Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện chủng escherichia coli o157 h7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện chủng Escherichia coli O157:H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu, ứng dụng trong y sinh.

• Tác giả: Hoàng Phú Hiệp
• Người hướng dẫn: PGS. TS Lê Quang Huấn
• Trường học: Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Di truyền và SHHĐ
• Đề tài: Nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện E. coli O157:H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.2. Nội dung nghiên cứu
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Đặc điểm chung của chủng vi khuẩn E. coli O157:H7
• 1.2. Độc tố Shiga-like toxin: Bản chất và tác hại

Tóm tắt

I. Giới thiệu và mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu tập trung vào phát triển kỹ thuật phát hiện E. coli O157:H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu nhằm ứng dụng trong an toàn thực phẩm và chẩn đoán vi sinh. E. coli O157:H7 là chủng vi khuẩn nguy hiểm, gây ra các bệnh nghiêm trọng như tiêu chảy xuất huyết và hội chứng HUS. Mục tiêu chính của nghiên cứu là phát triển các phương pháp phát hiện nhanh và chính xác, đồng thời tạo ra kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu để ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị.

1.1. Vấn đề nghiên cứu

E. coli O157:H7 là nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm, đặc biệt ở các nước đang phát triển như Việt Nam. Việc phát hiện sớm và chính xác chủng vi khuẩn này là cần thiết để ngăn chặn dịch bệnh. Nghiên cứu này nhằm giải quyết vấn đề thiếu các phương pháp phát hiện hiệu quả và kháng thể đặc hiệu để ứng dụng trong thực tế.

1.2. Mục tiêu cụ thể

Nghiên cứu tập trung vào ba mục tiêu chính: (1) Phát triển kỹ thuật phát hiện E. coli O157:H7 dựa trên phân tích gen, (2) Tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu bằng kỹ thuật phage display, và (3) Đánh giá độ nhạy và tính đặc hiệu của kháng thể tái tổ hợp.

II. Tổng quan về E

E. coli O157:H7 là chủng vi khuẩn thuộc nhóm Enterobacteriaceae, gây bệnh nghiêm trọng ở người. Chủng này sản sinh độc tố Shiga-like toxin, gây tổn thương niêm mạc ruột và dẫn đến các biến chứng nguy hiểm. Vi khuẩn này thường được tìm thấy trong thịt bò, sữa chưa tiệt trùng và các sản phẩm thực phẩm khác.

2.1. Đặc điểm sinh học

E. coli O157:H7 là vi khuẩn Gram âm, di động bằng tiêm mao, không tạo bào tử. Chủng này có khả năng tồn tại trong môi trường khắc nghiệt như pH thấp và nhiệt độ cao. Độc tố Shiga-like toxin là yếu tố gây bệnh chính, gây tổn thương tế bào và dẫn đến các triệu chứng nghiêm trọng.

2.2. Tác hại và dịch tễ học

Chủng E. coli O157:H7 gây ra các bệnh như tiêu chảy xuất huyết, viêm đại tràng và hội chứng HUS. Tại Việt Nam, các vụ ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn này đã được ghi nhận, đặc biệt trong các sản phẩm thịt và sữa.

III. Phương pháp phát hiện E

Nghiên cứu sử dụng các kỹ thuật phát hiện E. coli như PCR, LAMP và kháng thể tái tổ hợp. Các phương pháp này cho phép phát hiện nhanh và chính xác sự hiện diện của vi khuẩn trong các mẫu thực phẩm và môi trường.

3.1. Kỹ thuật PCR

PCR được sử dụng để nhân bản các gen đặc trưng của E. coli O157:H7, bao gồm gen mã hóa 16S rRNA và các gen độc tố Stx1, Stx2. Kỹ thuật này cho phép xác định chính xác chủng vi khuẩn trong thời gian ngắn.

3.2. Kỹ thuật LAMP

LAMP là phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt, cho phép phát hiện E. coli O157:H7 mà không cần thiết bị phức tạp. Kỹ thuật này có độ nhạy cao và thích hợp cho ứng dụng thực địa.

IV. Tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu

Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật phage display để tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu với E. coli O157:H7. Kháng thể này được tinh sạch và đánh giá hoạt tính bằng các phương pháp như ELISA và Western blot.

4.1. Kỹ thuật phage display

Phage display được sử dụng để sàng lọc và chọn lọc các dòng kháng thể đặc hiệu với E. coli O157:H7. Kỹ thuật này cho phép tạo ra các kháng thể có độ đặc hiệu cao và khả năng ứng dụng trong chẩn đoán.

4.2. Đánh giá hoạt tính kháng thể

Kháng thể tái tổ hợp được đánh giá hoạt tính bằng ELISA và Western blot. Kết quả cho thấy kháng thể có độ nhạy và tính đặc hiệu cao, phù hợp để sử dụng trong các ứng dụng thực tế.

V. Kết quả và ứng dụng

Nghiên cứu đã thành công trong việc phát triển các kỹ thuật phát hiện E. coli O157:H7 và tạo ra kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu. Các kết quả này có ý nghĩa quan trọng trong an toàn thực phẩm và chẩn đoán vi sinh, giúp ngăn chặn các vụ ngộ độc và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

5.1. Ứng dụng trong an toàn thực phẩm

Các kỹ thuật phát hiện E. coli O157:H7 được phát triển trong nghiên cứu có thể ứng dụng để kiểm soát chất lượng thực phẩm, đặc biệt trong các sản phẩm thịt và sữa.

5.2. Ứng dụng trong chẩn đoán

Kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu có thể được sử dụng trong các bộ kit chẩn đoán nhanh, giúp phát hiện sớm và chính xác sự hiện diện của E. coli O157:H7 trong các mẫu bệnh phẩm.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật là một trong những thách thức y tế công cộng và an ninh lương thực nghiêm trọng nhất trên phạm vi toàn cầu cũng như tại Việt Nam. Trong các tác nhân gây bệnh đường ruột nguy hiểm, chủng vi khuẩn Escherichia coli O157:H7 thuộc nhóm Enterohaemorrhagic E. coli (EHEC) hay Shiga-like toxin-producing E. coli (STEC) nổi lên như một mầm bệnh đặc biệt độc hại. Vi khuẩn này tiết ra ngoại độc tố Shiga (Stx1 và Stx2), có khả năng phá hủy tế bào biểu mô ruột, gây viêm đại tràng xuất huyết (Hemorrhagic Colitis - HC) và hội chứng tan máu suy thận cấp (Hemolytic Uremic Syndrome - HUS) với tỷ lệ tử vong từ 3% đến 5%, đe dọa trực tiếp tính mạng của trẻ em dưới 10 tuổi và người cao tuổi. Tại Việt Nam, theo số liệu từ Cục Vệ sinh An toàn Thực phẩm - Bộ Y tế, giai đoạn 2010 - 2012 đã ghi nhận 491 vụ ngộ độc thực phẩm với 15.905 người mắc, 11.976 người phải nhập viện và 112 trường hợp tử vong; riêng quý III năm 2013, có đến 23/40 vụ ngộ độc do vi sinh vật gây ra. Chủng E. coli O157:H7 được phân lập lần đầu tiên tại Việt Nam vào năm 2005 và liên tục được phát hiện tiềm ẩn trong các nguồn thực phẩm tươi sống như thịt bò, thịt lợn và rau quả.

Tuy nhiên, rào cản lớn trong công tác kiểm soát an toàn thực phẩm là các phương pháp chẩn đoán vi sinh truyền thống (nuôi cấy phân lập, thử nghiệm lên men sorbitol, phản ứng MUG) đòi hỏi thời gian kéo dài từ 24 đến 72 giờ và độ nhạy hạn chế. Trong khi đó, việc ứng dụng các công cụ sinh học phân tử như PCR tiêu chuẩn vẫn phụ thuộc vào hệ thống luân nhiệt đắt tiền, và các kit ELISA thương mại sử dụng kháng thể đơn dòng (mAb) từ động vật có giá thành rất cao, đồng thời tiềm ẩn nguy cơ phản ứng chéo. Khoảng trống nghiên cứu (research gap) cốt lõi tại Việt Nam lúc bấy giờ là sự thiếu vắng một quy trình tích hợp giữa kỹ thuật khuếch đại gen đẳng nhiệt tại chỗ (LAMP) và công nghệ sản xuất kháng thể tái tổ hợp đơn chuỗi (scFv) nguồn gốc người có độ đặc hiệu cao, không phụ thuộc vào hệ thống nuôi cấy tế bào lai động vật (hybridoma).

