Tổng quan luận án
Nhiễm khuẩn bệnh viện (Hospital-Acquired Infections - HAI) là thách thức y tế nghiêm trọng tại Việt Nam và trên thế giới. Tình trạng này làm gia tăng tỷ lệ tử vong, kéo dài thời gian nằm viện trung bình từ 7 đến 15 ngày và làm tăng chi phí điều trị lên gấp 2 đến 4 lần. Đồng thời, nhiễm khuẩn bệnh viện thúc đẩy sự gia tăng mức độ kháng thuốc của vi sinh vật, đặc biệt là các trực khuẩn Gram âm đa kháng.
Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật truyền thống hiện được xem là tiêu chuẩn vàng để xác định căn nguyên gây bệnh, song tồn tại nhiều hạn chế thực tiễn: thời gian cho kết quả kéo dài (từ 24 đến 72 giờ, thậm chí từ 1 đến 5 ngày tùy loài), tỷ lệ cấy máu dương tính thấp (chỉ đạt 14,5% đến 25% ở các bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết), đòi hỏi thể tích máu lớn (20 đến 30 ml cho hai quy trình cấy ái khí và kỵ khí, rất khó thực hiện ở bệnh nhi sơ sinh) và kết quả âm tính không loại trừ hoàn toàn tình trạng nhiễm khuẩn. Bên cạnh đó, việc sử dụng các bộ sinh phẩm thương mại nhập khẩu từ nước ngoài gặp rào cản về giá thành cao và chưa hoàn toàn tương thích với đặc điểm dịch tễ vi khuẩn tại Việt Nam. Xuất phát từ khoảng trống đó, luận án tiến sĩ của nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Loan (năm 2022) với đề tài "Nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện một số tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và khảo sát tính kháng kháng sinh" đã được thực hiện.
Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm 3 nội dung cụ thể:
- Phân lập và định danh được các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện phổ biến thường gặp.
- Phát triển thành công bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện 5 tác nhân vi khuẩn thường gặp gây nhiễm khuẩn bệnh viện: Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus aureus.
- Xác định tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được và khảo sát sự tồn tại gen mã hoá beta-lactamase phổ rộng (Extended-Spectrum Beta-Lactamase - ESBL) ở vi khuẩn Escherichia coli.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng nghiên cứu: 5 loài vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện gồm Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus; các mẫu bệnh phẩm lâm sàng thu nhận từ bệnh nhân nghi nhiễm khuẩn bệnh viện; các đoạn gen đích đặc hiệu loài (blaOXA-51-like, gtlA, gyrB, YccT, nuc), gen nội chuẩn người (GAPDH), gen 16S rRNA và các gen kháng thuốc nhóm ESBL (blaTEM, blaSHV, blaCTX-M).
- Phạm vi không gian: Nghiên cứu thu thập 1434 mẫu bệnh phẩm tại Bệnh viện Thanh Nhàn và Bệnh viện Đức Giang (Hà Nội); các thực nghiệm sinh học phân tử và vi sinh được tiến hành tại Khoa Vi sinh, Khoa Hóa sinh (Bệnh viện Thanh Nhàn) và Phòng Công nghệ tế bào động vật (Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam).
- Phạm vi thời gian: Mẫu bệnh phẩm được thu thập từ tháng 1 năm 2016 đến tháng 12 năm 2018; luận án hoàn thành và bảo vệ năm 2022.
Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án
Luận án điểm lại lịch sử nghiên cứu nhiễm khuẩn bệnh viện từ năm 1869 khi Sir James Young Simpson thực hiện khảo sát trên 4000 bệnh nhân tại Scotland và Anh, ghi nhận tỷ lệ tử vong cao ở bệnh nhân nằm viện hậu phẫu và đưa ra thuật ngữ "hospitalism". Tiếp sau đó, các công trình của Oliver Wendell Holmes, Ignaz Philipp Semmelweis, Louis Pasteur, Joseph Lister và Robert Koch đã xác định các yếu tố nguy cơ và đề xuất nguyên tắc vô trùng, rửa tay và khử trùng dụng cụ phẫu thuật. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), nhiễm khuẩn bệnh viện là nhiễm khuẩn mắc phải trong thời gian người bệnh điều trị tại bệnh viện, không hiện diện và không nằm trong giai đoạn ủ bệnh tại thời điểm nhập viện, thường xuất hiện sau 48 giờ kể từ khi nhập viện.
