Luận án tiến sĩ phát triển sinh khối vi rút nhân đa diện npv trên tế bào sâu khoang phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học

Luận án tiến sĩ nghiên cứu phát triển sinh khối vi rút NPV trên tế bào sâu khoang, phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học hiệu quả.

• Tác giả: Lê Thanh Hải
• Người hướng dẫn: GS. Hoàng Đình Hòa
• Trường học: Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Phát Triển Sinh Khối Vi Rút NPV Trên Tế Bào Sâu Khoang Để Sản Xuất Thuốc Trừ Sâu Sinh Học
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• MỞ ĐẦU
• 1. Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu
• 2. Mục đích, yêu cầu cần đạt của đề tài
• 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
• 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 5. Những đóng góp mới của luận án
• 1. CHƯƠNG 1: CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1. Cơ sở khoa học của đề tài nghiên cứu
• 1. Tổng quan tài liệu
• 1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài
• 1. Nghiên cứu sâu khoang hại cây trồng
• 1. Nghiên cứu về NPV trên sâu hại
• 1. Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào côn trùng
• 1. Nghiên cứu điều kiện phát triển sinh khối của tế bào côn trùng
• 1. Nghiên cứu lây nhiễm NPV trên tế bào nhân nuôi
• 1. Nghiên cứu tinh sạch thể vùi và tạo dạng sử dụng chế phẩm NPV
• 1. Tình hình nghiên cứu ở trong nước
• 1. Nghiên cứu sâu khoang hại cây trồng
• 1. Nghiên cứu về NPV trên sâu hại
• 1. Nghiên cứu nuôi nhân tế bào côn trùng
• 1. Nghiên cứu phát triển sinh khối NPV
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2. Vật liệu và dụng cụ, thiết bị nghiên cứu
• 2. Vật liệu nghiên cứu
• 2. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
• 2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2. Địa điểm nghiên cứu
• 2. Thời gian nghiên cứu
• 2. Nội dung nghiên cứu
• 2. Phương pháp nghiên cứu
• 2. Điều tra, đánh giá và thu thập, tuyển chọn NPV sâu khoang
• 2. Nghiên cứu điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây nhiễm NPV trên tế bào nuôi nhân
• 2. Nghiên cứu điều kiện thích hợp để nhân sinh khối tế bào sâu khoang
• 2. Nghiên cứu lây nhiễm NPV sâu khoang trên tế bào nhân nuôi
• 2. Nghiên cứu tinh sạch thể vùi và tạo chế phẩm NPV dạng bột thấm nước
• 2. Nghiên cứu tinh sạch thể vùi NPV sau lây nhiễm trên tế bào
• 2. Nghiên cứu phát triển chế phẩm NPV dạng bột thấm nước
• 2. Đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm tạo được
• 2. Phương pháp tính toán, xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3. Điều tra, đánh giá và thu thập, tuyển chọn virus nhân đa diện (NPV) trên sâu khoang
• 3. Mức độ phổ biến và khả năng gây chết sâu khoang của virus nhân đa diện (NPV) ngoài đồng ruộng
• 3. Phân lập, tuyển chọn chủng NPV có hoạt lực cao
• 3. Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây nhiễm NPV trên tế bào nhân nuôi
• 3. Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào sâu khoang
• 3. Nghiên cứu điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang
• 3. Phát triển sinh khối tế bào sâu khoang qui mô phòng thí nghiệm
• 3. Nghiên cứu phát triển sinh khối NPV sâu khoang trên tế bào nuôi nhân
• 3. Xác định điều kiện thích hợp cho lây nhiễm virus nhân đa diện ( NPV)
• 3. Mức độ phát triển sinh khối tế bào và hình thành thể vùi trong quá trình lây nhiễm virus nhân đa diện (NPV)
• 3. Mức độ gây chết sâu khoang và hình thành thể vùi của NPV nhân trên tế bào và trên sâu
• 3. Hiệu lực trừ sâu khoang của chủng virus TL.1a nhân trên tế bào
• 3. Nghiên cứu tinh sạch thể vùi NPV sâu khoang và tạo chế phẩm dạng bột thấm nước
• 3. Tinh sạch thể vùi NPV sâu khoang
• 3. Thử nghiệm tạo chế phẩm NPV sâu khoang dạng bột thấm nước
• 3. Đánh giá hiệu lưc phòng trừ sâu khoang của chế phẩm tạo được
• 3. Đánh giá hiệu lưc phòng trừ sâu khoang trong điều kiện phòng thí nghiệm
• 3. Đánh giá hiệu lưc phòng trừ sâu khoang trên bắp cải ngoài nhà lưới
• 3. Đánh giá hiệu lưc phòng trừ sâu khoang ngoài đồng ruộng
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• 1. Đề nghị
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Giới thiệu về sinh khối vi rút NPV

Nghiên cứu về sinh khối vi rút NPV (Nuclear Polyhedrosis Virus) trên tế bào sâu khoang (Spodoptera litura) đã trở thành một lĩnh vực quan trọng trong việc phát triển thuốc trừ sâu sinh học. NPV là một loại vi rút thuộc họ Baculoviridae, có khả năng gây chết cao đối với sâu khoang mà không ảnh hưởng đến các loài không phải ký chủ. Việc phát triển sinh khối vi rút này không chỉ giúp giảm thiểu việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học mà còn bảo vệ môi trường và sức khỏe con người. Nghiên cứu này nhằm mục đích khai thác tiềm năng của NPV trong việc sản xuất chế phẩm sinh học, từ đó cung cấp giải pháp hiệu quả cho nông nghiệp bền vững.

II. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng NPV

Trên thế giới, nhiều quốc gia như Mỹ, Canada, và Trung Quốc đã ứng dụng thành công công nghệ nuôi nhân tế bào côn trùng để sản xuất chế phẩm NPV. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng NPV có thể tồn tại lâu dài trong môi trường tự nhiên và có khả năng gây chết cao đối với sâu khoang. Việc phát triển sinh khối vi rút NPV trên tế bào sâu khoang không chỉ giúp tăng hiệu quả sản xuất mà còn tạo ra các chế phẩm có chất lượng cao. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng việc lây nhiễm NPV trên tế bào sâu khoang có thể đạt hiệu quả cao, từ đó tạo ra nguồn vi rút dồi dào cho sản xuất chế phẩm sinh học.

III. Phương pháp nghiên cứu phát triển sinh khối NPV

Nghiên cứu này sử dụng phương pháp nuôi nhân tế bào sâu khoang để phát triển sinh khối vi rút NPV. Các điều kiện nuôi cấy như pH, nhiệt độ, và mật độ tế bào được tối ưu hóa để đạt được hiệu quả lây nhiễm cao nhất. Việc xác định các yếu tố này là rất quan trọng để đảm bảo rằng sinh khối vi rút có thể được sản xuất với quy mô lớn và hiệu quả. Kết quả từ các thí nghiệm cho thấy rằng việc điều chỉnh các điều kiện nuôi cấy có thể làm tăng đáng kể số lượng thể vùi NPV, từ đó nâng cao hiệu quả của chế phẩm sinh học trong việc phòng trừ sâu khoang.

IV. Đánh giá hiệu quả của chế phẩm NPV

Kết quả nghiên cứu cho thấy chế phẩm NPV dạng bột thấm nước có hiệu quả cao trong việc phòng trừ sâu khoang. Các thử nghiệm thực địa đã chỉ ra rằng chế phẩm này có thể giảm thiểu đáng kể mật độ sâu khoang trên các loại cây trồng như bắp cải và đậu tương. Việc sử dụng chế phẩm sinh học này không chỉ giúp bảo vệ cây trồng mà còn góp phần bảo vệ môi trường và sức khỏe con người. Nghiên cứu này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các chế phẩm sinh học an toàn và hiệu quả cho nông nghiệp bền vững.

V. Kết luận và triển vọng

Nghiên cứu phát triển sinh khối vi rút NPV trên tế bào sâu khoang đã chứng minh được tiềm năng ứng dụng trong sản xuất thuốc trừ sâu sinh học. Kết quả đạt được không chỉ có giá trị khoa học mà còn có ý nghĩa thực tiễn cao trong việc bảo vệ cây trồng và môi trường. Việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển các chế phẩm sinh học từ NPV sẽ góp phần quan trọng trong việc giảm thiểu sử dụng thuốc trừ sâu hóa học, hướng tới một nền nông nghiệp bền vững và an toàn cho sức khỏe con người.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Sâu khoang (Spodoptera litura Fabr.) là loài sâu ăn tạp gây hại trên các đối tượng cây trồng cạn, phân bố rộng tại các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới. Các công trình nghiên cứu của Kumari và Singh (2009) cùng Hong (2002) ghi nhận sâu khoang có khả năng ký sinh và gây hại trên 290 loài cây thuộc 90 họ thực vật khác nhau. Tại Việt Nam, loài dịch hại này phát sinh nghiêm trọng trên các loại rau họ Thập tự, nho, cây họ đậu, cà chua, dưa chuột, rau muống, khoai sọ, thuốc lá, đậu tương, lạc, bông và đay. Theo số liệu điều tra của Viện Bảo vệ thực vật (2001), việc phòng trừ sâu khoang phần lớn phụ thuộc vào thuốc bảo vệ thực vật hóa học ở liều lượng cao, dẫn đến tình trạng kháng thuốc, gây ô nhiễm môi trường, tồn dư hóa chất trong nông sản và làm suy giảm các loài thiên địch hữu ích.

Trong tự nhiên, sâu khoang bị lây nhiễm bởi virus nhân đa diện (Nuclear Polyhedrosis Virus - NPV), thuộc họ Baculoviridae. Tỷ lệ sâu chết tự nhiên do NPV dao động từ 0,2–1,5% trên bắp cải, 0,9–1,6% trên đậu tương và 0,3–1,9% trên lạc. Virus NPV có tính chuyên tính cao, chỉ gây bệnh trên loài ký chủ tương ứng và an toàn đối với các loài không phải ký chủ cũng như động vật có xương sống.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án xác định xuất phát từ phương thức sản xuất NPV truyền thống: lâu nay việc phát triển sinh khối NPV chủ yếu thực hiện thủ công bằng cách nuôi sâu sống với số lượng lớn rồi gây nhiễm, nghiền lọc thu dịch thể (Nguyễn Văn Cảm et al., 1996). Quy trình này đòi hỏi diện tích nhà xưởng lớn, khó kiểm soát điều kiện vô trùng và không thể mở rộng ở quy mô công nghiệp. Trong khi các quốc gia như Mỹ, Canada, Đức, Hà Lan, Trung Quốc và Ấn Độ đã ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào côn trùng in vitro để nhân sinh khối NPV, tại Việt Nam hướng nghiên cứu này còn rất mới và kết quả mới dừng lại ở bước khởi đầu.