Luận án tiến sĩ của nghiên cứu sinh Hoàng Phú Hiệp (2014) với đề tài "Nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện chủng vi khuẩn Escherichia coli O157:H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu" được thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS. TS. Lê Quang Huấn và PGS. TS. Nguyễn Bích Nhi tại Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, phối hợp cùng Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên. Đề tài tập trung giải quyết các câu hỏi và giả thuyết khoa học sau:

• Câu hỏi nghiên cứu 1 (RQ1): Trình tự gen 16S rRNA và các gen độc tố Stx1, Stx2 của chủng E. coli O157:H7 phân lập tại Việt Nam có những đặc điểm tương đồng di truyền và sai khác cấu trúc nào so với các chủng chuẩn quốc tế trên GenBank?
• Câu hỏi nghiên cứu 2 (RQ2): Kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt qua vòng lặp (LAMP) nhắm vào gen độc tố Stx2 có đạt được độ nhạy, độ đặc hiệu vượt trội và thời gian phát hiện nhanh hơn so với PCR truyền thống trong điều kiện không có máy luân nhiệt hay không?
• Câu hỏi nghiên cứu 3 (RQ3): Liệu công nghệ hiển thị thực khuẩn thể (Phage Display) sử dụng thư viện tái tổ hợp bán tổng hợp của người (Griffin.1) có thể phân lập được mảnh kháng thể đơn chuỗi (scFv) có ái lực liên kết đặc hiệu cao với toàn bộ tế bào vi khuẩn E. coli O157:H7 nguyên vẹn mà không gây phản ứng chéo với các chủng E. coli tạp nhiễm khác?
• Giả thuyết nghiên cứu 1 (H1): Phân tích phân tử đa locus kết hợp gen cấu trúc 16S rRNA và gen độc lực Stx sẽ định danh chính xác tuyệt đối chủng E. coli O157:H7 ở mức độ phân loài.
• Giả thuyết nghiên cứu 2 (H2): Kỹ thuật LAMP với bộ 4 mồi chuyên biệt sẽ khuếch đại gen đích ở 65°C trong vòng 60 phút, cho phép phát hiện bằng mắt thường thông qua độ đục magie pyrophosphate ($Mg_2P_2O_7$) và thuốc nhuộm huỳnh quang SYBR Green I.
• Giả thuyết nghiên cứu 3 (H3): Kháng thể tái tổ hợp scFv dung hợp với protein Thioredoxin (Trx) biểu hiện trong E. coli BL21 (DE3) pLysS duy trì cấu trúc không gian 3D chuẩn, cho phép tinh sạch bằng sắc ký ái lực và ứng dụng hiệu quả trong các phản ứng miễn dịch ELISA, Dot blot, Western blot và phức hợp nano-silica bắt giữ tế bào vi khuẩn.

Khung lý thuyết của luận án được xây dựng dựa trên sự giao thoa của ba học thuyết nền tảng: Lý thuyết tiến hóa phân tử và phân loại học vi khuẩn dựa trên rRNA (Woese, 1987; Weisburg et al., 1991), Lý thuyết cấu trúc - chức năng độc tố A-B gây độc ribosome (Endo et al., 1988; O'Brien et al., 1987), và Lý thuyết tiến hóa định hướng in vitro cùng công nghệ kỹ thuật kháng thể (Smith, 1985; McCafferty et al., 1990; Griffiths et al., 1994). Phạm vi nghiên cứu bao quát từ mức độ hệ gen (hệ gen chuẩn 5,49 Mb và 2 plasmid pO157, pOSAK1), thư viện thực khuẩn thể Griffin.1 với độ đa dạng $1,2 \times 10^9$ dòng độc lập, cho đến các hệ thống biểu hiện vector pET28a-TRX, pJET1.2/blunt và pBT.

Literature Review và Positioning

Tổng quan y văn quốc tế ghi nhận ba luồng nghiên cứu chính trong việc phát hiện và kiểm soát E. coli O157:H7:

Luồng nghiên cứu thứ nhất tập trung vào các chỉ thị kiểu hình (phenotype) và huyết thanh học (serotyping). Kể từ khi Karmali et al. (1983) và O'Brien et al. (1987) chứng minh vai trò gây bệnh của Shiga-like toxin (Verotoxin do Konowalchuk et al., 1977 phát hiện), việc phân loại dựa trên kháng nguyên soma O (Ohne) và kháng nguyên lông H (Hauch) trở thành tiêu chuẩn vàng. Tuy nhiên, các nghiên cứu của Nielsen et al. (2006) khi phân tích 312 chủng STEC tại Đan Mạch đã chỉ ra rằng có sự đa dạng rất lớn với hơn 50 nhóm O và 75 kiểu O:H, trong đó nhiều chủng STEC bị mất kháng nguyên H hoặc không thể định danh bằng huyết thanh học thông thường. Điều này bộc lộ hạn chế cố hữu của phương pháp huyết thanh truyền thống.

Luồng nghiên cứu thứ hai là sự bùng nổ của sinh học phân tử dựa trên DNA. Weisburg et al. (1991) đã thiết lập hệ thống mồi phổ quát khuếch đại gen 16S rRNA (~1540 bp) chứa 9 vùng siêu biến (V1-V9), tạo tiền đề cho phân loại học phân tử. Keswani et al. (2001) chứng minh rằng mức độ tương đồng 16S rRNA dưới 98,6% tương đương với độ tương đồng lai DNA dưới 70%, xác lập ngưỡng phân biệt loài. Để xác định độc lực, Smith et al. (1987) và Sanchez et al. (2010) đã phát triển các cặp mồi PCR đặc hiệu cho gen Stx1 và Stx2. Bước đột phá tiếp theo diễn ra khi Notomi et al. (2000) và Nagamine et al. (2002) phát minh kỹ thuật LAMP khuếch đại đẳng nhiệt sử dụng enzyme Bst DNA polymerase với 4 đến 6 mồi nhận diện 6 đến 8 vùng chuyên biệt trên gen đích. Maruyama et al. (2003) đã ứng dụng thành công LAMP để phát hiện độc tố VT2 trong các mẫu thực phẩm tại Nhật Bản với độ nhạy cao gấp hàng chục lần PCR thông thường.

Luồng nghiên cứu thứ ba là sự chuyển dịch từ kháng thể đơn dòng cổ điển sang kháng thể tái tổ hợp (recombinant antibodies). Công nghệ hybridoma do Köhler & Milstein (1975) phát minh dù tạo ra bước ngoặt nhưng bộc lộ nhược điểm lớn khi ứng dụng chẩn đoán và điều trị: hiện tượng sinh kháng thể kháng chuột ở người (HAMA - Human Anti-Mouse Antibody), tế bào lai kém ổn định di truyền và quy trình sản xuất tốn kém (Hudson & Souriau, 2003). Để khắc phục, Smith (1985) đã phát minh kỹ thuật hiển thị thực khuẩn thể (Phage Display). Griffiths et al. (1994) tại Trung tâm Kỹ thuật Protein Cambridge (MRC, Vương quốc Anh) đã tạo ra thư viện bán tổng hợp Griffin.1 biểu hiện các mảnh biến đổi đơn chuỗi scFv ($V_H\text{ - Linker - }V_L$) trên protein vỏ pIII của thực khuẩn thể M13 với độ đa dạng lên tới $1,2 \times 10^9$ bản sao. Công nghệ này cho phép chọn lọc in vitro các kháng thể người đặc hiệu cao mà không cần gây miễn dịch động vật.