Trên thế giới, báo cáo của Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh Châu Âu (ECDC, 2016-2017) cho thấy tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện khu vực là 6,3%, trong đó nhiễm khuẩn hô hấp chiếm 41,8%, tiêu hóa 20,8%, tiết niệu 18,4%. Nghiên cứu tại các quốc gia ghi nhận tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện gồm: Bệnh viện Đại học Martin - Slovakia (2013: 5,2%), Mỹ (2015: 3,2%), Ấn Độ (2016: 3,7%), Canada (2017: 7,3%), Thụy Sĩ (2017: 4,5%), Bệnh viện Đại học Truyền nhiễm và Bệnh Nhiệt đới Serbia (2016-2018: 36,3% tiết niệu, 19,6% máu). Tại Việt Nam, nghiên cứu của Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương và VINAREX (2013) trên 3671 bệnh nhân tại 15 khoa Hồi sức tích cực ghi nhận tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện là 27,3%; các khảo sát tại Bệnh viện Sản Nhi Ninh Bình (2015-2016: 7,17%), Đại học Y Dược Huế (2016: 5,2%), Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 (2016: 3,86%), Bệnh viện Đa khoa Ninh Thuận (2016-2017: 2,4%), Bệnh viện Đa khoa Nông nghiệp (2016-2017: 6,94%), Bệnh viện Đa khoa Vĩnh Phúc (2017: 2,7%). Tỷ lệ mắc chung tại Việt Nam dao động từ 2,7% đến 10%, trong đó trực khuẩn Gram âm chiếm gần 70% và vi khuẩn Gram dương chiếm khoảng 30%.
Về kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán, nguyên lý PCR được Karry Mullis phát minh năm 1985 và phát triển bởi Saiki cùng cộng sự dựa trên nền tảng của Khorana. Kỹ thuật multiplex PCR được Chamberlain và cộng sự thiết lập năm 1988 nhằm khuếch đại đồng thời nhiều trình tự DNA đích. Các nghiên cứu quốc tế tiêu biểu gồm:
- Kais M. và cộng sự (2006): Định lượng Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis bằng realtime PCR.
- Deepa Anbazhagan và cộng sự (2011): Thiết lập 2 phản ứng multiplex realtime PCR xác định 6 loài vi khuẩn với các gen uidA (556 bp - E. coli), EFP (422 bp - Acinetobacter spp.), ply (348 bp - S. pneumoniae), sa442 (179 bp - S. aureus), lasA (125 bp - P. aeruginosa), NTRA (90 bp - K. pneumoniae), đạt độ tương đồng 93,7% so với nuôi cấy trên 300 mẫu.
- Nomanpour B. và cộng sự (2011, Iran): Thiết kế Taqman realtime PCR dựa trên gen blaOXA-51 phát hiện trực tiếp A. baumannii từ 361 bệnh phẩm hô hấp với ngưỡng phát hiện dưới 200 CFU/ml, độ nhạy và đặc hiệu đạt 100% (chỉ số kappa = 1).
- Reyes M.P. và cộng sự (2013, Tây Ban Nha): Sử dụng gen ompA định lượng tính kháng thuốc của A. baumannii trên 48 mẫu (đạt 95,8%).
- Hye-young Wang và cộng sự (2014): Phát hiện S. aureus kháng methicillin (MRSA) qua gen 16S rRNA, nuc và mecA với giới hạn phát hiện $10^3\text{ CFU/ml}$.
- Gadsby N.J. và cộng sự (2015, 2016, Vương quốc Anh): Phát triển hệ thống multiplex realtime PCR phát hiện 8 tác nhân hô hấp dưới (lytA, fucK, nuc, copB, yccT, gltA, gyrB, blaOXA-51-like) và kiểm soát nội GAPDH; năm 2016 mở rộng chẩn đoán 26 mầm bệnh trên 323 bệnh nhân viêm phổi cộng đồng, đạt tỷ lệ phát hiện 87% so với 39% của nuôi cấy ($p < 0{,}0001$).
