Luận án tiến sĩ phát triển sinh khối vi rút nhân đa diện npv trên tế bào sâu khoang phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học

Luận án tiến sĩ nghiên cứu phát triển sinh khối vi rút NPV trên tế bào sâu khoang, phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học hiệu quả.

• Tác giả: Lê Thanh Hải
• Người hướng dẫn: GS. Hoàng Đình Hòa
• Trường học: Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Phát Triển Sinh Khối Vi Rút NPV Trên Tế Bào Sâu Khoang Để Sản Xuất Thuốc Trừ Sâu Sinh Học
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• MỞ ĐẦU
• 1. Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu
• 2. Mục đích, yêu cầu cần đạt của đề tài
• 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
• 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 5. Những đóng góp mới của luận án
• 1. CHƯƠNG 1: CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1. Cơ sở khoa học của đề tài nghiên cứu
• 1. Tổng quan tài liệu
• 1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài
• 1. Nghiên cứu sâu khoang hại cây trồng
• 1. Nghiên cứu về NPV trên sâu hại
• 1. Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào côn trùng
• 1. Nghiên cứu điều kiện phát triển sinh khối của tế bào côn trùng
• 1. Nghiên cứu lây nhiễm NPV trên tế bào nhân nuôi
• 1. Nghiên cứu tinh sạch thể vùi và tạo dạng sử dụng chế phẩm NPV
• 1. Tình hình nghiên cứu ở trong nước
• 1. Nghiên cứu sâu khoang hại cây trồng
• 1. Nghiên cứu về NPV trên sâu hại
• 1. Nghiên cứu nuôi nhân tế bào côn trùng
• 1. Nghiên cứu phát triển sinh khối NPV
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2. Vật liệu và dụng cụ, thiết bị nghiên cứu
• 2. Vật liệu nghiên cứu
• 2. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
• 2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2. Địa điểm nghiên cứu
• 2. Thời gian nghiên cứu
• 2. Nội dung nghiên cứu
• 2. Phương pháp nghiên cứu
• 2. Điều tra, đánh giá và thu thập, tuyển chọn NPV sâu khoang
• 2. Nghiên cứu điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây nhiễm NPV trên tế bào nuôi nhân
• 2. Nghiên cứu điều kiện thích hợp để nhân sinh khối tế bào sâu khoang
• 2. Nghiên cứu lây nhiễm NPV sâu khoang trên tế bào nhân nuôi
• 2. Nghiên cứu tinh sạch thể vùi và tạo chế phẩm NPV dạng bột thấm nước
• 2. Nghiên cứu tinh sạch thể vùi NPV sau lây nhiễm trên tế bào
• 2. Nghiên cứu phát triển chế phẩm NPV dạng bột thấm nước
• 2. Đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm tạo được
• 2. Phương pháp tính toán, xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3. Điều tra, đánh giá và thu thập, tuyển chọn virus nhân đa diện (NPV) trên sâu khoang
• 3. Mức độ phổ biến và khả năng gây chết sâu khoang của virus nhân đa diện (NPV) ngoài đồng ruộng
• 3. Phân lập, tuyển chọn chủng NPV có hoạt lực cao
• 3. Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây nhiễm NPV trên tế bào nhân nuôi
• 3. Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào sâu khoang
• 3. Nghiên cứu điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang
• 3. Phát triển sinh khối tế bào sâu khoang qui mô phòng thí nghiệm
• 3. Nghiên cứu phát triển sinh khối NPV sâu khoang trên tế bào nuôi nhân
• 3. Xác định điều kiện thích hợp cho lây nhiễm virus nhân đa diện ( NPV)
• 3. Mức độ phát triển sinh khối tế bào và hình thành thể vùi trong quá trình lây nhiễm virus nhân đa diện (NPV)
• 3. Mức độ gây chết sâu khoang và hình thành thể vùi của NPV nhân trên tế bào và trên sâu
• 3. Hiệu lực trừ sâu khoang của chủng virus TL.1a nhân trên tế bào
• 3. Nghiên cứu tinh sạch thể vùi NPV sâu khoang và tạo chế phẩm dạng bột thấm nước
• 3. Tinh sạch thể vùi NPV sâu khoang
• 3. Thử nghiệm tạo chế phẩm NPV sâu khoang dạng bột thấm nước
• 3. Đánh giá hiệu lưc phòng trừ sâu khoang của chế phẩm tạo được
• 3. Đánh giá hiệu lưc phòng trừ sâu khoang trong điều kiện phòng thí nghiệm
• 3. Đánh giá hiệu lưc phòng trừ sâu khoang trên bắp cải ngoài nhà lưới
• 3. Đánh giá hiệu lưc phòng trừ sâu khoang ngoài đồng ruộng
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• 1. Đề nghị
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Giới thiệu về sinh khối vi rút NPV

