Đặt vấn đề Trong những năm gần đây, nhu cầu về thuỷ sản trên toàn cầu ngày càng gia tăng khi dân số thế giới không ngừng phát triển. Trong điều kiện nguồn hải sản tự nhiên không thể gia tăng, thì hoạt động nuôi trồng thuỷ sản chính là nguồn cung cho tương lai. Hiện nay, Việt Nam là một trong những quốc gia sản xuất thuỷ sản lớn trên thế giới. Trong năm 2015, theo Hiệp Hội Chế Biến và Xuất Khẩu Thủy Sản Việt Nam (VASEP), tổng kim ngạch xuất khẩu thuỷ sản đạt 6,7 tỷ USD và theo số liệu của Hải quan Việt Nam, xuất khẩu tôm ước đạt gần 3 tỷ USD, chiếm tỷ trọng cao nhất 44% trong tổng xuất khẩu thủy sản (Hiệp Hội Chế Biến và Xuất Khẩu Thủy Sản Việt Nam <http://vasep.vn>; Hải quan Việt Nam <http://www.
Mặt khác, tôm thẻ chân trắng là một trong những đối tượng mới được ngành nuôi trồng thủy sản đặc biệt quan tâm phát triển. Không những vì thịt thơm ngon, giá trị dinh dưỡng cao mà còn được thị trường thế giới đặc biệt ưa chuộng. Vì là đối tượng nuôi trồng mới của nước ta nên vẫn chưa có nhiều nghiên cứu giúp người nuôi tránh được những khó khăn khi nuôi loại tôm này. Điều kiện môi trường bất lợi do biến đổi khí hậu, bùng phát dịch bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra, trở thành rào cản bất lợi kiềm hãm sự phát triển của nghề nuôi tôm nước ta (Vaseeharan, Ramasamy, 2003; Nguyễn Trọng Nghĩa, 2015).
Để ngăn ngừa và kiểm soát dịch bệnh, kháng sinh, thuốc khử trùng và các chất hóa học đã được sử dụng. Tuy nhiên, việc lạm dụng thuốc kháng sinh và các chất hóa học đã gây những hậu quả nghiêm trọng, tác động trực tiếp đến môi trường nước và sức khỏe con người (Dorsey, Robertson, 2013). Lượng thuốc tồn dư trong các sản phẩm thủy sản đã gây nhiều khó khăn khi xuất khẩu ra thị trường nước ngoài. Hiện nay, các nhà khoa học khuyên nên sử dụng chế phẩm probiotic để giải quyết vấn đề dịch bệnh và nâng cao chất lượng của động vật thủy sản (Krishnaprakash, 2009; Senthong và cs, 2012).
Các chủng vi khuẩn probiotic đóng vai trò quan trọng trong đường tiêu hóa của vật chủ do cải thiện khả năng miễn dịch, cân bằng hệ vi sinh đường ruột và tiết ra chất kháng khuẩn như acid lactic, acid acetic, bacteriocin… ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh, đồng thời giúp cải thiện 2 chất lượng môi trường nước nuôi (Ige, 2013; Newaj-Fyzul và cs, 2007). Theo một số nghiên cứu cho thấy nguồn gốc của vi sinh vật có ích trong chế phẩm probiotic cũng ảnh hưởng tới hiệu quả của chế phẩm (Vaseeharan, Ramasamy, 2003). Bởi các vi sinh vật trong chế phẩm phải thích nghi được với môi trường ao nuôi và trong đường tiêu hóa của tôm. Từ những lí do trên, đề tài: “Phân lập, tuyển chọn và xác định các đặc tính sinh học của một số chủng vi khuẩn probiotic từ tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei)” đã được tiến hành.
Nhằm phân lập, tuyển chọn các chủng Bacillus và Lactobacillus có tìm năng probiotic cao tại huyện Nhơn Trạch, tỉnh Đồng Nai. Góp phần chủ động về con giống, giảm chi phí sản xuất, tạo ra chế phẩm probiotic có chất lượng và đưa ngành nuôi trồng thủy sản phát triển bền vững. Mục tiêu đề tài Phân lập, tuyển chọn và định danh một số chủng lợi khuẩn Bacillus và Lactobacillus từ mẫu tôm và mẫu nước tại một số ao nuôi tôm tại huyện Nhơn Trạch, tỉnh Đồng Nai. Xác định đặc tính sinh học có lợi của các chủng phân lập được.