Tại Việt Nam, tác giả Phùng Thị Bích Thủy và cộng sự đã ứng dụng bộ kit SeptiFast (Roche) phát hiện 43,3% dương tính so với 3,3% cấy máu; đề tài cấp Nhà nước do PGS. Lê Hữu Song chủ nhiệm (Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 phối hợp Bệnh viện Bạch Mai, Nhi Trung ương, Bệnh Nhiệt đới Trung ương) đã chế tạo kit xác định vi khuẩn nhiễm khuẩn huyết (ngưỡng 10 CFU/ml máu, đặc hiệu 100%) và các gen kháng (blaCTX-M, blaTEM, blaSHV, NDM, VIM, CMY, mecA); nhóm nghiên cứu của PGS.TS Đồng Văn Quyền và PGS.TS Đinh Duy Kháng (Viện Công nghệ sinh học, 2020) chế tạo thành công kit realtime RT-PCR phát hiện SARS-CoV-2 (ngưỡng 5 copies/phản ứng, độ đặc hiệu 100%).
Khoảng trống nghiên cứu được luận án lựa chọn giải quyết là: Thiết lập một quy trình công nghệ hoàn chỉnh và tối ưu hóa bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR đa mồi, đa mẫu dò đặc hiệu để phát hiện đồng thời 5 căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện phổ biến nhất tại Việt Nam (A. baumannii, K. pneumoniae, E. coli, P. aeruginosa, S. aureus) cùng đối chứng nội người GAPDH, đồng thời đánh giá thực trạng kháng kháng sinh và sự lưu hành các gen sinh enzyme beta-lactamase phổ rộng (blaTEM, blaSHV, blaCTX-M) của chủng E. coli phân lập tại cơ sở điều trị.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Cơ sở lý thuyết và khung phân tích
- Phân loại kháng sinh và cơ chế tác động: Ức chế tổng hợp vách tế bào peptidoglycan (nhóm beta-lactam gồm penicillin, cephalosporin, carbapenem, monobactam; fosfomycin, vancomycin); gây rối loạn tính thấm màng bào tương (polymyxin B, colistin); ức chế tổng hợp protein tại tiểu đơn vị 30S (aminoglycoside, tetracycline) hoặc 50S (erythromycin, chloramphenicol, clindamycin) của ribosome 70S; ức chế tổng hợp acid nucleic qua enzyme DNA gyrase (quinolone), RNA polymerase (rifampicin) hoặc ức chế tổng hợp acid folic (sulfamide, trimethoprim).
- Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn: Tiết enzyme bất hoạt kháng sinh (beta-lactamase, carbapenemase); biến đổi protein liên kết penicillin (PBP/PBP2a mã hóa bởi femA hoặc mecA); đột biến hoặc làm mất kênh porin màng ngoài (mất OprD ở P. aeruginosa kháng imipenem/meropenem; mất OmpF); tăng cường hệ thống bơm đẩy chủ động (protein bơm gồm dạng A, B, C); sửa đổi cấu trúc phân tử đích của ribosome.
- Cơ chế lan truyền vật liệu di truyền kháng thuốc: Tải nạp (transduction), biến nạp (transformation) và tiếp hợp (conjugation) thông qua các nhân tố di động như plasmid (nhóm IncF kích thước 50-200 kb), transposon và integron gắn chèn ISEcp1.
- Phân loại enzyme beta-lactamase theo Ambler: Lớp A (SHV, TEM, CTX-M), Lớp B (IMP, VIM, NDM-1), Lớp C (AmpC, CMY, FOX, MO), Lớp D (OXA).
