạt 0,60 chiếc/cây, vượt trội so với phân bón lá (77%), môi trường MS/2 (77%) và đối chứng không bón phân (78%).
• Đánh giá ảnh hưởng của chu kỳ bón phân (thí nghiệm 5): Chu kỳ bón 7 ngày/lần (CT2) đem lại tỷ lệ sống cao nhất (89%), mức tăng chiều cao đạt 1,74 cm, tăng 0,98 lá và 0,63 rễ sau 30 ngày. Bón phân với chu kỳ quá dày (3 ngày/lần) làm tỷ lệ sống giảm mạnh xuống 65% do cây bị thừa dinh dưỡng, úng thối bộ rễ và thân.

Phần 5: Kết luận và đề nghị

Đưa ra kết luận tổng hợp về bộ thông số kỹ thuật tối ưu cho quy trình ra ngôi lan Kim Tuyến tại nhà lưới và đề xuất áp dụng vào sản xuất thực tiễn cũng như định hướng nghiên cứu tiếp theo.

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã định lượng cụ thể các chỉ tiêu sinh trưởng và tỷ lệ sống của cây lan Kim Tuyến qua từng thí nghiệm thực nghiệm, được tổng hợp trong các bảng số liệu sau:

Bảng 1: Ảnh hưởng của thời gian cảm ứng ngoài ánh sáng tự nhiên sau 30 ngày

STT	Công thức thí nghiệm	Tỷ lệ cây sống (%)	Tăng chiều cao cây (cm)	Tăng số lá (chiếc)	Tăng số rễ (chiếc)
1	CT1 (ĐC): Cảm ứng 0 ngày	66	1,28	0,70	0,77
2	CT2: Cảm ứng 5 ngày	73	1,25	0,80	0,90
3	CT3: Cảm ứng 10 ngày	91	1,30	0,90	0,89
4	CT4: Cảm ứng 15 ngày	73	1,29	0,82	0,85

Bảng 2: Ảnh hưởng của thành phần giá thể sau 20 ngày

STT	Loại giá thể thí nghiệm	Tỷ lệ cây sống (%)	Chiều cao tăng thêm (cm)	Số lá tăng trung bình (chiếc)	Số rễ tăng trung bình (chiếc)
1	CT1 (ĐC): Cát	72	1,45	0,84	0,07
2	CT2: Xơ dừa	88	1,50	0,93	0,15
3	CT3: Đất mục + phân hoai + mùn cưa (3:1:1)	79	1,46	0,86	0,11

Bảng 3: Tác dụng của các loại thuốc trừ nấm sau 20 ngày

STT	Công thức thí nghiệm	Tỷ lệ cây sống (%)	Tăng chiều cao cây (cm)	Tăng số lá (chiếc)	Tăng số rễ (chiếc)
1	CT1 (ĐC): Không phun thuốc	77	1,43	0,74	0,33
2	CT2: Phun Anvil (0,5 ml/lít)	84	1,53	0,78	0,36
3	CT3: Phun Ridomil Gold (50 g/8 lít/m²)	88	1,64	0,92	0,43

Bảng 4: Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng khoáng sau 20 ngày

STT	Công thức dinh dưỡng	Tỷ lệ cây sống (%)	Tăng chiều cao cây (cm)	Tăng số lá (chiếc)	Tăng số rễ (chiếc)
1	CT1 (ĐC): Không phun dinh dưỡng	78	0,64	0,86	0,33
2	CT2: Phân Đầu Trâu NPK (1:1:2)	89	1,07	1,16	0,60
3	CT3: Phân bón lá A2	77	1,66	0,92	0,43
4	CT4: Dung dịch MS/2	77	1,53	0,73	0,25

