Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Ngành nuôi tôm nước lợ đóng vai trò trụ cột trong cơ cấu xuất khẩu thủy sản của Việt Nam, với diện tích canh tác hơn 600.000 ha và đóng góp 40–45% tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản toàn quốc, tương đương giá trị 3,5–4 tỷ USD hàng năm. Riêng tại tỉnh Trà Vinh, trong 9 tháng đầu năm 2020, diện tích thả nuôi thủy sản đạt 55.776 ha với 6,43 tỷ con giống, tập trung chủ yếu vào tôm sú (Penaeus monodon) và tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei). Tuy nhiên, nghề nuôi tôm thường xuyên đối mặt với rủi ro dịch bệnh nghiêm trọng, đặc biệt là hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease - AHPND, trước đây gọi là AHPNS). Tác nhân gây bệnh được xác định là vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus mang plasmid độc lực tích hợp gen mã hóa độc tố làm phá hủy tế bào biểu mô ống gan tụy, khiến tôm chết hàng loạt ở giai đoạn 25–40 ngày tuổi với tỷ lệ thiệt hại có thời điểm lên đến 9,6% đối với tôm sú và 16% đối với tôm thẻ chân trắng tại các huyện Châu Thành, Cầu Ngang, Trà Cú và thị xã Duyên Hải.

Biện pháp kiểm soát dịch bệnh phổ biến hiện nay vẫn là sử dụng hóa chất và trộn kháng sinh định kỳ vào thức ăn. Tuy nhiên, giải pháp này bộc lộ nhiều hạn chế nghiêm trọng: hầu như không mang lại hiệu quả đối với các chủng V. parahaemolyticus kháng thuốc, làm suy giảm chất lượng môi trường nước ao, ức chế sự phát triển của tôm và để lại dư lượng kháng sinh trong thương phẩm, ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe người tiêu dùng cũng như rào cản xuất khẩu. Việc ứng dụng vi khuẩn đối kháng, đặc biệt là nhóm vi khuẩn sinh acid lactic (Lactic Acid Bacteria - LAB), làm chế phẩm sinh học (probiotic) bổ sung vào thức ăn là giải pháp an toàn và bền vững. Mặc dù vậy, phần lớn các chế phẩm vi sinh trên thị trường Việt Nam hiện nay là sản phẩm nhập khẩu với giá thành cao và chưa thích nghi tối ưu với điều kiện sinh thái bản địa. Do đó, đề tài "Phân lập và sàng lọc vi khuẩn Lactic kháng Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm tại tỉnh Trà Vinh" được thực hiện nhằm khai thác nguồn vi sinh vật bản địa có tiềm năng ứng dụng thực tế.

Mục tiêu tổng quát của khóa luận là phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn lactic bản địa có khả năng đối kháng mạnh với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh trên tôm. Các nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể bao gồm:

  1. Phân lập các dòng vi khuẩn lactic từ các nguồn mẫu nước ao nuôi tôm, ruột tôm, ruột cá và bùn đáy ao tại tỉnh Trà Vinh.
  2. Sàng lọc hình thái, kiểm tra các đặc tính sinh lý - sinh hóa và xác định hoạt tính kháng khuẩn của các dòng phân lập được đối với Vibrio parahaemolyticus.
  3. Đánh giá cơ chế kháng khuẩn (acid hữu cơ hoặc bacteriocin) và thử nghiệm khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn chọn lọc trong dải độ mặn của môi trường nuôi tôm (5–25‰).
  4. Định danh các dòng vi khuẩn lactic ưu tú có hoạt tính đối kháng cao nhất bằng kỹ thuật sinh học phân tử (giải trình tự gen 16S rRNA).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ mẫu thực địa và chủng chỉ thị Vibrio parahaemolyticus do Phòng Nghiên cứu và Phát triển (R&D) Vi sinh - Công ty Cổ phần Mỹ Lan cung cấp.
  • Phạm vi không gian: Thu thập mẫu tôm nuôi (kích cỡ ~20 g/con), cá rô phi (Oreochromis niloticus, kích cỡ ~100 g/con), nước và bùn đáy tại các ao nuôi thâm canh và quảng canh thuộc thị xã Duyên Hải, thị trấn Cầu Kè và thị trấn Trà Cú, tỉnh Trà Vinh. Thí nghiệm được triển khai tại phòng thí nghiệm của Công ty Cổ phần Mỹ Lan.
  • Phạm vi thời gian: Khóa luận được thực hiện trong thời gian 3 tháng (năm 2021) và bảo vệ vào tháng 01/2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận xây dựng trên nền tảng lý thuyết vi sinh vật học thủy sản và phân loại vi khuẩn:

  • Vi khuẩn gây bệnh: Vibrio parahaemolyticus thuộc ngành Proteobacteria, lớp Gammaproteobacteria, bộ Vibrionales, họ Vibrionaceae. Đây là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi, di động bằng tiêm mao, phát triển mạnh trong môi trường có nồng độ muối 1–7%, khoảng pH 5–11 và nhiệt độ tối ưu 37°C. Độc lực của loài liên quan đến gen hemolysin không bền nhiệt (TLH), hemolysin bền nhiệt (TDH) và các enzyme ngoại bào phá hủy mô gan tụy tôm.
  • Nhóm vi khuẩn lactic (LAB): Thuộc ngành Firmicutes, lớp Bacilli, bộ Lactobacillales, gồm 4 họ chính theo khóa phân loại Bergey (2001): Lactobacillaceae (chi Lactobacillus, Pediococcus), Enterococcaceae (chi Enterococcus), Leuconostocaceae (chi Leuconostoc), và Streptococcaceae (chi Streptococcus, Lactococcus). Đây là các vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, kỵ khí tùy nghi hoặc vi hiếu khí, lên men carbohydrate sinh acid lactic.
  • Cơ chế đối kháng và bacteriocin: Vi khuẩn lactic ức chế vi sinh vật gây bệnh thông qua việc giảm pH môi trường bằng acid lactic và acid acetic (làm acid hóa nội bào và thay đổi tính thấm màng tế bào), sản sinh H2O2, diacetyl, CO2 và các peptide kháng khuẩn (bacteriocin). Theo Mokoena (2017), bacteriocin được chia thành 4 nhóm chính: Lớp I (lantibiotics, <5 kDa, ví dụ: nisin), Lớp IIa–IIc (peptides bền nhiệt, không biến tính, <10 kDa, ví dụ: pediocin, plantaricin), Lớp III (protein khối lượng phân tử lớn, không bền nhiệt, >30 kDa, ví dụ: helveticin J).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm bao gồm:

  • Xử lý mẫu và phân lập: Mẫu ruột tôm, ruột cá được nghiền đồng nhất vô trùng trong 5 mL nước muối sinh lý (NaCl 0,85%), tăng sinh trong môi trường de Man, Rogosa & Sharpe (MRS) broth ở 37°C trong 48 giờ. Mẫu bùn (1 g trong 9 mL nước muối sinh lý) và mẫu nước ao (1 mL) được cấy tăng sinh tương tự. Dịch pha loãng bậc 10 (10⁻¹ đến 10⁻⁶) được cấy trải trên môi trường thạch MRS agar có bổ sung 1% CaCO3, ủ ở 37°C trong 48 giờ. Các khuẩn lạc tạo vòng tan calci carbonate được chọn lọc và cấy ria thuần khiết trên đĩa MRS agar.
  • Khảo sát hình thái và thử nghiệm sinh hóa: Nhuộm Gram quan sát dưới kính hiển vi quang học Euromex (độ phóng đại 100X) và đo kích thước bằng phần mềm ImageFocus Plus V2. Tiến hành các thử nghiệm sinh hóa tiêu chuẩn theo Kandler và Weiss (1986): thử nghiệm catalase (với H2O2), oxidase, thử nghiệm citrate (môi trường Simmons Citrate), thử nghiệm indole (môi trường Nutrient Broth + thuốc thử Kovac’s), thử nghiệm phân giải gelatin (Nutrient Broth bổ sung 10% gelatin), thử nghiệm môi trường Kligler Iron Agar (KIA) kiểm tra lên men glucose/lactose và sinh H2S, thử nghiệm Methyl Red (MR), thử nghiệm Voges-Proskauer (VP trên môi trường Clark-Lubs), và kiểm tra khả năng di động trên thạch bán lỏng (0,5% agar).
  • Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn: Sử dụng phương pháp khuếch tán giếng thạch (well diffusion method) theo Ngô Thị Phương Dung (2011). Vi khuẩn LAB được nuôi cấy trong MRS broth (37°C, 48 giờ, 5% CO2), ly tâm 10.000 vòng/phút trong 20 phút ở 4°C để thu dịch nổi không có tế bào. Vi khuẩn chỉ thị V. parahaemolyticus được chuẩn hóa về mật độ 1–2×10⁸ CFU/mL (độ đục chuẩn McFarland 0.5) trong môi trường Nutrient Agar (NA) bổ sung 1,5% NaCl. Bơm 50 µL dịch nổi vào giếng thạch đường kính 6 mm, ủ ở 37°C trong 24 giờ. Đo đường kính vòng vô khuẩn (zone of inhibition) và phân cấp hoạt tính: yếu (<11 mm), trung bình (11–16 mm), mạnh (>16 mm).
  • Kiểm tra hoạt tính bacteriocin: Dịch nổi nuôi cấy của các chủng kháng mạnh được hiệu chỉnh về pH trung tính (pH 6,4) bằng NaOH để loại bỏ tác động ức chế của acid hữu cơ, sau đó thử nghiệm lại trên giếng thạch theo quy trình của Schillinger (1989) và Venema et al. (1997).
  • Đánh giá khả năng chịu mặn: Bố trí thí nghiệm khối hoàn toàn ngẫu nhiên (5 nghiệm thức độ mặn: 5‰, 10‰, 15‰, 20‰, 25‰ trong môi trường MRS broth; 3 lần lặp lại). Mật số vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc (CFU/mL) tại các mốc thời gian 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ nuôi ủ ở 37°C. Số liệu được phân tích phương sai (ANOVA) và so sánh trung bình nghiệm thức bằng phép thử Duncan (mức ý nghĩa P < 0,05) trên phần mềm Statgraphics Plus.
  • Định danh bằng giải trình tự gen 16S rRNA: Tách chiết DNA tổng số từ các chủng có hoạt tính đối kháng cao nhất, khuếch đại đoạn gen 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR, giải trình tự nucleotide và đối chiếu độ tương đồng bằng công cụ Nucleotide BLAST trên cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI). Xây dựng cây phát sinh chủng loài bằng các thuật toán Neighbor-Joining (NJ), Maximum Likelihood (ML) và Maximum Parsimony (MP) với 1000 lần lặp lại (bootstrap), sử dụng Bacillus amyloliquefaciens (mã số KN723307.1) làm loài ngoài nhóm (outgroup).

Nội dung chính theo từng chương

PHẦN I: TỔNG QUAN

Chương tổng quan hệ thống hóa dữ liệu về diện tích, sản lượng nuôi tôm tại Việt Nam và tỉnh Trà Vinh, tình hình dịch bệnh thủy sản do giống vi khuẩn Vibrio gây ra, với trọng tâm là bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND/AHPNS) trên tôm sú và tôm thẻ chân trắng do Vibrio parahaemolyticus mang độc tố. Chương cũng tổng thuật các cơ sở phân loại học vi khuẩn lactic theo Bergey (2001), các nhóm hợp chất kháng khuẩn chính do LAB sinh ra (acid hữu cơ, H2O2, diacetyl, CO2), và phân loại chi tiết các lớp bacteriocin (Lớp I đến Lớp III) cùng cơ chế tác động lên màng tế bào vi khuẩn gây bệnh.