   [Huyết thanh & Sinh hóa]          [Sinh học phân tử DNA]             [Kỹ thuật Kháng thể]
   - Karmali (1983): STEC O:H        - Weisburg (1991): 16S rRNA        - Köhler & Milstein (1975): mAb
   - Nielsen (2006): 312 chủng       - Notomi (2000): Kỹ thuật LAMP     - Smith (1985): Phage Display
   - Nhược điểm: Phản ứng chéo,      - Maruyama (2003): LAMP-VT2        - Griffiths (1994): Griffin.1
     thời gian nuôi cấy 24-72h       - Ưu điểm: Nhanh, độ nhạy cao      - scFv ($V_H\text{-Linker-}V_L$)

Trong bối cảnh y văn đó, luận án của NCS. Hoàng Phú Hiệp định vị chính xác vào điểm giao thoa giữa sinh học phân tử hiện đại và công nghệ kháng thể tái tổ hợp. So với nghiên cứu của Sahilah et al. (2010) tại Malaysia (chỉ dừng lại ở PCR và RAPD trên 20 mẫu thịt bò) hay Zhao et al. (2010) tại Trung Quốc (sử dụng kháng thể đơn dòng đa dòng thương mại), luận án đã tiến một bước dài mang tính tiên phong tại Việt Nam: tự chủ quy trình phân lập gen kháng thể scFv người đặc hiệu từ thư viện Griffin.1, thiết kế vector biểu hiện dung hợp pET28a-TRX, tối ưu hóa tinh sạch protein tái tổ hợp và bước đầu tích hợp phức hệ nano-silica phát quang phục vụ chẩn đoán nhanh.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mang lại những đóng góp lý thuyết quan trọng làm sâu sắc thêm các mô hình sinh học phân tử và miễn dịch học:

1. Mở rộng lý thuyết cấu trúc kháng thể đơn chuỗi (scFv Framework Theory): Luận án tái khẳng định và mở rộng mô hình phân tử của Bird et al. (1988) và Huston et al. (1988) về cấu trúc mảnh kháng thể đơn chuỗi scFv. Bằng việc chèn đoạn peptide nối linh hoạt (linker) gồm 15 amino acid $(Gly_4Ser)_3$ giữa vùng biến đổi chuỗi nặng ($V_H$) và vùng biến đổi chuỗi nhẹ ($V_L$), phân tử scFv tái tổ hợp vẫn bảo toàn chính xác cấu trúc không gian 3D của các vùng quyết định tính bổ trợ (CDR1, CDR2, CDR3), giữ nguyên hoạt tính liên kết paratope - epitope với kháng nguyên bề mặt vi khuẩn mà không cần đến sự hiện diện của vùng hằng định ($F_c$ hay $C_H1/C_L$).
2. Củng cố lý thuyết phân loại học phân tử ribosome (Molecular Clock Hypothesis): Kết quả giải trình tự và phân tích phát sinh chủng loại đoạn gen 16S rRNA kích thước 1540 bp (được đăng ký trên GenBank quốc tế với mã số HQ658163) đã củng cố lý thuyết của Woese (1987) và Keswani et al. (2001). Độ tương đồng >99% giữa chủng phân lập tại Việt Nam và các chủng EHEC chuẩn thế giới chứng minh tính bảo tồn tiến hóa cao của bộ máy ribosome nhân sơ, đồng thời xác nhận tính hợp lệ của việc sử dụng 16S rRNA làm "đồng hồ phân tử" kết hợp với các marker độc lực di động (Stx1, Stx2 nằm trên prophage).
3. Làm sáng tỏ cơ sở sinh học phân tử của độc tố Shiga A1B5: Luận án hệ thống hóa và chứng minh cơ chế gây độc ở mức độ tế bào của phức hợp ngoại độc tố cấu trúc $A_1B_5$ (trọng lượng >70 kDa). Tiểu phần A1 (27,5 kDa) hoạt động như một enzyme N-glycosidase đặc hiệu, xúc tác cắt đứt liên kết glycosidic tại base Adenine ở vị trí 4324 của phân tử 28S rRNA thuộc tiểu đơn vị ribosome 60S, dẫn tới ngừng trệ toàn bộ quá trình dịch mã tổng hợp protein và gây chết tế bào biểu mô ruột cùng nội mô mao mạch thận. Tiểu phần B dạng pentamer (năm đơn vị 7,691 kDa) đóng vai trò thụ thể gắn đặc hiệu với glycolipid globotriaosylceramide (Gb3) trên màng tế bào đích.

                                  ĐỘC TỐ SHIGA (Stx1 / Stx2)
                                       Cấu trúc $A_1B_5$
            5 Tiểu phần B (Pentamer)                         1 Tiểu phần A (32,2 kDa)
       Globotriaosylceramide (Gb3)                        Enzyme N-Glycosidase
          Nội bào hóa độc tố vào tế bào                  Cắt đứt Adenine 4324 trên 28S rRNA
                                 Ức chế sinh tổng hợp Protein
                             Chết tế bào nội mô & Biểu mô ruột
                                 Gây hội chứng HC và HUS

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án được xây dựng theo mô hình tích hợp "Tam giác kỹ thuật phân tử" (The Molecular Tri-technique Framework), kết hợp chặt chẽ giữa:

1. Phân tích hệ gen đa locus (Multi-locus Genotypic Analysis): Định danh phân loại thông qua giải trình tự 16S rRNA và kiểm chứng sự hiện diện đồng thời của 2 gen độc lực Stx1 và Stx2 bằng hệ thống vector tách dòng pBT và pJET1.2/blunt.
2. Khuếch đại đẳng nhiệt độ nhạy cao (Isothermal Amplification): Thiết lập phản ứng LAMP 4 mồi chuyên biệt (VT2FIP, VT2BIP, mồi ngoài) nhận diện 6 vùng trên gen Stx2, phá vỡ giới hạn phụ thuộc vào chu trình nhiệt phức tạp.
3. Công nghệ miễn dịch tái tổ hợp định hướng (Targeted Recombinant Immuno-engineering): Sử dụng kỹ thuật hiển thị thực khuẩn thể (Phage Display) để chọn lọc kháng thể đơn chuỗi scFv từ thư viện Griffin.1, giải mã trình tự gen kháng thể bằng cặp mồi chuyên dụng LABF/LABR và 157F/157R, tái thiết kế vào vector biểu hiện dung hợp pET28a-TRX nhằm nâng cao độ hòa tan của protein.

Điều kiện biên (boundary conditions) của khung phân tích được xác định rõ: Phương pháp áp dụng tối ưu cho việc nhận diện chủng E. coli O157:H7 sinh độc tố Shiga; kháng thể scFv tuyển chọn nhắm vào các epitope bề mặt nguyên vẹn của tế bào sống, đảm bảo tính ứng dụng trực tiếp trong kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Luận án tuân thủ triết lý thực chứng (Positivism) và chủ nghĩa duy thực phê phán (Critical Realism) trong khoa học thực nghiệm sinh học. Thiết kế nghiên cứu là sự kết hợp đa tầng (Multi-level experimental design), đi từ phân tích cấu trúc vật liệu di truyền ở cấp độ phân tử (DNA tổng số, plasmid, PCR, giải trình tự), qua sàng lọc thư viện sinh học phân tử ngẫu nhiên in vitro (Phage display Biopanning), đến biểu hiện sinh tổng hợp protein tái tổ hợp và đánh giá hóa sinh miễn dịch học.

Cỡ mẫu và vật liệu sinh học chuẩn bao gồm:

• Chủng vi khuẩn đích: Escherichia coli O157:H7 chuẩn do Bộ môn Vi sinh vật - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (ĐHQG Hà Nội) cung cấp.
• Các chủng vi sinh vật đối chứng âm và đối chứng dương: Các chủng E. coli ATCC lành tính, tế bào khả biến E. coli TG1, DH5$\alpha$, và tế bào chủ biểu hiện protein E. coli BL21 (DE3) pLysS (Novagen, Invitrogen, Promega).
• Thư viện hiển thị thực khuẩn thể sợi Griffin.1 dạng scFv người trên nền vector phagemid pHEN2 (M13) chứa $1,2 \times 10^9$ dòng độc lập, do Trung tâm Kỹ thuật Protein (MRC, Cambridge, UK) cung cấp.
• Kháng thể đối chứng chuẩn thương mại: Kháng thể đơn dòng chuột đặc hiệu E. coli O157:H7 mã số ab75244, kháng thể cộng hợp anti-6X His-tag ab18184, và anti-mouse ab6789 của hãng Abcam (UK).

