MỞ ĐẦU Ngày nay cùng với sự phát triển của xã hội, các ngành công – nông – lâm nghiệp … cũng phát triển một cách mạnh mẽ. Bên cạnh sự phát triển đó thì lượng chất thải từ các ngành này thải ra môi trường cũng ngày một nhiều, làm ô nhiễm môi trường sống không chỉ của các sinh vật mà còn gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới con người. Ngoài những chất thải nhân tạo khó bị phân hủy thì cũng có một số chất thải có nguồn gốc từ sinh vật cũng rất khó bị phân hủy trong điều kiện thường hay bởi các sinh vật thông thường như chintin, lignocellulose, pectin… Trong đó lingocellulose là chủ yếu. Sự tồn đọng của lignocellulose trong môi trường không những gây ô nhiễm môi trường mà còn làm đứt quãng chu trình tuần hoàn vật chất trong tự nhiên.
Do đó việc phân giải lignocellulose có vai trò rất quan trọng không chỉ đối với môi trường mà còn đối với các sinh vật. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh khả năng và triển vọng sử dụng enzyme vào việc biến đổi sinh học các chất thải lignocellulose để tạo ra các đường đơn hữu ích từ phế phụ liệu chứa lignocellulose [3]. Tuy nhiên, do lignocellulose là một chất rất khó bị phân giải trong điều kiện thường, và chỉ có một số ít sinh vật có khả năng phân hủy chúng. Bên cạnh đó, quá trình này đòi hỏi sự tham gia của rất nhiều enzyme khác nhau đặc biệt là các enzyme trong họ Glycoside Hydrolase.
Nhằm mục đích tăng năng suất quá trình thủy phân lignocellulose thành các đường đơn, đường đôi từ các phế phụ phẩm nông – lâm nghiệp, để từ đó đưa vào ứng dụng rộng rãi trong sản xuất các sản phẩm có giá trị trong đời sống con người và vật nuôi (nhiên liệu sinh học, thức ăn chăn nuôi…), chúng tôi đã thực hiện đề tài: Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc sinh enzyme họ GH61 hỗ trợ thủy phân lignocellulose. 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Lignocellulose Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thành tế bào thực vật. Thành phần chủ yếu của lignocellulose là cellulose, hemicellulose và lignin (Hình 1.
Cellulose và hemicellulose là các đại phân tử cấu tạo từ các gốc đường khác nhau, trong khi lignin là một polymer dạng vòng được tổng hợp từ tiền phenylpropanoid. Thành phần cấu tạo và hàm lượng của các polymer này trong thực vật là khác nhau giữa các loài. Ngoài ra, nó còn tùy thuộc vào độ tuổi, giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cây và các điều kiện môi trường. Thành phần của lignocellulose được trình bày ở bảng 1.1: Thành phần lignocellulose 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nguồn lignocellulose Cellulose (%) Hemicellulose (%) Lignin (%) Thân gỗ cứng 40-55 24-40 18-25 Thân gỗ mềm 45-50 25-35 25-35 Vỏ lạc 25-30 25-30 30-40 Lõi ngô 45 35 15 Giấy 85-99 0 0-15 Vỏ trấu 32.1 24 18 Vỏ trấu của lúa mì 30 50 15 Rác đã phân loại 60 20 20 Lá cây 15-20 80-85 0 Hạt bông 80-95 5-20 0 Giấy báo 40-55 25-40 18-30 Giấy thải từ bột giấy 60-70 10-20 5-10 hóa học Chất rắn nước thải 8-15 - 24-29 ban đầu Chất thải của lợn 6 28 - Phân bón gia súc 1.7 Cỏ ở bờ biển 25 35.4 Bermuda Cỏ mềm 45 31.0 Các loại cỏ 25-40 25-50 10-30 Bã thô 33.1: Thành phần lignocellulose trong rác thải và phế phụ liệu nông nghiệp phổ biến [8] 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lượng lớn lignocellulose được thải ra từ các ngành lâm nghiệp, nông nghiệp, công nghiệp giấy và gây ra ô nhiễm môi trường.