Mục tiêu và yêu cầu nghiên cứu của luận án được xác lập như sau:

1. Mục đích nghiên cứu:

   • Tuyển chọn chủng virus nhân đa diện (NPV) có hoạt lực cao trong phòng chống sâu khoang trên cơ sở đánh giá tiềm năng ký sinh tự nhiên ngoài đồng ruộng.
   • Xác định quy trình kỹ thuật nuôi nhân tế bào sâu khoang và lây nhiễm phát triển sinh khối NPV phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học.

2. Yêu cầu cần đạt:

   • (1) Đánh giá khả năng gây chết sâu khoang ngoài tự nhiên, thu thập và tuyển chọn chủng NPV có hoạt lực cao.
   • (2) Nghiên cứu xác định các điều kiện thích hợp để phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây nhiễm phát triển sinh khối NPV trên tế bào nuôi nhân.
   • (3) Thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học NPV sâu khoang dạng bột thấm nước (WP) và đánh giá hiệu lực phòng trừ ngoài thực địa.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Virus nhân đa diện (NPV) ký sinh sâu khoang thu thập từ đồng ruộng và phân lập tại phòng thí nghiệm Sinh học - Viện Bảo vệ thực vật; Dòng tế bào sâu khoang phát triển từ mô phôi sâu khoang (được Viện Bảo vệ thực vật phân lập, nuôi nhân và chọn lọc qua 135 chu kỳ); Sâu non sâu khoang (Spodoptera litura) nhân nuôi nhân tạo bằng lá bắp cải khử trùng bằng cồn 70°.
• Phạm vi nghiên cứu: Khảo sát tiềm năng gây bệnh của NPV trên bắp cải, lạc, đậu tương và khoai sọ ngoài đồng ruộng; Xác định thông số tối ưu cho nuôi nhân sinh khối tế bào và lây nhiễm NPV in vitro; Tinh sạch thể vùi (OB) và phát triển chế phẩm dạng bột thấm nước (WP) khảo nghiệm tại Hà Nội.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các công trình nghiên cứu trên thế giới đã xác định đặc tính đa thực của sâu khoang (Spodoptera litura Fabricius; Noctuidae: Lepidoptera) với phạm vi ký chủ rộng trên 290 loài thực vật (Kumari và Singh, 2009; Hong, 2002; Jadhav et al., 2015). Kuldeep et al. (2018) chỉ ra sâu khoang gây hại trên 63 loài cây thuộc 22 họ tại Đông Nam Á, trong khi Alfred và Samiayyan (2017) ghi nhận 140 loài cây thuộc 40 họ tại Ấn Độ. Thời gian phát dục và sức sinh sản của loài này được phân tích bởi Nagamandla và Shantanu (2018), Jadhav et al. (2015), Patil et al. (2014) và Muniappan và Marutani (1992), cho thấy một con cái có thể đẻ từ 499 đến 1.263 trứng, tạo áp lực phá hại lớn trên đồng ruộng. Tác nhân NPV gây bệnh trên sâu khoang được Evans (1986), Summers và Smith (1987), Rohrmann và George (2011) mô tả thuộc giống Alphabaculovirus, họ Baculoviridae, tồn tại dưới dạng thể vùi (Occlusion Bodies - OB) kích thước 0,15–15 µm bao bọc các hạt virion chứa ADN chuỗi xoắn kép.

Lịch sử nuôi cấy tế bào côn trùng in vitro bắt đầu từ Goldschmidt (1915) trên mô tằm Hyalophora cecropia, tiếp nối bởi Trager (1930s), Wyatt (1956) trên Bombyx mori, và bước chuyển biến của Grace (1962) khi thiết lập dòng tế bào đầu tiên từ bộ Lepidoptera (Granados et al., 2007). Đến nay hơn 500 dòng tế bào côn trùng đã được phát triển. Các quy trình kỹ thuật nuôi nhân tế bào, kiểm soát nhiễm khuẩn và tối ưu hóa môi trường được xây dựng bởi Lynn (1996, 2002), Elanchezyan (2009), Murhammer (2007), Invitrogen Life Technologies (2002), Agathos (1994, 2007, 2010), Mitsuhashi (1976, 1995). Về cơ chế lây nhiễm NPV in vitro, các nghiên cứu của Knudson và Tinsley (1974), Tipvadee et al. (1988), Escribano et al. (1999), Lynn (2003), Zitzmann et al. (2017), Jakubowska et al. (2009) đã chứng minh thể vùi cần được xử lý kiềm hóa (pH > 9,0 hoặc dung dịch $Na_2CO_3$) để giải phóng virion trước khi đưa vào dịch tế bào, đồng thời xác lập vai trò của chỉ số lây nhiễm (MOI) và thời gian ủ. Kỹ thuật tinh sạch thể vùi và tạo dạng bột thấm nước bổ sung chất chống tia tử ngoại được nghiên cứu bởi Shapiro et al. (2008), Patricia et al. (2013), Mushobozi et al. (2004), Cisneros et al. (2002).