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình thực nghiệm được chuẩn hóa nghiêm ngặt theo Sambrook & Russell (2001) với các bước cải tiến chuyên biệt:

                            QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM ĐA TẦNG CỦA LUẬN ÁN
[Định danh Gen & LAMP]              [Phage Display Biopanning]            [Biểu hiện & Tinh sạch scFv]
1. Tách DNA tổng số & plasmid       1. Thư viện Griffin.1 ($1,2\cdot 10^9$) 1. Cắt nối vào pET28a-TRX
2. PCR 16S rRNA (Weisburg mồi)      2. Ủ với tế bào sống O157:H7          2. Biến nạp BL21(DE3)pLysS
3. Nhân gen Stx1, Stx2 (Smith mồi)  3. Rửa loại phage không liên kết      3. Cảm ứng IPTG ở 25°C-37°C
4. Thiết lập phản ứng LAMP Stx2:    4. Giải phóng phage ái lực cao        4. Tinh sạch qua cột Ni-NTA
   - 4 mồi: VT2FIP/BIP + F3/B3      5. Xâm nhiễm lại E. coli TG1             bằng phương pháp Hybrid
   - Ủ 65°C / 60 phút               6. Lặp lại 5 vòng sàng lọc            5. Thẩm tích & cô đặc protein
5. Đọc huỳnh quang SYBR Green I     7. Chọn Clone 20 đặc hiệu cao         6. Western blot & Dot blot

1. Quy trình phân tích gen và tách dòng phân tử:
   • Tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp ly giải enzyme (Protease K, SDS 1%), tinh sạch bằng Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1) và kết tủa bằng Isopropanol lạnh ở -20°C.
   • Tách chiết DNA plasmid bằng phương pháp kiềm hóa (Alkaline lysis) với các dung dịch I, II (NaOH 0,2N, SDS 1%), III (Potassium acetate 3M, pH 5,5).
   • Hệ thống PCR khuếch đại: Gen 16S rRNA sử dụng cặp mồi 16s rRNA-F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') và 16s rRNA-R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') với chu trình nhiệt: biến tính 94°C (45s), gắn mồi 52°C (60s), kéo dài 72°C (1 phút 20s) qua 30 chu kỳ. Gen Stx1 và Stx2 sử dụng mồi chuyên biệt của Smith et al. (1987).
   • Tách dòng vào vector trung gian pBT và pJET1.2/blunt, biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5$\alpha$ chuẩn bị bằng phương pháp xử lý hóa chất $CaCl_2$ 0,1M và sốc nhiệt ở 42°C trong 70 giây.
2. Quy trình khuếch đại đẳng nhiệt LAMP:
   • Sử dụng enzyme Bst DNA polymerase có hoạt tính dịch chuyển chuỗi (strand displacement).
   • Thiết kế cặp mồi bên trong FIP/BIP chuyên biệt: VT2FIP (5'-GCGTTTTGTCACTGTCACAGCAGATAGCCTGACGAAATTCTCTCTGT-3') và VT2BIP (5'-TGCTCTGGATGCATCTCTGGTCATATCTGGTTTCATCATATCTGGCG-3').
   • Hỗn hợp phản ứng 25 $\mu$l được ủ đẳng nhiệt duy nhất tại 65°C trong 60 phút trong bể ổn nhiệt không cần máy PCR.
3. Quy trình sàng lọc kháng thể Phage Display (Biopanning):
   • Thực hiện qua 5 vòng sàng lọc liên tiếp (5 rounds of panning) trên bề mặt tế bào vi khuẩn E. coli O157:H7 sống nguyên vẹn để bảo toàn cấu trúc epitope tự nhiên.
   • Các phage liên kết không đặc hiệu bị loại bỏ bằng dung dịch đệm PBST (PBS bổ sung Tween-20 với nồng độ tăng dần qua các vòng từ 0,1% đến 0,5%).
   • Phage liên kết đặc hiệu được giải phóng bằng dung dịch đệm Triethylamine 100 mM (pH 11,5), trung hòa ngay lập tức bằng Tris-HCl 1M (pH 7,4), sau đó tái nhiễm vào vi khuẩn E. coli TG1 ở pha log ($OD_{600} \approx 0,5$) để nhân bản cho vòng sàng lọc tiếp theo.

Data và phân tích

Dữ liệu thực nghiệm được phân tích qua hệ thống thiết bị chuẩn quốc tế:

• Kiểm tra độ toàn vẹn của nucleic acid: Điện di trên gel agarose 0,8% - 1% trong đệm TAE 1X, nhuộm Ethidium Bromide (EtBr), ghi nhận hình ảnh trên hệ thống Bio-Rad Gel Doc dưới ánh sáng UV bước sóng 320 nm.
• Phân tích protein và tinh sạch: Điện di biến tính SDS-PAGE trên gel Polyacrylamide (12% gel phân tách, 5% gel gom mẫu) với bộ nguồn PowerPac 300 (Bio-Rad). Protein tái tổ hợp mang đuôi 6X His-tag được tinh sạch bằng phương pháp Hybrid (kết hợp biến tính Urea và tái gấp cuộn trên cột sắc ký ái lực Ni-NTA agarose của Qiagen).
• Phân tích tương tác miễn dịch:
  • Western blot: Chuyển băng protein từ gel polyacrylamide sang màng Nitrocellulose, lai với kháng thể kháng 6X His-tag cộng hợp HRP (ab18184).
  • Dot blot: Cố định kháng nguyên vi khuẩn lên màng lai, so sánh trực tiếp hoạt tính giữa scFv tái tổ hợp và kháng thể thương mại ab75244.
  • Phản ứng ELISA: Đo quang phổ tại bước sóng 405 nm và 450 nm trên đầu đọc vi đĩa tự động, xác định hiệu giá kháng thể (titer) và giới hạn phát hiện (LOD).
  • Tin sinh học: Trình tự nucleotide được phân tích và căn chỉnh bằng phần mềm BLAST, ClustalW trên Ngân hàng Gen Quốc tế (NCBI GenBank). Mô hình hóa cấu trúc 3D của scFv Clone 20 được dựng bằng công cụ Swiss-Model và PyMOL.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

Luận án đã đạt được 5 phát hiện khoa học mang tính đột phá với đầy đủ bằng chứng thực nghiệm:

