Chương 1 trình bày ngắn gọn tổng quan lý thuyết về cảm biến sinh học nói chung và cảm biến sinh học điện hóa nói riêng. Khái niệm chung về chỉ dấu khối u và vai trò trong chẩn đoán sớm đối với bệnh ung thư. Ba loại chỉ dấu khối u (α-hCG, PSA, AFP) là đối tượng nghiên cứu của luận án cũng được trình bầy chi tiết. Tình hình nghiên cứu cảm biến sinh học điện hóa ứng dụng phát hiện chỉ dấu khối u trong cộng đồng khoa học trong nước và quốc tế.
THỰC NGHIỆM VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chương 2 trình bày hai phương pháp điện hóa chính sử dụng trong nội dung của luận án là phương pháp phổ tổng trở điện hóa (EIS) và phương pháp quét thế tuần hoàn (CV). Các phương pháp khảo sát tính chất và hình thái học vật liệu biến tính bề mặt điện cực như chụp ảnh hiển vi điện tử quét (SEM), phổ tán xạ năng lượng tia X (EDS), phổ tán xạ Raman. Quy trình thực nghiệm chế tạo cảm biến cũng như quy hoạch số liệu thực nghiệm. 3 Kỹ thuật vi lưu ly tâm tích hợp với điện cực in lưới ứng dụng trong cảm biến sinh học điện hóa cũng sẽ được trình bày chi tiết.
CẢM BIẾN MIỄN DỊCH PHÁT HIỆN CHỈ DẤU α-hCG ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN U TẾ BÀO MẦM TINH Chương 3 trình bày các kết quả nghiên cứu chế tạo cảm biến nhạy khối lượng sử dụng linh kiện vi cân tinh thể thạch anh (QCM) và cảm biến phổ tổng trở điện hóa sử dụng điện cực in lưới mực in vàng (SPAuE). Kháng thể đơn dòng α-hCG được cố định lên điện cực vàng cảm biến thông qua liên kết cộng hóa trị giữa nhóm amin của kháng thể với nhóm cacboxyl của màng đơn lớp tự lắp ghép (MHDA). Hiệu suất cố định đầu thu kháng thể được đánh giá thông qua khảo sát sự thay đổi tần số dao động của QCM sau mỗi bước công nghệ chế tạo cảm biến. Bên cạnh đó, tác giả cũng tiến hành nghiên cứu cảm biến điện hóa sử dụng điện cực SPAuE với ưu điểm như giá thành rẻ, yêu cầu một lượng nhỏ dung dịch mẫu, dễ tích hợp với các thiết bị cầm tay.
Kết quả nghiên cứu cho thấy cảm biến điện hóa có dải làm việc tuyến tính trong vùng nồng độ kháng nguyên α-hCG từ 4 đến 100 ng/mL với giới hạn phát hiện là 9,35 ng/mL, đáp ứng yêu cầu phát hiện chỉ dấu α-hCG trong chẩn đoán sớm ung thư tế bào mầm tinh. CẢM BIẾN APTAMER PHÁT HIỆN CHỈ DẤU PSA ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN UNG THƯ TIỀN LIỆT TUYẾN Chương 4 trình bày các kết quả nghiên cứu chế tạo cảm biến phổ tổng trở điện hóa trên cơ sở điện cực in lưới mực in vàng (SPAuE) và điện cực in lưới mực in các bon (SPCE) được biến tính bởi lớp hạt nano vàng. Trong nghiên cứu này, đầu thu sinh học aptamer được thay thế cho đầu thu kháng thể trong cảm biến miễn dịch. Điểm nổi bật của kết quả là đầu thu aptamer được cố định phân tán trên điện cực mực in các bon biến tính bởi lớp hạt nano vàng có kích thước từ 10 ÷ 20 nm.