Tại Việt Nam, các nghiên cứu sinh học sâu khoang được thực hiện bởi Nguyễn Duy Nhất (1970) và Lê Văn Trịnh (1996). Khảo sát tác nhân Baculovirus được Nguyễn Văn Cảm et al. (1996a, 1996b) ghi nhận 5 loài trên cây công nghiệp và rau màu; Hoàng Thị Việt và Nguyễn Văn Cảm (2002) xác định 10 chủng NPV trên 10 loài sâu hại; Trịnh Thị Xuân et al. (2005) phân lập 4 chủng SeNPV trên sâu keo da láng; Trần Văn Hai et al. (2010) phân lập 5 chủng NPV sâu khoang tại Đồng bằng sông Cửu Long. Về công nghệ sản xuất, giai đoạn 1985–2005 Viện Bảo vệ thực vật và Trung tâm Bông Nha Hố đã xây dựng quy trình nuôi sâu nhân tạo để thu nhận dịch NPV thô (Nguyễn Thị Hai, 2005; Trương Thanh Giản et al., 1996). Đến năm 2011, Lê Văn Trịnh và Lê Thanh Hải Hà đã phân lập và duy trì thành công dòng tế bào từ mô phôi và mô mỡ sâu khoang đạt mật độ trên $10^{10}$ tế bào/ml qua các chu kỳ nuôi cấy.

Vị trí của luận án: Luận án là công trình nghiên cứu có tính hệ thống đầu tiên tại Việt Nam kết nối quy trình nuôi cấy dòng tế bào mô phôi sâu khoang in vitro với kỹ thuật lây nhiễm nhân sinh khối NPV, tinh sạch thể vùi và tạo chế phẩm dạng bột thấm nước (WP), giải quyết các hạn chế tồn tại của phương pháp nuôi sâu sống truyền thống.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

• Đặc tính sinh học của Baculovirus và NPV: NPV là virus thuộc giống Alphabaculovirus, họ Baculoviridae. Virus tồn tại dưới hai dạng hình thái: thể chồi (Budded Virus - BV) chịu trách nhiệm lây nhiễm giữa các tế bào trong cơ thể vật chủ, và thể vùi (Occlusion Bodies - OB / Polyhedral Inclusion Bodies - PIB) có vỏ bọc protein polyhedrin bảo vệ các virion chứa ADN sợi kép vòng. Thể vùi bền vững ngoài môi trường tự nhiên, chỉ bị hòa tan trong môi trường kiềm (pH ≥ 9,0) của dịch ruột giữa côn trùng để giải phóng virion gây bệnh.
• Động thái sinh trưởng tế bào côn trùng: Quá trình nuôi cấy tế bào in vitro tuân theo mô hình 4 pha của Murhammer (2007): pha khởi động (pha chậm), pha tăng trưởng theo hàm số mũ ($N = N_0 e^{\mu t}$), pha ổn định và pha suy giảm. Tế bào côn trùng phát triển tối ưu ở pH trung tính đến hơi acid (6,2–7,0), đòi hỏi các dưỡng chất từ môi trường chuyên dụng và huyết thanh thai bò (FBS).
• Nguyên lý lây nhiễm in vitro và chỉ số MOI: Do môi trường tế bào có pH ≤ 7,0 không thể tự giải phóng virion từ thể vùi, quy trình bắt buộc phải giải thể vùi nhân tạo bằng kiềm yếu ($Na_2CO_3$). Quá trình lây nhiễm phụ thuộc vào chỉ số MOI (Multiplicity of Infection - tỷ lệ giữa số lượng virus/thể vùi và số lượng tế bào) cùng thời gian ủ.

Phương pháp nghiên cứu

• Điều tra và phân lập NPV ngoài tự nhiên: Thu thập mẫu sâu khoang chết bệnh ngoài đồng ruộng trên 4 loại cây trồng (bắp cải, lạc, đậu tương, khoai sọ) tại các vùng sinh thái; phân lập, tinh chế và tuyển chọn qua 4 chu kỳ lây nhiễm liên tiếp trong phòng thí nghiệm.
• Phương pháp nuôi nhân sinh khối tế bào sâu khoang:
  • Khảo sát các môi trường nuôi cấy: TNM-FH, Grace, TC-100, SF-900 II;
  • Khảo sát dải nhiệt độ (20°C, 25°C, 27°C, 28°C, 30°C, 32°C) và dải pH (5,8; 6,0; 6,2; 6,5; 6,8; 7,0; 7,2);
  • Khảo sát tỷ lệ bổ sung huyết thanh thai bò FBS (0%, 3%, 5%, 10%, 15%);
  • Đánh giá phương pháp nuôi tĩnh và nuôi lắc trên bình lọc khuẩn dung tích 250 ml và 1.000 ml (chứa 750 ml môi trường);
  • Định lượng mật độ tế bào bằng buồng đếm hồng cầu Neubauer (Neubauer hemocytometer) dưới kính hiển vi quang học.
• Phương pháp lây nhiễm NPV trên tế bào in vitro: Xử lý phá vỡ thể vùi bằng dung dịch $Na_2CO_3$ 0,1 M (pH 11,2), ly tâm thu dịch virion hoạt động; Lây nhiễm vào dịch tế bào ở các mật độ tế bào, dải chỉ số MOI, thời gian ủ, môi trường, nhiệt độ và pH khác nhau; Theo dõi mật độ tế bào và số lượng thể vùi hình thành sau các ngày nuôi cấy.
• Kỹ thuật tinh sạch thể vùi và sinh học phân tử: Ly tâm phân đoạn kết hợp xử lý dung dịch đệm SDS; Giám định độ thuần và mối quan hệ di truyền bằng phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR), giải trình tự đoạn gen đặc trưng và thiết lập cây phả hệ bằng phương pháp Neighbor-joining.
• Phương pháp chế biến và khảo nghiệm chế phẩm bột thấm nước: Phối trộn thể vùi tinh sạch với phụ gia khoáng sét (Kaolin, Bentonite, bột tan), chất bám dính và chất chống tia tử ngoại; Đánh giá hiệu lực sinh học diệt sâu khoang trong phòng thí nghiệm, trong nhà lưới và ngoài đồng ruộng tại Vân Nội và Mỹ Thành (Hà Nội) theo quy chuẩn bảo vệ thực vật.
• Xử lý số liệu: Tính toán các giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến động (CV%), phân tích phương sai và so sánh các nghiệm thức bằng phần mềm thống kê chuyên ngành.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Cơ sở khoa học và tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp toàn diện các cơ sở lý luận và thành tựu nghiên cứu trong và ngoài nước về sâu khoang, virus NPV và công nghệ tế bào côn trùng. Về đặc điểm sâu hại, sâu khoang là loài sâu ăn tạp gây hại nghiêm trọng với chu kỳ sống từ 20 đến 60 ngày tùy thuộc vào nhiệt độ, có khả năng sinh sản cao (đẻ tới hơn 1.200 trứng/ngài cái). Tác nhân NPV thuộc họ Baculoviridae được xác định là nhân tố sinh học có khả năng hạn chế mật độ sâu hại tự nhiên ngoài đồng ruộng từ 7,2% đến 33,84%.