Bảng 5: Ảnh hưởng của chu kỳ bón phân Đầu Trâu NPK sau 30 ngày

STT	Chu kỳ bón phân	Tỷ lệ cây sống (%)	Tăng chiều cao cây (cm)	Tăng số lá (chiếc)	Tăng số rễ (chiếc)
1	CT1: Bón 3 ngày/lần	65	1,48	0,63	0,41
2	CT2: Bón 7 ngày/lần	89	1,74	0,98	0,63
3	CT3: Bón 10 ngày/lần	77	1,60	0,80	0,51
4	CT4: Bón 15 ngày/lần	68	1,52	0,87	0,30

Quy trình kỹ thuật ra ngôi hoàn chỉnh do tác giả đề xuất:

• Cảm ứng cây con: Cây mầm in vitro đạt tiêu chuẩn xuất vườn được đưa ra nhà lưới cảm ứng ánh sáng tự nhiên có che lưới đen trong 10 ngày; sau 1 tuần mở hé nắp bình, trước khi cấy 2–3 ngày mở hẳn nắp bình để cây thích nghi dần với ẩm độ không khí.
• Xử lý cây và giá thể: Cây ra khỏi bình được rửa sạch môi trường thạch bám ở rễ, ngâm khử trùng bằng dung dịch Ridomil Gold (nồng độ 3 g/lít) trong 5 phút. Giá thể xơ dừa được xé nhỏ, phơi khô, ngâm nước vôi loãng trong 6–8 ngày (2 ngày thay nước vôi một lần), xả sạch bằng nước lã và phơi khô trước khi đưa vào khay ươm (chiều dày 7–9 cm).
• Kỹ thuật trồng và phòng bệnh: Cấy cây vào buổi chiều râm mát, vùi kín rễ ngang cổ rễ; phủ vòm nilon kín và giữ ẩm độ 70% trong 2 tuần đầu. Phun phòng trừ nấm bệnh bằng Ridomil Gold với liều lượng 50 g cho 8 lít nước/m² giá thể/ngày.
• Chế độ dinh dưỡng: Khi cây hồi xanh (sau 14 ngày), phun bổ sung phân bón Đầu Trâu NPK pha theo tỷ lệ 1:1:2 (12 mg/l NH4NO3 + 33 mg/l NH4H2PO4 + 87 mg/l KNO3 + 20 mg/l CaCl2 + 35 mg/l MgSO4) với liều lượng 1 lít/m² giá thể/ngày, chu kỳ định kỳ 7 ngày/lần. Mở dần nilon theo các tuần tuổi và tháo dỡ hoàn toàn sau tuần thứ 6.

Đóng góp của khóa luận:

• Bổ khuyết và hoàn thiện mắt xích kỹ thuật chuyển tiếp từ phòng nuôi cấy mô sang môi trường tự nhiên cho cây lan Kim Tuyến tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp, Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
• Xác lập được các thông số định lượng cụ thể về thời gian tôi luyện cây, loại giá thể rẻ tiền dễ kiếm (xơ dừa đã xử lý vôi), phác đồ phòng nấm và công thức dinh dưỡng khoáng cân đối, giúp nâng tỷ lệ sống của cây con sau khi ra ngôi đạt mức 88–91%.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận tồn tại một số hạn chế gắn liền với phạm vi nghiên cứu thực nghiệm:

• Thời gian theo dõi thực nghiệm chỉ giới hạn ở giai đoạn vườn ươm ban đầu (20 đến 30 ngày sau khi cấy ra giá thể), chưa đánh giá được toàn diện quá trình sinh trưởng ở các giai đoạn sau (khi cây đạt 4–5 cặp lá, phân nhánh và giai đoạn sinh khối phục vụ thu hoạch dược liệu).
• Thí nghiệm được thực hiện tại một địa điểm duy nhất (nhà lưới Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp tại Thái Nguyên) trong vụ xuân hè (tháng 12 đến tháng 5), chưa kiểm chứng tính thích nghi của quy trình qua các mùa khác nhau trong năm (đặc biệt là mùa khô lạnh hoặc mùa mưa kéo dài) hoặc tại các vùng sinh thái tự nhiên khác của lan Kim Tuyến.
• Tác giả chưa tiến hành phân tích định lượng hàm lượng hoạt chất sinh học (như kinsenoside hay flavonoid) của cây con ở các công thức dinh dưỡng khác nhau để đánh giá chất lượng dược liệu sau giai đoạn vườn ươm.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Tiếp tục theo dõi quá trình sinh trưởng của cây lan Kim Tuyến sau giai đoạn vườn ươm khi chuyển ra trồng bán tự nhiên dưới tán rừng tự nhiên hoặc vườn sản xuất thương phẩm.
• Nghiên cứu ứng dụng thêm các chế phẩm sinh học, nấm cộng sinh mycorrhiza bản địa hỗ trợ bộ rễ lan Kim Tuyến phát triển bền vững, giảm thiểu sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo thực nghiệm hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ kỹ thuật thuộc các chuyên ngành Nông lâm kết hợp, Lâm nghiệp, Công nghệ sinh học thực vật và Trồng trọt.

Các nội dung có giá trị tham khảo ứng dụng cao bao gồm:

• Quy trình xử lý tanin trong xơ dừa bằng phương pháp ngâm nước vôi luân phiên 6–8 ngày, tạo môi trường giá thể xốp, vô trùng và giữ ẩm tốt cho các loài địa lan và lan dược liệu quý.
• Kỹ thuật điều tiết ẩm độ và giải phóng vòm nilon theo từng tuần tuổi (từ tuần 1 đến tuần 6) kết hợp chế độ cảm ứng ánh sáng 10 ngày trước khi nhổ cây in vitro, giúp hạn chế tối đa sốc nhiệt độ và sốc thoát hơi nước.
• Dữ liệu chi tiết về liều lượng và chu kỳ phối trộn phân bón khoáng NPK tỷ lệ 1:1:2 (sử dụng muối khoáng NH4NO3, NH4H2PO4, KNO3, CaCl2, MgSO4) phục vụ nuôi dưỡng cây mô giai đoạn vườn ươm.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao cây lan Kim Tuyến con sau in vitro phải trải qua thời gian cảm ứng ngoài ánh sáng tự nhiên 10 ngày trước khi trồng? Cây con nuôi cấy in vitro phát triển trong điều kiện nhân tạo kín, độ ẩm bão hòa, cường độ chiếu sáng thấp dẫn đến lớp sáp bề mặt lá mỏng, khí khổng mở bất thường, hàm lượng diệp lục thấp và hô hấp tối cao. Thời gian cảm ứng 10 ngày trong nhà lưới (kết hợp mở hé nắp bình ở ngày thứ 7 và mở hẳn nắp bình trước khi trồng 2–3 ngày) giúp cây tôi luyện, kích thích hoàn thiện bộ máy quang hợp, thích nghi với độ ẩm và nhiệt độ không khí bên ngoài, nhờ đó tỷ lệ cây sống đạt tới 91% (cao hơn rõ rệt so với 66% của công thức không cảm ứng).

2. Phương pháp xử lý giá thể xơ dừa trước khi đem trồng cây con được tiến hành như thế nào? Xơ dừa được xé nhỏ, phơi thật khô, sau đó ngâm trong nước vôi loãng từ 6–8 ngày. Cứ 2 ngày tiến hành thay nước vôi một lần (thay từ 2–3 lần) để khử chát (tanin) và tiêu diệt mầm bệnh. Lần ngâm cuối cùng thực hiện bằng nước sạch, sau đó vớt xơ dừa ra phơi khô rồi mới đóng vào khay trồng với độ dày 7–9 cm.

