Đặt vấn đề Ngộ độc thực phẩm xảy ra khi chúng ta sử dụng thức ăn, nƣớc uống không đƣợc bảo quản đúng cách dẫn đến sản phẩm bị hƣ thối do nhiễm khuẩn hoặc hóa chất độc hại. Các nghiên cứu gần đây đã xác định một trong những nguyên nhân của nhiều trƣờng hợp ngộ độc thức ăn là do vi khuẩn E. coli thuộc nhóm vi khuẩn đƣờng ruột Enterobacteriaceae, có nhiều trong tự nhiên, trong ruột của ngƣời và gia súc. Trong đƣờng ruột, chúng hiện diện chủ yếu ở đại tràng nên còn đƣợc gọi là vi khuẩn đại tràng.
coli nhiễm vào đất, nƣớc… từ phân của động vật. Khi gặp điều kiện thuận lợi cho sự phát triển chúng sẽ gây bệnh. coli là những chủng ít độc hại, tuy nhiên cũng có vài chủng rất độc nhƣ chủng E. coli O157:H7 có thể tìm thấy trong ruột và trong phân của các loài gia súc, đặc biệt là trong phân bò, chất thải của bò và các sản phẩm nhƣ thịt bò, sữa bò chƣa khử trùng.
Các bệnh có liên quan đến E. coli là tiêu chảy, viêm phổi, viêm đƣờng dẫn tiểu và một số bệnh khác. Triệu chứng bị nhiễm trùng vi khuẩn thƣờng khác nhau, nhƣng nhìn chung, bệnh nhân hay có các triệu chứng nhƣ: nôn, đau bụng, sốt, xuất huyết dƣới da, tăng huyết áp, tiêu chảy thƣờng có máu. Đại đa số bệnh nhân phục hồi sau 5 đến 7 ngày.
coli quá phổ biến, nên hàng năm trên khắp thế giới đều có ngƣời mắc bệnh do vi khuẩn này. Các chuyên gia ƣớc tính rằng ở Mỹ mỗi năm có khoảng 70 nghìn ngƣời mắc bệnh liên quan đến E. Ở Việt Nam, theo thống kê của Cục Vệ sinh An toàn Thực phẩm, năm 2010 có 175 vụ ngộ độc với 5664 ngƣời mắc, trong đó có 3978 ngƣời phải nhập viện và 51 ngƣời tử vong. Năm 2011 có 148 vụ ngộ độc, trong đó có 4700 ngƣời mắc với 3663 ngƣời phải nhập viện và 27 ngƣời tử vong.
Năm 2012 có 168 vụ ngộ độc, trong đó có 5541 ngƣời mắc với 4335 ngƣời nhập viện và 34 ngƣời tử vong. Nhƣ vậy, trong ba năm liên tiếp có 491 vụ ngộ độc với 112 ngƣời tử vong. Trong năm 2013 nƣớc ta xảy ra nhiều vụ ngộ độc nghiêm trọng nhất là những tháng cuối năm. Số liệu thống kê trong quý III năm 2013 cho thấy, trong 40 vụ ngộ độc thực phẩm thì 23 vụ do vi sinh vật gây ra.
Chủng vi khuẩn E. coli O157:H7 đƣợc xác định lần đầu tiên ở Việt Nam e 2 vào năm 2005 [63], tiếp đó đã có những nghiên cứu về E. Trong các vụ dịch gây tiêu chảy ở nƣớc ta hiện chƣa tìm thấy sự hiện diện của chủng E. coli O157:H7, tuy nhiên những vi khuẩn thuộc các nhóm khác gây ngộ độc và các bệnh liên quan đã đƣợc phát hiện trong nhiều trƣờng hợp [35].
Trong sinh hoạt hàng ngày, không ngoại trừ trƣờng hợp chúng ta bị nhiễm E. coli O157:H7 thông qua tiếp xúc hay phơi nhiễm với phân ngƣời, động vật và gia cầm. Việc xác định nhanh, chính xác sự có mặt của vi khuẩn E. coli O157:H7 trong các mẫu thực phẩm góp phần bảo vệ sức khỏe cho con ngƣời là cần thiết.