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
Luận án áp dụng phương pháp nghiên cứu định lượng thực nghiệm, kết hợp giữa vi sinh học kinh điển và sinh học phân tử:
| Nhóm phương pháp |
Nội dung kỹ thuật và quy trình thực hiện |
| Thu thập và xử lý mẫu |
Chọn mẫu thuận tiện trên 1434 mẫu bệnh phẩm (đờm, dịch hút phế quản, nước tiểu, máu) tại Bệnh viện Thanh Nhàn và Đức Giang (2016-2018). Tính cỡ mẫu tối thiểu $N = 1{,}96^2 \times p \times (1-p) / d^2$ với $d = 0{,}05$, dựa trên tỷ lệ nhiễm $p$ của S. Cairns và cs (2008), ra cỡ mẫu lý thuyết tối thiểu là 1019,3 mẫu (quy chuẩn 1100 mẫu). |
| Vi sinh truyền thống |
Nuôi cấy phân lập trên thạch máu Columbia, thạch chocolate, chai cấy ái khí BacT/ALERT 3D (BioMerieux). Định danh bằng hệ thống kit sinh hóa Api 20E, Api 20NE, Api Stap. Kháng sinh đồ theo phương pháp khuếch tán khoanh giấy trên thạch Mueller-Hinton (Kirby-Bauer) theo chuẩn CLSI, huyền dịch vi khuẩn độ đục 0,5 McFarland; khảo sát từ 11 đến 15 loại kháng sinh. |
| Tách chiết và làm giàu DNA |
Tách DNA từ vi khuẩn thuần khiết và mẫu đờm, dịch, máu bằng QIAamp DNA Mini Kit / QIAamp DNA Blood Mini Kit (hoặc máy QIAcube). Tách nhanh mẫu máu cấy bằng phương pháp đun sôi $100^\circ\text{C}$ trong 10 phút có bổ sung lysozyme ($1\text{ mg/ml}$) sau ủ $37^\circ\text{C}$ trong 30 phút. Làm giàu DNA bằng mồi random hexamer (Master mix 12,5 $\mu\text{l}$, khuôn 5 $\mu\text{l}$, mồi 1 $\mu\text{l}$ 10 pmol; nhiệt độ $93^\circ\text{C}$ biến tính 3 phút; 20 chu kỳ $93^\circ\text{C}$ - 45s, $50^\circ\text{C}$ - 45s, $72^\circ\text{C}$ - 1,5 phút). Đo nồng độ DNA bằng máy Nanodrop 1000 qua tỷ số $\text{OD}{260}/\text{OD}{280}$ (đạt chuẩn từ 1,8 đến 2,0) và công thức $C_{\text{DNA}} = \text{OD}_{260} \times 50 \times d$ ($\mu\text{g/ml}$). Điện di trên gel agarose 1% (đệm TAE 1X, hiệu điện thế 95-100V trong 25-30 phút, nhuộm EtBr $2\text{ }\mu\text{g/ml}$, soi đèn UV). |
| Kỹ thuật PCR và Multiplex Realtime PCR |
Khuếch đại gen 16S rRNA kiểm tra định danh (mồi 16SF/R, chu trình luân nhiệt $95^\circ\text{C}$ 3 phút; 30 chu kỳ: $94^\circ\text{C}$ 45s, $57^\circ\text{C}$ 45s, $72^\circ\text{C}$ 1 phút; kéo dài cuối $72^\circ\text{C}$ 8 phút). Thiết kế mồi và mẫu dò Taqman (nhiệt độ nóng chảy $T_m$ mồi 55-$60^\circ\text{C}$, mẫu dò 65-$70^\circ\text{C}$, tỷ lệ GC 30-80%) sử dụng các kênh màu huỳnh quang HEX, FAM, Cy5 trên hệ thống máy AriaMx Realtime PCR System (Agilent), Rotor-gene Q (QIAGEN), Cobas Taqman 48 (Roche). Tạo đối chứng dương bằng cách tách dòng sản phẩm PCR vào vector pCR2.1 biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α. Nhân bản gen kháng thuốc ESBL (blaTEM, blaSHV, blaCTX-M) bằng PCR đơn mồi. |
Trình tự các mồi và mẫu dò đặc hiệu được thiết kế và sử dụng trong luận án:
| Vi khuẩn đích |
Gen mục tiêu |
Tên mồi / Mẫu dò |
Trình tự nucleotide (5' $\rightarrow$ 3') |
| A. baumannii |
blaOXA-51-like |
AcOxa_F
AcOxa_R
