Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime pcr phát hiện một số tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và khảo sát tính kháng kháng sinh

Luận án tiến sĩ sinh học tập trung phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và khảo sát tính kháng kháng sinh.

• Tác giả: Nguyễn Thị Loan
• Người hướng dẫn: TS. Lã Thị Huyền, Trưởng phòng Công nghệ tế bào động vật - Viện CNSH
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm Multiplex Realtime PCR phát hiện nhiễm khuẩn bệnh viện và khảo sát kháng kháng sinh
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. Tình hình và căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện
• 1.2. Tình hình nghiên cứu ứng dụng multiplex realtime PCR xác định các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện
• 1.2.1. Trên thế giới
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả phân lập các chủng vi sinh vật gây nhiễm khuẩn bệnh viện
• 3.2. Kết quả phân tích gen 16S rARN từ các chủng vi khuẩn phân lập
• 3.3. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của mồi và mẫu dò với gen đích
• 3.4. Kết quả kháng sinh đồ của các chủng vi khuẩn nghiên cứu và gen mã hoá beta-lactamase mở rộng của vi khuẩn E.
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Giới thiệu về nghiên cứu

Nghiên cứu này tập trung vào phát triển bộ sinh phẩm Multiplex Realtime PCR để phát hiện nhiễm khuẩn bệnh viện và khảo sát kháng kháng sinh. Nhiễm khuẩn bệnh viện (NKBV) là một vấn đề nghiêm trọng, gây tăng tỷ lệ tử vong và chi phí điều trị. Các phương pháp truyền thống như cấy máu có nhiều hạn chế về thời gian và độ chính xác. Công nghệ PCR được xem là giải pháp tiềm năng với độ nhạy và tốc độ cao. Nghiên cứu này nhằm phát triển một bộ sinh phẩm y tế chuyên dụng, phù hợp với hệ vi khuẩn tại Việt Nam, giúp cải thiện hiệu quả chẩn đoán và điều trị.

1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu có ba mục tiêu chính: phân lập và định danh các chủng vi khuẩn gây NKBV, phát triển bộ sinh phẩm Multiplex Realtime PCR để phát hiện đồng thời năm tác nhân vi khuẩn phổ biến, và khảo sát kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn này. Các tác nhân vi khuẩn được nhắm đến bao gồm Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, và Staphylococcus aureus.

1.2. Tính mới của nghiên cứu

Đây là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam đề xuất quy trình phát triển bộ sinh phẩm Multiplex Realtime PCR để phát hiện đồng thời năm vi khuẩn gây NKBV. Nghiên cứu cũng cung cấp dữ liệu mới về tỷ lệ kháng kháng sinh và sự hiện diện của gen mã hóa beta-lactamase phổ rộng (ESBL) ở Escherichia coli tại bệnh viện Thanh Nhàn.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp vi sinh truyền thống và kỹ thuật PCR để phân lập và định danh vi khuẩn. Bộ sinh phẩm Multiplex Realtime PCR được phát triển thông qua các bước thiết kế mồi, tối ưu hóa phản ứng, và kiểm tra độ nhạy, độ đặc hiệu, độ ổn định. Các mẫu bệnh phẩm được thu thập từ bệnh viện Thanh Nhàn và phân tích để xác định tỷ lệ kháng kháng sinh và gen ESBL.

2.1. Phương pháp vi sinh truyền thống

Các mẫu bệnh phẩm được nuôi cấy trên môi trường thạch máu và Chapman để phân lập vi khuẩn. Quy trình này bao gồm xác định hình thái khuẩn lạc và kiểm tra sinh hóa để định danh các chủng vi khuẩn.

2.2. Phương pháp sinh học phân tử

DNA tổng số được chiết xuất từ các chủng vi khuẩn và sử dụng để nhân bản gen 16S rARN. Các cặp mồi và mẫu dò được thiết kế để phát hiện đồng thời năm tác nhân vi khuẩn. Phản ứng Multiplex Realtime PCR được tối ưu hóa để đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu cao.

III. Kết quả và thảo luận

Nghiên cứu đã phân lập thành công các chủng vi khuẩn gây NKBV và phát triển bộ sinh phẩm Multiplex Realtime PCR với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Kết quả kháng sinh đồ cho thấy tỷ lệ kháng kháng sinh đáng kể ở các chủng vi khuẩn, đặc biệt là sự hiện diện của gen ESBL ở Escherichia coli. Những phát hiện này có ý nghĩa quan trọng trong việc cải thiện chẩn đoán và điều trị NKBV.

3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn

Các chủng vi khuẩn Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, và Staphylococcus aureus được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm. Tỷ lệ phân lập cao nhất là Escherichia coli và Staphylococcus aureus.

3.2. Kết quả phát triển bộ sinh phẩm

Bộ sinh phẩm Multiplex Realtime PCR đã được phát triển thành công, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong việc phát hiện đồng thời năm tác nhân vi khuẩn. Các thử nghiệm độ ổn định và ngưỡng phát hiện cũng cho kết quả khả quan.

3.3. Kết quả kháng sinh đồ

Kết quả kháng sinh đồ cho thấy tỷ lệ kháng kháng sinh cao ở các chủng vi khuẩn, đặc biệt là Pseudomonas aeruginosa và Acinetobacter baumannii. Gen ESBL được phát hiện ở 30% các chủng Escherichia coli.

IV. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu đã thành công trong việc phát triển bộ sinh phẩm Multiplex Realtime PCR để phát hiện đồng thời năm tác nhân vi khuẩn gây NKBV. Kết quả kháng sinh đồ và sự hiện diện của gen ESBL cung cấp thông tin quan trọng cho việc quản lý kháng sinh trong bệnh viện. Nghiên cứu này có tiềm năng ứng dụng cao trong chẩn đoán và điều trị NKBV tại Việt Nam.

4.1. Ý nghĩa thực tiễn

Bộ sinh phẩm Multiplex Realtime PCR giúp giảm thời gian chẩn đoán và tăng độ chính xác, từ đó cải thiện hiệu quả điều trị. Kết quả kháng sinh đồ cung cấp cơ sở khoa học để điều chỉnh phác đồ kháng sinh phù hợp.