Các kết quả thực nghiệm thu được đã giải thích một cách khoa học và trọn vẹn cơ chế tín hiệu của cảm biến phổ tổng trở điện hóa sử dụng đầu thu aptamer. Cảm biến đã chế tạo có tính chọn lọc cao và độ tuyến tính cao trong dải nồng độ kháng nguyên PSA từ 2 ÷ 10 ng/mL, hoàn toàn đáp ứng được yêu cầu phát hiện chỉ dấu PSA trong chẩn đoán ung thư tiền liệt tuyến. CẢM BIẾN MIỄN DỊCH PHÁT HIỆN CHỈ DẤU AFP ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN UNG THƯ GAN Chương 5 trình bày các kết quả nghiên cứu chế tạo cảm biến miễn dịch xác định chỉ dấu AFP trên cơ sở điện cực in lưới mực in các bon được biến tính bởi vật liệu nano. Đầu thu kháng thể AFP được cố định trên bề mặt điện cực thông qua liên kết cộng hóa trị giữa nhóm chức -COOH (hoặc -NH2) trên kháng thể với nhóm chức -NH2 (hoặc -COOH) biến tính trên bề mặt điện cực.
Bề mặt điện cực SPCE được biến tính bởi bốn loại vật liệu khác nhau: polyme dẫn đồng trùng hợp PPy-PPa, vật liệu lai cấu trúc nano hai chiều giữa polyme PPy-PPa và ôxít graphene dạng khử điện hóa (erGO), màng đơn lớp tự lắp ghép SAM(p-ATP), vật liệu lai giữa poly(p-ATP) và hạt nano vàng. Các giải pháp biến tính bề mặt điện cực giúp nâng cao hiệu suất cố định đầu thu kháng thể cũng như cải thiện đáp ứng tín hiệu đối với cảm biến phổ tổng trở điện hóa. Kết quả nghiên cứu cho thấy bốn loại 4 cảm biến chế tạo có dải làm việc tuyến tính trong vùng nồng độ kháng nguyên AFP từ 1 đến 100 ng/mL, đáp ứng yêu cầu phát hiện chỉ dấu AFP trong chẩn đoán sớm ung thư gan. CẢM BIẾN ĐIỆN HÓA GLUCOSE Chương 6 trình bày kết quả nghiên cứu bước đầu về cảm biến điện hóa enzyme glucose thế hệ thứ 2 trên cơ sở vật liệu polyme ôxy hóa-khử Osmium.
GOx được cố định trong mạng polyme Osmium trên nền điện cực SPCE biến tính bởi lớp hạt nano vàng. Cấu trúc đa lớp giữa polyme Osmium và enzyme GOx với ưu điểm đơn giản trong quy trình chế tạo, độ đồng nhất bề mặt cao và không làm suy giảm hoạt tính của enzyme. Cảm biến hoạt động tại điều kiện điện áp thấp (-0,02 V vs. Ag/AgCl) cho phép loại bỏ được các tín hiệu không đặc hiệu có trong mẫu máu bệnh phẩm.
Cảm biến hoạt động tốt trong dải nồng độ glucose từ 0 đến 10 mM (R2 = 0,99). Kết quả này là tiền đề cho những nghiên cứu tiếp theo về cảm biến sinh học điện hóa enzyme phát hiện chỉ dấu sinh học ứng dụng chẩn đoán bệnh sớm. CẢM BIẾN SINH HỌC ĐIỆN HÓA ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN BỆNH SỚM Cảm biến sinh học là một lĩnh vực đa ngành kết hợp giữa vật lý, hóa học, sinh học phân tử, khoa học vật liệu, điện và điện tử đã thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trong nước và trên thế giới. Cảm biến sinh học là thiết bị cho phép chuyển đổi các tương tác sinh học sang các dạng tín hiệu có thể đo lường được như điện hóa, quang học, áp điện và nhiệt.
Cảm biến sinh học có nhiều ưu điểm như độ đặc hiệu ở mức độ sinh học phân tử, cấu trúc đơn giản, tiết kiệm thời gian phân tích, thao tác sử dụng đơn giản, có khả năng phân tích đa chất. Cảm biến được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của đời sống như công nghệ sinh học thực phẩm, trong y sinh và môi trường. Trong chương này, tác giả trình bày tổng quan về cảm biến sinh học nói chung và cảm biến sinh học điện hóa. Khái niệm chung về chỉ dấu khối u và vai trò của chúng trong chẩn đoán sớm đối với bệnh ung thư.