1. Xác lập mã số định danh quốc tế HQ658163 cho chủng E. coli O157:H7: Luận án đã giải mã hoàn chỉnh trình tự gen 16S rRNA kích thước 1540 bp, xác lập mối quan hệ phát sinh chủng loại với độ tương đồng >99% so với các chủng chuẩn EHEC trên NCBI GenBank. Đồng thời, phản ứng PCR đa mồi đã nhân bản thành công hai đoạn gen độc tố Stx1 (kích thước ~348 bp) và Stx2 (kích thước ~255 bp), khẳng định chủng nghiên cứu mang đầy đủ kiểu gen độc lực hoàn chỉnh của nhóm gây bệnh HUS.
2. Thiết lập thành công quy trình LAMP phát hiện nhanh độc tố Stx2 không phụ thuộc thiết bị luân nhiệt: Phản ứng LAMP với bộ mồi FIP/BIP chuyên biệt đã khuếch đại thành công vùng gen Stx2 tại nhiệt độ đẳng nhiệt 65°C trong thời gian đúng 60 phút. Sản phẩm khuếch đại tạo thành cấu trúc dạng thang đặc trưng nhiều vòng lặp trên gel điện di và có thể nhận diện trực tiếp bằng mắt thường thông qua sự đổi màu huỳnh quang rực rỡ khi bổ sung SYBR Green I dưới ánh sáng tia UV, hoặc qua độ đục của kết tủa magie pyrophosphate ($Mg_2P_2O_7$), loại bỏ hoàn toàn nhu cầu sử dụng máy PCR Real-time đắt đỏ.
3. Phân lập thành công dòng kháng thể đơn chuỗi scFv Clone 20 đặc hiệu cao từ thư viện Griffin.1: Sau 5 vòng Biopanning với áp lực chọn lọc tăng dần trên tế bào vi khuẩn nguyên vẹn, hiệu giá phage gắn kết tăng vọt qua từng vòng. Từ hỗn hợp phage vòng 5, luận án đã tách dòng và sàng lọc được dòng phage đơn lẻ mang ký hiệu Clone 20. Thử nghiệm ELISA khẳng định Clone 20 có ái lực liên kết mạnh vượt trội với E. coli O157:H7 ($OD_{405} > 1,2$), trong khi hoàn toàn không có phản ứng chéo ($OD_{405} < 0,15$) với các chủng E. coli thông thường khác. Trình tự gen mã hóa scFv của Clone 20 đã được nhân bản thành công bằng cặp mồi LABF/LABR (kích thước ~750 bp) và giải mã hoàn chỉnh.
4. Tối ưu hóa hệ thống biểu hiện dung hợp pET28a-TRX và tinh sạch protein: Luận án đã giải quyết triệt để bài toán khó trong kỹ thuật kháng thể tái tổ hợp là hiện tượng protein bị cuộn gập sai tạo thể vùi (inclusion bodies) không hòa tan. Bằng cách thiết kế vector tái tổ hợp pET28a-TRX mang gen mã hóa scFv dung hợp với protein Thioredoxin (Trx) tại đầu N và đuôi 6X His-tag tại đầu C, mức độ hòa tan của protein tái tổ hợp trong tế bào chủ E. coli BL21 (DE3) pLysS đã tăng lên rõ rệt khi cảm ứng với IPTG 0,5 mM ở 25°C. Quy trình tinh sạch bằng phương pháp Hybrid trên cột Ni-NTA đã thu hồi được kháng thể tái tổ hợp Trx-scFv có độ tinh khiết trên 90%, hiển thị băng protein rõ nét tại vị trí khối lượng phân tử dự đoán (~43 kDa) trên gel SDS-PAGE và được xác nhận chính xác qua phản ứng Western blot.
5. Khẳng định hoạt tính sinh học tương đương kháng thể thương mại và ứng dụng hạt nano: Phản ứng Dot blot và ELISA so sánh độ nhạy trực tiếp cho thấy kháng thể tái tổ hợp Trx-scFv Clone 20 có giới hạn phát hiện và tính đặc hiệu tương đương với kháng thể đơn dòng thương mại ab75244 của hãng Abcam. Đặc biệt, phức hợp kháng thể tái tổ hợp gắn hạt nano-silica phát quang đã bắt giữ và nhận diện thành công tế bào vi khuẩn E. coli O157:H7 dưới kính hiển vi huỳnh quang.

Implications đa chiều

• Về mặt học thuật và lý thuyết: Công trình đặt nền móng vững chắc cho công nghệ protein tái tổ hợp và kỹ thuật kỹ nghệ kháng thể (Antibody Engineering) tại Việt Nam. Nó chứng minh tính khả thi của việc khai thác các thư viện phage display bán tổng hợp của người để tạo ra các công cụ chẩn đoán sinh học mà không cần trải qua quy trình gây miễn dịch và giết mổ động vật thí nghiệm, phù hợp với xu hướng đạo đức nghiên cứu quốc tế (3Rs principle).
• Về mặt phương pháp luận: Quy trình tích hợp giữa LAMP và Phage Display cung cấp một mô hình phương pháp luận chuẩn xác có thể nhân rộng sang việc nghiên cứu các tác nhân gây bệnh nguy hiểm khác như Salmonella enterica, Shigella dysenteriae, Vibrio cholerae, hoặc các virus gây dịch bệnh mới nổi.
• Về mặt ứng dụng thực tiễn và chính sách: Kết quả nghiên cứu mở ra triển vọng tự chủ sản xuất các bộ kit ELISA, que thử nhanh (lateral flow strip) và cảm biến sinh học nano (nanobiosensors) "Make in Vietnam" với giá thành ước tính chỉ bằng 1/5 đến 1/10 so với các kit nhập ngoại từ các hãng như Eiken Chemical hay Biocontrol Systems. Điều này giúp các cơ quan kiểm nghiệm thực phẩm như Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia, các Chi cục ATVSTP tuyến tỉnh dễ dàng triển khai giám sát diện rộng tại các lò mổ, chợ đầu mối và cơ sở chế biến thực phẩm.

Limitations và Future Research

Mặc dù đạt được những kết quả xuất sắc, luận án vẫn tồn tại một số hạn chế khách quan cần được hoàn thiện:

1. Hạn chế về quy mô mẫu thực địa: Các thử nghiệm phát hiện vi khuẩn mới chỉ dừng lại ở chủng vi khuẩn chuẩn trong phòng thí nghiệm và một số mẫu thực phẩm nhân tạo bổ sung vi khuẩn (spiked samples); chưa được đánh giá trên quy mô hàng nghìn mẫu thực phẩm tươi sống đa dạng thu thập trực tiếp từ các chuỗi cung ứng nông sản thực tế.
2. Độ hòa tan của protein tái tổ hợp: Dù dung hợp với Thioredoxin đã cải thiện đáng kể độ tan, một phần protein Trx-scFv vẫn tồn tại ở dạng thể vùi đòi hỏi quy trình biến tính/tái cuộn gập bằng Urea, làm giảm hiệu suất thu hồi protein tinh sạch toàn phần.
3. Độ ổn định của phức hợp nano-silica: Quy trình chức năng hóa bề mặt hạt nano-silica và cố định kháng thể scFv đòi hỏi điều kiện bảo quản nghiêm ngặt ở 4°C để tránh hiện tượng mất hoạt tính gắn kháng nguyên theo thời gian.

Định hướng nghiên cứu tương lai (Future Research Agenda):

• Hướng 1: Ứng dụng kỹ thuật đột biến định hướng (site-directed mutagenesis) hoặc xáo trộn DNA (DNA shuffling) trên các vùng CDR của dòng scFv Clone 20 để thực hiện quá trình trưởng thành ái lực in vitro (affinity maturation), nâng cao hơn nữa hằng số ái lực liên kết ($K_D$).
• Hướng 2: Tích hợp bộ mồi LAMP và kháng thể tái tổ hợp scFv lên thiết bị vi lưu (Microfluidic Lab-on-a-chip) hoặc que nhúng dòng chảy bên (Lateral Flow Immunoassay Strip) tích hợp hạt nano vàng/chấm lượng tử để chẩn đoán tại chỗ (Point-of-Care Testing - POCT) cho kết quả trong 15 phút.
• Hướng 3: Nghiên cứu biểu hiện scFv trong các hệ thống tế bào chủ bậc cao như nấm men Pichia pastoris hoặc tế bào thực vật để tối ưu hóa quá trình hình thành liên kết disulfide tự nhiên, loại bỏ hoàn toàn nhu cầu tái cuộn gập protein.
• Hướng 4: Mở rộng nghiên cứu độc tính trung hòa của scFv Clone 20 đối với độc tố Shiga trên mô hình nuôi cấy tế bào Vero/Hela nhằm phát triển kháng thể điều trị hội chứng HUS.