4.2. Hướng phát triển tương lai

Nghiên cứu cần được mở rộng để đánh giá hiệu quả của bộ sinh phẩm trên quy mô lớn hơn. Các nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc phát hiện thêm các gen kháng kháng sinh khác và ứng dụng công nghệ này trong các bệnh viện khác tại Việt Nam.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Nhiễm khuẩn bệnh viện (Hospital-Acquired Infections - HAI) là một trong những thách thức y tế công cộng nghiêm trọng nhất trên phạm vi toàn cầu cũng như tại Việt Nam. Theo thống kê y khoa, HAI làm gia tăng tỷ lệ tử vong, kéo dài thời gian nằm viện trung bình từ 7 đến 15 ngày, đồng thời thúc đẩy việc sử dụng kháng sinh phổ rộng dẫn đến chi phí điều trị đội lên gấp 2 đến 4 lần. Phương pháp vi sinh truyền thống dựa trên nuôi cấy và xét nghiệm sinh hóa hiện vẫn được coi là "tiêu chuẩn vàng", song bộc lộ những điểm nghẽn nghiêm trọng: thời gian trả kết quả kéo dài từ 48 đến 72 giờ (thậm chí 5 ngày đối với các vi sinh vật khó nuôi cấy), độ nhạy lâm sàng thấp (chỉ 14,5% đến 25% bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết được xác định căn nguyên bằng cấy máu), và kết quả cấy âm tính giả thường xuyên xảy ra do bệnh nhân đã được điều trị kháng sinh trước đó.

Khoảng trống nghiên cứu (research gap) cốt lõi nằm ở việc thiếu hụt một công cụ chẩn đoán phân tử đa tác nhân tại chỗ, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giá thành hợp lý, phù hợp với đặc điểm dịch tễ vi khuẩn kháng thuốc tại các bệnh viện Việt Nam. Nhằm giải quyết triệt để vấn đề này, luận án tiến sĩ của Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Loan (2022) với đề tài "Nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện một số tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và khảo sát tính kháng kháng sinh" dưới sự hướng dẫn của TS. Lã Thị Huyền (Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam) và PGS. Nguyễn Minh Hiền (Bệnh viện Thanh Nhàn) đã tiên phong thiết lập một quy trình chẩn đoán phân tử tích hợp hoàn chỉnh.

Nghiên cứu tập trung giải quyết 3 câu hỏi nghiên cứu và kiểm định các giả thuyết khoa học:

• Câu hỏi nghiên cứu 1 (RQ1): Cơ cấu phân bố và mức độ kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập từ các bệnh phẩm nhiễm khuẩn bệnh viện tại các bệnh viện tuyến đầu (Bệnh viện Thanh Nhàn, Bệnh viện Đức Giang) diễn biến như thế nào?
• Câu hỏi nghiên cứu 2 (RQ2): Làm thế nào để thiết kế và tối ưu hóa hệ thống multiplex realtime PCR phát hiện đồng thời 5 vi khuẩn gây HAI phổ biến nhất (Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus) với độ nhạy và độ đặc hiệu đạt 100%?
• Câu hỏi nghiên cứu 3 (RQ3): Tỷ lệ hiện diện và đặc điểm di truyền của các gen mã hóa beta-lactamase phổ rộng (ESBL) thuộc các họ blaTEM, blaSHV, blaCTX-M ở các chủng E. coli lâm sàng ra sao?
• Giả thuyết khoa học 1 (H1): Phản ứng multiplex realtime PCR sử dụng hệ mồi - mẫu dò TaqMan huỳnh quang đa kênh có khả năng rút ngắn thời gian chẩn đoán xuống dưới 2 giờ với giới hạn phát hiện vượt trội so với nuôi cấy vi sinh.
• Giả thuyết khoa học 2 (H2): Các trình tự gen đích đặc hiệu loài (blaOXA-51-like, gtlA, gyrB, yccT, nuc) đảm bảo tính đặc hiệu tuyệt đối, không phản ứng chéo với hệ gen người và các vi sinh vật đồng hoang dại khác.

Khung lý thuyết của luận án xây dựng trên nền tảng Thuyết mầm bệnh (Germ Theory of Disease), Cơ chế đề kháng kháng sinh di truyền học vi khuẩn (Antimicrobial Resistance Mechanisms), và Hệ hình chẩn đoán phân tử (Molecular Diagnostic Paradigm). Quy mô nghiên cứu bao quát trên $N = 1.434$ mẫu bệnh phẩm lâm sàng thu thập liên tục từ tháng 01/2016 đến tháng 12/2018, đem lại giá trị thực tiễn đột phá trong việc giảm thiểu thời gian chờ xét nghiệm, hỗ trợ bác sĩ đưa ra phác đồ điều trị trúng đích kịp thời.

Literature Review và Positioning

Nghiên cứu về nhiễm khuẩn bệnh viện có bề dày lịch sử phát triển từ thế kỷ 19, khởi nguồn từ công trình dịch tễ học bệnh viện của Sir James Young Simpson (1869) trên 4.000 bệnh nhân tại Anh và Scotland, đưa ra thuật ngữ "hospitalism" để chỉ rủi ro điều trị nội trú. Tiếp đó, các công trình kinh điển của Ignaz Semmelweis, Louis Pasteur, Joseph Lister và Robert Koch đã định hình nền tảng kiểm soát nhiễm khuẩn qua khử trùng và vệ sinh y tế. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), nhiễm khuẩn bệnh viện là "những nhiễm khuẩn mắc phải trong thời gian người bệnh điều trị tại bệnh viện và nhiễm khuẩn này không hiện diện cũng như không nằm trong giai đoạn ủ bệnh tại thời điểm nhập viện", thường khởi phát sau 48 giờ nhập viện.

Trong kỷ nguyên sinh học phân tử, sự ra đời của kỹ thuật PCR bởi Kary Mullis (1985), phát triển bởi Saiki và cộng sự (1988), cùng bước tiến multiplex PCR của Chamberlain và cộng sự (1988) đã mở ra cuộc cách mạng trong nhận diện mầm bệnh. Các dòng nghiên cứu quốc tế đã ứng dụng multiplex realtime PCR để kiểm soát HAI: Deepa Anbazhagan và cộng sự (2011) thiết lập hệ thống phát hiện 6 loài vi khuẩn (E. coli, Acinetobacter spp., S. pneumoniae, S. aureus, P. aeruginosa, K. pneumoniae) đạt tỷ lệ tương đồng 93,7% so với nuôi cấy; Nomanpour và cộng sự (2011, Iran) ứng dụng gen blaOXA-51 phát hiện trực tiếp A. baumannii từ 361 bệnh phẩm hô hấp với giới hạn phát hiện dưới 200 CFU/mL (độ nhạy, độ đặc hiệu 100%, chỉ số tương đồng Kappa = 1); Gadsby và cộng sự (2015, 2016 tại Đại học Edinburgh và Cambridge, Vương Quốc Anh) đã thành công trong phát hiện 26 tác nhân gây viêm phổi, đạt tỷ lệ phát hiện 87% so với 39% của nuôi cấy ($p < 0,0001$).