Lĩnh vực tổng quan	Nội dung và tác giả trích dẫn chính
Sinh học NPV	Cấu trúc thể vùi (OB), hạt virion, cơ chế xâm nhiễm qua đường tiêu hóa ruột giữa có pH kiềm (Evans, 1986; Rohrmann và George, 2011; Lynn, 2002).
Nuôi cấy tế bào côn trùng	Quá trình phát triển môi trường từ Wyatt (1956), Grace (1962); kỹ thuật nuôi nhân tế bào thuộc bộ Lepidoptera, kiểm soát tạp nhiễm không dùng kháng sinh dài hạn (Lynn, 1996, 2002; Granados et al., 2007; Murhammer, 2007).
Lây nhiễm NPV in vitro	Quy trình xử lý kiềm giải phóng virion, kiểm soát chỉ số MOI từ 0,1–1,0, thời gian ủ lây nhiễm 3–4 ngày (Knudson và Tinsley, 1974; Tipvadee et al., 1988; Zitzmann et al., 2017).
Nghiên cứu tại Việt Nam	Điều tra phân lập NPV trên sâu xanh, sâu khoang, sâu róm thông (Nguyễn Văn Cảm et al., 1996; Hoàng Thị Việt, 2002; Trần Văn Hai et al., 2010); Thiết lập dòng tế bào mô phôi sâu khoang (Lê Văn Trịnh và Lê Thanh Hải Hà, 2011).

Chương 2. Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc vật liệu, hóa chất, thiết bị và các bước triển khai thực nghiệm. Nghiên cứu sử dụng dòng tế bào mô phôi sâu khoang đã ổn định qua 135 chu kỳ nuôi cấy tại Viện Bảo vệ thực vật. Sâu thí nghiệm được nuôi bằng lá bắp cải sạch. Thiết bị bao gồm kính hiển vi quang học phóng đại từ 100X đến 600X, buồng đếm hồng cầu Neubauer, hệ thống máy lắc, bình lọc khuẩn 250 ml và 1.000 ml, máy ly tâm lạnh và hệ thống phân tích PCR.

Quy trình nghiên cứu gồm 4 nội dung chính: (1) Điều tra thu thập và tuyển chọn chủng NPV; (2) Tối ưu hóa điều kiện nuôi nhân sinh khối tế bào sâu khoang và lây nhiễm NPV in vitro; (3) Tinh sạch thể vùi NPV và phối chế thử nghiệm chế phẩm dạng bột thấm nước (WP); (4) Đánh giá hiệu lực sinh học của chế phẩm trong phòng thí nghiệm, nhà lưới và ngoài đồng ruộng tại Vân Nội và Mỹ Thành (Hà Nội).

Chương 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận

1. Điều tra, thu thập và tuyển chọn virus nhân đa diện (NPV)

Kết quả điều tra ngoài đồng ruộng giai đoạn 2014–2015 cho thấy sâu khoang phát sinh trên nhiều cây trồng cạn, tỷ lệ sâu chết do nhiễm NPV tự nhiên dao động từ 0,2% đến 1,9%. Từ các mẫu sâu bệnh thu thập được, tác giả tiến hành phân lập và tinh chế qua 4 chu kỳ lây nhiễm liên tiếp trên sâu non trong phòng thí nghiệm. Kết quả tuyển chọn được 3 chủng NPV có tiềm năng ký sinh cao là TL.1a, TL.2a và TL.3a. Trong đó, chủng TL.1a thể hiện hoạt lực cao nhất: tỷ lệ gây chết sâu non đạt 80,00% và số lượng thể vùi hình thành đạt $2,6 \times 10^8$ OB/10 sâu.

2. Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây nhiễm NPV in vitro

Nghiên cứu đã xác định các thông số kỹ thuật tối ưu cho quá trình nhân sinh khối dòng tế bào mô phôi sâu khoang:

• Môi trường nuôi cấy: Môi trường TNM-FH và Grace cho mật độ tế bào tăng trưởng cao và ổn định nhất.
• Nhiệt độ nuôi nhân: Dải nhiệt độ tối ưu từ 26°C đến 28°C; ở nhiệt độ ≥ 30°C mật độ tế bào suy giảm rõ rệt và không phục hồi khi hạ nhiệt độ.
• Độ pH môi trường: Giá trị pH thích hợp nhất đạt từ 6,2 đến 6,8.
• Huyết thanh bổ sung: Bổ sung huyết thanh thai bò (FBS) tỷ lệ 10% cho tốc độ tăng trưởng tế bào đạt cực đại sau 6 ngày nuôi cấy.
• Quy mô phòng thí nghiệm: Nuôi nhân theo phương pháp lắc ở tốc độ thích hợp trên bình lọc khuẩn dung tích 1.000 ml chứa 750 ml môi trường cho mật độ tế bào cao hơn rõ rệt so với nuôi tĩnh.

Đối với quá trình lây nhiễm NPV trên tế bào nhân nuôi: Xử lý giải thể vùi bằng dung dịch $Na_2CO_3$ 0,1 M (pH 11,2) giải phóng virion hoạt động. Các thông số lây nhiễm tối ưu gồm: mật độ tế bào khi nhiễm từ $1 \times 10^6$ đến $1,5 \times 10^6$ tế bào/ml, chỉ số lây nhiễm MOI từ 0,1 đến 0,5, thời gian ủ 3–4 ngày tại nhiệt độ 27–28°C và pH 6,5. Động thái lây nhiễm cho thấy số lượng thể vùi hình thành tăng mạnh từ ngày thứ 3 và đạt đỉnh ở ngày thứ 6–7 sau lây nhiễm. So sánh hoạt lực sinh học cho thấy chủng TL.1a nhân trên tế bào nuôi cấy đạt hiệu lực diệt sâu khoang tương đương với virus nhân trên cơ thể sâu sống truyền thống. Kết quả phân tích PCR và cây phả hệ Neighbor-joining khẳng định chủng virus nhân trên tế bào duy trì độ thuần khiết và tính đồng nhất di truyền cao.

3. Tinh sạch thể vùi, sản xuất chế phẩm và đánh giá hiệu lực phòng trừ

Phương pháp ly tâm phân đoạn kết hợp dung dịch đệm SDS cho tỷ lệ thu hồi thể vùi tinh sạch cao, loại bỏ triệt để mảnh vụn tế bào và tạp chất hữu cơ. Từ nguồn thể vùi tinh sạch, tác giả đã xây dựng công thức phụ gia khoáng sét, chất bám dính và phát triển thành công 2 chế phẩm dạng bột thấm nước ký hiệu là NPV-1 WP và NPV-2 WP.

Điều kiện khảo nghiệm	Đối tượng cây trồng / Địa điểm	Liều lượng / Thời gian	Hiệu lực phòng trừ sâu khoang (%)
Phòng thí nghiệm	Sâu non sâu khoang tuổi 2–3	Nồng độ tiêu chuẩn, sau 6 ngày	80,00 – 85,00%
Nhà lưới	Cây bắp cải	Liều lượng khuyến cáo	80,50 – 83,10%
Đồng ruộng	Bắp cải tại Vân Nội (Hà Nội)	Chế phẩm NPV-1 WP	80,51 – 82,29%
Đồng ruộng	Đậu tương tại Mỹ Thành (Hà Nội)	Chế phẩm NPV-1 WP	96,92%

Số lượng thể vùi thu hồi trên sâu chết ngoài thực địa đạt mật độ cao, chứng minh khả năng phát tán và duy trì mầm bệnh của chế phẩm sinh học trong hệ sinh thái đồng ruộng.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học

• Cung cấp hệ thống dữ liệu thực nghiệm đầu tiên tại Việt Nam về đặc tính sinh trưởng, động thái tăng sinh khối của dòng tế bào mô phôi sâu khoang (Spodoptera litura) trong điều kiện nuôi cấy in vitro.
• Xác lập cơ sở khoa học về các thông số môi trường (dinh dưỡng, nhiệt độ, pH, tỷ lệ huyết thanh FBS) và thông số lây nhiễm (chỉ số MOI, mật độ tế bào, thời gian ủ) chi phối quá trình tổng hợp và tạo thể vùi (OB) của virus nhân đa diện trên tế bào côn trùng nuôi nhân.
• Bổ sung dữ liệu khoa học về mức độ phân bố tự nhiên của NPV trên sâu khoang hại bắp cải, lạc, đậu tương, khoai sọ; phân lập và xác định đặc điểm di truyền của 3 chủng NPV bản địa bằng chỉ thị phân tử.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn

• Tuyển chọn thành công chủng virus TL.1a có hoạt lực gây chết sâu khoang đạt 80% và sản lượng thể vùi đạt $2,6 \times 10^8$ OB/10 sâu.
• Xây dựng quy trình công nghệ nhân sinh khối tế bào sâu khoang quy mô phòng thí nghiệm bằng phương pháp lắc với thể tích 750 ml môi trường trong bình lọc khuẩn 1.000 ml.
• Hoàn thiện quy trình kỹ thuật tinh sạch thể vùi sau nuôi cấy tế bào và chế tạo thành công 2 dạng chế phẩm bột thấm nước NPV-1 WP và NPV-2 WP.
• Khảo nghiệm đồng ruộng chứng minh chế phẩm NPV-1 WP đạt hiệu lực diệt sâu khoang từ 80,51–82,29% trên bắp cải và 96,92% trên đậu tương, tạo tiền đề thay thế thuốc hóa học trong quản lý dịch hại tổng hợp (IPM) và sản xuất rau, nông sản an toàn.