Tác động và ảnh hưởng

• Tác động học thuật (Academic Impact): Công trình là một trong những luận án tiến sĩ đầu tiên tại Việt Nam làm chủ hoàn chỉnh chu trình công nghệ Phage Display tạo kháng thể tái tổ hợp scFv. Các dữ liệu trình tự gen (GenBank HQ658163) đóng góp giá trị lâu dài cho cơ sở dữ liệu di truyền vi sinh vật toàn cầu, tạo tiền đề cho hàng loạt công bố khoa học chuyên ngành trên các tạp chí quốc gia và quốc tế.
• Chuyển đổi ngành công nghệ sinh học và thực phẩm: Cung cấp nguồn nguyên liệu sinh học giá trị cao (kháng thể scFv Clone 20) cho các công ty công nghệ sinh học trong nước phát triển các sinh phẩm chẩn đoán y tế và thú y, giảm bớt sự phụ thuộc vào nguồn kháng thể nhập khẩu đắt đỏ từ các tập đoàn Âu - Mỹ.
• Đóng góp cho chính sách và cộng đồng: Giúp cơ quan quản lý nhà nước hoàn thiện các tiêu chuẩn kỹ thuật kiểm nghiệm vi sinh vật trong chuỗi an toàn thực phẩm từ trang trại đến bàn ăn (Farm-to-Table), bảo vệ sức khỏe cộng đồng và giảm thiểu gánh nặng chi phí y tế do các vụ ngộ độc thực phẩm quy mô lớn gây ra.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và Giới học thuật: Cung cấp tài liệu tham khảo chuyên sâu và quy trình thực nghiệm chi tiết từng bước về công nghệ hiển thị thực khuẩn thể, tách dòng biểu hiện protein tái tổ hợp và kỹ thuật LAMP.
• Trung tâm Kiểm nghiệm ATVSTP và Viện Vệ sinh Dịch tễ: Được chuyển giao quy trình kỹ thuật LAMP phát hiện nhanh vi khuẩn chỉ trong 60 phút với chi phí hóa chất cực thấp, cho phép sàng lọc hàng loạt mẫu thực phẩm nghi ngờ ngay tại hiện trường.
• Các doanh nghiệp sản xuất sinh phẩm y tế: Tiếp nhận dòng tế bào tái tổ hợp ổn định mang gen kháng thể scFv đặc hiệu để phát triển các sản phẩm thương mại phục vụ thị trường trong nước và xuất khẩu.
• Cơ quan quản lý và Cộng đồng: Hưởng lợi gián tiếp thông qua một hệ thống kiểm soát an toàn thực phẩm hiệu quả hơn, ngăn ngừa sớm các vụ ngộ độc thực phẩm gây chết người.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì và đã mở rộng lý thuyết nào?

Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất là việc mở rộng Lý thuyết Cấu trúc Kháng thể Tái tổ hợp Đơn chuỗi (scFv Engineering Theory) của Bird et al. (1988) và Huston et al. (1988) trong bối cảnh chọn lọc kháng thể người in vitro chống lại toàn bộ tế bào vi khuẩn sống nguyên vẹn. Luận án đã chứng minh rằng một phân tử scFv bán tổng hợp mang khung dòng mầm người kết hợp đoạn nối $(Gly_4Ser)_3$ dài 15 amino acid hoàn toàn có khả năng tái tạo trọn vẹn bề mặt tương tác paratope để nhận diện chính xác các epitope tự nhiên phức tạp trên màng ngoài của trực khuẩn Gram âm E. coli O157:H7 mà không bị biến tính hay giảm ái lực khi dung hợp với protein mang Thioredoxin.

2. Sự đổi mới về phương pháp luận so với ít nhất 2 nghiên cứu quốc tế trước đây?

So với nghiên cứu của Sahilah et al. (2010) tại Malaysia (chỉ áp dụng kỹ thuật PCR và RAPD truyền thống đòi hỏi gel điện di phức tạp và không tạo ra công cụ kháng thể) và nghiên cứu của Maruyama et al. (2003) tại Nhật Bản (chỉ tập trung vào kỹ thuật LAMP đơn thuần cho gen VT2 mà không giải quyết vấn đề nhận diện protein bề mặt), luận án của Hoàng Phú Hiệp đã đổi mới phương pháp luận mang tính đột phá thông qua:

• Thiết lập quy trình chẩn đoán kép tích hợp (Dual-diagnostic Platform): Kết hợp khuếch đại gen đẳng nhiệt LAMP huỳnh quang trực quan với công nghệ hiển thị thực khuẩn thể Phage Display để chọn lọc kháng thể đơn chuỗi scFv.
• Thay thế hoàn toàn phương pháp sản xuất kháng thể qua động vật bằng công nghệ tái tổ hợp trên tế bào vi khuẩn E. coli BL21 (DE3) pLysS với vector pET28a-TRX, tối ưu hóa độ hòa tan protein bằng dung hợp Thioredoxin và tinh sạch qua cột ái lực Hybrid Ni-NTA.

3. Phát hiện bất ngờ nhất với bằng chứng dữ liệu hỗ trợ?

Phát hiện bất ngờ nhất là tính đặc hiệu tuyệt đối của dòng phage scFv Clone 20. Dù được sàng lọc trên toàn bộ tế bào vi khuẩn sống nguyên vẹn (vốn chứa hàng nghìn kháng nguyên màng tương đồng giữa các chủng trong họ Enterobacteriaceae), Clone 20 sau 5 vòng Biopanning đã chọn lọc chính xác các epitope đặc trưng riêng biệt của E. coli O157:H7. Dữ liệu đo quang phổ ELISA cho thấy Clone 20 đạt giá trị $OD_{405} > 1,2$ đối với E. coli O157:H7, trong khi phản ứng với các chủng E. coli ATCC đối chứng âm chỉ cho tín hiệu nền ($OD_{405} < 0,15$), tương đương với kháng thể chuẩn thương mại ab75244 của Abcam.

4. Luận án có cung cấp quy trình tái lập (Replication Protocol) hoàn chỉnh không?

Luận án cung cấp quy trình thực nghiệm vô cùng chi tiết và có khả năng tái lập 100%:

• Thành phần hóa chất, nồng độ từng primer, dNTPs (10 mM), $MgCl_2$ (25 mM), enzyme Taq/Bst polymerase và chu trình luân nhiệt cụ thể cho từng gen (16S rRNA, Stx1, Stx2, LABF/LABR, 157F/157R).
• Quy trình chuẩn bị tế bào khả biến bằng $CaCl_2$ 0,1M, điều kiện sốc nhiệt chính xác ở 42°C trong 70 giây.
• Quy trình ủ đẳng nhiệt LAMP tại 65°C trong 60 phút.
• Quy trình biểu hiện protein cảm ứng bằng IPTG và tinh sạch Hybrid trên cột Ni-NTA sử dụng nồng độ đệm Imidazole/Urea chuẩn hóa.

5. Chương trình nghiên cứu 10 năm (10-year Research Agenda) được phác thảo như thế nào?

Chương trình 10 năm phát triển từ luận án định hình 3 giai đoạn chiến lược:

• Giai đoạn 1 (Năm 1 - 3): Tối ưu hóa ái lực của scFv Clone 20 bằng công nghệ đột biến ngẫu nhiên (Error-prone PCR) trên các vùng CDR3; nâng cao năng suất biểu hiện protein dạng hòa tan trên hệ thống lên men mật độ cao.
• Giai đoạn 2 (Năm 4 - 6): Tích hợp kháng thể scFv và hệ mồi LAMP lên chip sinh học vi lưu (Microfluidic Lab-on-a-chip) và que thử dòng chảy bên (Lateral Flow Immunoassay) kết hợp hạt nano vàng để thương mại hóa bộ kit chẩn đoán nhanh POCT đạt chuẩn ISO 13485.
• Giai đoạn 3 (Năm 7 - 10): Phát triển các dạng kháng thể dung hợp đa chức năng (scFv-Fc hoặc Diabody) và thử nghiệm tiền lâm sàng kháng thể tái tổ hợp trung hòa độc tố Shiga trong điều trị hội chứng tan máu suy thận cấp (HUS).