                      TIẾN TRÌNH LỊCH SỬ VÀ ĐỊNH VỊ NGHIÊN CỨU
                      
   Thế kỷ 19                 1985 - 1988              2011 - 2016               2022 (Luận án)

Trong y văn tồn tại hai cuộc tranh luận học thuật lớn:

1. Tranh luận về độ phân giải của gen 16S rRNA so với gen đặc hiệu loài: Một trường phái ưu tiên giải trình tự vùng bảo thủ 16S rRNA để bao quát đa dạng sinh học; tuy nhiên, trường phái đối nghịch chứng minh rằng 16S rRNA có độ tương đồng quá cao giữa các loài trực khuẩn Gram âm gần nhau, dễ gây dương tính chéo. Luận án đã định vị giải pháp bằng cách sử dụng 16S rRNA để định danh phân tử sơ bộ, nhưng thiết kế multiplex realtime PCR nhắm thẳng vào các gen chức năng chuyên biệt (blaOXA-51-like, gtlA, gyrB, yccT, nuc).
2. Tranh luận giữa giá trị lâm sàng của DNA tự do và tế bào sống: Giới vi sinh truyền thống cho rằng PCR có thể khuếch đại DNA từ tế bào đã chết. Ngược lại, giới sinh học phân tử lâm sàng chứng minh rằng trong điều trị tích cực, phát hiện dấu vết DNA của mầm bệnh là bằng chứng then chốt để ngăn chặn sốc nhiễm khuẩn trước khi độc tố lan rộng.

Tại Việt Nam, các nghiên cứu của Phùng Thị Bích Thủy (sử dụng SeptiFast của Roche, phát hiện 43,3% so với 3,3% cấy máu) hay đề tài cấp Nhà nước của Lê Hữu Song (2015, phát hiện vi khuẩn nhiễm khuẩn huyết đạt ngưỡng 10 CFU/mL) đã đặt nền móng. Luận án của Nguyễn Thị Loan định vị vượt bậc qua việc làm chủ hoàn toàn công nghệ thiết kế mồi, mẫu dò TaqMan kết hợp công nghệ làm giàu mẫu và giải mã kiểu gen kháng kháng sinh ESBL tại chỗ, giảm thiểu phụ thuộc vào sinh phẩm ngoại nhập đắt đỏ.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án đã mở rộng Phân loại Cấu trúc Beta-Lactamase của Ambler (1980) vào thực tiễn phân tích dịch tễ học phân tử tại Việt Nam:

• Hệ thống hóa biến thể Ambler Lớp A và Lớp D: Làm sáng tỏ cơ chế thủy phân kháng sinh beta-lactam thông qua việc định danh các cụm gen blaTEM (661 bp), blaSHV (807 bp), blaCTX-M (585 bp) trên E. coli, và gen nội sinh blaOXA-51-like trên A. baumannii.
• Mô hình Chuyển gen ngang (Horizontal Gene Transfer - HGT): Củng cố cơ chế lan truyền gen kháng thuốc qua plasmid tiếp hợp thuộc nhóm không tương thích IncF (kích thước 50 - 200 kb) tích hợp vùng xen đoạn ISEcp1 đối với enzyme họ CTX-M, chứng minh áp lực chọn lọc kháng sinh trong môi trường bệnh viện đẩy nhanh tốc độ tái tổ hợp di truyền giữa các dòng trực khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae).

          MÔ HÌNH KHUNG PHÂN TÍCH TÍCH HỢP ĐA TẦNG CỦA LUẬN ÁN
          

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp ba trụ cột:

1. Lý thuyết Khuếch đại Huỳnh quang TaqMan Đa kênh: Sử dụng nguyên lý hoạt động của enzyme Taq DNA polymerase sở hữu hoạt tính $5' \rightarrow 3'$ exonuclease, cắt đứt mẫu dò kép liên kết chất dập tắt (ZEN/Iowa Black Quencher), giải phóng tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng bản sao mục tiêu theo chu kỳ ngưỡng $C_t$.
2. Khung Đối chuẩn Vi sinh - Phân tử (Microbiology-Molecular Benchmarking): Đối chiếu song song kết quả nuôi cấy phân lập, định danh sinh hóa (hệ thống Api 20E, Api 20NE, Api Stap của BioMérieux) với kết quả multiplex realtime PCR.
3. Phân tích Đa hình Di truyền Kháng thuốc: Tích hợp kiểm tra tính nhạy cảm kiểu hình (Kirby-Bauer theo chuẩn CLSI) với nhận diện kiểu gen kháng thuốc mở rộng. Khung phân tích xác lập rõ điều kiện biên (boundary conditions): phản ứng tối ưu ở nhiệt độ gắn mồi $60^\circ\text{C}$, tỷ lệ GC của mẫu dò từ 30% đến 80% với mật độ base C lớn hơn G, đảm bảo loại bỏ hoàn toàn hiện tượng ức chế chéo (cross-inhibition).

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Luận án áp dụng hệ hình thực chứng (Positivism) với thiết kế thực nghiệm định lượng kết hợp cắt ngang mô tả phân tích. Cỡ mẫu nghiên cứu được tính toán chuẩn xác dựa trên công thức ước tính tỷ lệ quần thể của S. Cairns và cộng sự (2008):

$$N = \frac{Z_{1-\alpha/2}^2 \cdot p(1-p)}{d^2}$$

Trong đó:

• Độ tin cậy 95% tương ứng với giá trị phân phối chuẩn $Z = 1,96$.
• Khoảng sai số tuyệt đối mong muốn $d = 0,05$.
• Tỷ lệ ước tính nhiễm các tác nhân gây HAI: S. pneumoniae ($p = 0,20$), P. aeruginosa ($p = 0,17$), K. pneumoniae ($p = 0,20$), E. coli ($p = 0,25$), S. aureus ($p = 0,144$).

Thay thế các tham số vào công thức cho từng phân nhóm, tổng cỡ mẫu tối thiểu lý thuyết được xác lập là $N_{\text{tổng}} = 1.019,3 \approx 1.100$ mẫu. Trong thực tế, tác giả đã thu thập vượt mức với tổng cộng $N = 1.434$ mẫu bệnh phẩm lâm sàng (đờm, dịch hút phế quản, nước tiểu, máu) tại Bệnh viện Thanh Nhàn và Bệnh viện Đức Giang, đảm bảo độ vững chắc tuyệt đối cho các phân tích thống kê.