Ba loại chỉ dấu khối u là đối tượng nghiên cứu của luận án (α-hCG, PSA, AFP) cũng được trình bầy chi tiết. Từ tổng quan tình hình nghiên cứu cảm biến sinh học điện hóa phát hiện chỉ dấu khối u trong cộng đồng khoa học trong nước và quốc tế, tác giả đưa ra những định hướng nghiên cứu chính của luận án.1 Cảm biến sinh học Kháng thể Kháng nguyên Điện hóa Enzyme Kim loại nặng Quang học Chuyển sang Xử lý và Axít nucleic Phản ứng hóa sinh tín hiệu điện hiển thị DNA. RNA Áp điện Aptamer Chất độc Nhiệt Tế bào, mô Vi khuẩn Chất cần phân tích Đầu thu sinh học Chuyển đổi tín hiệu Xử lý tín hiệu Hình 1. Cấu trúc của cảm biến sinh học.
Theo Hiệp hội Quốc tế về Hóa học và Hóa học ứng dụng (IUPAC – International Union of Pure and Applied Chemistry), cảm biến sinh học (biosensor) là một thiết bị tích hợp có khả năng cung cấp thông tin, phân tích định lượng hoặc bán định lượng của chất cần phân tích thông qua việc sử dụng đầu thu sinh học được cố định lên bộ phận chuyển đổi tín hiệu [85]. Cấu tạo của một cảm biến sinh học bao gồm ba phần chính: đầu thu sinh học, bộ phận 6 chuyển đổi và bộ phận xử lý đọc tín hiệu.1 cấu tạo của một cảm biến sinh học nói chung. Cảm biến sinh học có thể phân loại dựa trên cơ chế chuyển đổi tín hiệu hoặc loại đầu thu sinh học sử dụng như được trình bày trên hình 1. Cảm biến sinh học Cơ chế chuyển đổi tín hiệu Đầu thu sinh học Kháng thế Nhiệt Áp điện Điện hóa Quang học Enzyme Đo dòng SPR Vi cân tinh thể Axít nucleic thạch anh (QCM) Đo điện áp Raman & FT-IR Aptamer Sóng bề mặt (SAW) Đo độ dẫn Ống dẫn sóng Tế bào, mô Polyme in Phổ tổng trở Khác phân tử Hình 1.
Phân loại cảm biến sinh học theo cơ chế chuyển đổi tín hiệu và loại đầu thu sinh học [134].1 Đầu thu sinh học Đầu thu sinh học là phần tử sinh học được cố định trên bộ phận chuyển đổi nhằm phát hiện các chất cần phân tích thông qua các phản ứng hóa sinh, tín hiệu này được nhận biết bởi bộ chuyển đổi tín hiệu. Có sáu loại đầu thu sinh học cơ bản thường được sử dụng trong cảm biến sinh học bao gồm: kháng nguyên/ kháng thể, enzyme, chuỗi axít nucleic (ssDNA, DNA, RNA), aptamer, tế bào hoặc bộ phận của tế bào, polyme in phân tử. ➢ Kháng nguyên/ kháng thể Kháng nguyên/ kháng thể là những phần tử sinh học phức tạp gồm các chuỗi polypeptide được cấu tạo từ vài trăm phân tử axít amin liên kết với nhau theo một trật tự xác định [4]. Tương tác giữa kháng thể với kháng nguyên theo nguyên tắc ổ khóa và chìa khóa có tính đặc hiệu cao.
Đầu thu kháng thể được sử dụng trong cảm biến sinh học phát hiện các tế bào và chỉ dấu sinh học như kháng nguyên [122, 133], xác định chủng virus, vi khuẩn [224] và các chất độc tố [15, 196]. • Kháng nguyên Kháng nguyên là thành phần sinh học khi tiếp xúc với hệ thống miễn dịch (in vitro hay in vivo) sẽ tạo ra đáp ứng miễn dịch và có khả năng kết hợp đặc hiệu với kháng thể hay các thụ thể bề mặt của tế bào T đã hình thành trong đáp ứng miễn dịch. Kháng nguyên hoàn chỉnh (antigen) vừa có tính sinh miễn dịch vừa có tính đặc hiệu kháng nguyên [6]. Tính đặc hiệu kháng nguyên không phải do toàn bộ cấu trúc phân tử kháng nguyên gây ra mà do một hoặc nhiều vùng (domain) cấu trúc trong phân tử kháng nguyên quyết định.
Những domain cấu trúc này sẽ quyết định tính đặc hiệu kháng nguyên được gọi là nhóm quyết định kháng 7 nguyên. Nhóm quyết định kháng nguyên được nhận biết đặc hiệu bởi các kháng thể đặc hiệu hoặc thụ thể đặc hiệu trên tế bào T mẫn cảm.