Xây dựng đường cong sinh trưởng của các chủng lợi khuẩn phân lập được. Mục đích đề tài Góp phần nâng cao chất lượng nuôi tôm thẻ chân trắng tại huyện Nhơn Trạch, tỉnh Đồng Nai nói riêng và ngành nuôi tôm nói chung. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về probiotic 1.
Định nghĩa Kể từ khi xuất hiện, probiotic vẫn chưa có một định nghĩa thống nhất. Thuật ngữ probiotics đã ra đời và được Parker đưa vào tài liệu khoa học vào năm 1974 “Probiotic như hỗn hợp những sinh vật và các chất mà giúp cân bằng hệ sinh vật đường ruột” (Paker, 1974). Năm 1989 định nghĩa về probiotic đã được làm rõ hơn bởi Fuller. Ông cho rằng probiotic là “chất bổ sung vi sinh vật sống vào thức ăn giúp cải thiện cân bằng của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa theo hướng có lợi cho vật chủ” (Fuller, 1989).
Định nghĩa này sau đó được phát triển xa hơn vào năm 1992 bởi Havenaar và Huis Int Veld là “Một hỗn hợp tập hợp các vi sinh vật sống, ứng dụng cho động vật hoặc con người, ảnh hưởng có lợi cho hệ tiêu hóa bằng cách cải thiện các tính chất của hệ vi sinh vật có sẵn trong vật chủ” (Yuan Kun Lee, Seppo Salminen, 2009). Năm 2002, tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO) và tổ chức Y tế thế giới (WHO) khẳng định rằng probiotic là “các vi sinh vật sống khi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hoá với một số lượng đủ sẽ đem lại sức khoẻ tốt cho vật chủ”. Đây là định nghĩa thể hiện tương đối đầy đủ bản chất của probiotic và được nhiều nhà khoa học sử dụng (FAO và WHO, 2002). Cơ chế tác dụng của probiotic Sản sinh các hoạt chất ức chế: Vi khuẩn probiotic tạo ra các chất có khả năng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh khác nhau ở bên trong đường ruột và môi trường sống vật chủ, gồm có các acid hữu cơ, bacteriocin… (Ige, 2013; Maeda và cs, 2014).
Cạnh tranh loại trừ vi khuẩn gây bệnh: Chế phẩm sinh học là một rào cản hữu hiệu ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh. Các vi khuẩn có lợi có khả năng cạnh tranh vị trí bám và thức ăn trong thành ruột với các vi sinh vật gây bệnh, không cho phép các vi sinh vật này bám vào cơ thể 4 vật nuôi, nhờ vậy giúp ngăn ngừa dịch bệnh, đảm bảo sức khỏe cho vật nuôi (Kenneth H. Wilson & Fulvio Perini 1998). Tăng cường hệ miễn dịch: Các chế phẩm sinh học có thể kích thích hệ miễn dịch của vật nuôi.
Việc sử dụng Lactobacillus plantarum đã được chứng minh có hiệu quả trong việc chống lại vi khuẩn gây bệnh V. alginolyticus bằng cách tăng sức đề kháng và kích hoạt hệ miễn dịch của tôm thẻ chân trắng (Chiu-Hsia Chiu và cs, 2007). Cải thiện chất lượng nước: Chế phẩm sinh học còn giúp ngăn ngừa và giảm thiểu ô nhiễm trong ao nuôi. Các vi sinh vật có lợi giúp phân hủy các chất hữu cơ dư thừa trong nước thông qua các enzyme ngoại bào, góp phần làm giảm thiểu việc hình thành các lớp bùn và chất cặn bã, nhờ vậy chất lượng nước trong ao nuôi được cải thiện, làm tăng số lượng của động vật phù du, giảm mùi hôi, từ đó tăng sản lượng nuôi trồng thủy sản.