Kiến nghị và đề xuất

• Tiếp tục hoàn thiện các thông số công nghệ để nâng quy mô nuôi cấy tế bào và lây nhiễm NPV trên hệ thống thiết bị lên men sinh học (bioreactor) dung tích lớn.
• Đưa chế phẩm NPV-1 WP vào khảo nghiệm diện rộng trên các vùng chuyên canh rau họ Thập tự và cây công nghiệp ngắn ngày để hoàn thiện hồ sơ đăng ký lưu hành thuốc bảo vệ thực vật sinh học.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế của luận án: Quy mô nhân sinh khối tế bào và lây nhiễm virus trong luận án mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm (bình nuôi cấy dung tích 250 ml và 1.000 ml với thể tích môi trường tối đa 750 ml/bình); chưa tiến hành thử nghiệm trên các hệ thống bình lên men công nghiệp (bioreactor) có kiểm soát tự động oxy hòa tan và tốc độ khuấy cơ học lớn. Ngoài ra, môi trường nuôi cấy vẫn phụ thuộc vào huyết thanh thai bò (FBS), vốn có chi phí cao trong sản xuất đại trà.
• Hướng nghiên cứu tiếp: Thử nghiệm thay thế FBS bằng các nguồn dinh dưỡng thủy phân hoặc môi trường không chứa huyết thanh (serum-free media) nhằm hạ giá thành chế phẩm; Tối ưu hóa các chất phụ gia chống tia tử ngoại nhằm kéo dài thời gian tồn lưu của thể vùi khi phun ngoài đồng ruộng trong điều kiện bức xạ nhiệt cao; Mở rộng quy trình công nghệ lên quy mô pilot và công nghiệp.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên sâu đối với:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên ngành Công nghệ Sinh học, Bảo vệ Thực vật: Tham khảo phương pháp thiết lập điều kiện nuôi cấy tế bào côn trùng in vitro, kỹ thuật đếm tế bào bằng buồng đếm Neubauer, quy trình kiềm hóa phá vỡ thể vùi virus và phân tích di truyền phả hệ virus ký sinh.
• Cán bộ nghiên cứu tại các viện, trung tâm nghiên cứu nông nghiệp: Sử dụng quy trình kỹ thuật tinh sạch thể vùi và công thức phối chế bột thấm nước (WP) để phát triển các chế phẩm sinh học phòng trừ dịch hại khác thuộc bộ Cánh phấn (Lepidoptera).
• Cơ sở sản xuất chế phẩm sinh học và nhà hoạch định chính sách: Tham khảo cơ sở dữ liệu thực nghiệm về hiệu lực phòng trừ ngoài đồng ruộng để xây dựng các giải pháp quản lý dịch hại tổng hợp (IPM), phục vụ chương trình sản xuất nông nghiệp sạch, hữu cơ và an toàn sinh học.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Nguồn tế bào sâu khoang được sử dụng trong luận án có nguồn gốc và đặc điểm như thế nào?
Nguồn thực liệu tế bào sâu khoang do Viện Bảo vệ thực vật cung cấp, là dòng tế bào phát triển từ tế bào gốc mô phôi sâu khoang (Spodoptera litura), đã được phân lập, nuôi nhân và chọn lọc ổn định qua 135 chu kỳ nuôi cấy, được lưu giữ trong ngân hàng gen vi sinh vật.

2. Chủng virus nào được tuyển chọn có hoạt lực cao nhất và các chỉ số sinh học đạt được là bao nhiêu?
Trong số 3 chủng NPV phân lập được (TL.1a, TL.2a, TL.3a), chủng TL.1a có hoạt lực cao nhất với tỷ lệ gây chết sâu non sâu khoang đạt 80,00% và số lượng thể vùi hình thành đạt $2,6 \times 10^8$ OB/10 sâu.

3. Vì sao không thể sử dụng trực tiếp thể vùi (OB) ngoài tự nhiên để lây nhiễm vào dịch tế bào in vitro?
Do tế bào côn trùng nuôi cấy chỉ sinh trưởng ở điều kiện pH ≤ 7,0, trong khi vỏ protein polyhedrin của thể vùi chỉ bị phân hủy trong môi trường kiềm (pH ≥ 9,0). Vì vậy, thể vùi phải được xử lý nhân tạo bằng dung dịch kiềm ($Na_2CO_3$ 0,1 M, pH 11,2) để giải phóng các hạt virion hoạt động trước khi tiến hành lây nhiễm vào dịch tế bào.

4. Quy mô nhân sinh khối tế bào tối ưu nhất được xác lập trong phòng thí nghiệm là gì?
Luận án xác định phương pháp nuôi lắc trên bình lọc khuẩn dung tích 1.000 ml chứa 750 ml môi trường nuôi cấy ở nhiệt độ 26–28°C, pH 6,2–6,8 bổ sung 10% FBS cho mật độ tế bào và khả năng nhân sinh khối cao nhất ở quy mô phòng thí nghiệm.

5. Hiệu lực trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-1 WP ngoài đồng ruộng đạt kết quả như thế nào?
Khảo nghiệm thực địa tại Hà Nội cho thấy chế phẩm NPV-1 WP đạt hiệu lực phòng trừ sâu khoang từ 80,51% đến 82,29% trên cây bắp cải (tại xã Vân Nội) và đạt 96,92% trên cây đậu tương (tại xã Mỹ Thành).