AcOxa_probe |
5’-GAAGTGAAGCGTGTTGGTTAT-3’
5’-GCCTCTTGCTGAGGAGTAAT-3’
/5HEX/CG ACT TGG G/ZEN/T ACC GAT ATC TGC ATT GC/3IABkFQ/ |
| K. pneumoniae |
gtlA (citrate synthase) |
KpCy_F
KpCy_R
KpCy_probe |
5’-CCAGTTAGCGACCGAATCTAAT-3’
5’-CGGGTGATCTGCTCATGAAT-3’
5’-/56-FAM/CGACCCAG/ZEN/CCGAATATGACGAAT/3IABkFQ/-3’ |
| P. aeruginosa |
gyrB (DNA gyrase subunit B) |
PaGyr_F
PaGyr_R
PaGyr_probe |
5’-CACCCTGCTGTTGACCTTCTT-3’
5’-CTGGTCGTCCTTGATGTACTG-3’
5’/5Cy5/CCCACATGG/TAO/CCTCCAAGGAGTAAG/3IABkRQSp/3’ |
| E. coli |
YccT |
EcYcc_F
EcYcc_R
EcYcc_probe |
5’-CCAATTCCGGTAAAGCTGGATA-3’
5’-GCGTTTCGCGGATTTGTTATAG-3’
/5HEX/TCTCGCCATTACCTCAACGGCAAA/3IABkfQ/ |
| S. aureus |
nuc |
SaNucF
SaNucR
SaNuc_probe |
5’-AGGGATGGCTATCAGTAATGTTT-3’
5’-CGCCGTTATCTGTTTGTGATG-3’
5’/56FAM/CGAAAGGGC/ZEN/AATACGCAAAGAGGT/3IABkFQ/3’ |
| Đối chứng nội người |
GAPDH |
GAPD_HF
GAPDH_R
GAPDH_Probe |
5’-AGGGTGGTGGACCTCAT-3’
5’-CTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTG-3’
5’/5Cy5/CCCACATGG/TAO/CCTCCAAGGAGTAAG/3IABkRQSp/3’ |
| Định danh vi khuẩn |
16S rRNA |
16S_F
16S_R |
5'-AGAGTTTGATCMTGGC-3'
5'-TACCTTGTTACGACT-3' |
| Gen ESBL |
blaTEM (661 bp)
blaSHV (807 bp)
blaCTX-M (585 bp) |
TEM_F / TEM_R
SHV_F / SHV_R
CTX-M_F / CTX-M_R |
5’-CAGCGGTAAGATCCTTGAGA-3’ / 5’-TTCATCCATAGTTGCCTGACT-3’
5’-TTCGCCTGTGTATTATCTCC-3’ / 5’-TTTGCTGATTTCGCTCGG-3’
5’-CGATGTGCAGTACCAGTAA-3’ / 5’-AGTGACCAGAATCAGCGG-3’ |
Nội dung chính theo từng chương
CHƯƠNG 1. TÌNH HÌNH VÀ CĂN NGUYÊN VI KHUẨN GÂY NHIỄM KHUẨN BỆNH VIỆN - MỘT SỐ KỸ THUẬT PHÁT HIỆN VÀ TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH
Chương 1 tổng hợp bức tranh dịch tễ học và các cơ chế bệnh sinh, sinh học phân tử của vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện:
- Hệ thống hóa các số liệu nhiễm khuẩn bệnh viện: Trực khuẩn Gram âm chiếm ưu thế lớn (khoảng 70%), chủ yếu là A. baumannii, P. aeruginosa, K. pneumoniae, E. coli; vi khuẩn Gram dương chiếm khoảng 30% với đại diện chủ yếu là S. aureus. Dữ liệu tại các bệnh viện tuyến đầu Việt Nam cho thấy tỷ lệ phân lập A. baumannii tại Bệnh viện Chợ Rẫy (2014) lên tới 59,3%, Bệnh viện Bạch Mai (2015) là 21,4% (K. pneumoniae chiếm 34,8%), Bệnh viện Đa khoa Phú Thọ (2016) là 21,5%.
- Cơ chế tác động và phân tử học kháng kháng sinh: Đi sâu vào cơ chế sinh enzyme phân giải kháng sinh họ beta-lactam. Trình bày chi tiết cấu trúc di truyền của các gen lớp A (blaTEM, blaSHV, blaCTX-M), cấu trúc blaOXA (lớp D), gen kháng methicillin mecA/femA qua protein PBP2a (78 kDa) ở tụ cầu, các đột biến giảm tính thấm màng (mất OprD, OmpF) và hệ thống bơm tống thuốc.
- Đánh giá các phương pháp chẩn đoán: So sánh chi tiết ưu nhược điểm giữa phương pháp nuôi cấy vi sinh kinh điển với kỹ thuật PCR, multiplex PCR và multiplex realtime PCR sử dụng đầu dò huỳnh quang Taqman, khẳng định ưu thế vượt trội về thời gian phát hiện, độ nhạy và khả năng định lượng trực tiếp của kỹ thuật multiplex realtime PCR.