Có nhiều nghiên cứu cho thấy chất lượng môi trường nước ao nuôi được cải thiện khi bổ sung probiotic, đặc biệt là khi bổ sung chế phẩm có chứa các chi Lactobacillus và Bacillus (Verschuere và cs, 2000). Cải thiện hệ tiêu hóa: Chế phẩm sinh học là nguồn dinh dưỡng và enzyme cho bộ máy tiêu hóa của vật nuôi. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các dòng chế phẩm sinh học sản xuất ra các enzyme ngoại bào như: protease, amylase… có ảnh hưởng tích cực đến quá trình tiêu hóa của vật nuôi (Xu-xia Zhou al et. Các chủng vi sinh vật thường sử dụng để sản suất probiotic cho tôm Vi khuẩn được sử dụng làm probiotic chủ yếu là các chủng Bacillus và Lactobacillus.
Bên cạnh đó, nấm men cũng được xem là tiềm năng probiotic hiện nay. Chủng Bacillus Trong số các vi sinh vật probiotics, Bacilus subtilis được quan tâm sử dụng rộng rãi. Bacillus subtilis là những vi khuẩn Gram dương, thuộc họ Bacillaceae. Bacillus subtilis có hình que thẳng với kích thước 0,5 - 2,5 x 1,2 - 10 µm, phân bố rộng rãi trong đất, nước và không khí, có khả năng kháng nhiệt, kháng điều kiện khô 5 hạn, chịu mặn và tạo bào tử.
Đa số chúng thích nghi sinh trưởng tốt ở pH = 7, nhiệt độ sinh trưởng phù hợp các chủng ưa nóng từ 45oC đến 75oC hoặc cao hơn, chủng ưa lạnh từ -5oC đến 25oC. Đặc biệt, Bacillus subtilis an toàn cho người và động vật. Phần lớn các chủng Bacillus đều phân giải chất hữu cơ mạnh nhờ sinh khả năng tiết các enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulose…) trong quá trình phát triển (Robinson và cs, 2000; Jorge và cs, 2014). Với nhiều đặc điểm về tìm năng probiotic như: khả năng sinh enzyme, tạo bào tử và thích nghi nhanh với các điều kiện bất lợi của môi trường nên các chủng Bacillus đã trở thành lựa chọn cho các nghiên cứu về chế phẩm sinh học hiện nay.
Một số chủng Bacillus thường dùng để sản xuất chế phẩm sinh học: Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis (Robinson và cs, 2000). Chủng Lactobacillus Lactobacillus thuộc họ Lactobacillaceae. Tương tự như các chi khác, Lactobacillus được đặc trưng bởi khả năng sản xuất axit lactic là một sản phẩm phụ của quá trình chuyển hóa glucose. Các chi Lactobacillus phát triển trong điều kiện kỵ khí hoặc vi hiếu khí (5% đến 10% CO2), ưa axit.
Nhu cầu dinh dưỡng của Lactobacillus đặc trưng cho từng loài và tương đối phức tạp. Môi trường sinh trưởng thường có các amino axit, peptit, dẫn xuất của nucleic axit, vitamin, muối, axit béo hoặc este axit béo và các loại đường dễ lên men. Nhiệt độ tăng trưởng của Lactobacillus rộng, khoảng 2oC đến 53oC và tối ưu thường 30oC đến 40oC, pH thích hợp khoảng 5,5 đến 6,2, tăng trưởng thường xảy ra ở pH 5,0 hoặc ít hơn, tốc độ tăng trưởng thường giảm trong điều kiện môi trường trung tính hoặc kiềm. Các chủng Lactobacillus được đặc trưng bởi khả năng sinh axit lactic, catalase và casein đều âm tính (Paul De Vos và cs, 2011).
Lactobacillus có khả năng lên men monosaccarit và hầu hết các loại disaccarit nhưng không thể phân giải tinh bột (trừ chủng Lactobacillus delbruceckii) (Paul De Vos và cs, 2011; Robinson và cs, 2000). 6 Trong quá trình lên men một hoặc một số sản phẩm được tạo ra như: formic, axetic, propionic, butyric, lactic và axit valerianic, cồn và carbon dioxide. Khả năng tạo thành axit lactic của các chủng Lactobacillus khác nhau thì rất khác nhau và độ bền với axit này cũng rất khác nhau. Ngoài khả năng tạo ra axit lactic, Lactobacillus còn sinh ra các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn (bacteriocin) (Paul De Vos và cs, 2011).
Lactobacillus là nhóm vi khuẩn phổ biến được sử dụng rộng rãi trong sản xuất các chế phẩm probiotic. Với khả năng sinh acid lactic trong quá trình phát triển là tiềm năng quan trọng trong sản xuất probiotic.