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương trình bày cụ thể địa điểm, thời gian lấy mẫu tại các huyện Duyên Hải, Cầu Kè, Trà Cú (tỉnh Trà Vinh); hóa chất, thiết bị vi sinh và chủng chỉ thị V. parahaemolyticus từ Công ty Cổ phần Mỹ Lan. Tác giả mô tả chi tiết quy trình xử lý 4 nguồn mẫu (ruột tôm, ruột cá, nước ao, bùn đáy), phương pháp phân lập trên môi trường chọn lọc MRS agar + 1% CaCO3, hệ thống 8 thử nghiệm sinh lý - sinh hóa định danh sơ bộ, quy trình khuếch tán giếng thạch 6 mm, phương pháp khử ảnh hưởng của acid bằng đệm pH 6,4 để kiểm tra bacteriocin, bố trí thí nghiệm khảo sát 5 nồng độ muối (5–25‰) qua 3 mốc thời gian (48h, 72h, 96h) phân tích bằng Statgraphics Plus, và quy trình giải trình tự gen 16S rRNA dựng cây phát sinh chủng loài.

PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Chương trình bày toàn bộ dữ liệu thực nghiệm đạt được:

  • Kết quả phân lập: Thu được 18 chủng vi khuẩn tạo vòng tan CaCO3 từ các nguồn mẫu. Trong đó, ruột tôm chiếm số lượng nhiều nhất với 12/18 chủng (66,7%), nước ao nuôi tôm có 4/18 chủng (22,2%), ruột cá có 2/18 chủng (11,1%), và không phân lập được chủng nào từ bùn đáy ao.
  • Đặc điểm hình thái và sinh hóa: Các chủng phân lập có khuẩn lạc màu trắng đục hoặc trắng trong, dạng hình tròn hoặc cầu, rìa nguyên hoặc răng cưa, độ nổi mô hoặc lài, đường kính khuẩn lạc từ 0,9 đến 2,5 mm. 100% (18/18) chủng là vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, gồm dạng trực khuẩn (kích thước 1,0–2,3 µm, xếp chuỗi hoặc đôi) và cầu khuẩn (kích thước ~0,5 µm, xếp đám). Về sinh hóa, toàn bộ 18 chủng đều cho kết quả Catalase (-), Oxidase (-), Citrate (-), Indole (-), Gelatinase (-), Di động (-), Methyl Red (+), Voges-Proskauer (+), và KIA cho phản ứng vàng/vàng (lên men đồng thời glucose và lactose, không sinh H2S).
  • Hoạt tính ức chế Vibrio parahaemolyticus: 17/18 chủng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối kháng. Trong đó, chủng CT3 cho đường kính vòng vô khuẩn lớn nhất đạt 22,6 ± 0,6 mm. Sáu chủng có hoạt tính ức chế mạnh nhất gồm CT3 (22,6 mm), CT5 (21,6 mm), AO2.2 (21,0 mm), AO3 (21,0 mm), AO4 (21,0 mm) và CT4 (21,0 mm).
  • Cơ chế kháng khuẩn và bacteriocin: Khi điều chỉnh pH dịch nổi nuôi cấy của 6 chủng ưu tú về pH 6,4, toàn bộ hoạt tính ức chế đối với V. parahaemolyticus bị triệt tiêu hoàn toàn (đường kính vòng kháng bằng 0 mm). Điều này chứng minh khả năng đối kháng của các chủng lactic phân lập được chủ yếu phụ thuộc vào acid hữu cơ làm giảm pH môi trường, không ghi nhận hoạt tính bacteriocin hoạt động ở pH trung tính.
  • Khả năng chịu mặn: Mật số tế bào của các chủng khảo sát đạt cực đại tại thời điểm 48 giờ ở tất cả các mức độ mặn, sau đó giảm dần ở 72 giờ và 96 giờ. Chủng CT3 đạt mật số cao nhất ở độ mặn 5‰ (3,6×10⁶ CFU/mL) và 10‰ (3,5×10⁶ CFU/mL), giảm dần ở 15‰ (2,0×10⁶ CFU/mL), 20‰ (1,4×10⁶ CFU/mL) và thấp nhất ở 25‰ (6,0×10⁵ CFU/mL). Chủng AO3 sinh trưởng tối ưu ở độ mặn 15‰ với mật số đạt 8,7×10⁷ CFU/mL (log 7,94), tiếp tục duy trì mật số cao ở 5‰ (5,2×10⁷ CFU/mL), 10‰ (5,1×10⁷ CFU/mL), 25‰ (3,8×10⁷ CFU/mL) và thấp nhất ở 20‰ (9,3×10⁶ CFU/mL).
  • Định danh phân tử: Ba chủng có hoạt tính đối kháng cao nhất (CT3, CT4, AO3) được giải trình tự gen 16S rRNA và phân tích BLAST trên NCBI, xác định thuộc chi Lactobacillus spp. Cây phát sinh chủng loài xây dựng bằng 3 phương pháp Neighbor-Joining, Maximum Likelihood và Maximum Parsimony (bootstrap 1000) đều khẳng định vị trí phân loại của 3 chủng nằm trong nhánh tiến hóa của chi Lactobacillus.