Kết luận

Luận án tiến sĩ của NCS. Hoàng Phú Hiệp là một công trình nghiên cứu khoa học xuất sắc, hoàn chỉnh và có tính tiên phong cao trong lĩnh vực công nghệ sinh học phân tử và kỹ nghệ protein tại Việt Nam. Những đóng góp cốt lõi của luận án bao gồm:

1. Định danh phân tử chuẩn xác: Giải mã thành công trình tự gen 16S rRNA (1540 bp) của chủng E. coli O157:H7 phân lập tại Việt Nam, đăng ký thành công lên Ngân hàng Gen Quốc tế NCBI với mã số HQ658163; xác lập hệ thống PCR đa mồi nhân bản đặc hiệu hai gen độc lực Stx1 và Stx2.
2. Làm chủ kỹ thuật chẩn đoán đẳng nhiệt LAMP: Thiết lập thành công quy trình LAMP 4 mồi khuếch đại gen Stx2 tại 65°C trong 60 phút, cho phép phát hiện trực quan bằng mắt thường qua huỳnh quang SYBR Green I và độ đục kết tủa $Mg_2P_2O_7$, mở ra giải pháp chẩn đoán tại chỗ không cần máy luân nhiệt.
3. Phân lập thành công kháng thể tái tổ hợp scFv người: Ứng dụng xuất sắc công nghệ Phage Display trên thư viện Griffin.1 ($1,2 \times 10^9$ dòng), chọn lọc thành công dòng Clone 20 có ái lực liên kết cao và tính đặc hiệu tuyệt đối với E. coli O157:H7.
4. Đột phá trong công nghệ biểu hiện và tinh sạch protein: Thiết kế thành công vector dung hợp pET28a-TRX, biểu hiện hiệu quả protein Trx-scFv trong E. coli BL21 (DE3) pLysS và tinh sạch đạt độ tinh khiết >90% bằng phương pháp Hybrid trên cột Ni-NTA.
5. Khẳng định hoạt tính miễn dịch và ứng dụng nano: Chứng minh kháng thể tái tổ hợp Trx-scFv Clone 20 có độ nhạy và tính đặc hiệu tương đương kháng thể thương mại ab75244 qua Western blot, Dot blot, ELISA và chế tạo thành công phức hệ nano-silica phát quang bắt giữ tế bào vi khuẩn sống.
6. Mở ra các hướng nghiên cứu liên ngành: Đặt nền móng cho việc ứng dụng công nghệ hiển thị thực khuẩn thể trong sản xuất kháng thể tái tổ hợp phục vụ chẩn đoán bệnh truyền nhiễm và an toàn thực phẩm tại Việt Nam.

Công trình không chỉ giải quyết một bài toán cấp thiết của thực tiễn kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm mà còn đưa năng lực nghiên cứu công nghệ kháng thể tái tổ hợp của Việt Nam tiệm cận với trình độ khoa học tiên tiến trên thế giới.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Ngộ độc thực phẩm xảy ra khi chúng ta sử dụng thức ăn, nƣớc uống không đƣợc bảo quản đúng cách dẫn đến sản phẩm bị hƣ thối do nhiễm khuẩn hoặc hóa chất độc hại. Các nghiên cứu gần đây đã xác định một trong những nguyên nhân của nhiều trƣờng hợp ngộ độc thức ăn là do vi khuẩn E. coli thuộc nhóm vi khuẩn đƣờng ruột Enterobacteriaceae, có nhiều trong tự nhiên, trong ruột của ngƣời và gia súc. Trong đƣờng ruột, chúng hiện diện chủ yếu ở đại tràng nên còn đƣợc gọi là vi khuẩn đại tràng.

coli nhiễm vào đất, nƣớc… từ phân của động vật. Khi gặp điều kiện thuận lợi cho sự phát triển chúng sẽ gây bệnh. coli là những chủng ít độc hại, tuy nhiên cũng có vài chủng rất độc nhƣ chủng E. coli O157:H7 có thể tìm thấy trong ruột và trong phân của các loài gia súc, đặc biệt là trong phân bò, chất thải của bò và các sản phẩm nhƣ thịt bò, sữa bò chƣa khử trùng.

Các bệnh có liên quan đến E. coli là tiêu chảy, viêm phổi, viêm đƣờng dẫn tiểu và một số bệnh khác. Triệu chứng bị nhiễm trùng vi khuẩn thƣờng khác nhau, nhƣng nhìn chung, bệnh nhân hay có các triệu chứng nhƣ: nôn, đau bụng, sốt, xuất huyết dƣới da, tăng huyết áp, tiêu chảy thƣờng có máu. Đại đa số bệnh nhân phục hồi sau 5 đến 7 ngày.

coli quá phổ biến, nên hàng năm trên khắp thế giới đều có ngƣời mắc bệnh do vi khuẩn này. Các chuyên gia ƣớc tính rằng ở Mỹ mỗi năm có khoảng 70 nghìn ngƣời mắc bệnh liên quan đến E. Ở Việt Nam, theo thống kê của Cục Vệ sinh An toàn Thực phẩm, năm 2010 có 175 vụ ngộ độc với 5664 ngƣời mắc, trong đó có 3978 ngƣời phải nhập viện và 51 ngƣời tử vong. Năm 2011 có 148 vụ ngộ độc, trong đó có 4700 ngƣời mắc với 3663 ngƣời phải nhập viện và 27 ngƣời tử vong.

Năm 2012 có 168 vụ ngộ độc, trong đó có 5541 ngƣời mắc với 4335 ngƣời nhập viện và 34 ngƣời tử vong. Nhƣ vậy, trong ba năm liên tiếp có 491 vụ ngộ độc với 112 ngƣời tử vong. Trong năm 2013 nƣớc ta xảy ra nhiều vụ ngộ độc nghiêm trọng nhất là những tháng cuối năm. Số liệu thống kê trong quý III năm 2013 cho thấy, trong 40 vụ ngộ độc thực phẩm thì 23 vụ do vi sinh vật gây ra.

Chủng vi khuẩn E. coli O157:H7 đƣợc xác định lần đầu tiên ở Việt Nam e 2 vào năm 2005 [63], tiếp đó đã có những nghiên cứu về E. Trong các vụ dịch gây tiêu chảy ở nƣớc ta hiện chƣa tìm thấy sự hiện diện của chủng E. coli O157:H7, tuy nhiên những vi khuẩn thuộc các nhóm khác gây ngộ độc và các bệnh liên quan đã đƣợc phát hiện trong nhiều trƣờng hợp [35].

Trong sinh hoạt hàng ngày, không ngoại trừ trƣờng hợp chúng ta bị nhiễm E. coli O157:H7 thông qua tiếp xúc hay phơi nhiễm với phân ngƣời, động vật và gia cầm. Việc xác định nhanh, chính xác sự có mặt của vi khuẩn E. coli O157:H7 trong các mẫu thực phẩm góp phần bảo vệ sức khỏe cho con ngƣời là cần thiết.

Việc sử dụng kháng thể kháng E.coli O157:H7, một trong những yếu tố quan trọng để phát hiện E. coli O157:H7 vẫn còn chƣa đƣợc nghiên cứu. Chính vì vậy, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện chủng vi khuẩn Escherichia coli O157:H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu”. Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu các kỹ thuật phát hiện chủng vi khuẩn E.

coli O157:H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu với E. Nội dung nghiên cứu (i) Xác định chủng E. coli O157:H7 bằng các kỹ thuật di truyền: (1) Tách dòng và xác định trình tự gen 16S rRNA; (2) Tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa cho các độc tố Stx1, Stx2 và (3) Kỹ thuật LAMP. (ii) Tạo dòng gen mã hóa cho kháng thể đặc hiệu chủng vi khuẩn E.

coli O157:H7 bằng kỹ thuật phage display; (iii) Thu nhận kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7; (iv) Xác định độ nhạy, tính đặc hiệu của kháng thể tái tổ hợp. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Đặc điểm chung của chủng vi khuẩn E.

coli O157:H7 Vi khuẩn E. coli O157:H7 hiện diện một cách tự nhiên trong ruột ngƣời và động vật, có thể đƣợc tìm thấy trong ruột và trong phân của các loài gia súc, đặc biệt là trong phân bò. Thịt băm, thịt xay, thịt hamburger thƣờng có tỷ lệ nhiễm khuẩn cao nhất, ngoài ra E. coli cũng còn có thể nhiễm vào nguồn nƣớc, rau xanh, trái cây, giá sống, rƣợu táo, sữa và các loại nƣớc trái cây trong lon, trong hộp nếu chúng không đƣợc hấp khử trùng trƣớc khi bán ra.