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Lê Thanh Hải Hà đã giải quyết thành công quy trình công nghệ phát triển sinh khối virus nhân đa diện (NPV) trên dòng tế bào mô phôi sâu khoang in vitro ở quy mô phòng thí nghiệm. Nghiên cứu đã xác định các thông số môi trường tối ưu cho sinh trưởng tế bào, quy trình kiềm hóa giải phóng virion và các chỉ số lây nhiễm tối ưu để thu nhận thể vùi với mật độ cao. Hai chế phẩm dạng bột thấm nước (NPV-1 WP và NPV-2 WP) được chế tạo từ thể vùi tinh sạch đã thể hiện hiệu lực phòng trừ sâu khoang cao ngoài đồng ruộng trên bắp cải (80,51–82,29%) và đậu tương (96,92%), cung cấp cơ sở khoa học và thực tiễn quan trọng cho việc sản xuất thuốc trừ sâu sinh học thay thế hóa chất độc hại tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Cơ sở khoa học của đề tài nghiên cứu NPV (Nuclear Polyhedrosis Virus) thuộc giống Alphabaculovirus, họ Baculoviridae là một trong số ít vi rút có thể tồn tại ở dạng thể vùi (Occlusion Bodies- OB) nên dễ dàng phân lập, lưu giữ và tạo dạng thành chế phẩm sinh học. Trên đồng ruộng, NPV thường phát sinh gây chết sâu hại với tỷ lệ khá cao và luôn tồn tại dưới dạng thể vùi, các thể vùi có thể tồn tại tới 30 năm ngoài tự nhiên và chỉ bị tiêu diệt khi thể vùi gặp phải môi trường đất, nước có pH ≥ 9,0 hoặc dính bám trên thân cây, lá cây, tàn dư cây trồng khi phơi nhiễm dưới ánh sáng trực xạ mạnh hoặc tia cực tím (Kitajima, 1989; Grzywacz et al. Sau khi các cá thể sâu non ăn phải thức ăn có mang thể vùi NPV, gặp pH cao (> 9,0) của ruột giữa làm vỏ protein của thể vùi bị phá vỡ, giải phóng các thể hoạt động (virion) và các thể vi rút hoạt động này sẽ xâm nhiễm vào nhu mô ruột giữa.

Sau đó xâm nhiễm sang các mô bào khác của cơ thể côn trùng. Sau 2-3 ngày, sâu ngừng ăn và sau 5- 7 ngày thì sâu chết (Sajap et al. Khi sâu non chết, cơ thể căng mọng rất dễ bị vỡ khi có va chạm nhẹ và sau khi vỡ, thân sâu dính bám vào lá hoặc thân cây và treo ngược cơ thể. Khi sâu chết, các thể hoạt động của NPV tập hợp lại trong vỏ bọc protein thành thể vùi, thể vùi được giải phóng ra môi trường đồng ruộng và tồn tại trong đất, trên tàn dư cây trồng.

Một sâu non chết bệnh NPV có thể chứa tới 24.553 thể vùi được giải phóng ra môi trường đồng ruộng và có thể tồn tại từ 20-30 năm. Trong quá trình canh tác cây trồng, làm đất hoặc do mưa gió, các thể vùi này dính bám lên lá cây và tiếp tục chờ cơ hội tiếp tục xâm nhiễm gây chết cho sâu hại (Pourmirza, 2000) [15]. Như vậy, việc phun chế phẩm NPV vừa có ý nghĩa như một loại thuốc sinh học để phòng trừ sâu hại một cách trực tiếp, vừa có tác dụng bổ sung nguồn virus hữu ích, góp phần bảo vệ cân bằng sinh thái trên đồng ruộng. Tuy nhiên, NPV chỉ có thể lây nhiễm và phát triển sinh khối trong các tế bào sống của cơ thể côn trùng ở điều kiện môi trường thích hợp, như vậy việc phát triển 5 luan an sinh khối NPV phải được thực hiện trên cơ thể sâu còn sống như phương pháp nuôi sâu truyền thống hoặc lây nhiễm trên các mô, tế bào được nuôi nhân (Kalmakoff và Ward, 2007; Elanchezhyan, 2009; Granados et al., 2007; Agathos et al., 2007, Rohrmann và George, 2011) [6, 11, 9, 16].

Vì vậy, cần thiết phải nghiên cứu để có sự hiểu biết đầy đủ về điều kiện phát triển sinh khối tế bào côn trùng, lây nhiễm NPV trên tế bào nuôi nhân trên cơ sở sử dụng các chủng NPV có hoạt lực cao đã được tuyển chọn để phát triển sinh khối NPV phục vụ phát triển thuốc trừ sâu sinh học phòng trừ sâu hại. Tổng quan tài liệu 1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 1. Nghiên cứu sâu khoang hại cây trồng Các nhà khoa học trên thế giới đều xác định sâu khoang (Spodoptera litura Fabricius; Noctuidae: Lepidoptera) là loài sâu đa thực, phá hại trên trên 290 loài cây thuộc 90 họ thực vật khác nhau và được coi là đối tượng sâu hại quan trọng trong sản xuất nông nghiệp ở nhiều nước trên thế giới (Kumari và Singh, 2009; Hong, 2002, Jadhav et al, 2015, Cherry et al.

Theo tổng hợp của Kuldeep et al.