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã ghi nhận các kết quả thực nghiệm định lượng cụ thể:

Ký hiệu chủng Nguồn phân lập Hình thái tế bào Hoạt tính kháng V. parahaemolyticus (mm) Mức độ kháng Mật số tối ưu tại 48h (CFU/mL) / Độ mặn
CT3 Ruột tôm Cầu khuẩn, Gram (+) 22,6 ± 0,6 Lớn (+++) 3,6×10⁶ (ở 5‰)
CT5 Ruột tôm Cầu khuẩn, Gram (+) 21,6 ± 0,6 Lớn (+++) Chưa khảo sát chịu mặn
AO3 Nước ao tôm Trực khuẩn, Gram (+) 21,0 ± 1,0 Lớn (+++) 8,7×10⁷ (ở 15‰)
AO4 Nước ao tôm Trực khuẩn, Gram (+) 21,0 ± 1,0 Lớn (+++) Chưa khảo sát chịu mặn
AO2.2 Nước ao tôm Trực khuẩn, Gram (+) 21,0 ± 1,0 Lớn (+++) Chưa khảo sát chịu mặn
CT4 Ruột tôm Cầu khuẩn, Gram (+) 21,0 ± 3,0 Lớn (+++) Duy trì trong dải 5–25‰
AO1.1 Nước ao tôm Trực khuẩn, Gram (+) 20,3 ± 0,6 Lớn (+++) Chưa khảo sát chịu mặn
AO5 Nước ao tôm Cầu khuẩn, Gram (+) 20,0 ± 0,0 Lớn (+++) Chưa khảo sát chịu mặn
CT2 Ruột tôm Trực khuẩn, Gram (+) 20,0 ± 1,0 Lớn (+++) Chưa khảo sát chịu mặn
A4 Ruột tôm Trực khuẩn, Gram (+) 19,3 ± 0,6 Lớn (+++) Chưa khảo sát chịu mặn
CT1 Ruột tôm Trực khuẩn, Gram (+) 19,0 ± 1,0 Lớn (+++) Chưa khảo sát chịu mặn
R1.2 Ruột cá Trực khuẩn, Gram (+) 12,3 ± 0,6 (hoặc 0 mm) Trung bình (++) / Không Chưa khảo sát chịu mặn
A22 Ruột tôm Trực khuẩn, Gram (+) 10,0 ± 0,0 Yếu (+) Chưa khảo sát chịu mặn
A1 Ruột tôm Trực khuẩn, Gram (+) 10,0 ± 0,0 Yếu (+) Chưa khảo sát chịu mặn
A2 Ruột tôm Trực khuẩn, Gram (+) 0,0 ± 0,0 Không kháng -

Đóng góp khoa học và giải pháp ứng dụng do tác giả đề xuất:

  • Khóa luận đã xây dựng được bộ sưu tập gồm 18 chủng vi khuẩn lactic bản địa từ hệ sinh thái nuôi tôm nước lợ tại Trà Vinh, trong đó tuyển chọn được 3 chủng ưu tú nhất (Lactobacillus sp. CT3, Lactobacillus sp. CT4 và Lactobacillus sp. AO3) có hoạt tính đối kháng in vitro mạnh đối với vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp.
  • Làm rõ cơ chế ức chế V. parahaemolyticus của các dòng vi khuẩn lactic tuyển chọn là do quá trình sinh tổng hợp các acid hữu cơ làm giảm pH môi trường, không phụ thuộc vào bacteriocin bền ở pH 6,4.
  • Xác định được chủng Lactobacillus sp. AO3 có khả năng sinh trưởng và duy trì mật số cao (đạt 8,7×10⁷ CFU/mL) tại độ mặn 15‰, rất thích hợp với điều kiện độ mặn thực tế trong các ao nuôi tôm thẻ chân trắng và tôm sú tại khu vực Đồng bằng sông Cửu Long.
  • Cung cấp nguồn chủng vi sinh vật bản địa phục vụ nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học probiotic trộn vào thức ăn tôm, góp phần thay thế kháng sinh trong phòng ngừa bệnh AHPND.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài:

  • Các thử nghiệm đối kháng và cơ chế ức chế mới chỉ dừng lại ở quy mô in vitro trong phòng thí nghiệm, chưa tiến hành thử nghiệm cảm nhiễm in vivo trên tôm sống để đánh giá tỷ lệ bảo hộ thực tế.
  • Thử nghiệm bacteriocin ở pH 6,4 cho kết quả âm tính, do đó đề tài chưa phân lập được chủng có khả năng sinh bacteriocin ngoại bào hoạt tính cao ở pH trung tính.
  • Mẫu thu thập giới hạn tại 3 địa bàn của tỉnh Trà Vinh (Duyên Hải, Cầu Kè, Trà Cú) trong thời gian 3 tháng, chưa bao quát biến động theo các mùa vụ nuôi trồng khác nhau.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

  • Đánh giá khả năng bám dính, khả năng chịu đựng dịch dạ dày - mật và an toàn sinh học của các chủng Lactobacillus sp. CT3, CT4, AO3.
  • Thực hiện thử nghiệm bổ sung sinh khối vi khuẩn lactic vào thức ăn tôm và gây nhiễm nhân tạo với Vibrio parahaemolyticus (in vivo challenge test) để xác định tỷ lệ sống sót, chỉ tiêu tăng trưởng và sự biến đổi mô bệnh học gan tụy tôm.
  • Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy và công nghệ tạo chế phẩm vi sinh dạng bột hoặc vi nang nhằm nâng cao độ bền sinh học khi đưa vào môi trường nước ao nuôi.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Bệnh học Thủy sản, Nuôi trồng Thủy sản và Vi sinh vật học ứng dụng.

Nội dung đáng tham khảo bao gồm:

  • Quy trình phân lập vi khuẩn lactic từ mẫu động vật thủy sản và môi trường nước mặn/lợ sử dụng thạch MRS bổ sung CaCO3.
  • Phương pháp kiểm tra hoạt tính đối kháng vi khuẩn gây bệnh thủy sản bằng kỹ thuật khuếch tán giếng thạch và phương pháp loại trừ ảnh hưởng của acid hữu cơ để kiểm tra bacteriocin.
  • Thiết kế thí nghiệm khối hoàn toàn ngẫu nhiên và quy trình xử lý số liệu vi sinh bằng phần mềm Statgraphics Plus.
  • Quy trình định danh vi sinh vật bằng giải trình tự 16S rRNA kết hợp phân tích phả hệ với 3 thuật toán Neighbor-Joining, Maximum Likelihood và Maximum Parsimony.