3. Vì sao Ridomil Gold lại đạt hiệu quả phòng trừ bệnh tốt hơn Anvil trong giai đoạn cây con ra ngôi? Ridomil Gold được kết hợp cả hai bước xử lý: ngâm rễ cây con 5 phút với nồng độ 3 g/lít ngay sau khi rửa sạch thạch và phun định kỳ liều lượng 50 g/8 lít nước cho 1 m² giá thể/ngày. Biện pháp này bảo vệ toàn diện hệ thống rễ non và vết thương cơ giới khi cấy, giúp tỷ lệ sống đạt 88% và mức tăng số rễ đạt 0,43 chiếc/cây (so với 84% tỷ lệ sống và 0,36 chiếc rễ của thuốc Anvil).

4. Vì sao chu kỳ bón phân 3 ngày/lần lại làm giảm tỷ lệ sống của cây lan Kim Tuyến xuống còn 65%? Cây lan Kim Tuyến con ở giai đoạn vườn ươm có hệ thống rễ sơ cấp dẫn truyền kém và sinh trưởng chậm. Việc phun phân bón lá Đầu Trâu NPK với chu kỳ quá dày (3 ngày/lần) dẫn đến hiện tượng thừa dưỡng chất cục bộ trên giá thể, làm bộ rễ non và gốc thân bị xót, ngập úng dinh dưỡng, tạo điều kiện cho vi sinh vật hại xâm nhập gây thối thân rễ và làm chết cây hàng loạt.

5. Thành phần dung dịch dinh dưỡng NPK tối ưu cho cây lan Kim Tuyến gồm những hoạt chất khoáng nào? Công thức dinh dưỡng tối ưu có tỷ lệ N:P:K là 1:1:2, được pha chế với thành phần gồm: 12 mg/l NH4NO3, 33 mg/l NH4H2PO4, 87 mg/l KNO3, bổ sung thêm 20 mg/l CaCl2 và 35 mg/l MgSO4. Dung dịch được phun sương định kỳ 7 ngày/lần với liều lượng 1 lít cho 1 m² giá thể sau khi cây hồi xanh được 14 ngày.

Kết luận

Khóa luận của tác giả Mai Thị Ngọc Châm đã xây dựng thành công quy trình kỹ thuật ra ngôi sau in vitro cho cây lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) tại vườn ươm của Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp – Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. Kết quả thực nghiệm đã xác định các thông số kỹ thuật tối ưu bao gồm: thời gian cảm ứng ánh sáng 10 ngày trước khi ra ngôi, sử dụng giá thể xơ dừa xử lý nước vôi loãng, xử lý và phòng nấm bằng Ridomil Gold, kết hợp bổ sung dinh dưỡng phân Đầu Trâu NPK tỷ lệ 1:1:2 định kỳ 7 ngày/lần. Đề tài cung cấp cơ sở thực nghiệm vững chắc giúp nâng cao tỷ lệ sống của cây con đạt từ 88% đến 91%, đóng góp thiết thực vào công tác hoàn thiện quy trình nhân giống, bảo tồn nguồn gen và phát triển thương mại loài dược liệu quý này.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Họ lan (Orchidaceae) là họ thực vật đa dạng nhất Việt Nam, với tổng số 865 loài thuộc 154 chi, được phân bố rộng ở khắp các tỉnh của Việt Nam. Chi lan Kim Tuyến Anoectochilus ở Việt Nam hiện thống kê được 12 loài. Thông thường lan được sử dụng làm cảnh nhưng trong y học, lan Kim Tuyến được sử dụng làm thuốc trị lao phổi, ho do phế nhiệt, phong thấp, đau nhức khớp xương, chấn thương, viêm dạ dày mãn tính, viêm khí quản, viêm gan mãn tính, suy nhược thần kinh, giúp tăng cường sức khoẻ, làm khí huyết lưu thông, có tính kháng khuẩn, có khả năng chữa trị các bệnh về tim mạch, bồi bổ sức khỏe cho phụ nữ sau khi sinh, có khả năng tiêu diệt được các khối u… Lan kim tuyến thuộc một trong mười loại dược liệu quý nhất Trung Quốc và có giá trị kinh tế rất cao. Vì vậy lan Kim Tuyến đang bị thu hái nhiều đến mức cạn kiệt ngoài tự nhiên nhưng không chú ý tới bảo vệ và tái sinh cộng với việc khai thác rừng bừa bãi nên hiện nay lan Kim Tuyến được cấp báo thuộc nhóm IA của Nghị định 32/2006/CP, nghiêm cấm khai thác vì mục đích thương mại và thuộc nhóm thực vật rừng đang nguy cấp EN A1a,c,d, trong sách đỏ Việt Nam (Bộ Học và Công Nghệ, 2007) [2].

Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật việc ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống đã trở nên phổ biến. Nuôi cấy mô tế bào sẽ tạo ra hàng loạt cây giống sạch bệnh, chất lượng tốt, độ đồng đều cao, hệ số nhân lớn và giữ được đặc tính di truyền của cây mẹ. Góp phần bảo tồn các cây quý hiếm cũng như cung cấp đủ nguồn giống cây cho thị trường. Đây cũng chính là giải pháp để bảo tồn cũng như phát triển giống Lan kim tuyến quý hiếm này.

Hiện tại, Viện Nghiên cứu và phát triển Lâm nghiệp - Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên đã nghiên cứu thành công quy trình nhân giống Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume ) ở giai đoạn in vitro. Để 2 hoàn thiện được quy trình nhân giống cây lan Kim Tuyến thì vấn đề ra ngôi cây con giai đoạn sau nuôi cấy in vitro là rất quan trọng. Trên cơ sở đó tôi được tiến hành đề tài: ―Nghiên cứu quy trình ra ngôi sau in vitro cho cây Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume ) ở giai đoạn vƣờn ƣơm”. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình ra ngôi giai đoạn sau in vitro tạo cây lan Kim Tuyến hoàn chỉnh.

Mục tiêu nghiên cứu + Xác định được thời gian cảm ứng ánh sáng tự nhiên sau giai đoạn in vitro để khi ra ngôi cho tỷ lệ cây sống cao và sinh trưởng tốt. + Xác định giá thể thích hợp cho cây con sau giai đoạn in vitro cho tỉ lệ cây sống cao và sinh trưởng tốt. + Xác định chế độ dinh dưỡng khoáng thích hợp cho cây con sau in vitro. + Xác định loại thuốc trừ nấm thích hợp cho cây Lan kim tuyến giai đoạn sau in vitro.

+ Xác định chu kỳ bón phân thích hợp cho cây ở giai đoạn sau in vitro. Ý nghĩa nghiên cứu 1. Ý nghĩa trong học tập và nghiên cứu khoa học - Kết quả nghiên cứu của đề tài đưa ra sẽ giúp hoàn thiện được quy trình nhân giống Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. - Giúp sinh viên củng cố lại những kiến thức đã học , có điều kiện ứng dụng các kiến thức đã học vào làm quen với thực tiễn sản xuất.

Từ đó giúp sinh viên trau dồ i, tích lũy đươ ̣c kiế n thức thông qua thực tiễn. - Biết được phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý, phân tích số liệu, trình bày một bài báo cáo khoa học. Ý nghĩa thực tiễn Đề suất được quy trình ra ngôi cây lan Kim Tuyến sau in vitro, để cung cấp, bảo tồn và phát triển loài lan kim Tuyến quý hiếm. 4 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.

Cơ sở khoa học về quy trình ra ngôi cây Lan Kim Tuyến giai đoạn sau in-vitro * Kỹ thuật cảm ứng và xử lý cây con in vitro Bình lan Kim Tuyến ra rễ đủ điều kiện để đưa xuống nhà lưới và cảm ứng ánh sáng từ 1 đến 2 tuần. Sau một tuần cảm ứng tiến hành mở hé nắp bình để cây lan Kim Tuyến thích nghi với độ ẩm không khí. Sau 2 – 3 ngày tiến hành mở hẳn nắp bình và cấy cây con ra bầu đất. * Thời điểm ra ngôi Tiến hành ra ngôi vào những ngày râm mát thời tiết đẹp.