Nghiên cứu về sinh khối vi rút NPV (Nuclear Polyhedrosis Virus) trên tế bào sâu khoang (Spodoptera litura) đã trở thành một lĩnh vực quan trọng trong việc phát triển thuốc trừ sâu sinh học. NPV là một loại vi rút thuộc họ Baculoviridae, có khả năng gây chết cao đối với sâu khoang mà không ảnh hưởng đến các loài không phải ký chủ. Việc phát triển sinh khối vi rút này không chỉ giúp giảm thiểu việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học mà còn bảo vệ môi trường và sức khỏe con người. Nghiên cứu này nhằm mục đích khai thác tiềm năng của NPV trong việc sản xuất chế phẩm sinh học, từ đó cung cấp giải pháp hiệu quả cho nông nghiệp bền vững.

II. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng NPV

Trên thế giới, nhiều quốc gia như Mỹ, Canada, và Trung Quốc đã ứng dụng thành công công nghệ nuôi nhân tế bào côn trùng để sản xuất chế phẩm NPV. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng NPV có thể tồn tại lâu dài trong môi trường tự nhiên và có khả năng gây chết cao đối với sâu khoang. Việc phát triển sinh khối vi rút NPV trên tế bào sâu khoang không chỉ giúp tăng hiệu quả sản xuất mà còn tạo ra các chế phẩm có chất lượng cao. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng việc lây nhiễm NPV trên tế bào sâu khoang có thể đạt hiệu quả cao, từ đó tạo ra nguồn vi rút dồi dào cho sản xuất chế phẩm sinh học.

III. Phương pháp nghiên cứu phát triển sinh khối NPV

Nghiên cứu này sử dụng phương pháp nuôi nhân tế bào sâu khoang để phát triển sinh khối vi rút NPV. Các điều kiện nuôi cấy như pH, nhiệt độ, và mật độ tế bào được tối ưu hóa để đạt được hiệu quả lây nhiễm cao nhất. Việc xác định các yếu tố này là rất quan trọng để đảm bảo rằng sinh khối vi rút có thể được sản xuất với quy mô lớn và hiệu quả. Kết quả từ các thí nghiệm cho thấy rằng việc điều chỉnh các điều kiện nuôi cấy có thể làm tăng đáng kể số lượng thể vùi NPV, từ đó nâng cao hiệu quả của chế phẩm sinh học trong việc phòng trừ sâu khoang.

IV. Đánh giá hiệu quả của chế phẩm NPV

Kết quả nghiên cứu cho thấy chế phẩm NPV dạng bột thấm nước có hiệu quả cao trong việc phòng trừ sâu khoang. Các thử nghiệm thực địa đã chỉ ra rằng chế phẩm này có thể giảm thiểu đáng kể mật độ sâu khoang trên các loại cây trồng như bắp cải và đậu tương. Việc sử dụng chế phẩm sinh học này không chỉ giúp bảo vệ cây trồng mà còn góp phần bảo vệ môi trường và sức khỏe con người. Nghiên cứu này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các chế phẩm sinh học an toàn và hiệu quả cho nông nghiệp bền vững.