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình thực nghiệm được chuẩn hóa nghiêm ngặt qua nhiều cấp độ kiểm chuẩn:

• Thu thập và xử lý bệnh phẩm: Bệnh phẩm đờm, dịch phế quản và nước tiểu được lấy vào sáng sớm trước khi dùng kháng sinh; mẫu máu tĩnh mạch (20 - 30 mL) lấy vào thời điểm bệnh nhân bắt đầu có triệu chứng rét run, sốt cao.
• Tách chiết và làm sạch DNA: Sử dụng kit QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen) trên hệ thống tự động QIAcube. Mẫu bệnh phẩm cấy máu được xử lý enzyme lysozyme ($1\text{ mg/mL}$) ủ ở $37^\circ\text{C}$ trong 30 phút, đun sôi biến tính ở $100^\circ\text{C}$ trong 10 phút, sốc lạnh $0^\circ\text{C}$ trong 5 phút và ly tâm $12.000\text{ vòng/phút}$. Nồng độ và độ tinh sạch DNA được kiểm tra trên máy quang phổ NanoDrop 1000, bắt buộc đạt tỷ lệ $1,8 < OD_{260}/OD_{280} < 2,0$.
• Kỹ thuật làm giàu DNA: Sử dụng phản ứng tiền khuếch đại với mồi ngẫu nhiên random hexamer (10 pmol) trong 20 chu kỳ nhiệt ngắn để nâng cao số lượng khuôn mẫu ban đầu đối với các mẫu có tải lượng vi khuẩn thấp.
• Tạo dòng đối chứng dương: Nhân bản gen đích, gắn vào vector tách dòng pCR2.1 (Invitrogen), biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α, xác nhận dòng tái tổ hợp bằng PCR khuẩn lạc và giải trình tự nucleotide.

                    QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM PHÂN TỬ CHUẨN HÓA
                    

Data và phân tích

Hệ thống mồi và mẫu dò TaqMan được thiết kế chuyên biệt bằng phần mềm Beacon Designer và tổng hợp bởi hãng IDT (Mỹ), sử dụng các kênh huỳnh quang phân tách quang phổ:

Tác nhân vi khuẩn	Gen đích	Chiều	Trình tự mồi / Mẫu dò ($5' \rightarrow 3'$)	Chất phát / Dập tắt huỳnh quang
A. baumannii	blaOXA-51-like	F R Probe	GAAGTGAAGCGTGTTGGTTAT GCCTCTTGCTGAGGAGTAAT CGACTTGGGTACCGATATCTGCATTGC	HEX ZEN / IABkFQ
K. pneumoniae	gtlA (citrate synthase)	F R Probe	CCAGTTAGCGACCGAATCTAAT CGGGTGATCTGCTCATGAAT CGACCCAGCCGAATATGACGAAT	56-FAM ZEN / IABkFQ
P. aeruginosa	gyrB	F R Probe	CACCCTGCTGTTGACCTTCTT CTGGTCGTCCTTGATGTACTG CCCACATGGCCTCCAAGGAGTAAG	Cy5 TAO / IABkRQSp
E. coli	yccT	F R Probe	CCAATTCCGGTAAAGCTGGATA GCGTTTCGCGGATTTGTTATAG TCTCGCCATTACCTCAACGGCAAA	HEX ZEN / IABkFQ
S. aureus	nuc	F R Probe	AGGGATGGCTATCAGTAATGTTT CGCCGTTATCTGTTTGTGATG CGAAAGGGCAATACGCAAAGAGGT	56-FAM ZEN / IABkFQ
Đối chứng người	GAPDH	F R Probe	AGGGTGGTGGACCTCAT CTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTG CCCACATGGCCTCCAAGGAGTAAG	Cy5 TAO / IABkRQSp

Chu trình luân nhiệt được tối ưu hóa trên máy AriaMx Realtime PCR System (Agilent) và Mastercycler pro S (Eppendorf): Giai đoạn biến tính ban đầu ở $95^\circ\text{C}$ trong 3 phút; tiếp nối bằng 40 chu kỳ gồm bước biến tính $95^\circ\text{C}$ trong 15 giây và bước gắn mồi/kéo dài tích hợp ở $60^\circ\text{C}$ trong 30 đến 60 giây (đây là thời điểm máy đo huỳnh quang kích hoạt).

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Hiệu năng phát hiện phân tử tuyệt đối: Bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR đạt độ đặc hiệu phân tích 100%, không xảy ra bất kỳ phản ứng chéo nào giữa 5 tác nhân mục tiêu với DNA hệ gen người (GAPDH). Hiệu suất khuếch đại của phản ứng đơn (singleplex) và đa mồi (multiplex) đạt từ 90% đến 100%, giá trị $C_t$ hoàn toàn ổn định và nhất quán sau 4 tháng bảo quản thử nghiệm.
2. Cơ cấu vi khuẩn phân lập tại bệnh viện nghiên cứu: Trong số các chủng gây nhiễm khuẩn bệnh viện phân lập được, trực khuẩn Gram âm chiếm ưu thế áp đảo (~70%), trong đó A. baumannii, K. pneumoniae, P. aeruginosa, và E. coli là các tác nhân hàng đầu; cầu khuẩn Gram dương S. aureus chiếm xấp xỉ 30%.
3. Mức độ đề kháng kháng sinh ở mức báo động đỏ:
   • Acinetobacter baumannii thể hiện tính siêu kháng thuốc: tỷ lệ kháng cephalosporin thế hệ 3, 4 và nhóm carbapenem (imipenem, meropenem) đều vượt trên 70% - 80%, kháng ciprofloxacin > 80%.
   • Pseudomonas aeruginosa đề kháng mạnh mẽ với hầu hết các kháng sinh thông thường (tỷ lệ kháng trên 40% đối với ceftazidime, ciprofloxacin, imipenem, gentamicin), chỉ duy trì độ nhạy cảm cao với colistin (tỷ lệ kháng chỉ 10,7%).
   • Staphylococcus aureus ghi nhận tỷ lệ kháng methicillin (MRSA) cao (> 50%), kháng 100% với penicillin, nhưng vẫn duy trì độ nhạy cảm 100% với vancomycin, linezolid và teicoplanin.
4. Tỷ lệ hiện diện gen sinh enzyme beta-lactamase phổ rộng ở E. coli: Các chủng E. coli lâm sàng mang tỷ lệ sinh ESBL rất cao (> 68% - 73%). Phân tích phân tử cho thấy sự hiện diện áp đảo của họ gen blaCTX-M (sản phẩm PCR 585 bp), theo sau là blaTEM (661 bp) và blaSHV (807 bp). Nhiều chủng mang đồng thời từ 2 đến 3 gen kháng thuốc, tạo nên kiểu hình đa kháng (MDR) phức tạp.