Câu hỏi thường gặp

1. Nghiên cứu đã phân lập được bao nhiêu chủng vi khuẩn và nguồn mẫu nào cho hiệu suất phân lập vi khuẩn lactic cao nhất?
Nghiên cứu đã phân lập được tổng cộng 18 chủng vi khuẩn có khả năng phân giải CaCO3. Nguồn mẫu ruột tôm cho hiệu suất phân lập cao nhất với 12/18 chủng (chiếm 66,7%), tiếp theo là mẫu nước ao nuôi tôm với 4/18 chủng (22,2%), mẫu ruột cá có 2/18 chủng (11,1%), và không phân lập được chủng nào từ mẫu bùn đáy ao.

2. Chủng vi khuẩn nào thể hiện hoạt tính đối kháng Vibrio parahaemolyticus mạnh nhất và đường kính vòng vô khuẩn là bao nhiêu?
Chủng vi khuẩn phân lập từ ruột tôm ký hiệu CT3 thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất với đường kính vòng vô khuẩn trung bình đạt 22,6 ± 0,6 mm, có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê (P < 0,05) so với các nghiệm thức còn lại.

3. Khả năng ức chế vi khuẩn V. parahaemolyticus của các chủng lactic trong khóa luận có nguồn gốc từ bacteriocin hay acid hữu cơ?
Khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh có nguồn gốc chủ yếu từ các acid hữu cơ sinh ra trong quá trình lên men làm giảm pH môi trường. Khi dịch ly tâm của 6 chủng kháng mạnh nhất được điều chỉnh pH về mức trung tính (pH 6,4), hoạt tính kháng khuẩn đối với V. parahaemolyticus hoàn toàn biến mất, cho thấy các chủng này không tiết bacteriocin có hoạt tính ở điều kiện pH trung tính.

4. Khả năng chịu mặn của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. AO3 biến thiên như thế nào qua các nồng độ muối từ 5‰ đến 25‰?
Chủng AO3 sinh trưởng tối ưu ở độ mặn 15‰ với mật số đạt cao nhất là 8,7×10⁷ CFU/mL sau 48 giờ nuôi cấy. Ở các độ mặn 5‰ và 10‰, mật số đạt lần lượt 5,2×10⁷ CFU/mL và 5,1×10⁷ CFU/mL; ở độ mặn 25‰ đạt 3,8×10⁷ CFU/mL; và thấp nhất ở độ mặn 20‰ với 9,3×10⁶ CFU/mL. Mật số tế bào ở tất cả các mức mặn đều đạt đỉnh ở 48 giờ và giảm dần sau 72 đến 96 giờ.

5. Ba chủng vi khuẩn đối kháng mạnh nhất đã được định danh thuộc chi nào và bằng phương pháp phân tử gì?
Ba chủng vi khuẩn có hoạt tính đối kháng mạnh nhất gồm CT3, CT4 và AO3 đã được định danh thuộc chi Lactobacillus spp. thông qua phương pháp tách chiết DNA, khuếch đại và giải trình tự đoạn gen 16S rRNA, sau đó phân tích độ tương đồng bằng công cụ BLAST trên cơ sở dữ liệu NCBI và dựng cây phát sinh loài.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Cao Thị Thùy Linh đã phân lập thành công 18 chủng vi khuẩn lactic từ các nguồn mẫu thủy sản tại tỉnh Trà Vinh, trong đó ruột tôm là nguồn phân lập hiệu quả nhất. Đề tài đã sàng lọc và xác định được 3 chủng vi khuẩn ưu tú gồm Lactobacillus sp. CT3, Lactobacillus sp. CT4 và Lactobacillus sp. AO3 có khả năng ức chế mạnh vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm thông qua cơ chế sản sinh acid hữu cơ. Đặc biệt, chủng Lactobacillus sp. AO3 chứng minh khả năng thích ứng và sinh trưởng tối ưu ở độ mặn 15‰ với mật số đạt 8,7×10⁷ CFU/mL, tạo tiền đề khoa học thực tiễn cho việc phát triển các chế phẩm sinh học probiotic bản địa phục vụ nuôi tôm bền vững.