Những ngày nắng gây gắt, nhưng ngày ưa ẩm ướt kéo dài, nhiều gió và lạnh không được ra ngôi. * Xử lý cây in vitro trƣớc khi ra ngôi Cây con sau khi lấy ra khỏi bình được rửa sạch môi trường, xếp gọn gàng trên rổ có lót báo ẩm để tránh cho cây bị gãy hỏng và mất nước. Gía thể sử dụng ra ngôi lan lan Kim Tuyến là thảm sơ dừa hoặc thảm rêu rừng, mùn cưa. Yêu cầu giá thể thông thoáng cung cấp đầy đủ nước cho cây, khả năng thoát nước tốt sạch nấm bệnh và vi khuẩn.

Kỹ thuật ra ngôi * Cấy cây: Trồng cây sao cho bộ rễ của cây được phủ kín trong giá thể nhưng vừa đủ ngập cổ rễ giúp cây sinh trưởng phát triển tốt. Nên trồng cây vào buổi 5 chiều để cây có thời gian phục hồi tốt sau 1 đêm, sau khi trồng tưới phun sương đẫm nước cho cây, làm vòm và phủ kín nilon thảm luống để tránh tình trạng cây con bị mất nước. * Chế độ chăm sóc. - Chăm sóc sau khi ra ngôi: + Cây lan Kim Tuyến mới ra ngôi cần được che phủ nilon và giữ độ ẩm đều ở 70% + Chế độ tưới nước là 1 ngày tưới 2 lần vào sáng và chiều, nếu thời tiết nắng nóng cần che phủ lưới đen để cản ánh sáng.

+ Phủ nilon liên tục trong hai tuần đầu sau khi ra ngôi. - Chăm sóc cây sau 2 tuần tuổi và cảm ứng cây con - Chế độ tưới nước: Tưới phun sương ngày 2 lần vào sáng sớm và chiều muộn giữ ẩm độ đều 70%. - Bắt đầu từ tuần thứ 3 mở phủ nilon từ 20 – 40% để cây quen với nhiệt độ và độ ẩm bên ngoài, mở phủ nilon vào thời điểm thời tiết mát không nắng gắt và ban đêm phủ nilon vào. - Khi cây đạt 4 tuần tuổi phun thêm phân bón lá với nồng độ nhẹ 20ml/1 bình161.

Mở phủ nilon từ 50- 70%,và tăng thêm thời gian mở nilon từ 4 – 5 giờ/ngày và ban đêm phủ nilon.Tưới nước bằng hệ thống phun sương lần/ngày đả bảo độ ẩm cho cây. - Khi cây đạt 5 tuần tuổi tiến hành mở phủ nilon từ 70 – 100%, tưới bằng hệ thống phun sương lần/ngày đảm bảo độ ẩm cho cây. - Tuần 6: Khi cây đã cảm ứng và thích nghi với điều kiện thời tiết bên ngoài tiến hành bỏ phủ nilon hoàn toàn và tưới bằng hệ thống phun mưa hoặc tưới bằng ozoa. Tiến hành phun phân bón lá với nồng độ 40ml/bình 161.

- Khi cây đạt 4- 5 cặp lá và đã bén rễ,cứng cây thì tùy thuộc vào điều kiện thực tế và có chế độ chăm sóc bổ sung. 6 * Một số loại bệnh và sâu thƣờng gặp sau khi ra ngôi lan Kim Tuyến - Về sâu bệnh. + Sâu xám hại cây: phun thuốc phòng trừ sâu xám hại cây dùng thuốc đơn TP – pentin 18EC, basudin 50EC, sheepain 36EC,… các loại thuốc này hòa với nước để phun. + Dế mèn ăn cây con: Giữ gìn vườn ươm sạch sẽ gọn gàng, thường xuyên vệ sinh.