Việc sử dụng kháng thể kháng E.coli O157:H7, một trong những yếu tố quan trọng để phát hiện E. coli O157:H7 vẫn còn chƣa đƣợc nghiên cứu. Chính vì vậy, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện chủng vi khuẩn Escherichia coli O157:H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu”. Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu các kỹ thuật phát hiện chủng vi khuẩn E.
coli O157:H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu với E. Nội dung nghiên cứu (i) Xác định chủng E. coli O157:H7 bằng các kỹ thuật di truyền: (1) Tách dòng và xác định trình tự gen 16S rRNA; (2) Tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa cho các độc tố Stx1, Stx2 và (3) Kỹ thuật LAMP. (ii) Tạo dòng gen mã hóa cho kháng thể đặc hiệu chủng vi khuẩn E.
coli O157:H7 bằng kỹ thuật phage display; (iii) Thu nhận kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7; (iv) Xác định độ nhạy, tính đặc hiệu của kháng thể tái tổ hợp. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Đặc điểm chung của chủng vi khuẩn E.
coli O157:H7 Vi khuẩn E. coli O157:H7 hiện diện một cách tự nhiên trong ruột ngƣời và động vật, có thể đƣợc tìm thấy trong ruột và trong phân của các loài gia súc, đặc biệt là trong phân bò. Thịt băm, thịt xay, thịt hamburger thƣờng có tỷ lệ nhiễm khuẩn cao nhất, ngoài ra E. coli cũng còn có thể nhiễm vào nguồn nƣớc, rau xanh, trái cây, giá sống, rƣợu táo, sữa và các loại nƣớc trái cây trong lon, trong hộp nếu chúng không đƣợc hấp khử trùng trƣớc khi bán ra.
Ở những ngƣời bình thƣờng, E. coli O157:H7 gây rối loạn tiêu hóa nhƣ đau bụng, tiêu chảy, nôn, thân nhiệt có thể tăng chút ít. Bình thƣờng bệnh tự khỏi sau 1 tuần hay 10 ngày. Bệnh có thể rất nặng ở trẻ em, ngƣời cao tuổi và ở những ngƣời mà hệ miễn dịch đã bị suy yếu do bệnh tật.
3- 5% trƣờng hợp có thể gây biến chứng sau vài ba tuần bị nhiễm bệnh. Độc tố Shiga- like toxin của E. coli O157:H7 gây sung huyết, hủy hoại niêm mạc ruột, gây tiêu chảy có máu, làm hƣ thận và đồng thời làm giảm lƣợng nƣớc tiểu. Đây là hội chứng xuất huyết đƣờng ruột (Hemolytic Uremic Syndrome, HUS), rất nguy hiểm có thể gây tử vong, hoặc phải lọc thận suốt đời [72].
Vị trí phân loại: Giới : Bacteria Ngành(phylum): Proteobacteria Lớp (class): Gamma Proteobacteria Bộ (ordo): Enterobacteriales Họ (familia): Enterobacteriaceae Chi (genus): Escherichia Loài (species): E. Hình ảnh vi khuẩn E. coli Chủng: O157: H7 O157:H7 trên kính hiển vi điện tử [104] E. coli O157:H7 thuộc nhóm vi khuẩn đƣờng ruột Enterobacteriaceae, thuộc loại trực khuẩn Gram âm, di động bằng tiêm mao quanh tế bào, không tạo bào tử, có vỏ ngoài (capsule) và có lông bám (pili) (Hình 1.
coli O157:H7 có cấu tạo đơn e 4 giản gồm bên ngoài là vách tế bào, tiếp theo là màng sinh chất, hai lớp màng này liên kết chặt chẽ với nhau để bảo vệ tế bào. Bên trong lớp màng là tế bào chất, nơi chứa các enzyme, đƣờng, ATP, và các phân tử khác [60], [64]. coli O157:H7 là vi sinh vật kị khí không bắt buộc, có khả năng hô hấp và lên men, không sinh bào tử, tế bào tồn tại dạng đơn lẻ hoặc theo cặp đôi. Khoảng nhiệt độ tồn tại của vi khuẩn này từ 7-50C, tối thích ở 37C, bị tiêu diệt ở nhiệt độ trên 70C.
coli O157:H7 sinh trƣởng đƣợc trên môi trƣờng có pH từ 4,4-9,0 và có thể tồn tại đƣợc ở điều kiện pH 2,5 ở 37C trong 2-7 giờ, pH tối ƣu cho vi khuẩn hoạt động là từ 6-7 [16]. Vi khuẩn bị ức chế trong môi trƣờng có nồng độ muối là 8,5%, chậm phát triển ở nồng độ muối trên 2,5%. coli O157:H7 sản sinh ra độc tố gọi là Shiga-like toxin (hoặc Verocytoxin) do có sự giống nhau với độc tố gây bệnh lị đƣợc tạo ra bởi Shigella dysenteria type 1, vi khuẩn này cũng gây ra hội chứng xuất huyết đƣờng ruột (HUS) ở nhiều quốc gia trên thế giới. Có rất nhiều chủng vi khuẩn E.