Tuy nhiên, lượng lớn các sinh khối thực vật dư thừa được coi là rác thải có thể được biến đổi thành nhiều sản phẩm có giá trị khác nhau như nhiên liệu sinh học, hóa chất, các nguồn năng lượng rẻ cho quá trình lên men, bổ sung chất dinh dưỡng cho con người và thức ăn cho động vật [10]. Cellulose Cellulose là hợp chất hữu cơ có công thức (C6H10O5)n, là một polysaccharide gồm một chuỗi tuyến tính gồm từ vài trăm đến hơn 10.000 đơn phân D – glucose nối với nhau bởi liên kết 1,4 β - glucoside [6] [8]. Cellulose là thành phần cấu trúc chính của thành tế bào ở thực vật, nhiều loại tảo và lớp nấm trứng (Oomycetes). Một số loài vi khuẩn chế tiết cellulose để tạo thành màng sinh học.
Cellulose là một hợp chất hữu cơ phổ biến nhất trên trái đất. Khoảng 33% khối lượng khô của thực vật là cellulose (sợi bông là 90%, gỗ là 40 -50% và cây gai dầu khô là khoảng 75%) [9] [23] [24]. Khác với các carbohydrate phức tạp khác như tinh bột, glycogel có cấu trúc cuộn lại hoặc phân nhánh, phân tử chính mở rộng và một cấu tạo giống hình que khá cứng, cellulose có cấu trúc mạch thẳng. Sự khác biệt này là do các đơn phân trong cellulose nối với nhau bằng cầu nối 1,4 β – glycoside; trong khi các carbohydrate khác lại là liên kết 1,4 α – glycoside.
Nhờ đặc tính này mà các phân tử cellulose dai hơn, bền hơn, rất khó phân hủy ở điều kiện thường [2] [14]. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Cellulose được cấu tạo thành chuỗi dài gồm ít nhất 500 phân tử glucose. Các chuỗi cellulose này xếp đối song song tạo thành các vi sợi cellulose có đường kính khoảng 3,5 nm. Mỗi chuỗi có nhiều nhóm OH tự do, vì vậy các sợi ở cạnh nhau liên kết với nhau bằng liên kết hydro.
Các vi sợi lại liên kết với nhau tạo thành vi sợi lớn hay còn gọi là bó mixen có đường kính 20 nm, giữa các sợi trong mixen có những khoảng trống lớn. Khi tế bào còn non, những khoảng này chứa đầy nước, ở tế bào già thì chứa đầy lignin và hemicellulose. Cellulose có nguồn gốc từ thực vật thường được tìm thấy trong hỗn hợp với hemicellulose, lignin, pectin và các chất khác, trong khi cellulose vi khuẩn là khá tinh khiết, có hàm lượng nước cao hơn nhiều [23]. Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và lực Van der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là kết tinh và vô định hình.
Trong vùng kết kinh, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị tấn công bởi enzyme cũng như hóa chất. Ngược lại, trong vùng vô định hình, cellulose liên kết lỏng lẻo nên dễ bị tấn công. Có hai kiểu cấu trúc của cellulose đã được đưa ra nhằm mô tả vùng kết tinh và vô định hình [4].2: Cấu trúc cellulose: kiểu nhiều sợi nhỏ hợp thành (Fringed fibrillar) và kiểu chuỗi gấp khúc (Folding chain) [4] 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com - Kiểu nhiều sợi nhỏ hợp thành (Fringed fibrillar): phân tử cellulose kéo thẳng và định hướng theo chiều dài sợi. Vùng tinh thể có chiều dài 500 A, xếp xen kẽ với vùng vô định hình - Kiểu chuỗi gấp khúc (Folding chain): phân tử cellulose gấp khúc theo chiều dài sợi.
Mỗi đơn vị lặp lại có độ trùng hợp khoảng 1000, giới hạn bởi hai điểm a và b như hình vẽ. Các đơn vị đó được sắp xếp thành chuỗi nhờ vào các mạch glucose nhỏ, các vị trí này rất dễ bị thủy phân. Đối với các đơn vị lặp lại, hai đầu là vùng vô định hình, càng vào giữa, tính chất kết tinh càng cao. Trong vùng vô định hình, các liên kết β – glucoside giữa các monomer bị thay đổi góc liên kết, ngay tại cuối các đoạn gấp, ba phân tử monomer sắp xếp tạo sự thay đổi 1800 cho toàn mạch.