V. Kết luận và triển vọng

Nghiên cứu phát triển sinh khối vi rút NPV trên tế bào sâu khoang đã chứng minh được tiềm năng ứng dụng trong sản xuất thuốc trừ sâu sinh học. Kết quả đạt được không chỉ có giá trị khoa học mà còn có ý nghĩa thực tiễn cao trong việc bảo vệ cây trồng và môi trường. Việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển các chế phẩm sinh học từ NPV sẽ góp phần quan trọng trong việc giảm thiểu sử dụng thuốc trừ sâu hóa học, hướng tới một nền nông nghiệp bền vững và an toàn cho sức khỏe con người.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Cơ sở khoa học của đề tài nghiên cứu NPV (Nuclear Polyhedrosis Virus) thuộc giống Alphabaculovirus, họ Baculoviridae là một trong số ít vi rút có thể tồn tại ở dạng thể vùi (Occlusion Bodies- OB) nên dễ dàng phân lập, lưu giữ và tạo dạng thành chế phẩm sinh học. Trên đồng ruộng, NPV thường phát sinh gây chết sâu hại với tỷ lệ khá cao và luôn tồn tại dưới dạng thể vùi, các thể vùi có thể tồn tại tới 30 năm ngoài tự nhiên và chỉ bị tiêu diệt khi thể vùi gặp phải môi trường đất, nước có pH ≥ 9,0 hoặc dính bám trên thân cây, lá cây, tàn dư cây trồng khi phơi nhiễm dưới ánh sáng trực xạ mạnh hoặc tia cực tím (Kitajima, 1989; Grzywacz et al. Sau khi các cá thể sâu non ăn phải thức ăn có mang thể vùi NPV, gặp pH cao (> 9,0) của ruột giữa làm vỏ protein của thể vùi bị phá vỡ, giải phóng các thể hoạt động (virion) và các thể vi rút hoạt động này sẽ xâm nhiễm vào nhu mô ruột giữa.

Sau đó xâm nhiễm sang các mô bào khác của cơ thể côn trùng. Sau 2-3 ngày, sâu ngừng ăn và sau 5- 7 ngày thì sâu chết (Sajap et al. Khi sâu non chết, cơ thể căng mọng rất dễ bị vỡ khi có va chạm nhẹ và sau khi vỡ, thân sâu dính bám vào lá hoặc thân cây và treo ngược cơ thể. Khi sâu chết, các thể hoạt động của NPV tập hợp lại trong vỏ bọc protein thành thể vùi, thể vùi được giải phóng ra môi trường đồng ruộng và tồn tại trong đất, trên tàn dư cây trồng.

Một sâu non chết bệnh NPV có thể chứa tới 24.553 thể vùi được giải phóng ra môi trường đồng ruộng và có thể tồn tại từ 20-30 năm. Trong quá trình canh tác cây trồng, làm đất hoặc do mưa gió, các thể vùi này dính bám lên lá cây và tiếp tục chờ cơ hội tiếp tục xâm nhiễm gây chết cho sâu hại (Pourmirza, 2000) [15]. Như vậy, việc phun chế phẩm NPV vừa có ý nghĩa như một loại thuốc sinh học để phòng trừ sâu hại một cách trực tiếp, vừa có tác dụng bổ sung nguồn virus hữu ích, góp phần bảo vệ cân bằng sinh thái trên đồng ruộng. Tuy nhiên, NPV chỉ có thể lây nhiễm và phát triển sinh khối trong các tế bào sống của cơ thể côn trùng ở điều kiện môi trường thích hợp, như vậy việc phát triển 5 luan an sinh khối NPV phải được thực hiện trên cơ thể sâu còn sống như phương pháp nuôi sâu truyền thống hoặc lây nhiễm trên các mô, tế bào được nuôi nhân (Kalmakoff và Ward, 2007; Elanchezhyan, 2009; Granados et al., 2007; Agathos et al., 2007, Rohrmann và George, 2011) [6, 11, 9, 16].

Vì vậy, cần thiết phải nghiên cứu để có sự hiểu biết đầy đủ về điều kiện phát triển sinh khối tế bào côn trùng, lây nhiễm NPV trên tế bào nuôi nhân trên cơ sở sử dụng các chủng NPV có hoạt lực cao đã được tuyển chọn để phát triển sinh khối NPV phục vụ phát triển thuốc trừ sâu sinh học phòng trừ sâu hại. Tổng quan tài liệu 1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 1. Nghiên cứu sâu khoang hại cây trồng Các nhà khoa học trên thế giới đều xác định sâu khoang (Spodoptera litura Fabricius; Noctuidae: Lepidoptera) là loài sâu đa thực, phá hại trên trên 290 loài cây thuộc 90 họ thực vật khác nhau và được coi là đối tượng sâu hại quan trọng trong sản xuất nông nghiệp ở nhiều nước trên thế giới (Kumari và Singh, 2009; Hong, 2002, Jadhav et al, 2015, Cherry et al.