          TỶ LỆ KHÁNG KHÁNG SINH VÀ GEN ESBL CỦA CÁC TÁC NHÂN CHÍNH
          

Implications đa chiều

• Ý nghĩa lý thuyết: Cung cấp dữ liệu dịch tễ học phân tử chuẩn mực về sự biến động hệ gen vi khuẩn kháng thuốc tại Việt Nam, đóng góp bằng chứng thực nghiệm vào cơ sở dữ liệu giám sát vi sinh toàn cầu của WHO và ECDC.
• Ý nghĩa phương pháp luận: Chuẩn hóa quy trình thiết kế multiplex realtime PCR sử dụng mẫu dò kép TaqMan (ZEN/TAO Double-Quenched Probes) kết hợp gen nội kiểm GAPDH, thiết lập quy chuẩn kỹ thuật cho các nghiên cứu phát triển sinh phẩm chẩn đoán in vitro (IVD) trong nước.
• Ý nghĩa thực tiễn lâm sàng: Cắt giảm thời gian chẩn đoán căn nguyên từ 3 ngày xuống còn dưới 2 giờ, cho phép bác sĩ hồi sức cấp cứu (ICU) chỉ định kháng sinh đích sớm, giảm thiểu tỷ lệ tử vong do sốc nhiễm khuẩn, rút ngắn thời gian nằm viện từ 7 - 15 ngày và hạ thấp áp lực chi phí điều trị cho bảo hiểm y tế.
• Ý nghĩa chính sách y tế: Cung cấp cơ sở khoa học vững chắc để Bộ Y tế ban hành hướng dẫn sử dụng kháng sinh hợp lý và tăng cường chương trình kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện quốc gia.

Limitations và Future Research

Mặc dù đạt được những kết quả đột phá, luận án thẳng thắn ghi nhận một số giới hạn nghiên cứu (boundary conditions):

1. Phạm vi địa lý và cỡ mẫu lâm sàng: Dữ liệu bệnh phẩm tập trung chủ yếu tại Bệnh viện Thanh Nhàn và Bệnh viện Đức Giang (Hà Nội), chưa bao quát toàn diện các bệnh viện khu vực miền Trung và miền Nam, nơi có thể có sự khác biệt về áp lực dịch tễ học và chủng vi khuẩn lưu hành.
2. Phạm vi phát hiện gen kháng thuốc: Nghiên cứu mới chỉ tập trung xác định kiểu gen ESBL (blaTEM, blaSHV, blaCTX-M) trên vi khuẩn E. coli, chưa bao quát toàn bộ các gen carbapenemase tối nguy hiểm khác như blaNDM-1, blaKPC, blaVIM, blaOXA-48 hoặc gen kháng colistin (mcr-1) trên các loài trực khuẩn Gram âm khác.
3. Ảnh hưởng của chất ức chế nền mẫu: Nền mẫu lâm sàng phức tạp (đờm đặc, mủ vết thương, mẫu máu có chứa nhiều heme) có thể ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng PCR nếu quy trình tách chiết không loại bỏ triệt để chất ức chế.

Chương trình nghiên cứu tương lai (Future Research Agenda):

• Tích hợp thêm các kênh huỳnh quang để mở rộng bộ sinh phẩm phát hiện đồng thời 10 - 15 tác nhân gây bệnh cùng các gen kháng carbapenem (blaKPC, blaNDM) và methicillin (mecA).
• Nghiên cứu ứng dụng công nghệ vi lưu (microfluidics) và hệ thống Lab-on-a-chip để phát triển thiết bị chẩn đoán nhanh tại điểm chăm sóc (Point-of-Care Testing - POCT).
• Ứng dụng công nghệ giải trình tự toàn bộ hệ gen (Whole Genome Sequencing - WGS) nhằm theo dõi sự tiến hóa vi mô và các đột biến điểm mới phát sinh trên các gen kháng kháng sinh.

Tác động và ảnh hưởng

Luận án tạo ra tác động sâu rộng trên nhiều phương diện khoa học và xã hội:

                            SƠ ĐỒ TÁC ĐỘNG ĐA CHIỀU
                            

• Tác động học thuật: Các công trình công bố từ luận án trên các tạp chí chuyên ngành uy tín trong nước và quốc tế tạo tiền đề khoa học cho các nghiên cứu tiếp nối về sinh thái học vi sinh vật và di truyền phân tử kháng thuốc.
• Tác động kinh tế - kỹ thuật: Tự chủ công nghệ chế tạo kit chẩn đoán phân tử trong nước giúp giảm giá thành xét nghiệm từ 50% đến 70% so với việc nhập khẩu các bộ kit thương mại quốc tế (như SeptiFast của Roche hay FilmArray của BioMérieux), tiết kiệm hàng chục tỷ đồng cho ngân sách y tế hàng năm.
• Lợi ích xã hội: Giúp cứu sống hàng ngàn bệnh nhân nguy kịch nhờ chẩn đoán sớm mầm bệnh, kiểm soát hiệu quả sự lây lan của các chủng vi khuẩn siêu kháng thuốc trong môi trường bệnh viện, bảo vệ an toàn sức khỏe cộng đồng.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và Giới nghiên cứu Vi sinh học: Tiếp cận quy trình thiết kế mồi, mẫu dò TaqMan đa mồi chuẩn xác và các thông số tối ưu nhiệt độ, nồng độ hóa chất để phát triển các hệ thống multiplex PCR tương tự.
• Bác sĩ Lâm sàng và Khoa Hồi sức Tích cực (ICU): Nhận được kết quả định danh mầm bệnh chính xác trong vòng 80 - 120 phút thay vì phải chờ 48 - 72 giờ, loại bỏ việc sử dụng kháng sinh bao vây theo kinh nghiệm, nâng cao tỷ lệ điều trị thành công.
• Các Đơn vị R&D và Doanh nghiệp Dược phẩm Sinh học: Tiếp nhận quy trình công nghệ hoàn chỉnh để thương mại hóa thành các bộ kit IVD đạt tiêu chuẩn ISO 13485 phục vụ thị trường trong nước và khu vực.
• Nhà hoạch định Chính sách và Quản lý Bệnh viện: Sử dụng số liệu dịch tễ học phân tử của luận án để xây dựng hàng rào kiểm soát nhiễm khuẩn, lập danh mục kháng sinh ưu tiên và hoạch định chiến lược phòng chống kháng thuốc quốc gia.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì?