Vùng vô định hình dễ bị tấn công bởi tác nhân thủy phân hơn vùng tinh thể vì sự thay đổi góc liên kết của các liên kết cộng hóa trị (β – glucoside) sẽ làm giảm độ bền nhiệt động của liên kết, đồng thời vị trí này không tạo được liên kết hydro. Nhiều tính chất của cellulose phụ thuộc vào độ dài chuỗi hoặc mức độ trùng hợp, số lượng các đơn phân glucose tạo nên phân tử polymer. Cellulose từ bột gỗ có độ dài chuỗi điển hình giữa 300 và 1700 đơn phân, bông và sợi thực vật khác cũng như cellulose vi khuẩn có độ dài chuỗi khác nhau, từ 800 đến 10. Các phân tử với chiều dài chuỗi rất nhỏ là kết quả từ sự phân hủy cellulose, được gọi là cellodextrin, trái ngược với chuỗi cellulose dài, cellodextrin thường hòa tan trong nước và dung môi hữu cơ.
Một số động vật, đặc biệt là động vật nhai lại và mối, có thể tiêu hóa cellulose với sự giúp đỡ của vi sinh vật sống cộng sinh trong ruột. Con người có thể tiêu hóa cellulose trong chừng mực nào đó [13], tuy nhiên nó chủ yếu là hoạt động như một chất hỗ trợ tiêu hóa và thường được gọi là "chất xơ". 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Cellulose dùng trong công nghiệp ngày nay chủ yếu được lấy từ bột giấy và bông. Chúng chủ yếu được sử dụng để sản xuất bìa và giấy, trong một phạm vi nhỏ hơn nó được chuyển thành sản phẩm dẫn xuất như giấy bóng kính và tơ nhân tạo.
Chuyển đổi cellulose từ cây trồng nhiên liệu vào nhiên liệu sinh học như ethanol cellulosic đang được nghiên cứu như là một nguồn nhiên liệu thay thế. Hemicellulose Hemicellulose là một polymer carbohydrate phức tạp và chiếm 25-30% tổng trọng lượng khô gỗ. Nó là một polysaccharide với trọng lượng phân tử thấp hơn cellulose [12]. Nó thường được tìm thấy trong liên kết với cellulose trong thành tế bào thứ cấp của thực vật, nhưng chúng cũng có mặt trong thành tế bào sơ cấp [19].
Hemicellulose là thuật ngữ chỉ một nhóm các homo - và heteropolymer bao gồm các đơn phân chính: D – xylose, D – mannose, D – galactose, D – glucose, và các nhóm thế: L – arabinose, acid 4 – O – methyl – glucuronic, D – galacturonic và D – glucuronic. Các phân tử đường liên kết với nhau bằng liên kết 1,4 β và đôi khi là 1,3 β – glycoside. Sự khác biệt chính với cellulose là hemicellulose có phân nhánh với chuỗi bên ngắn gồm các loại đường khác nhau; do đó, chúng dễ bị thủy phân hơn so với cellulose [12]. Thành phần chính của hemicellulose trong gỗ cứng là glucuronoxylan và trong gỗ mềm là Glucomannan.
Glucuronoxylan trong gỗ cứng và thực vật thân thảo gồm mạch chính là 1,4 β – D – xylan với nhóm thế 1,2 α – 4 – O – methyl – D – giucuronic acid (hoặc 1,2 α – D – glucuronic acid), chiếm khoảng 10% dư lượng xylose (Hình 1. Xylan trong trong gỗ mềm và thực vật thân thảo khác với xylan trong gỗ cứng ở chỗ chúng có arabinofuranose liên kết với mạch chính xylan bằng liên kết 1,3 α (Hình 1. 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.3: O – acetyl4 – O – methyl – D – glucuronoxylan từ Hạt kín (theo Dekker 1985) Hình 1.