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Chương 2 mô tả chi tiết toàn bộ thiết kế thực nghiệm và quy trình triển khai:
- Mẫu nghiên cứu: Thu thập 1434 mẫu bệnh phẩm lâm sàng (đờm, dịch hút phế quản, nước tiểu, máu) tại Bệnh viện Thanh Nhàn và Bệnh viện Đức Giang trong giai đoạn từ tháng 1/2016 đến tháng 12/2018.
- Phương pháp vi sinh: Mô tả chi tiết kỹ thuật nuôi cấy trên thạch máu Columbia, thạch chocolate, máy cấy máu tự động BacT/ALERT 3D; quy trình định danh bằng hệ thống dải sinh hóa Api 20E, Api 20NE, Api Stap; kỹ thuật kháng sinh đồ khoanh giấy khuếch tán trên thạch Mueller-Hinton theo tiêu chuẩn CLSI.
- Kỹ thuật sinh học phân tử: Quy trình tách chiết DNA bằng kit thương mại và phương pháp sốc nhiệt phá vỡ tế bào bằng lysozyme kết hợp đun sôi $100^\circ\text{C}$; phương pháp làm giàu DNA bằng PCR mồi random hexamer; công thức xác định nồng độ và độ tinh sạch DNA; điện di gel agarose 1%; thiết kế hệ thống mồi và mẫu dò Taqman đa màu (HEX, FAM, Cy5); tối ưu hóa thành phần phản ứng (nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi/mẫu dò, loại hóa chất Master Mix của IDT và HQ); quy trình tạo plasmid tái tổ hợp đối chứng dương trên vector pCR2.1 và tế bào E. coli DH5α; đánh giá độ đặc hiệu, độ nhạy, ngưỡng phát hiện (LOD), độ ổn định theo thời gian bảo quản và phương pháp thống kê y sinh học.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Chương 3 trình bày toàn bộ các phát hiện thực nghiệm của luận án qua các nhóm nội dung chính:
- Kết quả phân lập vi sinh vật: Phân bố xét nghiệm theo từng loại bệnh phẩm lâm sàng và xác định tỷ lệ phân lập của 5 loài vi khuẩn mục tiêu (A. baumannii, K. pneumoniae, E. coli, P. aeruginosa, S. aureus). Kiểm tra khẳng định định danh các chủng phân lập thông qua giải trình tự và nhân bản gen 16S rRNA.
- Phát triển và tối ưu bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR:
- Phân tích và lựa chọn các vùng gen đích đặc hiệu tuyệt đối cho từng loài: gen blaOXA-51-like (A. baumannii), gtlA (K. pneumoniae), gyrB (P. aeruginosa), YccT (E. coli), nuc (S. aureus) và gen đối chứng nội GAPDH của người.
- Thử nghiệm độ đặc hiệu của từng cặp mồi và mẫu dò đơn lẻ, sau đó phối hợp thành các phản ứng đa mồi (multiplex). Kết quả chu kỳ ngưỡng (Ct) cho thấy phản ứng chỉ khuếch đại tín hiệu huỳnh quang với DNA đích tương ứng, không có hiện tượng phản ứng chéo với DNA của các loài vi khuẩn khác hoặc DNA người; ống đối chứng âm không xuất hiện tín hiệu khuếch đại.
- Tối ưu hóa điều kiện phản ứng: Khảo sát dải nhiệt độ gắn mồi, so sánh hiệu quả giữa các loại hóa chất Master Mix (IDT và HQ), thử nghiệm trên các nồng độ pha loãng của DNA khuôn để xây dựng đường chuẩn và xác định ngưỡng phát hiện (LOD) của bộ sinh phẩm.
- Xây dựng hệ thống mẫu đối chứng dương thông qua kỹ thuật dòng hóa plasmid mang đoạn gen đích biến nạp vào tế bào E. coli DH5α, khẳng định qua PCR khuẩn lạc và điện di kiểm tra plasmid tái tổ hợp.
- Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, độ ổn định: So sánh kết quả phát hiện trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm bằng bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR với kết quả nuôi cấy tiêu chuẩn vàng; đánh giá sự biến thiên giá trị Ct của các mẫu đối chứng dương sau các khoảng thời gian bảo quản khác nhau để xác định hạn dùng và tính ổn định của sinh phẩm.