coli cũng sản sinh Shiga-like toxin nhƣng E. coli O157:H7 là chủng phổ biến nhất. Độc tố này đƣợc cho là yếu tố gây bệnh của vi khuẩn [33]. Hình ảnh vi khuẩn E.
coli O157:H7 trên môi trƣờng có MUG [103]. Dƣới ánh sáng UV 365 nm, trên môi trƣờng có MUG vi khuẩn E. coli O157:H7 không phát quang, các chủng vi khuẩn E. coli khác phát quang.
coli O157:H7 không có khả năng lên men đƣờng sorbitol và cellobiose, không tạo ra β-D-glucuronidase do đó không chuyển hóa 4-methylumbelliferyl-β- D-glucuronide (MUG) thành 4- methylumbelliferone nên khi chiếu dƣới đèn UV khuẩn lạc không phát huỳnh quang (Hình 1. Khi nuôi cấy trên môi trƣờng e 5 Fluorocult có bổ sung sorbitol và MUG do không có khả năng lên men đƣờng sorbitol, khuẩn lạc có màu xanh nhạt phân biệt với các vi khuẩn E. coli khác khuẩn lạc có màu vàng do lên men đƣợc đƣờng sorbitol. Đây là đặc điểm đƣợc sử dụng trong xét nghiệm để phát hiện sự có mặt của vi khuẩn này [60].
Bản đồ hệ gen (genome) của vi khuẩn E. DNA của vi khuẩn E. coli O157:H7 gồm hệ gen vùng nhân có kích thƣớc khoảng 5,5 triệu bp, gồm 5483 gen và 2 plasmid: plasmid lớn (pO157) có kích thƣớc 9,3 kb và plasmid nhỏ (pOSAKI) kích thƣớc 3,3 kb, 7 chuỗi rRNA (16S, 23S, 5S); số chuỗi của tRNA và mRNA là 102 (Bảng 1. Tỷ lệ G+C là 50,5 %.
coli O157:H7 là loại vi khuẩn sinh độc tố, trong hệ gen vùng nhân chứa 2 gen mã hóa cho độc tố đặc trƣng của vi khuẩn này là Stx1 và Stx2 [62], đƣợc sử dụng nhƣ là những marker cho việc phân loại và phát hiện. Mặt khác các phƣơng pháp này cho thấy các chủng là thể liên tục chứ không phải phân thành các chủng khác nhau. Tên của vi khuẩn bắt nguồn từ 2 loại kháng nguyên quan trọng nhất của E. coli là kháng nguyên O (Ohne- kháng nguyên soma) và kháng nguyên H (Hauch- kháng nguyên lông) [33], ngoài ra còn có kháng nguyên K (capsular) và kháng nguyên F (fimbriae).
Kháng nguyên soma O đƣợc xác định bởi phần polysaccharide của thành thế bào lipopolysaccharide, còn kháng nguyên H đƣợc xác định bởi e 6 protein roi. Có 174 kháng nguyên O (đánh số thứ tự từ 1- 181, trong đó không có các số 31, 47, 67, 72, 93, 94 và 122) và 53 kháng nguyên H. Các thông số hệ gen của vi khuẩn E. coli O157:H7 Đặc điểm Hệ gen pO157 pOSAK1 Kích thƣớc (bp) 5498450 92721 3306 Tỉ lệ G+C (%) 50,5 47,6 43,4 Khung đọc mở (ORF): 5361 83 3 Vùng mã hóa protein (%) 88,1 82,5 52,8 Chiều dài trung bình của các ORF (bp) 904 922 579 rRNA (16S-23S-5S) 7 0 0 tRNA và mRNA 103 0 0 Khái niệm về type gây bệnh chỉ hữu ích cho việc nghiên cứu về tác nhân gây bệnh, truyền bệnh và có thể có có ích trong thiết lập các quy trình chẩn đoán.
Cách phân loại nhƣ vậy cho thấy sự đa dạng giữa các chủng STEC (Shiga Toxin-Producing E. Nielsen tìm thấy 312 chủng STEC phân lập từ bệnh nhân ở Đan Mạch thuộc 50 nhóm O và 75 type O:H [64]. Phƣơng pháp phân loại dựa vào kháng nguyên O và H là chủ yếu, tuy nhiên nhiều vi khuẩn E. coli đƣợc phân lập bao gồm cả một số nhóm STEC chỉ có một kháng nguyên O hoặc một kháng nguyên H hoặc không có cả hai trong hệ thống quốc tế, do đó không thể phân loại bằng type huyết thanh.