Theo tổng hợp của Kuldeep et al. (2018) [17], sâu khoang phân bố rộng khắp ở khu vực Đông Nam châu Á, gây hại trên 63 loại cây thuộc 22 họ, là sâu hại nguy hiểm gây thiệt hại nặng trên các loại rau màu, đậu tương và bông, đay, v. Riêng tại Ấn độ, theo Alfred và Samiayyan (2017) [18] đã thống kê và xác định sâu khoang phá hại trên 140 loài cây thuộc 40 họ thực vật khác nhau, chủ yếu trên các cây trồng nông nghiệp. Sâu khoang có thời gian qua các giai đoạn phát dục khá dài, nhất là giai đoạn sâu non là thời gian sâu phá hại trên cây trồng, nên mức hại do sâu gây ra lớn.

Nghiên cứu sự phát triển của sâu khoang trên cà chua, Nagamandla và Shantanu (2018) [19] xác định ở nhiệt độ 200C thời gian sâu non kéo dài tới 41,8 ± 3,56 ngày và thời gian hoàn thành vòng đời là 60,4 ± 3,13 ngày; ở nhiệt độ 250C, thời gian tương ứng là 25,8 ± 0,67 và 41,6 ± 1,08 ngày, nhưng ở nhiệt độ 300C thời gian phát dục của sâu khoang rút ngắn, còn 16,3 ± 0,83 và 30,1 ± 1,29 ngày (tương ứng). Kết quả nghiên cứu của Jadhav et al. (2015) chỉ rõ, khi sinh sống trên cây nho ở điều kiện nhiệt đới, vòng đời của sâu từ 52- 56 ngày, trong đó thời gian phát 6 luan an dục của trứng, sâu non, nhộng và trưởng thành sâu khoang là 5- 7 ngày; 20- 23 ngày; 4- 6 ngày và 9- 12 ngày (tương ứng), một trưởng thành cái đẻ trung bình 499,2 trứng/con cái. Tác giả cũng xác định tỷ lệ trứng nở của sâu khoang và khả năng sống sót của sâu non tuổi lớn khá cao, vì vậy tác hại do sâu khoang gây ra trên cây trồng thường rất lớn [20].

Theo nghiên cứu của Patil et al., (2014), sâu khoang có tiềm năng sinh sản rất cao, một trưởng thành cái có thể đẻ từ 500- 1.263 trứng và khi trứng nở với thời gian sống của sâu non tới 24,5- 28,2 ngày thì mức gây hại của chúng là rất lớn [21]. Nghiên cứu của Alfred và Samiayyan (2017) chỉ rõ sức ăn của sâu khoang trên cây đậu triều ở mức cao nhất với chỉ số tiêu thụ thức ăn tới 3,889 trên đậu đỗ, trong khi với các cây trồng khác ở mức từ 2,825- 3,343 [22]. Theo Liu et al. Kết quả nghiên cứu của Muniappan và Marutani (1992) xác định số lượng quần thể sâu khoang phát triển mạnh ở nhiệt độ không khí 29- 300C và độ ẩm trên 90%.

Các tác giả chỉ rõ sâu khoang phát triển nhanh với mật độ cao trên bắp cải (185,7 con/10 cây), cải dưa và cải cuốn (169,0 con/10 cây) [24]. Trứng Sâu non Trưởng thành Nhộng Hình 1. Các giai đoạn phát dục của sâu khoang 7 luan an Kết quả nghiên cứu Jat et al. (2017) [25] và Srivastava et al.

(2018) [26] xác định NPV là tác nhân vi sinh vật gây chết sâu khoang rất phổ biến, được coi là nhân tố quan trọng và có hiệu quả cao trong điều hoà số lượng quần thể sâu hại trên đồng ruộng. Hiện nay, các nhà bảo vệ thực vật rất quan tâm đến việc phát triển, ứng dụng các chế phẩm NPV trong hệ thống quản lý tổng hợp (IPM) sâu hại nói chung và sâu khoang nói riêng. Tại Quảng Đông (Trung Quốc), Liu et al., (1995) xác định yếu tố hạn chế đáng kể sự phát triển số lượng quần thể sâu khoang ngoài đồng ruộng là các tác nhân ký sinh trên sâu non, đặc biệt NPV có thể làm sâu chết từ 7,2- 30,5%. Mặt khác, do sâu hoá nhộng trong đất nên khi mưa kéo dài làm đất ngập nước thì nhộng có thể chết tới 100% [23].