- Kết quả kháng sinh đồ và khảo sát gen ESBL:
- Đánh giá tỷ lệ đề kháng kháng sinh của 5 loài vi khuẩn đối với các nhóm kháng sinh thông dụng (penicillin, cephalosporin thế hệ 1-4, carbapenem, aminoglycoside, fluoroquinolone, polymyxin).
- Xác định tỷ lệ mang các gen mã hóa enzyme beta-lactamase phổ rộng (blaTEM, blaSHV, blaCTX-M) bằng kỹ thuật PCR trên các chủng E. coli phân lập được tại Bệnh viện Thanh Nhàn; phân tích mối liên quan giữa kiểu gen ESBL và kiểu hình kháng kháng sinh trên kháng sinh đồ.
Kết quả và những đóng góp mới
Đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn
- Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam đề xuất quy trình công nghệ phát triển hoàn chỉnh bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR có khả năng phát hiện đồng thời 5 tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện phổ biến nhất (Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus) tích hợp hệ thống kiểm soát nội chất lượng tách chiết (gen GAPDH người).
- Thiết kế và đánh giá thành công hệ thống mồi và mẫu dò Taqman đặc hiệu cao trên các gen chỉ thị phân tử (blaOXA-51-like, gtlA, gyrB, YccT, nuc), xây dựng thành công bộ mẫu chuẩn đối chứng dương tái tổ hợp trên vector pCR2.1 mang tính ổn định cao.
- Cung cấp bộ dữ liệu thực nghiệm có giá trị khoa học về tỷ lệ phân lập, mức độ đề kháng kháng sinh của 5 loài vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện và tỷ lệ lưu hành các gen kháng thuốc sinh beta-lactamase phổ rộng (blaTEM, blaSHV, blaCTX-M) ở các chủng E. coli tại Bệnh viện Thanh Nhàn.
Kiến nghị và đề xuất
- Đề xuất ứng dụng quy trình multiplex realtime PCR đã hoàn thiện vào công tác xét nghiệm chẩn đoán vi sinh lâm sàng tại các bệnh viện nhằm rút ngắn thời gian xác định tác nhân gây bệnh từ 48-72 giờ xuống còn vài giờ, hỗ trợ bác sĩ điều trị đưa ra phác đồ kháng sinh sớm và chính xác.
- Khuyến nghị tiếp tục giám sát định kỳ sự biến đổi kiểu gen kháng thuốc và kiểu hình kháng sinh đồ của các chủng vi khuẩn bệnh viện để cập nhật hướng dẫn sử dụng kháng sinh hợp lý, hạn chế sự gia tăng của các chủng trực khuẩn Gram âm đa kháng và siêu kháng thuốc.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
- Hạn chế của nghiên cứu: Nghiên cứu thu thập mẫu bệnh phẩm tập trung tại hai bệnh viện trên địa bàn Hà Nội (Bệnh viện Thanh Nhàn và Bệnh viện Đức Giang), việc khảo sát dịch tễ gen kháng thuốc ESBL mới chỉ tập trung sâu trên đối tượng vi khuẩn Escherichia coli mà chưa mở rộng trên toàn bộ các loài trực khuẩn Gram âm khác.
- Hướng nghiên cứu tiếp theo: Mở rộng cỡ mẫu và mạng lưới đánh giá lâm sàng bộ sinh phẩm tại nhiều bệnh viện đa khoa tuyến trung ương và địa phương trên toàn quốc; nghiên cứu tích hợp thêm các kênh phát hiện trực tiếp các gen kháng carbapenem (blaNDM, blaKPC, blaOXA-48) và gen kháng methicillin (mecA) vào cùng một quy trình multiplex realtime PCR khép kín.
Giá trị tham khảo
- Đối với nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Công nghệ sinh học, Vi sinh vật học, Sinh học phân tử y học: Luận án là tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình thiết kế mồi, mẫu dò Taqman đa màu, các bước tối ưu hóa phản ứng multiplex realtime PCR, phương pháp tạo dòng plasmid đối chứng dương và quy trình đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng phát hiện của một bộ kit chẩn đoán phân tử.