Nếu có quá nhiều dế thì ta phun thuốc sâu xung quanh luống cây con. + Sâu róm ăn lá hoặc ngọn non: Giữ gìn vườn sạch sẽ, nhặt hết các loại cỏ cho sạch sẽ. Nếu phát hiện sớm có thể bắt bằng tay hoặc phun thuốc sâu. - Về bệnh hại: + Bệnh thối cây: sử dụng Ridominl liều lượng 200g/100l nước hoặc daconil với liều lượng 250g/100l nước, định kỳ 7 ngày phun 1 lần.

Thành tựu nuôi cấy mô trên thế giới và Việt Nam 2. Trên thế giới Nuôi cấy mô trên thế giới đã có từ rất lâu đời và đến nay đã có các thành tựu rất đáng kể như: Melchers (1978) lai tạo thành công cây lai giữa Khoai tây và Cà chua bằng dung hợp tế bào chất. Vasil và cộng sự (1990), tái sinh cây lúa mì hoàn chỉnh từ nuôi cấy tế bào trần. Vasil và cộng sự (1991), báo cáo về tạo cây lúa mì chuyển gen bằng súng bắn gen vào các phôi non; hay như năm 1994, cây cà chua Favr-savr chuyển gen được chấp nhận cho buôn bán ở Hoa Kỳ.

Lazarus Agus Sukamto và cs (2011) [19], đã so sánh sự khác nhau gữa Anoectochilus formosanus và Anoectochilusformosanus khi sử dụngThidiazuron (TDZ) trong nuôi cấy in-vitro, họ đã tìm ra môi trường nuôi cấy A. setaceus tốt 7 nhất với TDZ là 0,1 mg/l, A. formosanus với TDZ là 0,5 mg/l. Số lá cao nhất của A.setacesu với TDZ 0,001 mg/l, còn A.

formosanus với hàm lượng TDZ là 0,005 mg/l. Số chồi được tạo ra trên TDZ đối với loài A. setacesu là 0,001mg/l còn với A. formosanus là 0,05 mg/l.

Số rễ cao nhất của A. setaceus trên TDZ là 0,001 mg/l trong khi của A. formosanus là 0,005 mg/l. Kiet Van Nguyen (2004) [18], cũng đã đưa ra quy trình nhân giống in- vitrothành công cho loài lan kim tuyến – Anoectochilus formosanus với vật liệu ban đầu là từ chồi đỉnh tại Đại Học chungbuk, Hàn Quốc.

Môi trường tạo vật liệu ban đầu là H3 (Hyponex: 6,5N-4,5P-19K1g/l + 20N-20P-20K1g/l + peptone 2g/l). Môi trường nhân nhanh là: H3 + BAP 1mg/l (hoặc 1-2mg/l TDZ) + than hoạt tính 1%. Ở Việt Nam Nuôi cấy mô và tế bào thực vật được phát triển ở Việt Nam ngay sau khi chiến tranh kết thúc (1975). Phòng nuôi cấy mô và tế bào thực vật đầu tiên được xây dựng tại viện sinh học, Viện khoa học Việt Nam do tiến sĩ Lê Thị Muội đứng đầu.

Bước đầu chỉ nghiên cứu sự phát triển của túi phấn, mô sẹo và protoplast, nhưng sự thành công thì chỉ có ở cây là lúa và khoai tây. Tiến đến những năm 80 trở lại đây thì nuôi cấy mô phát triển khá mạnh mẽ và kết quả khích lệ đã đạt được ở các giống: chuối, dứa, mía, hồng, cúc, phong lan,…(Nguyễn Đức Thành, 2000) [11]. Như kỹ thuật tạo cây lan Cymbidium giống sạch bệnh bằng xử lý nhiệt và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng của Nguyễn Văn Uyển và cs (1984) [14].