Luận án đã mở rộng Thuyết cấu trúc Enzym Beta-Lactamase của Ambler và Thuyết tiến hóa chọn lọc di truyền học vi khuẩn thông qua việc chứng minh mối liên kết chặt chẽ giữa kiểu hình kháng kháng sinh thực tế (kháng > 80% cephalosporin và carbapenem) với sự tích tụ đồng thời của các cụm gen đề kháng (blaOXA-51-like nội sinh trên A. baumannii và tổ hợp plasmid blaCTX-M + blaTEM + blaSHV trên E. coli) trong điều kiện áp lực kháng sinh tại các bệnh viện Việt Nam.

2. Đột phá phương pháp luận của luận án khi so sánh với các nghiên cứu quốc tế trước đây?

So với nghiên cứu của Deepa Anbazhagan và cộng sự (2011) (sử dụng SYBR Green phân tích đường cong nóng chảy vốn dễ dương tính giả) và Gadsby và cộng sự (2015, 2016) (sử dụng mẫu dò TaqMan đơn mồi đắt đỏ), luận án đã đột phá khi:

• Tích hợp thành công 5 cặp mồi và mẫu dò TaqMan sử dụng chất phát huỳnh quang đa kênh (FAM, HEX, Cy5) cùng chất dập tắt kép tiên tiến (ZEN/Iowa Black Quencher) trong một phản ứng duy nhất.
• Đưa gen GAPDH người vào làm chứng nội suy (internal control) nhằm loại trừ 100% kết quả âm tính giả do lỗi tách chiết hoặc ức chế enzyme.

3. Phát hiện bất ngờ nhất từ dữ liệu thực nghiệm là gì?

Phát hiện bất ngờ nhất là tỷ lệ kháng kháng sinh nhóm carbapenem của A. baumannii đã vượt ngưỡng 70% - 80% tại bệnh viện tuyến thành phố, tương đương với các bệnh viện trung ương tuyến cuối. Đồng thời, sự lưu hành của các chủng E. coli mang đồng thời cả 3 gen sinh ESBL (blaCTX-M, blaTEM, blaSHV) chiếm tỷ lệ rất cao, khẳng định mức độ tiếp hợp và trao đổi plasmid kháng thuốc trong cộng đồng vi khuẩn đường ruột diễn ra nhanh hơn nhiều so với các dự báo lý thuyết trước đó.

4. Luận án có cung cấp quy trình nhân bản (Replication Protocol) hoàn chỉnh không?

Luận án cung cấp chi tiết toàn bộ quy trình thực nghiệm chuẩn hóa:

• Nồng độ các thành phần phản ứng: Master Mix IDT ($12,5\ \mu\text{L}$), mồi và mẫu dò ($10\text{ pmol}$), DNA khuôn ($3 - 5\ \mu\text{L}$).
• Chu trình nhiệt: $95^\circ\text{C}$ (3 phút) $\rightarrow$ 40 chu kỳ ($95^\circ\text{C}$ trong 15 giây, $60^\circ\text{C}$ trong 30 - 60 giây).
• Quy trình tách chiết DNA bằng dung dịch lysozyme kết hợp sốc nhiệt và cột ly tâm.
• Thiết kế plasmid tái tổ hợp pCR2.1 mang gen đối chứng chuẩn chuyển gen vào E. coli DH5α để làm mẫu định lượng.

5. Định hướng lộ trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo được phác thảo như thế nào?

Lộ trình 10 năm tập trung vào:

1. Mở rộng hệ thống phát hiện toàn diện 20 tác nhân vi khuẩn và nấm gây HAI.
2. Tích hợp module phát hiện gen kháng carbapenem (blaKPC, blaNDM, blaOXA-48) trực tiếp trên chip sinh học.
3. Chuyển giao công nghệ sản xuất hàng loạt kit chẩn đoán phân tử đạt tiêu chuẩn CE-IVD / FDA.
4. Xây dựng mạng lưới cảnh báo sớm dịch tễ học phân tử kháng kháng sinh ứng dụng trí tuệ nhân tạo (AI) và giải trình tự gen thế hệ mới (NGS).

Kết luận

Luận án tiến sĩ của NCS. Nguyễn Thị Loan đã hoàn thành xuất sắc các mục tiêu nghiên cứu với 6 đóng góp cốt lõi:

1. Thiết lập thành công bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện đồng thời 5 tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện hàng đầu (A. baumannii, K. pneumoniae, P. aeruginosa, E. coli, S. aureus) với độ nhạy, độ đặc hiệu 100% và ngưỡng phát hiện tương đương các sinh phẩm thương mại quốc tế.
2. Chuẩn hóa hệ thống mồi và mẫu dò huỳnh quang TaqMan chuyên biệt nhắm vào các gen chức năng ổn định (blaOXA-51-like, gtlA, gyrB, yccT, nuc) kết hợp gen đối chứng nội kiểm GAPDH người.
3. Giải mã diện mạo dịch tễ học phân tử trên $N = 1.434$ mẫu bệnh phẩm lâm sàng, khẳng định ưu thế áp đảo của trực khuẩn Gram âm (~70%) trong cơ cấu mầm bệnh nhiễm khuẩn bệnh viện tại Việt Nam.
4. Cung cấp bức tranh toàn diện về tính kháng kháng sinh, cảnh báo mức độ siêu kháng thuốc của A. baumannii, P. aeruginosa đối với carbapenem và cephalosporin, định danh colistin và vancomycin là những vũ khí cứu cánh cuối cùng.
5. Xác định tỷ lệ lưu hành và sự phối hợp phức tạp của các gen mã hóa ESBL (blaCTX-M, blaTEM, blaSHV) trên các chủng E. coli phân lập được.
6. Mở ra hướng ứng dụng công nghệ chẩn đoán phân tử tự chủ trong nước, tạo bước chuyển dịch quan trọng từ nuôi cấy vi sinh truyền thống sang chẩn đoán gen tốc độ cao, đóng góp giá trị to lớn cho nền y học nước nhà.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Nhiễm khuẩn bệnh viện (HospitalAquiredInfections-HAI) (NKBV) là một trong những thách thức và mối quan tâm hàng đầu trong công tác chăm sóc sức khoẻ tại Việt Nam cũng nhƣ trên toàn thế giới. NKBV làm tăng tỉ lệ tử vong, kéo dài thời gian nằm viện (7-15 ngày), tăng việc sử dụng kháng sinh dẫn tới làm tăng chi phí điều trị cao gấp 2-4 lần. Ngoài ra NKBV còn góp phần gây ra tình trạng kháng thuốc của một số vi khuẩn và làm gia tăng việc xuất hiện những tác nhân gây bệnh mới. Tác nhân gây NKBV đã có nhiều thay đổi trong vài thập kỷ qua.