Nghiên cứu về NPV trên sâu hại Theo Evans (1986), Summer và Smith (1987), Rohman và George (2011) chỉ rõ vi rút nhân đa diện (Nucleo Polyhedrosis Virus) thuộc họ Baculoviridae, lớp Virus, bao gồm 2 giống: vi rút nhân đa diện (Nucleo Polyhedrosis Virus- NPV) và vi rút hạt (Granulosis Virus – GV) [27, 28]. NPV là tác nhân gây chết cao đối với các loài côn trùng thuộc các Bộ Lepidoptera, Hymenoptera, Diptera, Neuroptera, Coleoptera, Trichoptera và nhện. Theo Arayya et al. Các dạng Baculovirus (A), thể chồi (B) và thể vùi của NPV (C, D) (Nguồn: Rohrmann và George, 2011) 8 luan an Theo Arayya et al.

(2013), NPV có dạng hình gậy, có kích thước 40- 70 x 250 - 400nm bao gồm lớp vỏ lipoprotein bao quanh nhân (capsid) chứa thể DNA- protein (core) và được gọi là nucleo- capsid. NPV tồn tại dưới dạng các hạt tinh thể sáng, góc cạnh gọi là thể vùi (OB) hay còn gọi là polyhedra hoặc thể nhân đa diện (PIB). Khi quan sát dưới kính hiển vi phản pha, thể vùi có kích thước 1-7µm. Tinh thể này có nhiều cạnh và tạo thành 1 protein có khối lượng phân tử khoảng 25- 30 kDa.

Các hạt virus có một lớp bọc bên ngoài gọi là nhân capsit (virion) và NPV có một đặc tính hình thành các protein tinh thể trong nhân của tế bào vật chủ với kích thước 0,5 - 15 nm [13]. Theo Hong et al. (2002), Rohrmann và George (2011) [2, 5], cấu tạo của NPV gồm 3 phần: vỏ ngoài, vỏ capsid và lõi axit nucleic. - Vỏ ngoài: là một lớp màng lipoprotein ngoài cùng còn gọi là protein ngoài.

Protein ngoài mang tính kháng nguyên và có tác dụng kích thích vào hệ thống miễn dịch của cơ thể vật chủ. - Vỏ capsid: Vỏ capsid nằm kế tiếp bên trong lớp vỏ ngoài và được ngăn cách với lớp vỏ ngoài bởi một lớp dịch. Protein tạo nên vỏ capsid được gọi là protein trong. Protein trong mang tính kháng nguyên, có tác dụng làm tăng khả năng gây bệnh của virus.

- Genom: Genom của NPV là một phân tử ADN gồm 2 mạch xoắn kép. Khi nhiễm vào tế bào vật chủ virus đưa lõi ADN vào tế bào vật chủ, ADN của virus sử dụng năng lượng, nguyên liệu và riboxom của tế bào vật chủ để tổng hợp nên protein và quá trình nhân lên của ADN. Mặt khác, khi tế bào bị nhiễm virus, ADN của virus sinh ra men Azenaza ức chế ADN của tế bào vật chủ và phân giải tạo thành các nucleotit tự do. Sau khi tổng hợp đủ các thành phần như vỏ, ADN thì NPV tạo thành thể virus mới.

Theo Lynn (2002), vỏ của polyhedrin (thể vùi) được bao bọc là protein. Polyhedrin dễ bị thủy phân trong môi trường kiềm. Do đó trong dịch ruột giữa của sâu khoang với pH là 9-10 các thể đa diện bị phá vỡ, giải phóng các hạt virus tự do (virion). Các hạt virus xâm nhập vào tế bào máu đến tế bào da, tế bào biểu mô khí quản và tế bào mỡ để gây bệnh [30].

9 luan an Quá trình nhân lên của NPV và sự hình thành thể đa diện được tiến hành trong nhân tế bào, vỏ của thể đa diện được tổng hợp ở ngoài nhân sau đó vận chuyển vào trong nhân để hình thành các thể đa diện. Số lượng virus và thể đa diện ngày một tăng, kết quả phá vỡ tế bào vật chủ, giải phóng virus tự do và thể đa diện.