Ở những ngƣời bình thƣờng, E. coli O157:H7 gây rối loạn tiêu hóa nhƣ đau bụng, tiêu chảy, nôn, thân nhiệt có thể tăng chút ít. Bình thƣờng bệnh tự khỏi sau 1 tuần hay 10 ngày. Bệnh có thể rất nặng ở trẻ em, ngƣời cao tuổi và ở những ngƣời mà hệ miễn dịch đã bị suy yếu do bệnh tật.

3- 5% trƣờng hợp có thể gây biến chứng sau vài ba tuần bị nhiễm bệnh. Độc tố Shiga- like toxin của E. coli O157:H7 gây sung huyết, hủy hoại niêm mạc ruột, gây tiêu chảy có máu, làm hƣ thận và đồng thời làm giảm lƣợng nƣớc tiểu. Đây là hội chứng xuất huyết đƣờng ruột (Hemolytic Uremic Syndrome, HUS), rất nguy hiểm có thể gây tử vong, hoặc phải lọc thận suốt đời [72].

Vị trí phân loại: Giới : Bacteria Ngành(phylum): Proteobacteria Lớp (class): Gamma Proteobacteria Bộ (ordo): Enterobacteriales Họ (familia): Enterobacteriaceae Chi (genus): Escherichia Loài (species): E. Hình ảnh vi khuẩn E. coli Chủng: O157: H7 O157:H7 trên kính hiển vi điện tử [104] E. coli O157:H7 thuộc nhóm vi khuẩn đƣờng ruột Enterobacteriaceae, thuộc loại trực khuẩn Gram âm, di động bằng tiêm mao quanh tế bào, không tạo bào tử, có vỏ ngoài (capsule) và có lông bám (pili) (Hình 1.

coli O157:H7 có cấu tạo đơn e 4 giản gồm bên ngoài là vách tế bào, tiếp theo là màng sinh chất, hai lớp màng này liên kết chặt chẽ với nhau để bảo vệ tế bào. Bên trong lớp màng là tế bào chất, nơi chứa các enzyme, đƣờng, ATP, và các phân tử khác [60], [64]. coli O157:H7 là vi sinh vật kị khí không bắt buộc, có khả năng hô hấp và lên men, không sinh bào tử, tế bào tồn tại dạng đơn lẻ hoặc theo cặp đôi. Khoảng nhiệt độ tồn tại của vi khuẩn này từ 7-50C, tối thích ở 37C, bị tiêu diệt ở nhiệt độ trên 70C.

coli O157:H7 sinh trƣởng đƣợc trên môi trƣờng có pH từ 4,4-9,0 và có thể tồn tại đƣợc ở điều kiện pH 2,5 ở 37C trong 2-7 giờ, pH tối ƣu cho vi khuẩn hoạt động là từ 6-7 [16]. Vi khuẩn bị ức chế trong môi trƣờng có nồng độ muối là 8,5%, chậm phát triển ở nồng độ muối trên 2,5%. coli O157:H7 sản sinh ra độc tố gọi là Shiga-like toxin (hoặc Verocytoxin) do có sự giống nhau với độc tố gây bệnh lị đƣợc tạo ra bởi Shigella dysenteria type 1, vi khuẩn này cũng gây ra hội chứng xuất huyết đƣờng ruột (HUS) ở nhiều quốc gia trên thế giới. Có rất nhiều chủng vi khuẩn E.

coli cũng sản sinh Shiga-like toxin nhƣng E. coli O157:H7 là chủng phổ biến nhất. Độc tố này đƣợc cho là yếu tố gây bệnh của vi khuẩn [33]. Hình ảnh vi khuẩn E.

coli O157:H7 trên môi trƣờng có MUG [103]. Dƣới ánh sáng UV 365 nm, trên môi trƣờng có MUG vi khuẩn E. coli O157:H7 không phát quang, các chủng vi khuẩn E. coli khác phát quang.

coli O157:H7 không có khả năng lên men đƣờng sorbitol và cellobiose, không tạo ra β-D-glucuronidase do đó không chuyển hóa 4-methylumbelliferyl-β- D-glucuronide (MUG) thành 4- methylumbelliferone nên khi chiếu dƣới đèn UV khuẩn lạc không phát huỳnh quang (Hình 1. Khi nuôi cấy trên môi trƣờng e 5 Fluorocult có bổ sung sorbitol và MUG do không có khả năng lên men đƣờng sorbitol, khuẩn lạc có màu xanh nhạt phân biệt với các vi khuẩn E. coli khác khuẩn lạc có màu vàng do lên men đƣợc đƣờng sorbitol. Đây là đặc điểm đƣợc sử dụng trong xét nghiệm để phát hiện sự có mặt của vi khuẩn này [60].

Bản đồ hệ gen (genome) của vi khuẩn E. DNA của vi khuẩn E. coli O157:H7 gồm hệ gen vùng nhân có kích thƣớc khoảng 5,5 triệu bp, gồm 5483 gen và 2 plasmid: plasmid lớn (pO157) có kích thƣớc 9,3 kb và plasmid nhỏ (pOSAKI) kích thƣớc 3,3 kb, 7 chuỗi rRNA (16S, 23S, 5S); số chuỗi của tRNA và mRNA là 102 (Bảng 1. Tỷ lệ G+C là 50,5 %.

coli O157:H7 là loại vi khuẩn sinh độc tố, trong hệ gen vùng nhân chứa 2 gen mã hóa cho độc tố đặc trƣng của vi khuẩn này là Stx1 và Stx2 [62], đƣợc sử dụng nhƣ là những marker cho việc phân loại và phát hiện. Mặt khác các phƣơng pháp này cho thấy các chủng là thể liên tục chứ không phải phân thành các chủng khác nhau. Tên của vi khuẩn bắt nguồn từ 2 loại kháng nguyên quan trọng nhất của E. coli là kháng nguyên O (Ohne- kháng nguyên soma) và kháng nguyên H (Hauch- kháng nguyên lông) [33], ngoài ra còn có kháng nguyên K (capsular) và kháng nguyên F (fimbriae).

Kháng nguyên soma O đƣợc xác định bởi phần polysaccharide của thành thế bào lipopolysaccharide, còn kháng nguyên H đƣợc xác định bởi e 6 protein roi. Có 174 kháng nguyên O (đánh số thứ tự từ 1- 181, trong đó không có các số 31, 47, 67, 72, 93, 94 và 122) và 53 kháng nguyên H. Các thông số hệ gen của vi khuẩn E. coli O157:H7 Đặc điểm Hệ gen pO157 pOSAK1 Kích thƣớc (bp) 5498450 92721 3306 Tỉ lệ G+C (%) 50,5 47,6 43,4 Khung đọc mở (ORF): 5361 83 3 Vùng mã hóa protein (%) 88,1 82,5 52,8 Chiều dài trung bình của các ORF (bp) 904 922 579 rRNA (16S-23S-5S) 7 0 0 tRNA và mRNA 103 0 0 Khái niệm về type gây bệnh chỉ hữu ích cho việc nghiên cứu về tác nhân gây bệnh, truyền bệnh và có thể có có ích trong thiết lập các quy trình chẩn đoán.

Cách phân loại nhƣ vậy cho thấy sự đa dạng giữa các chủng STEC (Shiga Toxin-Producing E. Nielsen tìm thấy 312 chủng STEC phân lập từ bệnh nhân ở Đan Mạch thuộc 50 nhóm O và 75 type O:H [64]. Phƣơng pháp phân loại dựa vào kháng nguyên O và H là chủ yếu, tuy nhiên nhiều vi khuẩn E. coli đƣợc phân lập bao gồm cả một số nhóm STEC chỉ có một kháng nguyên O hoặc một kháng nguyên H hoặc không có cả hai trong hệ thống quốc tế, do đó không thể phân loại bằng type huyết thanh.