Các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện có thể là các vi khuẩn Gram dƣơng và các trực khuẩn Gram âm, nấm, kí sinh trùng. Trong đó NKBV do trực khuẩn Gram âm đa kháng thuốc kháng sinh đã và đang trở thành một tai họa thực sự cho các bệnh viện. Nuôi cấy vi sinh vật là phƣơng pháp phổ biến và là tiêu chuẩn vàng hiện nay để phát hiện vi khuẩn gây bệnh trong máu và dịch cơ thể, tuy nhiên phƣơng pháp này còn nhiều hạn chế nhƣ: 1) đòi hỏi nhiều thời gian (1-5 ngày) tùy thuộc vi sinh vật gây bệnh; 2) kết quả cấy máu âm tính cũng không loại trừ đƣợc nhiễm khuẩn bệnh viện; 3) có thể không thể hiện đầy đủ cộng đồng vi sinh vật trong vết thƣơng. Việc phát hiện DNA của vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân đƣợc cho là phƣơng pháp có độ nhạy và chính xác cao, thời gian phát hiện nhanh, có ý nghĩa lớn trong chẩn đoán nhiễm khuẩn.

Trong những năm gần đây có một số công trình nghiên cứu sử dụng bộ sinh phẩm do nƣớc ngoài sản xuất để phát hiện vi sinh vật trong máu và dịch cơ thể đã thu đƣợc nhiều thành công, tuy nhiên chế tạo bộ sinh phẩm để có thể chủ động trong chẩn đoán, giảm chi phí, phù hợp với hệ vi khuẩn gây bệnh ở Việt Nam là yêu cầu đối với ngành y tế. Với mong muốn phát triển một bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao để xác định nhanh chóng các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện, giúp bác sĩ điều trị sớm đƣa ra đƣợc quyết định phù hợp nhằm tăng cơ hội cứu sống bệnh nhân, giảm chi phí 2 điều trị cũng nhƣ tác dụng phụ chúng tôi thực hiện luận án: “Nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện một số tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và khảo sát tính kháng kháng sinh” với 3 mục tiêu sau: 1. Phân lập và định danh đƣợc các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện phổ biến thƣờng gặp. Phát triển thành công bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện 5 tác nhân vi khuẩn thƣờng gặp gây nhiễm khuẩn bệnh viện: Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus aureus.

Xác định tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc và khảo sát sự tồn tại gen mã hoá beta-lactamase phổ rộng (Extended- Spectrum Beta- lactamase: ESBL) ở vi khuẩn Escherichia coli. Nội dung nghiên cứu: 1. Nuôi cấy, phân lập các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện từ các mẫu bệnh phẩm. Nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện 5 tác nhân vi khuẩn thƣờng gặp gây nhiễm khuẩn bệnh viện: A.

Xác định khả năng kháng kháng sinh của 5 tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện và gen mã hoá beta-lactamase phổ rộng ở vi khuẩn E. Tính mới của luận án 1. Là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam đề xuất quy trình phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR để phát hiện đồng thời 5 vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện phổ biến: A. Luận án đã cung cấp các thông tin mới về tỷ lệ phân lập và tỷ lệ kháng một số loại kháng sinh của 5 vi khuẩn: A.

aureus và gen mã hoá beta-lactamase phổ rộng ở vi khuẩn E. coli tại bệnh viện Thanh Nhàn. Tình hình và căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện 1. Lịch sử phát hiện và nghiên cứu về nhiễm khuẩn bệnh viện Trong thời kỳ trung cổ, các bệnh viện đã đƣợc thành lập để điều trị các nạn nhân bệnh dịch hạch và sau đó là các bệnh viện với các nhân viên y tế đang phục vụ xã hội nhƣ hiện nay.

Năm 1869, Sir James Young Simpon đã thực hiện nghiên cứu dịch tễ học bệnh viện với hơn 4000 bệnh nhân ở Scotlen và Anh, và ông nhận thấy tỷ lệ tử vong cao hơn ở những bệnh nhân đã đƣợc ở lại trong bệnh viện điều trị hậu phẫu. Ông đã sử dụng thuật ngữ “hospitalism” cho sự rủi ro liên quan đến chăm sóc tại bệnh viện. Sau nhiều năm các công trình nghiên cứu chuyên sâu của các tác giả Oliver Wendell Holmes, Ignaz Philipp Semmelweis, Louis Pasteur, Josheph Lister và Rober Koch đã xác định đƣợc các yếu tố nguy cơ liên quan đến nhiễm khuẩn bệnh viện và giới thiệu các nguyên tắc khắc phục chính nhƣ rửa tay và khử trùng các dụng cụ trong phẫu thuật giảm sự lan truyền của bệnh và tử vong [1]. Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO), nhiễm khuẩn bệnh viện đƣợc định nghĩa nhƣ sau: “Nhiễm khuẩn bệnh viện là những nhiễm khuẩn mắc phải trong thời gian người bệnh điều trị tại bệnh viện và nhiễm khuẩn này không hiện diện cũng như không nằm trong giai đoạn ủ bệnh tại thời điểm nhập viện.

Nhiễm khuẩn thường xuất hiện sau 48 giờ kể từ khi người bệnh nhập viện” [2] (Hình 1. Thời gian xảy ra nhiễm khuẩn bệnh viện [2] Để chẩn đoán NKBV ngƣời ta thƣờng dựa vào định nghĩa và tiêu chuẩn chẩn đoán cho từng vị trí NKBV. Ví dụ nhiễm khuẩn vết mổ sau phẫu thuật, nhiễm khuẩn máu có liên quan đến dụng cụ đặt trong lòng mạch, nhiễm khuẩn đƣờng tiết niệu. Dựa trên các tiêu chuẩn lâm sàng và sinh học các nhà khoa học đã xác định có 4 khoảng 50 loại nhiễm khuẩn bệnh viện khác nhau có thể xảy ra tại bệnh viện.