- Đối với bác sĩ lâm sàng, dược sĩ và cán bộ xét nghiệm vi sinh tại các cơ sở y tế: Cung cấp tài liệu tham khảo về độ tương đồng giữa kỹ thuật PCR và phương pháp nuôi cấy cấy máu, dữ liệu về thực trạng đề kháng kháng sinh và đặc điểm phân bố các gen ESBL (blaCTX-M, blaTEM, blaSHV) phục vụ công tác điều trị và kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện.
- Đối với các nhà quản lý y tế và kiểm soát nhiễm khuẩn: Cung cấp cơ sở khoa học để xây dựng chiến lược giám sát vi khuẩn đa kháng và thúc đẩy phát triển các sản phẩm sinh phẩm chẩn đoán in vitro (IVD) sản xuất trong nước.
Câu hỏi thường gặp
1. Bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR trong luận án phát hiện đồng thời những tác nhân vi khuẩn nào và dựa trên các gen đích nào?
Bộ sinh phẩm phát hiện đồng thời 5 loài vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện phổ biến cùng 1 đối chứng nội người, gồm:
- Acinetobacter baumannii: Gen blaOXA-51-like
- Klebsiella pneumoniae: Gen gtlA (citrate synthase)
- Pseudomonas aeruginosa: Gen gyrB (DNA gyrase subunit B)
- Escherichia coli: Gen YccT
- Staphylococcus aureus: Gen nuc
- Đối chứng nội chất lượng người: Gen GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)
2. Luận án đã khảo sát những gen mã hóa beta-lactamase phổ rộng (ESBL) nào trên vi khuẩn Escherichia coli?
Luận án tiến hành khảo sát 3 họ gen mã hóa enzyme beta-lactamase phổ rộng (lớp A theo Ambler) bằng kỹ thuật PCR đặc hiệu, bao gồm:
- Họ gen blaTEM (kích thước sản phẩm khuếch đại 661 bp)
- Họ gen blaSHV (kích thước sản phẩm khuếch đại 807 bp)
- Họ gen blaCTX-M (kích thước sản phẩm khuếch đại 585 bp)
3. Cỡ mẫu và nguồn bệnh phẩm thực tế được sử dụng để phân lập vi khuẩn và thử nghiệm trong luận án là bao nhiêu?
Luận án đã thu thập tổng cộng 1434 mẫu bệnh phẩm lâm sàng (gồm mẫu đờm, dịch hút phế quản, nước tiểu và máu) từ các bệnh nhân nghi ngờ nhiễm khuẩn bệnh viện tại Bệnh viện Thanh Nhàn và Bệnh viện Đức Giang (Hà Nội) trong giai đoạn từ tháng 1/2016 đến tháng 12/2018.
4. Quy trình làm giàu DNA của vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm được thực hiện như thế nào trong luận án?
Quy trình làm giàu DNA vi khuẩn được thực hiện bằng phản ứng PCR sử dụng mồi random hexamer với thành phần: Master mix (12,5 $\mu\text{l}$), DNA khuôn (5 $\mu\text{l}$), mồi random hexamer (1 $\mu\text{l}$ nồng độ 10 pmol) và nước khử trùng vừa đủ thể tích 25 $\mu\text{l}$. Chu trình nhiệt gồm: biến tính ban đầu ở $93^\circ\text{C}$ trong 3 phút, tiếp theo là 20 chu kỳ gồm $93^\circ\text{C}$ trong 45 giây, $50^\circ\text{C}$ trong 45 giây và $72^\circ\text{C}$ trong 1 phút 30 giây.
Kết luận
Luận án tiến sĩ của nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Loan đã hoàn thành đầy đủ 3 mục tiêu khoa học đề ra, xây dựng thành công quy trình công nghệ phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR đa mồi phát hiện nhanh và chính xác 5 tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện phổ biến tại Việt Nam. Nghiên cứu đã tối ưu hóa các thông số kỹ thuật, thiết lập hệ thống mẫu chuẩn đối chứng dương plasmid tái tổ hợp và kiểm chứng độ đặc hiệu trên các mẫu bệnh phẩm lâm sàng. Đồng thời, luận án đã cung cấp dữ liệu thực nghiệm toàn diện về tính kháng kháng sinh và đặc điểm phân bố các gen sinh beta-lactamase phổ rộng (blaTEM, blaSHV, blaCTX-M) ở E. coli, mang lại giá trị khoa học và giá trị ứng dụng thiết thực cho ngành y tế trong chẩn đoán và điều trị nhiễm khuẩn bệnh viện.