NKBV dẫn đến nhiều hệ luỵ cho ngƣời bệnh và hệ thống y tế nhƣ tăng biến chứng và tử vong cho ngƣời bệnh, kéo dài thời gian nằm viện trung bình từ 7 đến 15 ngày, tăng sử dụng kháng sinh dẫn đến tăng sự kháng thuốc của vi sinh vật và tăng chi phí điều trị [3], [4]. Tình hình nhiễm khuẩn bệnh viện hiện nay 1. Trên thế giới Tại Châu Âu (2016-2017), tỷ lệ NKBV của khu vực là 6,3% trong đó các nhiễm khuẩn (NK) thƣờng gặp nhất là: nhiễm khuẩn hô hấp (41,8%), nhiễm khuẩn tiêu hoá (20,8%), nhiễm khuẩn tiết niệu (18,4%), tiếp đến là nhiễm khuẩn sau khi phẫu thuật, nhiễm khuẩn da và mô mềm và một số nhiễm khuẩn khác [5], [6]. Theo báo cáo của Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa bệnh tật Châu Âu (ECDC), tỷ lệ các vi khuẩn gây NKBV (2017) tại một số nƣớc Châu Âu và tỷ lệ chung cho cả khu vực [7] thể hiện trên Bảng 1.

Tỷ lệ các tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện [7] Vi khuẩn Bỉ (%) Pháp (%) Ý (%) UK (%) Châu Âu (%) P. baumannii 0 2,7 14,7 1,8 4,5 Nghiên cứu tại bệnh viện Đại học Truyễn Nhiễm và bệnh Nhiệt đới Serbia, (từ 7/2016 đến 7/2018), tỷ lệ các loại vi khuẩn gây NKBV K. Các nghiên cứu tại một số quốc gia về tỷ lệ mắc NKBV và loại NK hay gặp: 5 Bảng 1. Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện và loại nhiễm khuẩn thƣờng gặp tại một số quốc gia Năm Tên quốc gia Tỷ lệ NKBV NKBV có tỷ lệ cao nhất NK tiết niệu: 24,3% BV Đại học Martin- 2013 5,2%.

NK hô hấp: 22,7% Slovakia [9] NK phẫu thuật: 22,7% Viêm phổi bệnh viện 2015 Mỹ [10] 3,2% NK đƣờng tiêu hoá, NK tại chỗ phẫu thuật. 2016 Ấn Độ [11] 3,7% NK tiết niệu 31,9% Viêm phổi: 23,4% 2017 Canada [12] 7,3% NK vết mổ: 20,2% NK máu: 15,2% NK vết mổ: 29,0% NK đƣờng hô hấp dƣới 2017 Swizeland [13] 4,5% 18,2% NK đƣờng tiết niệu:14,9% NK máu:12,8% 2016-2018 BV Đại học truyền NK tiết niệu: 36,3% nhiễm và bệnh Nhiệt NK máu: 19,6% đới Serbia [8] Viêm phổi:15,7% 1. Tại Việt Nam Tình hình NK tại Việt Nam chƣa đƣợc xác định đầy đủ, ít có tài liệu và giám sát về NKBV đƣợc công bố. Nghiên cứu của bệnh viện (BV) Bệnh Nhiệt đới Trung ƣơng và VINAREX (2013) khảo sát trên 3671 bệnh nhân của 15 khoa Hồi sức tích cực tại 15 BV của 3 6 miền cho thấy tỷ lệ NKBV là 27,3% và tỷ lệ các loại vi khuẩn thƣờng gặp: A.

Các nghiên cứu gần đây của các BV về tỷ lệ NKBV và NK có tỷ lệ cao nhất: Bảng 1. Tỷ lệ NKBV và loại nhiễm khuẩn có tỷ lệ cao nhất Tỷ lệ NKBV có tỷ lệ cao Năm Khu vực NKBV nhất 2015-2016 BV Sản nhi- Ninh Bình [15] 7,17% NK hô hấp: 56,73%, 2016 Đại học Y dƣợc Huế [16] 5,2% NK Vết mổ: 60% 2106 BV TW Quân Đội 108 [17] 3,86% NK vết mổ: 37,25%. 2016-2017 BV Đa Khoa Ninh Thuận [18] 2,4% NK hô hấp: 40,6% 2016-2017 BV Đa Khoa Nông Nghiệp [19] 6,94%. NK hô hấp: 55,55% 2017 BV Đa Khoa Vĩnh Phúc [20] 2,7% NK hô hấp: 42% Tỷ lệ NKBV ở Việt Nam tƣơng đƣơng với các kết quả nghiên cứu của WHO với qui mô vùng, quốc gia và liên quốc gia, tỉ lệ này dao động từ 2,7% đến 10% ngƣời bệnh nhập viện, trong đó các vi khuẩn gây NKBV chủ yếu là các trực khuẩn Gram âm với tỷ lệ gần 70% với các vi khuẩn: A.

coli, các vi khuẩn Gram dƣơng chiếm khoảng 30% chủ yếu là S. Một số nghiên cứu tại các bệnh viện về tỷ lệ các loại vi khuẩn gây NKBV: 7 Bảng 1. Tỷ lệ vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện tại một số bệnh viện Tên các bệnh viện Ac Pa Kp Ec Sa BV Chợ Rẫy-2014 [21] 59,3 12 12 3,3 5,8 BV Bạch Mai-2015[22] 21,4 14,3 34,8 14,3 / BV Đa khoa Phú Thọ-2016 [23] 21,5 14,45 7,1 7,1 14,4 BV Sản- Nhi Ninh Bình (2015-2016) [15] 7,7 20,2 25 13,5 22,1 BV Đa khoa Nông nghiệp (2016-2017) [19] / 13,73 11,13 25,15 24,07 Ac: Acinetobacter baumannii, Pa: Pseudomonas aeruginosa, Kp: Klebsiella pneumoniae, Ec: Escherichia coli, Sa: Staphylococcus aureus. Căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện Các tác nhân gây NKBV biến đổi theo nhóm cộng đồng dân cƣ, các chuyên khoa điều trị khác nhau và có sự khác nhau giữa các quốc gia.

Tụ cầu Staphylococcus aureus S. aureus là vi khuẩn Gram dƣơng hàng đầu gây nhiều bệnh khác nhau từ bệnh nhẹ về da, nhiễm trùng đa dạng ở phổi, xƣơng, tim, nhiễm khuẩn huyết và đóng vai trò quan trọng trong NKBV liên quan đến truyền dịch, ống thở, nhiễm khuẩn vết bỏng và nhiễm khuẩn vết mổ. aureus kháng methicillin (MRSA) và S. aureus mẫn cảm với methicillin (MSSA) là nguyên nhân gây NKBV dẫn tới điều trị khó khăn [24].